Штамм бактерий Enterococcus faecium, обладающий антагонистической активностью в отношении бактерий вида E. coli, родов Enterococcus и Listeria Российский патент 2020 года по МПК C12N1/20 A61K35/744 A61P31/04 C12R1/01 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в производстве пробиотических препаратов, оказывающих антагонистическое влияние на бактерии вида Е. coli, родов Enterococcus и Listeria, вызывающих заболевания у сельскохозяйственных животных.

Аналогом изобретения является известный штамм бактерий Enterococcus faecium 1251, характеризующийся антагонистической активностью в отношении бактерий рода Listeria и вида Enterococcus faecalis (Сычева М.В., Карташова О.Л., Щепитова Н.Е. Штамм бактерий Enterococcus faecium, обладающий антагонистической активностью в отношении бактерий рода Listeria и вида Enterococcus faecalis. Патент РФ №2571852).

Однако данный штамм обладает узким спектром антагонистической активности - только в отношении бактерий рода Listeria и вида Enterococcus faecalis.

Технический результат, на достижение которого направлено изобретение, заключается в получении бактериального штамма Enterococcus faecium, обладающего антагонистической активностью в отношении широкого спектра микроорганизмов: бактерий вида Е. coli, родов Enterococcus и Listeria.

Указанный технический результат достигнут тем, что получен новый штамм Enterococcus faecium.

Новый штамм Enterococcus faecium выделен с использованием классических бактериологических методов из содержимого толстого отдела кишечника здоровой лошади в 2017 году в лаборатории кафедры микробиологии и заразных болезней ФГБОУ ВО «Оренбургский государственный аграрный университет».

Полученный штамм Enterococcus faecium депонирован в Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения ОСХН РАН, под регистрационным номером - RCAM05160.

Заявляемый штамм Enterococcus faecium RCAM05160 характеризуется следующими культурально-морфологическими и физиолого-биохимическими признаками.

Культурально-морфологические признаки.

Овоидные (яйцевидные) неподвижные клетки несколько вытянутые в длину, расположены попарно. Размер клеток 1,25×1,59 мкм. Окраска по Граму - положительная. Спор не образуют.

На желчно-эскулиновом агаре с азидом натрия образует мелкие (точечные), 0,5-1 мм в диаметре, сероватого цвета (полупрозрачные), окруженные черным ореолом, округлые, выпуклые колонии с гомогенной внутренней структурой, S-форма. Рост обильный.

На Schaedler-бульоне дает обильный рост, придонный осадок, который гомогенизируется при встряхивании.

Физиолого-биохимические признаки.

Факультативный анаэроб, оптимальные условия для культивирования - атмосферные. Температура культивирования - 37°С. Способен к росту при 45°С. Может расти на средах с содержанием 6,5% NaCl. На средах вырастает в течение 18-24 часов.

Штамм гомоферментативен. Каталазу не продуцирует, желатину не разжижает; ферментирует арабинозу, сорбозу, мелибиозу. Не ферментирует маннитол, сорбитол, рафинозу, мелезитозу. Продуцирует ферменты: L-аспартат-ариламидазу, аргининдигидролазу 1, альфа-галактозидазу, бета-галактозидазу, L-пирролидонил-ариламидазу, аргининдигидролазу 2.

Условия и состав среды для размножения: на Schaedler-агаре при 37°С (рН 7,2-7,6), в Schaedler-бульоне при 37°С в течении 18-24 часов.

Диапазон значений рН среды, при котором растет штамм Enterococcus faecium RCAM05160, составляет 4,5-10, рН-оптимум роста штамма - 7,5.

Генетические особенности штамма: методом полногеномного секвенирования в геноме бактерии идентифицированы гены, ответственные за синтез витаминов (биотин, рибофлавин, пиридоксин) и пять генетических детерминант бактериоциногении (entA, entB, entL50A/B, лактобин А/цереин 7b). В структуре генома с помощью сервера RAST (rapid annotation using Subsistem technology) не обнаружены гены, кодирующие синтез известных факторов вирулентности (Overbeek R. et al. The SEED and the Rapid Annotation of microbial genomes using Subsystems Technology (RAST). Nucleic. Acids Res. 2014. 42: D206-D214).

Геномная последовательность штамма E. faecium RCAM05160 депонирована в базе данных NCBI BioProject (геномный проект ID:PRJNA224116) (Pashkova Т.М. et al. Genome Sequence of Enterococcus faecium Strain ICIS 96 Demonstrating Intermicrobial Antagonism Associated with Bacteriocin Production. Genome Announcements. 2018. 6(10)).

Условия хранения: криоконсервация культуры Е. faecium RCAM05160 с использованием автоматизированного хранилища на -80°С в течение 5 лет или культура, выращенная в течение суток при 37°С в полужидкой среде СТА, в условиях бытового холодильника при температуре 4±2°С в течение 1 года.

Штамм Е. faecium RCAM05160 идентифицирован с использованием метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) по видоспецифическому гену, кодирующему синтез супероксиддисмутазы (Jackson C.R., Fedorka-Cray P.J., Barrett J.B. Use of a genus- and species-specific multiplex PCR for identification of enterococci. J. Clin. Microbiol. 2004. 42(8): 3558-3565), как штамм вида Enterococcus faecium.

Антагонистическая активность.

