ШТАММ ДРОЖЖЕЙ Candida parapsilosis - ПРОДУЦЕНТ ЛИПАЗЫ Российский патент 2016 года по МПК C12N1/16 C12N9/20 C12R1/72 

Описание патента на изобретение RU2575804C1

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии. Штамм Candida parapsilosis Μ10, обладающий высокой липолитической активностью депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) ФГУПГосНИИГенетика (г. Москва, 1-й Дорожный проезд, 1) под регистрационным номером ВКПМ: Υ-4055 и может быть использован при получении ферментного препарата липазы. Изобретение позволяет получать штамм, обладающий высокой липазной активностью.

Липолитические ферменты - это гидролазы эфиров насыщенных и ненасыщенных алифатических кислот, содержащих не менее 12 атомов углерода.

Они имеют широкий спектр применения - в пищевой промышленности, бытовой химии, косметике, медицине. Значительный интерес к практическому использованию ферментов в медицине обусловлен важной ролью, которую они играют в биологических процессах, в частности в процессах пищеварения у человека и животных. Не меньший интерес представляет их практическое применение в пищевой промышленности - в сыроделии, в хлебопечении. Липазы микроорганизмов в сочетании с другими ферментами применяются для биологической очистки сточных вод.

Известен штамм Trichosporon fermentans WU-C12 (Chen J., Ishii Т., Shimura S., Kirimura K. and Usami S. Lipase production by Trichosporon fermentans WU-C12, a newly isolated yeast. Journal of Fermentation and Bioengineering, 1992, vol. 73, p. 412-414), обладающий липолитической активностью. Недостатком штамма является низкая активность липазы.

Известен рекомбинантный штамм Pichia pastoris (Catoni Ε., Schmidt-Dannert С, Brocca S., Schmid R. Overexpression of lipase A and В of Geotrichum candidum in Pichia pastoris: high-level production and some properties of functional expressed lipase B. Biotechnology Techniques, September 1997, vol. 11, no. 9, p. 689-695), обладающий липолитической активностью. Недостатком штамма является низкая активность липазы.

Известен дикий штамм Yarrowia lipolytica W29 (АТСС 20460), служивший родительским штаммом (J. Biotechnol., 2004, vol. 109 рр. 63-81) для ряда штаммов реципиентов, в том числе Yarrowia lipolytica Pold (CLIB 139) и Yarrowia lipolytica Polf (ATCC MYA-2613). Несмотря на то что они хорошо охарактеризованы биохимически и генетически, вышеуказанные продуценты не способны обеспечивать высокий уровень липолитической активности.

Наиболее близким аналогом к заявляемому изобретению является штамм Yarrowia lipolytica ВКПМ Y-3600 (патент РФ №2475532). В патенте описан способ получения рекомбинантного штамм Y. lipolytica ВКПМ Y-3600 путем трансформации штамма Y. lipolytica Polf (leu+) экспрессионной плазмидой pY-Y1PIR1-LIP2. К недостаткам штамма можно отнести невысокую активность продуцента, а также затруднительное выделение и очистку ферментного препарата.

Задачей заявленного изобретения является получение нового дрожжевого штамма, обладающего высокой липолитической активностью.

Технический результат заявленного изобретения - улучшение биотехнологии липазы, возможность применения этого фермента в пищевой промышленности.

Технический результат достигается за счет применения нового штамма Candida parapsilosis М10, выделенного из образца сливочного масла. Критериями отбора микроорганизмов служили изменение цвета индикатора в составе селективной питательной среды при выращивании колоний дрожжей, величина зон просветления вокруг них и количество накапливаемой липазы в фильтрате культуральной жидкости по истечении срока ферментации.

За единицу активности липазы принимают такое количество фермента, которое при рН 7,0 и температуре 37°C в течение 1 часа катализирует гидролиз 40%-ной эмульсии оливкового масла с образованием 1 мкмоль олеиновой кислоты.

Предлагаемый штамм депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) ФГУПГосНИИГенетика (г. Москва, 1-й Дорожный проезд, 1). Регистрационный номер ВКПМ: Y-4055.

Штамм Candida parapsilosis М10 характеризуется следующими признаками:

Принадлежность штамма Candida parapsilosis М10 к указанному виду была выявлена на основе генетического анализа секвенсов вариабельных участков 18S рРНК. Гомология составила 99%.

Морфология клетки.

