Штамм бактерий Enterococcus faecium, обладающий антагонистической активностью в отношении бактерий вида E. coli, родов Enterococcus и Listeria Российский патент 2020 года по МПК C12N1/20 A61K35/744 A61P31/04 C12R1/01 

Описание патента на изобретение RU2739427C1

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в производстве пробиотических препаратов, оказывающих антагонистическое влияние на бактерии вида Е. coli, родов Enterococcus и Listeria, вызывающих заболевания у сельскохозяйственных животных.

Аналогом изобретения является известный штамм бактерий Enterococcus faecium 1251, характеризующийся антагонистической активностью в отношении бактерий рода Listeria и вида Enterococcus faecalis (Сычева М.В., Карташова О.Л., Щепитова Н.Е. Штамм бактерий Enterococcus faecium, обладающий антагонистической активностью в отношении бактерий рода Listeria и вида Enterococcus faecalis. Патент РФ №2571852).

Однако данный штамм обладает узким спектром антагонистической активности - только в отношении бактерий рода Listeria и вида Enterococcus faecalis.

Технический результат, на достижение которого направлено изобретение, заключается в получении бактериального штамма Enterococcus faecium, обладающего антагонистической активностью в отношении широкого спектра микроорганизмов: бактерий вида Е. coli, родов Enterococcus и Listeria.

Указанный технический результат достигнут тем, что получен новый штамм Enterococcus faecium.

Новый штамм Enterococcus faecium выделен с использованием классических бактериологических методов из содержимого толстого отдела кишечника здоровой лошади в 2017 году в лаборатории кафедры микробиологии и заразных болезней ФГБОУ ВО «Оренбургский государственный аграрный университет».

Полученный штамм Enterococcus faecium депонирован в Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения ОСХН РАН, под регистрационным номером - RCAM05160.

Заявляемый штамм Enterococcus faecium RCAM05160 характеризуется следующими культурально-морфологическими и физиолого-биохимическими признаками.

Культурально-морфологические признаки.

Овоидные (яйцевидные) неподвижные клетки несколько вытянутые в длину, расположены попарно. Размер клеток 1,25×1,59 мкм. Окраска по Граму - положительная. Спор не образуют.

На желчно-эскулиновом агаре с азидом натрия образует мелкие (точечные), 0,5-1 мм в диаметре, сероватого цвета (полупрозрачные), окруженные черным ореолом, округлые, выпуклые колонии с гомогенной внутренней структурой, S-форма. Рост обильный.

На Schaedler-бульоне дает обильный рост, придонный осадок, который гомогенизируется при встряхивании.

Физиолого-биохимические признаки.

Факультативный анаэроб, оптимальные условия для культивирования - атмосферные. Температура культивирования - 37°С. Способен к росту при 45°С. Может расти на средах с содержанием 6,5% NaCl. На средах вырастает в течение 18-24 часов.

Штамм гомоферментативен. Каталазу не продуцирует, желатину не разжижает; ферментирует арабинозу, сорбозу, мелибиозу. Не ферментирует маннитол, сорбитол, рафинозу, мелезитозу. Продуцирует ферменты: L-аспартат-ариламидазу, аргининдигидролазу 1, альфа-галактозидазу, бета-галактозидазу, L-пирролидонил-ариламидазу, аргининдигидролазу 2.

Условия и состав среды для размножения: на Schaedler-агаре при 37°С (рН 7,2-7,6), в Schaedler-бульоне при 37°С в течении 18-24 часов.

Диапазон значений рН среды, при котором растет штамм Enterococcus faecium RCAM05160, составляет 4,5-10, рН-оптимум роста штамма - 7,5.

Генетические особенности штамма: методом полногеномного секвенирования в геноме бактерии идентифицированы гены, ответственные за синтез витаминов (биотин, рибофлавин, пиридоксин) и пять генетических детерминант бактериоциногении (entA, entB, entL50A/B, лактобин А/цереин 7b). В структуре генома с помощью сервера RAST (rapid annotation using Subsistem technology) не обнаружены гены, кодирующие синтез известных факторов вирулентности (Overbeek R. et al. The SEED and the Rapid Annotation of microbial genomes using Subsystems Technology (RAST). Nucleic. Acids Res. 2014. 42: D206-D214).

