ШТАММ BACILLUS LICHENIFORMIS ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ГИСТИДИНДЕКАРБОКСИЛАЗЫ Российский патент 2013 года по МПК C12N9/88 C12N1/20 C12R1/10 

Изобретение относится к биотехнологии и микробиологии и может быть использовано с целью получения ферментного препарата гистидиндекарбоксилазы.

Известен штамм Klebsiella pneumonia (Taylor S.L., Guthertz L.S., Leatherwood M., Lieber E.R. Histamine production by Klebsiella pneumonia and incident of scombroid fish poisoning. Appl. Environ. Microbiol. 37: 274, 1979), обладающий гистидиндекарбоксилазной активностью.

Указанный микроорганизм условно-патогенен, что затрудняет его использование в качестве продуцента в биотехнологии гистидиндекарбоксилазы. К недостаткам работы следует также отнести отсутствие способа выделения и очистки ферментного препарата.

Известен штамм Proteus morganii (Sakabe Y. Studies on allergylike food poisoning. 1. Histamine production by Proteus Morganii. J. Nara Med. Assn. 24: 248, 1973), способный синтезировать гистидиндекарбоксилазу.

Недостатком работы является условная патогенность штамма, не позволяющая использовать его для масштабирования с целью получения гистидиндекарбоксилазы.

Известен штамм Hafnia alvei (Hawelka В. Role of the Hafnia bacteria in the rise of histamine in tuna fish meat. Cesk. Hyg. 12: 343, 1967.) с выраженной гистидиндекарбоксилазной активностью.

Недостаток работы состоит в условной патогенности продуцента.

Известны штаммы рода Lactobacillus (Bibb W.R., Straughn W.R. Studies on the amoni acid decarboxylases of oral Lactobacilli. Department of Bacteriology and Immunology, School of Medicine; Rodwell A.W. The occurrence and Distribution of amino-acid decarboxylases within the genus Lactobacillus. J.gen. Microbiol. 8, 224-232, 1953), выделенные со слизистых оболочек человека и животных, обладающие гистидиндекарбоксилазной активностью. В работах проведены исследования по выращиванию культур на питательных средах различного состава с добавлением индукторов и оценено их влияние на количество образующегося углекислого газа.

К недостаткам исследований следует отнести отсутствие прикладной составляющей: нет данных о потенциальной разработке технологии ферментного препарата.

Известны штаммы Escherichia coli, Salmonella schottmuelleri, Salmonella enteriditis. Salmonella aertrycke, Eberthella typhi, Shigella desenteriae, Shigella paradesenteriae, Shigella alkalescens, Aerobacter aerogenes, Clostridium welchii (Eggerth A.H. The production of histamine in bacterial cultures. Department of Bacteriology. 1938), способные к синтезу гистидиндекарбоксилазы. В работе исследована зависимость количества образующегося гистамина, продукта катализируемой реакции, от состава питательной среды и условий культивирования продуцента.

Недостатком исследования является патогенность и условная патогенность штаммов-продуцентов, не позволяющая использовать их в биотехнологии ферментного препарата.

Наиболее близким аналогом к заявляемому изобретению является штамм Micrococcus sp.n., выделенный из бактериальной флоры кишечника крыс (Семина Л.А., Мардашев С.Р. Очистка и кристаллизация микробной гистидиндекарбоксилазы. - Биохимия, 1965, т.30, №1, с.100-106). В работе изложена схема получения ферментного препарата.

К недостаткам исследования следует отнести экономически неэффективную схему выделения и очистки ферментного препарата.

Задачей заявленного изобретения является получение нового штамма, обладающего высокой гистидиндекарбоксилазной активностью.

Технический результат заявленного изобретения - улучшение биотехнологии гистидиндекарбоксилазы, повышение рентабельности за счет использования нового штамма.

Технический результат достигается за счет применения нового штамма Bacillus licheniformis КЛ13, выделенного из образца почвы Московской области. Критериями отбора служили изменение цвета индикатора в составе селективной питательной среды (триптон - 5 г/дм³; дрожжевой экстракт - 5 г/дм³; L - гистидин моногидрохлорид - 27 г/дм³; NaCl - 5 г/дм³; CaCO₃ - 1 г/дм³; бромкрезол пурпурный - 0,06 г/дм³; бактериальный агар - 20 г/дм³) и количество накапливаемого гистамина в фильтрате культуральной жидкости по истечении генерации.

Предлагаемый штамм депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) ФГУПГосНИИГенетика (г.Москва, 1-й Дорожный проезд, 1). Регистрационный номер ВКПМ: В-11185.

Штамм Bacillus licheniformis КЛ13 характеризуется следующими признаками.

Принадлежность штамма Bacillus licheniformis КЛ13 к указанному виду была выявлена на основе генетического анализа секвенсов вариабельных участков 16S pРНК. Гомология составила 99%.

Морфология клетки.

Клетки культуры грамположительные, имеют палочковидную форму, подвижны. Средний размер вегетативных клеток 0,4×1,6 мкм. Образуют эндоспоры. Спорообразование в основном центральное, споры не расширяют материнскую клетку.

Культуральные признаки Bacillus licheniformis КЛ13.

На поверхности плотных питательных сред типа ГРМ-агар Bacillus licheniformis КЛ13 образует колонии, имеющие следующие признаки:

- форма - неправильная;

- размер (диаметр) - от 1 до 7 мм;

- поверхность - шероховатая, морщинистая;

- профиль - плоский, врастающий в субстрат;

- блеск и прозрачность - колония матовая, непрозрачная;

- цвет - бело-желтый;

- край - изрезанный, складчатый;

- структура - крупнозернистая;

- консистенция - колонии врастающие в агар.