Исследование антагонистической активности штамма Е. faecium RCAM05160 проводили чашечным методом (принцип отсроченного антагонизма) на плотной среде - Schaedler агар (Кудлай М.Г., Лиходед В.Г. Бактериоциногения. Л.: «Медицина». 1966: 15-24) на тест-штаммах Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, K. oxytoca, Enterobacter cloacae, Morganella morganii, Candida albicans, C. krusei, С. kefir, С. pelliculosae, Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, в том числе на ванкомицинрезистентном штамме, Listeria monocytogenes, L. ivanovii, L. inocua, L. seligeri, Pseudomonas aeruginosa, Providencia rettgeri.

Результаты исследований приведены в таблице 1.

Как видно из таблицы 1, антагонистическая активность Е. faecium RCAM05160 установлена в отношении Escherichia coli, Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, в том числе в отношении ванкомицинрезистентной культуры, Listeria monocytogenes, L. ivanovii, L. inocua и не выявлена в отношении Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, K. oxytoca, Enterobacter cloacae, Morganella morganii, Candida albicans, С. krusei, C. kefir, C. pelliculosae, Pseudomonas aeruginosa, Providencia rettgeri. Степень антагонизма выражается коэффициентом антагонистической активности и определяется по следующим критериям: 2 и менее - низкая, 2-5 - средняя, 5 и более - высокая.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1.

Суточную культуру штамма Е. faecium RCAM05160 засевали уколом в питательный Schaedler-агар. После инкубации при температуре 37°С в течение 24 часов выросшую культуру инактивировали парами хлороформа в течение одного часа. Затем чашку просушивали 30 мин на воздухе и на поверхность агара наслаивали второй слой (4-5 мл) расплавленного и остуженного до 50°С 0,7% Schaedler-агара, смешанного с 0,1 мл тестируемых культур - Escherichia coli, Е. faecium, Е. faecalis, в том числе штамм, устойчивый к ванкомицину, Listeria monocytogenes, L. ivanovii, L. innocua (их мутность составляет 2 по шкале МакФарланда).

Через 24 ч инкубации при температуре 37°С проводили учет результатов: для этого с помощью линейки и циркуля измеряли диаметр зон задержки роста тестируемой культуры (d₁) и диаметр роста штамма-продуцента (d₂). По отношению зоны задержки роста тестируемой культуры к зоне роста штамма-продуцента антагонистически активных субстанций вычисляли коэффициент его антагонистической активности (КА).

Результаты исследований приведены в таблице 2.

Коэффициент антагонистической активности Е. faecium RCAM05160 в отношении Escherichia coli составляет от 7,3 до 9,0; Enterococcus faecalis от 6,0 до 6,7; Enterococcus faecium - от 6,3 до 6,5; Listeria monocytogenes - 6,0; также штамм проявляет антагонистическую активность в отношении других видов рода Listeria: L. ivanovii - 7,7, L. innocua - 6,0.

Пример 2.

Аналогично примеру 1 проводили эксперименты по определению коэффициента антагонистической активности (КА) у Е. faecium RCAM05160 и диких штаммов Enterococcus faecium, выделенных из кишечного биотопа по отношению к тест-штаммам (таблица 3).

Авторами экспериментально установлено, что коэффициент антагонистической активности (КА) у Enterococcus faecium RCAM05160 в отношении Escherichia coli составляет 8,4; Enterococcus faecalis - 6,0; ванкомицинрезистентного Enterococcus faecalis - 6,7; Enterococcus faecium - 6,4; Listeria monocytogenes - 6,1; L. ivanovii - 7,7, L. innocua - 6,0.

Тогда как коэффициент антагонистической активности диких штаммов Enterococcus faecium составлял: в отношении Е. faecalis от 1,4 до 2,1; ванкомицинрезистентного Е. faecalis от 1,7 до 2,8; Е. faecium от 1,3 до 2,5; L. monocytogenes от 1,4 до 3,6; L. innocua от 0 до 2,9, L. ivanovii от 0 до 3,2, дикие штаммы Е. faecium не обладали антагонистической активностью в отношении E.coli, что свидетельствует о высокой антагонистической активности заявляемого штамма Enterococcus faecium RCAM05160 в отношении E.coli, бактерий рода Listeria и Enterococcus по сравнению с изученными дикими штаммами Enterococcus faecium.

Таким образом, заявляемый штамм Enterococcus faecium RCAM05160 отличается высокой антагонистической активностью в отношении бактерий вида Е. coli, родов Enterococcus и Listeria и может быть использован в производстве биопрепаратов пробиотической направленности, оказывающих антагонистическое влияние на бактерии вида Е. coli, родов Enterococcus и Listeria, вызывающих заболевания у сельскохозяйственных животных.

Изобретение относится к биотехнологии. Штамм бактерий Enterococcus faecium, обладающий антагонистической активностью в отношении бактерий вида Е. coli, родов Enterococcus и Listeria, депонирован в Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения ОСХН РАН под регистрационным номером RCAM05160. Изобретение обеспечивает повышение антагонистической активности бактерий Enterococcus faecium в отношении широкого спектра микроорганизмов, вызывающих заболевания у сельскохозяйственных животных. 3табл., 2 пр.

Штамм бактерий Enterococcus faecium, обладающий антагонистической активностью в отношении бактерий вида Е. coli, родов Enterococcus и Listeria, депонированный в Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения ОСХН РАН под регистрационным номером RCAM05160.