При росте на жидкой среде Сабуро (пептон - 10 г/дм3, глюкоза - 40 г/дм3, вода - остальное) суточная культура дрожжей представлена овальными, удлиненно-овальными, округлыми клетками. Размеры клеток колеблются от 2,5-4 мкм в ширину и 2,5-9 мкм в длину. Ко вторым суткам большинство клеток почкуются и образуют псевдомицелий. Клетки хорошо растут на простых питательных средах.

При росте на жидкой среде Candida parapsilosis Μ10: наблюдается помутнение, образуется осадок и кольцо на стенках пробирки, пигментации среды нет, выделения газа нет, запах - характерный дрожжевой.

Культуральные признаки Candida parapsilosis М10.

На поверхности плотных питательных сред типа Сабуро Candida parapsilosis М10 образует колонии, имеющие следующие признаки:

- форма - круглая с фестончатым краем;

- размер (диаметр) - от 1 до 7 мм;

- поверхность - крупно-складчатая;

- профиль - плоский, врастающий в субстрат;

- блеск и прозрачность - колония блестящая, непрозрачная;

- цвет - светлый грязновато-бежевый;

- край - волнистый;

- структура - крупнозернистая;

- консистенция - плотная кожистая.

Особенности роста по штриху Candida parapsilosis М10: штрих обильный, сплошной с волнистым краем, поверхность крупно-складчатая, блестящая, светлого грязновато-бежевого цвета. Спор не образует.

Физиолого-биохимические признаки.

Облигатный аэроб. Сбраживает глюкозу. Ассимилирует: глюкозу, галактозу, сахарозу, мальтозу, D-ксилозу, D-рибозу, глицерин, лимонную и янтарную кислоты. Не ассимилирует: целлобиозу, лактозу, раффинозу, инулин, D-арабинозу, L-рамнозу, молочную кислоту. Не ассимилирует нитраты. Растет в безвитаминной среде, однако биотин является сильным стимулятором роста.

Разжижает желатин. Гидролизует мочевину.

Отношение Candida parapsilosis M10 к концентрации хлористого натрия в питательной среде: на средах с добавлением NaCl (8%, 10%, 12%) наблюдался интенсивный рост культуры.

Отношение Candida parapsilosis М10 к рН среды: рост культуры наблюдается в области рН от 3 до 9.

Отношение Candida parapsilosis М10 к температуре культивирования:

- при 20°C - слабый рост;

- при 25°C - обильный рост;

- при 30°C - обильный рост;

- при 37°C - обильный рост;

- при 50°C - слабый рост.

Условия и состав среды для длительного хранения штамма: агаризованная питательная среда Сабуро с добавлением трибутирина - 0,1%, ионов Са2+ - 0,03-0,08%, t 4-6°C. Пересевы на свежие среды - один раз в три месяца.

Условия и состав среды для размножения штамма: скошенная агаризованная питательная среда Сабуро, температура инкубирования 28-30°C, длительность инкубирования 48 ч.

Активность ферментного препарата липазы Г20Х, полученного на основе культивирования предлагаемого штамма достигает 30400-30500 ед/г.

Примеры осуществления изобретения.

Пример 1.

Субстратом для выделения дрожжей-продуцентов липаз служили образцы почвы, фруктов, масел, мясные и молочные продукты, содержащие повышенное количество липидов. С момента отбора материал хранили при температуре +4°C не более 1 месяца.

Отобранные образцы суспендировали в физиологическом растворе с добавлением гентамицина и выдерживали в термостате при температуре 30°C в течение 1 ч. Использование антибиотических препаратов на начальных этапах скрининга позволило исключить прорастание сопутствующих бактериальных культур.

Полученную накопительную культуру пересевали в чашки Петри на плотную обогащенную питательную среду М9 следующего состава (г/дм3): Na2HPO4 - 6; KH2PO4 - 3; NaCl - 0,5; NH4Cl - 1; оливковое масло - 10; агар - 20. Инкубирование проводили в термостате при температуре 30°C в течение 72 ч. По истечении срока инкубирования проводили отбор активных дрожжевых колоний, способных усваивать в качестве единственного источника углерода оливковое масло. Чистые культуры пересевали на селективную питательную среду следующего состава (г/дм3): Na2HPO4 - 6; KH2РO4 - 3; NaCl - 0,5; NH4Cl - 1; трибутирин - 3; агар - 20; в присутствии красителя метиловый красный.

О наличии липолитической активности судили по величине зон просветления вокруг колоний, и по переходу цвета плотной питательной среды от желтого к оранжевому и далее к красному.