Особенности роста по штриху Bacillus licheniformis КЛ13: штрих умеренный, ризоидный, поверхность шероховатая, матовая, бело-желтого цвета.

Особенности роста на жидкой среде типа ГРМ-бульон Bacillus licheniformis КЛ13: помутнение отсутствует, пленка - плотная, складчатая, пигментации среды нет, выделения газа нет, запах - характерный бактериальный.

Физиолого-биохимические признаки Bacillus licheniformis КЛ13. 1. Особенности потребления Bacillus licheniformis КЛ13 различных соединений углерода:

- арабиноза - слабое потребление, выделения газа нет;

- галактоза - рост есть, выделения газа нет;

- глюкоза - рост есть, выделения газа нет;

- дульцит - роста нет;

- инозит - слабое потребление, выделения газа нет;

- лактоза - роста нет;

- мальтоза - рост есть, выделения газа нет;

- манноза - рост есть, выделения газа нет;

- рамноза - роста нет;

- сахароза - роста нет;

- свекловичный пектин - роста нет;

- сорбит - роста нет;

- сорбоза - слабое потребление, выделения газа нет;

- фруктоза - рост есть, выделения газа нет.

2. Реакция Фогес-Проскауэра - положительная, происходит образование ацетилметилкарбинола.

3. Способность Bacillus licheniformis КЛ13 образовывать аммиак при выращивании на пептонной воде обнаружена, происходит интенсивное окрашивание культуральной жидкости в желтый цвет при воздействии реактивом Несслера.

4. Способность Bacillus licheniformis КЛ13 продуцировать H₂S была выявлена по истечении 96 ч роста.

5. В результате культивирования Bacillus licheniformis КЛ13 образование индола выявлено не было.

6. В результате культивирования Bacillus licheniformis КЛ13 выявлено слабое потребление мочевины в качестве основного источника азота.

7. Способность Bacillus licheniformis КЛ13 использовать азот минеральных солей обнаружена.

8. Способность Bacillus licheniformis КЛ13 использовать молекулярный азот не обнаружена.

9. Отношение к молекулярному кислороду Bacillus licheniformis КЛ13: факультативный анаэроб, способности к денитрификации и восстановлению нитратов до нитритов (по реакции с реактивом Грисса) обнаружены.

10. Чувствительность Bacillus licheniformis КЛ13 к антибиотическим веществам:

- амикацин - высокая чувствительность;

- бензилпенициллин - не чувствителен;

- клиндамицин - средняя чувствительность;

- линкомицин - слабая чувствительность;

- неомицин - средняя чувствительность;

- стрептомицин - средняя чувствительность;

- цефалексин - высокая чувствительность;

- цефотаксим - средняя чувствительность;

- ципрофлоксацин - высокая чувствительность;

- эритромицин - не чувствителен.

11. Отношение Bacillus licheniformis КЛ13 к концентрации хлористого натрия в питательной среде: на средах с добавлением NaCl (5%, 7%, 10%) наблюдался интенсивный рост культуры.

18. Отношение Bacillus licheniformis КЛ13 к pH среды: рост культуры не выявлен только в сильно кислой области pH (до 1,9).

19. Отношение Bacillus licheniformis КЛ13 к температуре культивирования:

- при 20°C - слабый рост;;

- при 25°C - обильный рост;

- при 30°C - обильный рост;

- при 37°C - обильный рост;

- при 50°C - слабый рост.

Условия и состав среды для длительного хранения штамма: агаризованная питательная среда состава ГРМ-агар с добавление гистидина - 5-10 мкг/см³, ионов Mg²⁺ - 0,03-0,08%, t 4-6°C. Пересевы на свежие среды - один раз в месяц.

Условия и состав среды для размножения штамма: скошенная агаризованная питательная среда состава ГРМ-агар с добавлением гистидина 5-10 мкг/см³, ионов Mg²⁺ - 0,03-0,08%, температура инкубирования 35-37°C, длительность инкубирования 24-72 ч.

Активность ферментного препарата гистидиндекарбоксилазы Г10Х, полученного на основе культивирования предлагаемого штамма достигает 600-700 ед/г.

Примеры осуществления изобретения.

Пример 1.

Культивирование штамма Bacillus licheniformis КЛ13 в следующих условиях позволяет достичь в фильтрате КЖ активности фермента 14-16 ед/см³: питательная среда - ГРМ-бульон с добавлением гистидина 8-10 мкг/мл и ионов Mg²⁺ 0,03-0,08%, pH 7,0, возраст посевного материала - 36-48 ч, посевная доза - 10⁶-10⁸ кл, длительность культивирования - 72-96 ч. Осаждение фермента гистидиндекарбоксилазы из фугата культуральной жидкости Bacillus licheniformis КЛ13 изопропанолом в соотношении 4:1-5:1 и pH 8,0-9,0, позволяет получить ферментный препарат с активностью гистидиндекарбоксилазы 600,0-700,0 ед/г.

Изобретение относится к биотехнологии и молочной промышленности. Штамм Bacillus licheniformis КЛ-13, обладающий высокой гистидиндекарбоксилазной активностью депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) под регистрационным номером ВКПМ В-11185 и может быть использован при получении ферментативного препарата гистидиндекарбоксилазы. Изобретение позволяет получать штамм, обладающий высокой гистидиндекарбоксилазной активностью. 1 пр.

Штамм бактерии Bacillus licheniformis, регистрационный номер во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов В-11185, характеризующийся способностью синтезировать гистидиндекарбоксилазу.