ШТАММ БАКТЕРИЙ Enterococcus faecium, ОБЛАДАЮЩИЙ СПОСОБНОСТЬЮ СНИЖАТЬ ОБРАЗОВАНИЕ БИОПЛЕНОК ГРИБАМИ РОДА Candida Российский патент 2016 года по МПК C12N1/20 C12R1/01 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в микробиологической промышленности для получения пробиотического препарата, обладающего способностью снижать образование биопленок грибами рода Candida.

Аналогов изобретения в патентной и научно-технической литературе не обнаружено.

Технический результат, на достижение которого направлено изобретение, заключается в получении нового бактериального штамма, обеспечивающего эффективное снижение способности образовывать биопленки грибами рода Candida.

Указанный технический результат достигнут получением нового штамма бактерий Enterococcus faecium 18.

Штамм Enterococcus faecium 18 выделен с использованием классических бактериологических методов из содержимого толстого кишечника здорового человека в 2014 году в лаборатории кафедры микробиологии и заразных болезней ФГБОУ ВПО «Оренбургский государственный аграрный университет».

Полученный штамм Enterococcus faecium 18 депонирован в Государственной коллекции микроорганизмов нормальной микрофлоры ФГУН «МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора». Коллекционный номер - №1252.

Штамм Enterococcus faecium 18 характеризуется следующими культурально-морфологическими и физиолого-биохимическими признаками.

Культурально-морфологические признаки

Овоидные (яйцевидные) неподвижные клетки, несколько вытянутые в длину, расположены попарно. Размер клеток 1,25×1,59 мкм. Окраска по Граму - положительная. Спор не образуют.

На желчно-эскулиновом агаре с азидом натрия (37°С, 24 ч) образует мелкие (точечные), 0,5-1 мм в диаметре, сероватого цвета (полупрозрачные), окруженные черным ореолом, округлые, выпуклые колонии с гомогенной внутренней структурой, S-форма. Рост обильный.

В Schaedler-бульоне (37°С, 24 ч) дает обильный рост, придонный осадок, который гомогенизируется при встряхивании.

На Schaedler-агаре (37°С, 24 ч) дает обильный рост с характерным молочнокислым запахом, колонии мелкие (1-2 мм), округлые, выпуклые, блестящие, гладкие, край колонии ровный.

На молочно-ингибиторной среде по Г.П. Калине (37°С, 24 ч) формирует мелкие (1-2 мм), серого цвета, с металлическим (стальным) блеском, округлые колонии. Края колонии ровные, поверхность выпуклая, влажная, блестящая. Рост обильный.

Физиолого-биохимические признаки

Факультативный анаэроб, оптимальные условия для культивирования - атмосферные. Температура культивирования - 37°С. На питательных средах вырастает в течение 18-24 часов.

Хемоорганотроф, метаболизм бродильного типа. Штамм осуществляет гомоферментативное молочнокислое брожение. Каталазу не продуцирует, желатину не разжижает. Ферментирует D-рибозу, D-рафинозу, лактозу, салицин, N-ацетил-D-глюкозамин, D-маннозу, сахарозу, D-мальтозу, метил-В-D-глюкопиранозид, D-трегалозу, D-галактозу. Продуцирует ферменты: L-аспартат-ариламидазу, аргининдигидролазу 1, альфа-галактозидазу, бета-галактозидазу, L-пирролидонил-ариламидазу, аргининдигидролазу 2.

Штамм желатиназу не продуцирует, продуцирует аминокислоту аргинин, ферментирует сорбозу, арабинозу, маннитол, мелибиозу.

Штамм Enterococcus faecium 18 идентифицирован с использованием полимеразной цепной реакции по видоспецифическому гену, кодирующему синтез супероксиддисмутазы (Jackson C.R., Fedorka-Cray P.J., Barrett J.B. Use of a genus- and species-specific multiplex PCR for identification of enterococci. J. Clin. Microbiol. 2004. 42(8): 3558-3565), как штамм вида Enterococcus faecium.

Генетические особенности штамма: методом ПЦР установлено, что в геноме штамма отсутствуют генетические детерминанты, кодирующие синтез факторов вирулентности: цитолизинов (cylM, cylB, cylA, cylLs); ген, обуславливающий протеолитическую активность (GelE); ген, ответственный за продукцию гиалуронидазы (Hyl); ген, кодирующий белки клеточной стенки (ESP); ген, отвечающий за синтез поверхностного белка-адгезина (ASA).

Штамм устойчив к ванкомицину, тейкопланину, гентамицину и имеет гены устойчивости к ванкомицину и тейкопланину (Van A, Van C1, Van С2-3).

Условия и состав среды для размножения: на Schaedler-агаре при 37°С (рН 7,2-7,6), в Schaedler-бульоне при 37°С в течение 18-24 часов.

Условия хранения: лиофильно высушенная культура при температуре 4±2°С в защищенном от прямых солнечных лучей месте при относительной влажности воздуха не более 60% в течение 2-х лет или культура, выращенная в течение суток при 37°С в полужидкой среде СТА, в условиях бытового холодильника при температуре 4±2°С в течение 6 месяцев.