В результате проведенного скрининга был отобран штамм дрожжей, обладающий липолитической активностью.

Пример 2.

Культивирование штамма Candida parapsilosis Μ10, полученного в результате скрининга, на питательной среде следующего состава (г/дм3): горчичное масло - 26; глюкоза - 5; дрожжевой экстракт - 18; соевая мука - 10; KH2РO4 - 0,3; MgSO4·7H2O - 0,2; CaCO3 - 3; твин-80 - 4,2; вода - до 1 дм3, в течение 48 ч при 30°C при постоянном перемешивании позволяет достичь в фильтрате КЖ активности фермента 235-240 ед/см3. Возраст посевного материала - 36-48 ч, доза - 5% от объема питательной среды (количество клеток 5·107 кл/см3.

Выделение и концентрирование ферментного препарата липазы из фугата культуральной жидкости Candida parapsilosis Μ10 проведенное методами ультрафильтрации и стерилизующей фильтрации позволяет получить ферментный препарат с активностью липазы 30400-30500 ед/г.

Похожие патенты RU2575804C1

название год авторы номер документа
ШТАММ BACILLUS LICHENIFORMIS ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ГИСТИДИНДЕКАРБОКСИЛАЗЫ 2012
  • Иванова Людмила Афанасьевна
  • Устинова Юлия Вадимовна
RU2485176C1
РЕКОМБИНАНТНЫЙ ШТАММ ДРОЖЖЕЙ YARROWIA-LIPOLYTICA - ПРОДУЦЕНТ ЛИПАЗЫ 2011
  • Выборная Татьяна Владимировна
  • Юзбашев Тигран Владимирович
  • Соболевская Татьяна Ивановна
  • Лаптев Иван Александрович
  • Юзбашева Евгения Юрьевна
  • Синеокий Сергей Павлович
RU2451075C1
ШТАММ ДРОЖЖЕЙ Yarrowia lipolytica - ПРОДУЦЕНТ КЛЕТОЧНО-СВЯЗАННОЙ ЛИПАЗЫ 2012
  • Юзбашева Евгения Юрьевна
  • Юзбашев Тигран Владимирович
  • Гордеева Татьяна Леонидовна
  • Лаптев Иван Александрович
  • Выборная Татьяна Владимировна
  • Синеокий Сергей Павлович
RU2475532C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГРАНУЛИРОВАННОГО БИОКАТАЛИЗАТОРА НА ОСНОВЕ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ КЛЕТОК ДРОЖЖЕЙ ДЛЯ ПРОВЕДЕНИЯ РЕАКЦИИ ПЕРЕЭТЕРИФИКАЦИИ 2016
  • Борголов Артем Викторович
  • Василов Раиф Гаянович
  • Горин Кирилл Викторович
  • Готовцев Павел Михайлович
  • Дьяков Андрей Викторович
  • Сергеева Яна Эдуардовна
RU2646104C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НАТУРАЛЬНОГО ПИЩЕВОГО АНТОЦИАНОВОГО КРАСИТЕЛЯ ИЗ ОТХОДОВ КУКУРУЗЫ И ПИЩЕВОЙ АНТОЦИАНОВЫЙ КРАСИТЕЛЬ, ПОЛУЧЕННЫЙ ПО ЭТОМУ СПОСОБУ 2004
  • Бутова Светлана Николаевна
  • Иванова Людмила Афанасьевна
  • Рыжова Наталья Валентиновна
RU2294348C2
ПИЩЕВАРИТЕЛЬНОЕ СРЕДСТВО НА ОСНОВЕ ФЕРМЕНТОВ МИКРОБНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ 2009
  • Бебуров Михаил Юрьевич
  • Дебабов Владимир Георгиевич
  • Яненко Александр Степанович
  • Синеокий Сергей Павлович
  • Честухина Галина Георгиевна
  • Леонова Татьяна Евгеньевна
  • Ларикова Галина Андреевна
  • Котлова Елена Константиновна
  • Воюшина Татьяна Львовна
  • Константинова Галина Евгеньевна
  • Выборная Татьяна Владимировна
  • Рыбаков Юрий Александрович
RU2429291C1
ШТАММ ДРОЖЖЕЙ Yarrowia lipolytica - ПРОДУЦЕНТ ЛИПАЗЫ 2007
  • Синеокий Сергей Павлович
  • Юзбашев Тигран Владимирович
  • Лаптев Иван Александрович
  • Юзбашева Евгения Юрьевна
  • Выборная Татьяна Владимировна
  • Соболевская Татьяна Ивановна
RU2355754C1
ДРОЖЖИ РОДА YARROWIA, ОБЛАДАЮЩИЕ СПОСОБНОСТЬЮ ВНУТРИКЛЕТОЧНО НАКАПЛИВАТЬ СЛОЖНЫЕ ЭФИРЫ ЖИРНЫХ КИСЛОТ, И СПОСОБ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО СИНТЕЗА ТАКИХ ЭФИРОВ 2013
  • Юзбашева Евгения Юрьевна
  • Юзбашев Тигран Владимирович
  • Мостова Елизавета Борисовна
  • Перковская Наталья Игоревна
  • Выборная Татьяна Владимировна
  • Соболевская Татьяна Ивановна
  • Синеокий Сергей Павлович
RU2539744C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОДИЗЕЛЬНОГО ТОПЛИВА 2016
  • Альмяшева Наиля Рафиковна
  • Жигалова Лариса Викторовна
  • Савельева Елена Викторовна
  • Копицын Дмитрий Сергеевич
  • Котелев Михаил Сергеевич
  • Новиков Андрей Александрович
  • Гущин Павел Александрович
  • Иванов Евгений Владимирович
  • Винокуров Владимир Арнольдович
RU2665041C2
БИОСЕНСОР ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ 2,4,6-ТРИНИТРОТОЛУОЛА 2010
  • Хиляс Ирина Валерьевна
  • Зиганшин Айрат Мансурович
  • Наумова Римма Павловна
RU2437930C1