Геномная последовательность штамма E. faecium RCAM05160 депонирована в базе данных NCBI BioProject (геномный проект ID:PRJNA224116) (Pashkova Т.М. et al. Genome Sequence of Enterococcus faecium Strain ICIS 96 Demonstrating Intermicrobial Antagonism Associated with Bacteriocin Production. Genome Announcements. 2018. 6(10)).

Условия хранения: криоконсервация культуры Е. faecium RCAM05160 с использованием автоматизированного хранилища на -80°С в течение 5 лет или культура, выращенная в течение суток при 37°С в полужидкой среде СТА, в условиях бытового холодильника при температуре 4±2°С в течение 1 года.

Штамм Е. faecium RCAM05160 идентифицирован с использованием метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) по видоспецифическому гену, кодирующему синтез супероксиддисмутазы (Jackson C.R., Fedorka-Cray P.J., Barrett J.B. Use of a genus- and species-specific multiplex PCR for identification of enterococci. J. Clin. Microbiol. 2004. 42(8): 3558-3565), как штамм вида Enterococcus faecium.

Антагонистическая активность.

Исследование антагонистической активности штамма Е. faecium RCAM05160 проводили чашечным методом (принцип отсроченного антагонизма) на плотной среде - Schaedler агар (Кудлай М.Г., Лиходед В.Г. Бактериоциногения. Л.: «Медицина». 1966: 15-24) на тест-штаммах Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, K. oxytoca, Enterobacter cloacae, Morganella morganii, Candida albicans, C. krusei, С. kefir, С. pelliculosae, Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, в том числе на ванкомицинрезистентном штамме, Listeria monocytogenes, L. ivanovii, L. inocua, L. seligeri, Pseudomonas aeruginosa, Providencia rettgeri.

Результаты исследований приведены в таблице 1.

Как видно из таблицы 1, антагонистическая активность Е. faecium RCAM05160 установлена в отношении Escherichia coli, Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, в том числе в отношении ванкомицинрезистентной культуры, Listeria monocytogenes, L. ivanovii, L. inocua и не выявлена в отношении Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, K. oxytoca, Enterobacter cloacae, Morganella morganii, Candida albicans, С. krusei, C. kefir, C. pelliculosae, Pseudomonas aeruginosa, Providencia rettgeri. Степень антагонизма выражается коэффициентом антагонистической активности и определяется по следующим критериям: 2 и менее - низкая, 2-5 - средняя, 5 и более - высокая.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1.

Суточную культуру штамма Е. faecium RCAM05160 засевали уколом в питательный Schaedler-агар. После инкубации при температуре 37°С в течение 24 часов выросшую культуру инактивировали парами хлороформа в течение одного часа. Затем чашку просушивали 30 мин на воздухе и на поверхность агара наслаивали второй слой (4-5 мл) расплавленного и остуженного до 50°С 0,7% Schaedler-агара, смешанного с 0,1 мл тестируемых культур - Escherichia coli, Е. faecium, Е. faecalis, в том числе штамм, устойчивый к ванкомицину, Listeria monocytogenes, L. ivanovii, L. innocua (их мутность составляет 2 по шкале МакФарланда).

Через 24 ч инкубации при температуре 37°С проводили учет результатов: для этого с помощью линейки и циркуля измеряли диаметр зон задержки роста тестируемой культуры (d1) и диаметр роста штамма-продуцента (d2). По отношению зоны задержки роста тестируемой культуры к зоне роста штамма-продуцента антагонистически активных субстанций вычисляли коэффициент его антагонистической активности (КА).

Результаты исследований приведены в таблице 2.

Коэффициент антагонистической активности Е. faecium RCAM05160 в отношении Escherichia coli составляет от 7,3 до 9,0; Enterococcus faecalis от 6,0 до 6,7; Enterococcus faecium - от 6,3 до 6,5; Listeria monocytogenes - 6,0; также штамм проявляет антагонистическую активность в отношении других видов рода Listeria: L. ivanovii - 7,7, L. innocua - 6,0.

Пример 2.

Аналогично примеру 1 проводили эксперименты по определению коэффициента антагонистической активности (КА) у Е. faecium RCAM05160 и диких штаммов Enterococcus faecium, выделенных из кишечного биотопа по отношению к тест-штаммам (таблица 3).