Способность штамма Enterococcus faecium 18 снижать образование биопленок грибами рода Candida определяется по степени связывания грибами рода Candida красителя «кристаллический фиолетовый» в стерильных 96-луночных полистироловых планшетах (O′Toole G., Kaplan Н.В., Kolter R. Biofilm formation as microbial development. Annu. Rev. Microbiol. 2000, 54: 49-79) с помощью фотометра Stat Fax 2100 («Awareness Technology», США) после их совместного культивирования (Ермоленко Е.И., Ждан-Пушкина С.Х., Суворов А.Н. Взаимодействие Candida albicans и Lactobacillus plantarum in vitro. Проблемы медицинской микологии. 2004, т. 6, №2: 49-54). Уровень способности к образованию биопленок грибами рода Candida рассчитывается как отношение опыт/контроль и выражается в условных единицах (Валышев А.В., Валышева И.В., Гейде И.В. Образование биопленок фекальными штаммами энтеробактерий и дрожжевых грибов рода Candida. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2009, №4: С.44-46).

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1.

Изучали влияние штамма Enterococcus faecium 18, выделенного из кишечника здорового человека, на способность грибов рода Candida образовывать биопленки при совместном культивировании в жидкой питательной среде (Schaedler-бульон «Hi Media», Индия).

Готовили взвеси суточных агаровых культур 5 видов грибов: С. albicans (n=6), С. glabrata (n=6), С. tropicalis (n=6), С. kefyr (n=6), С. krusei (n=6) и штамма Enterococcus faecium 18 (мутность 2 по шкале Мак Фарланда).

Затем готовили 30 пробирок (5 видов грибов по 6 штаммов), в каждую вносили 5 мл Schaedler-бульона, 0,05 мл взвеси штамма Enterococcus faecium 18 и добавляли 0,05 мл взвеси исследуемого штамма гриба рода Candida (опытные пробы).

В 30 контрольных пробирок вносили только по 5 мл Schaedler-бульона и по 0,05 мл взвеси исследуемого штамма гриба рода Candida.

Опытные и контрольные пробы инкубировали при 37°С в микроаэрофильных условиях в течение 24 часов.

После инкубирования культуры грибов рода Candida из опытных и контрольных пробирок в объеме 0,01 мл высевали на среду Сабуро, посевы инкубировали при 37°С 24 часа, затем из выросших колоний грибов рода Candida готовили взвесь и определяли их способность образовывать биопленки по степени связывания ими красителя «кристаллический фиолетовый» в стерильных 96-луночных полистироловых планшетах с помощью фотометра Stat Fax 2100 («Awareness Technology», США).

Уровень признака выражали в условных единицах.

Результаты исследований приведены в таблице 1.

Как видно из таблицы 1, средний уровень признака в контроле составляет у С. albicans 3,5±0,01, у non-albicans видов (С. glabrata, С. tropicalis, С. kefyr, С. krusei) 3,7±0,02, 2,9±0,02, 2,9±0,02, 2,8±0,02, соответственно.

В опытных пробах, после совместного культивирования грибов с Enterococcus faecium 18 уровень способности к образованию биопленок у всех исследуемых видов грибов рода Candida существенно снижался (в 2,1-3,7 раза).

Пример 2.

Аналогично примеру 1 проводили эксперименты по определению у разных видов грибов рода Candida уровня способности образовывать биопленки при культивировании с заявляемым штаммом Enterococcus faecium 18 и дикими штаммами Enterococcus faecium, выделенными из кишечного биотопа.

Результаты исследований приведены в таблице 2.

Как видно из таблицы 2, после совместного культивирования грибов рода Candida с Enterococcus faecium 18 уровень способности образовывать биопленки составил - у С. albicans 1,7±0,01; С. glabrata 1,0±0,01; С. tropicalis 0,95±0,01; С. kefyr 1,2±0,01; С. krusei 1,05±0,01, а после сокультивирования с дикими штаммами Enterococcus faecium уровень признака составил - у С. albicans от 1,9±0,01 до 3,5±0,01; С. glabrata от 1,2±0,01 до 2,0±0,01 С. tropicalis от 1,1±0,01 до 2,4±0,01 С. kefyr от 1,4±0,01 до 2,2±0,01 С. krusei от 1,1±0,01 до 2,1±0,01, что свидетельствует о высокой способности заявляемого штамма Enterococcus faecium 18 снижать образование биопленок у грибов рода Candida по сравнению с изученными дикими штаммами Enterococcus faecium.

Таким образом, заявляемый штамм Enterococcus faecium 18 отличается высокой способностью снижать образование биопленок грибами рода Candida и может быть использован в производстве пробиотических препаратов, оказывающих профилактическое и лечебное действие при дисбиозах кишечника.

Изобретение относится к биотехнологии. Штамм бактерий Enterococcus faecium 18 депонирован в Государственной коллекции микроорганизмов нормальной микрофлоры ФБУН «МНИИЭМ им Г.Н. Габричевского» Роспотребнадзора под коллекционным номером 1252. Штамм обладает способностью снижать образование биопленок грибами рода Candida и может быть использован для приготовления пробиотического препарата. 2 табл., 2 пр.

Штамм бактерий Enterococcus faecium, обладающий способностью снижать образование биопленок грибами рода Candida, депонированный в Государственной коллекции микроорганизмов нормальной микрофлоры ФБУН «МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора», под коллекционным номером 1252.