Реферат патента 2016 года ШТАММ ДРОЖЖЕЙ Candida parapsilosis - ПРОДУЦЕНТ ЛИПАЗЫ

Изобретение относится к биотехнологии. Штамм дрожжей Candida parapsilosis M10, обладающий высокой липолитической активностью, депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под регистрационным номером Y-4055 и может быть использован для получения ферментного препарата липазы. Изобретение позволяет получить штамм с повышенной липолитической активностью. 2 пр.

Формула изобретения RU 2 575 804 C1

Штамм дрожжей Candida parapsilosis, регистрационный номер во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов Y-4055, характеризующийся способностью синтезировать липазу.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2016 года RU2575804C1

ШТАММ ДРОЖЖЕЙ Yarrowia lipolytica - ПРОДУЦЕНТ КЛЕТОЧНО-СВЯЗАННОЙ ЛИПАЗЫ 2012
  • Юзбашева Евгения Юрьевна
  • Юзбашев Тигран Владимирович
  • Гордеева Татьяна Леонидовна
  • Лаптев Иван Александрович
  • Выборная Татьяна Владимировна
  • Синеокий Сергей Павлович
RU2475532C1
ШТАММ ДРОЖЖЕЙ Yarrowia lipolytica - ПРОДУЦЕНТ ЛИПАЗЫ 2007
  • Синеокий Сергей Павлович
  • Юзбашев Тигран Владимирович
  • Лаптев Иван Александрович
  • Юзбашева Евгения Юрьевна
  • Выборная Татьяна Владимировна
  • Соболевская Татьяна Ивановна
RU2355754C1
ШТАММ БАКТЕРИЙ SERRATIA MARCESCENS-ПРОДУЦЕНТ ЛИПАЗЫ 1997
  • Дужак А.Б.
  • Панфилова З.И.
  • Салганик Р.И.
RU2148645C1
Штамм гриба RнIZорUS сонNII BeRL eF De ToNI - продуцент липазы с каталазной активностью 1990
  • Билай Тарас Иванович
  • Айзенберг Виктория Леонидовна
  • Захарченко Валентина Алексеевна
  • Капичон Анна Павловна
  • Вьюницкая Валентина Алексеевна
  • Церетели Мака Эмильевна
  • Долидзе Джамая Аквсентьевич
  • Квеситадзе Георгий Иванович
  • Мысак Анатолий Евтихиевич
  • Шинкаренко Любовь Николаевна
  • Зингер Генриетта Ефимовна
  • Ющенко Владимир Александрович
  • Бовика Леонид Иванович
  • Корчун Людмила Леонидовна
SU1726513A1

RU 2 575 804 C1

Авторы

Иванова Людмила Афанасьевна

Гаскарова Елена Фидаевна

Даты

2016-02-20Публикация

2014-09-24Подача