Авторами экспериментально установлено, что коэффициент антагонистической активности (КА) у Enterococcus faecium RCAM05160 в отношении Escherichia coli составляет 8,4; Enterococcus faecalis - 6,0; ванкомицинрезистентного Enterococcus faecalis - 6,7; Enterococcus faecium - 6,4; Listeria monocytogenes - 6,1; L. ivanovii - 7,7, L. innocua - 6,0.

Тогда как коэффициент антагонистической активности диких штаммов Enterococcus faecium составлял: в отношении Е. faecalis от 1,4 до 2,1; ванкомицинрезистентного Е. faecalis от 1,7 до 2,8; Е. faecium от 1,3 до 2,5; L. monocytogenes от 1,4 до 3,6; L. innocua от 0 до 2,9, L. ivanovii от 0 до 3,2, дикие штаммы Е. faecium не обладали антагонистической активностью в отношении E.coli, что свидетельствует о высокой антагонистической активности заявляемого штамма Enterococcus faecium RCAM05160 в отношении E.coli, бактерий рода Listeria и Enterococcus по сравнению с изученными дикими штаммами Enterococcus faecium.

Таким образом, заявляемый штамм Enterococcus faecium RCAM05160 отличается высокой антагонистической активностью в отношении бактерий вида Е. coli, родов Enterococcus и Listeria и может быть использован в производстве биопрепаратов пробиотической направленности, оказывающих антагонистическое влияние на бактерии вида Е. coli, родов Enterococcus и Listeria, вызывающих заболевания у сельскохозяйственных животных.

Похожие патенты RU2739427C1

название год авторы номер документа
ШТАММ БАКТЕРИЙ Enterococcus faecium, ОБЛАДАЮЩИЙ АНТАГОНИСТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ В ОТНОШЕНИИ БАКТЕРИЙ РОДА Listeria И ВИДА Enterococcus faecalis 2014
  • Сычева Мария Викторовна
  • Карташова Ольга Львовна
  • Щепитова Наталья Евгеньевна
RU2571852C2
Способ повышения продуктивности цыплят-бройлеров 2022
  • Сычева Мария Викторовна
  • Карташова Ольга Львовна
  • Кочкина Елена Евгеньевна
RU2787241C2
Штамм энтерококков Enterococcus faecium L-3 для лечения и профилактики бактериальных и вирусных инфекций с использованием изготовленных на его основе лечебно-профилактических средств и продуктов питания и способ культивирования штамма энтерококков Enterococcus faecium L-3 2022
  • Алехина Галина Геннадьевна
  • Суворов Александр Николаевич
RU2800359C1
ШТАММ ENTERОCOCCUS MUNDTII, ПРОДУЦИРУЮЩИЙ СУБСТАНЦИЮ ПЕПТИДНОЙ ПРИРОДЫ С АНТИЛИСТЕРИОЗНОЙ АКТИВНОСТЬЮ 2013
  • Храмов Владимир Михайлович
  • Похиленко Виктор Данилович
  • Перелыгин Владимир Владимирович
  • Садикова Гульнур Тахавиевна
  • Калмантаев Тимур Ахмерович
  • Чукина Ирина Анатольевна
  • Светоч Эдуард Арсеньевич
RU2532227C1
ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ДНКАЗНОЙ АКТИВНОСТИ У ПАТОГЕННЫХ ГРАМПОЛОЖИТЕЛЬНЫХ БАКТЕРИЙ 2018
  • Зайцева Елена Александровна
RU2684721C1
Способ идентификации уропатогенных Enterococcus faecalis у детей 2022
  • Зайцева Елена Александровна
  • Коменкова Татьяна Сергеевна
RU2788842C1
Штамм лактобактерий Enterococcus faecalis - продуцент молочной кислоты и антибиотических веществ 2018
  • Цугкиев Борис Георгиевич
  • Рамонова Элла Викторовна
  • Цугкиева Ирина Борисовна
  • Хозиев Алан Макарович
  • Кабисов Руслан Гельбертович
  • Петрукович Андрей Георгиевич
  • Хозиев Марат Аланович
RU2696083C1
ШТАММ ЛАКТОБАКТЕРИЙ Enterococcus faecalis - ПРОДУЦЕНТ МОЛОЧНОЙ КИСЛОТЫ И АНТИБИОТИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ 2015
  • Цугкиев Борис Георгиевич
  • Рамонова Элла Викторовна
  • Ревазова Зарина Ибрагимовна
  • Гадзаонов Радион Хизирович
  • Берлева Лилия Михайловна
RU2599424C1
ШТАММ БАКТЕРИЙ Enterococcus faecium, ОБЛАДАЮЩИЙ СПОСОБНОСТЬЮ СНИЖАТЬ ОБРАЗОВАНИЕ БИОПЛЕНОК ГРИБАМИ РОДА Candida 2015
  • Сычева Мария Викторовна
  • Пашинина Ольга Александровна
  • Карташова Ольга Львовна
  • Пашкова Татьяна Михайловна
  • Попова Лидия Петровна
RU2576008C2
Штамм бактерий Bacillus mojavensis RCAM05965, обладающий антагонистической активностью по отношению к Candida albicans, Serratia marcescens, Escherichia coli и перспективный для производства пробиотика для человека и/или животных 2023
  • Малкова Ангелина Владимировна
  • Иркитова Алена Николаевна
  • Евдокимов Иван Юрьевич
  • Ширманов Максим Вячеславович
  • Дудник Дина Евгеньевна
  • Каргашилова Екатерина Николаевна
RU2804275C1

Реферат патента 2020 года Штамм бактерий Enterococcus faecium, обладающий антагонистической активностью в отношении бактерий вида E. coli, родов Enterococcus и Listeria

Изобретение относится к биотехнологии. Штамм бактерий Enterococcus faecium, обладающий антагонистической активностью в отношении бактерий вида Е. coli, родов Enterococcus и Listeria, депонирован в Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения ОСХН РАН под регистрационным номером RCAM05160. Изобретение обеспечивает повышение антагонистической активности бактерий Enterococcus faecium в отношении широкого спектра микроорганизмов, вызывающих заболевания у сельскохозяйственных животных. 3табл., 2 пр.

Формула изобретения RU 2 739 427 C1

Штамм бактерий Enterococcus faecium, обладающий антагонистической активностью в отношении бактерий вида Е. coli, родов Enterococcus и Listeria, депонированный в Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения ОСХН РАН под регистрационным номером RCAM05160.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2020 года RU2739427C1

ШТАММ БАКТЕРИЙ Enterococcus faecium, ОБЛАДАЮЩИЙ АНТАГОНИСТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ В ОТНОШЕНИИ БАКТЕРИЙ РОДА Listeria И ВИДА Enterococcus faecalis 2014
  • Сычева Мария Викторовна
  • Карташова Ольга Львовна
  • Щепитова Наталья Евгеньевна
RU2571852C2
ШТАММ ENTEROCOCCUS FAECIUM LVP1073, ПРОДУЦЕНТ БАКТЕРИОЦИНА ПРОТИВ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ПАТОГЕНОВ, БАКТЕРИОЦИН E1073 ПРОТИВ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ПАТОГЕНОВ, ШТАММ LACTOBACILLUS PLANTARUM 1 LVP7 - ИНДУКТОР СИНТЕЗА БАКТЕРИОЦИНА E1073, СИГНАЛЬНЫЙ ПЕПТИД СП1073 - РЕГУЛЯТОР СИНТЕЗА БАКТЕРИОЦИНА E1073, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БАКТЕРИОЦИНА E1073 2009
  • Светоч Эдуард Арсеньевич
  • Перелыгин Владимир Владимирович
  • Ерусланов Борис Васильевич
  • Левчук Владимир Павлович
  • Похиленко Виктор Данилович
  • Мицевич Евгений Викторович
  • Мицевич Ирина Петровна
  • Лунева Надежда Ивановна
  • Борзенков Валерий Николаевич
  • Светоч Ольга Егоровна
  • Дятлов Иван Алексеевич
RU2409661C2
Способ определения нитратов в водных растворах 1989
  • Межлумян Пайцар Гарушовна
SU1737332A1
CN 0102747003 B, 24.10.2012
СЫЧЕВА М.В
"Биологические эффекты антимикробных веществ животного и бактериального происхождения".//Автореферат диссертации доктора биологических наук, 2016, Уфа.

RU 2 739 427 C1

Авторы

Кочкина Елена Евгеньевна

Сычева Мария Викторовна

Карташова Ольга Львовна

Пашкова Татьяна Михайловна

Даты

2020-12-24Публикация

2019-12-23Подача