ШТАММ БАКТЕРИЙ Enterococcus faecium, ОБЛАДАЮЩИЙ АНТАГОНИСТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ В ОТНОШЕНИИ БАКТЕРИЙ РОДА Listeria И ВИДА Enterococcus faecalis Российский патент 2015 года по МПК C12N1/20 A61K35/744 C12R1/01 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в производстве пробиотических препаратов, оказывающих антагонистическое влияние на бактерии рода Listeria и вида Enterococcus faecalis, вызывающих заболевания у сельскохозяйственных животных.

Аналогов изобретения в патентной и научно-технической литературе не обнаружено.

Технический результат, на достижение которого направлено изобретение, заключается в получении бактериального штамма, обладающего антагонистической активностью в отношении бактерий рода Listeria и вида Enterococcus faecalis.

Указанный технический результат достигнут тем, что получен новый штамм Enterococcus faecium.

Новый штамм Enterococcus faecium выделен с использованием классических бактериологических методов из содержимого толстого отдела кишечника здоровой свиньи в 2013 году в лаборатории кафедры микробиологии и заразных болезней ФГБОУ ВПО «Оренбургский государственный аграрный университет».

Полученный штамм Enterococcus faecium депонирован в Государственной коллекции микроорганизмов нормальной микрофлоры человека (ГКНМ) ФГУН «МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора», под регистрационным номером - 1251.

Заявляемый штамм Enterococcus faecium 1251 характеризуется следующими культурально-морфологическими и физиолого-биохимическими признаками.

Культурально-морфологические признаки.

Овоидные (яйцевидные) неподвижные клетки несколько вытянутые в длину, расположены попарно. Размер клеток 1,25×1,59 мкм. Окраска по Граму - положительная. Спор не образуют.

На желчно-эскулиновом агаре с азидом натрия (37°C, 24 ч) образует мелкие (точечные), 0,5-1 мм в диаметре, сероватого цвета (полупрозрачные), окруженные черным ореолом, округлые, выпуклые колонии с гомогенной внутренней структурой, S-форма. Рост обильный.

На Schaedler-агаре (37°C, 24 ч) дает обильный рост с характерным молочно-кислым запахом, колонии мелкие (1-2 мм), округлые, выпуклые, блестящие, гладкие, край колонии ровный.

В Schaedler-бульоне (37°C, 24 ч) дает обильный рост, придонный осадок, который гомогенизируется при встряхивании.

На молочно-ингибиторной среде по Г.П. Калине (37°C, 24 ч) формирует мелкие (1-2 мм), серого цвета, с металлическим (стальным) блеском, округлые колонии. Края колонии ровные, поверхность выпуклая, влажная, блестящая. Рост обильный.

Физиолого-биохимические признаки.

Факультативный анаэроб, оптимальные условия для культивирования - атмосферные. Температура культивирования - 37°C. Способен к росту при 45°C. Может расти на средах с содержанием 6,5% NaCl. На средах вырастает в течение 18-24 часов.

Хемоорганотроф, метаболизм бродильного типа. Штамм осуществляет гомоферментативное молочно-кислое брожение. Каталазу не продуцирует, желатину не разжижает. Ферментирует D-рибозу, D-рафинозу, лактозу, салицин, N-ацетил-D-глюкозамин, D-маннозу, сахарозу, D-мальтозу, метил-В-D-глюкопиранозид, D-трегалозу, D-галактозу. Продуцирует ферменты: L-аспартат-ариламидазу, аргининдигидролазу 1, альфа-галактозидазу, бета-галактозидазу, L-пирролидонил-ариламидазу, аргининдигидролазу 2.

Штамм устойчив к новобицину, бацитрацину.

Условия и состав среды для размножения: на Schaedler-агаре при 37°C (pH 7,2-7,6), в Schaedler-бульоне при 37°C в течение 18-24 часов.

Диапазон значений pH среды, при котором растет штамм Enterococcus faecium 1251, составляет 4,5-10, pH-оптимум роста штамма-7,5.

Генетические особенности штамма: методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) установлено, что штамм имеет гены, кодирующие синтез энтероцинов Р, L50A и L50B. С помощью ПЦР установлено, что в геноме штамма отсутствуют генетические детерминанты, кодирующие синтез факторов вирулентности: цитолизинов (cylM, cylB, cylA, cylL_s, cylL₁)); гены, обуславливающие протеолитическую активность (GelE и sprE); ген, ответственный за продукцию гиалуронидазы (Hyl); ген, кодирующий белки клеточной стенки (ESP); ген, отвечающий за синтез поверхностного белка-адгезина (ASA). Штамм имеет гены устойчивости к аминогликозидам (кроме гентамицина) (ant(4′)-Ia) и к низким концентрациям ванкомицина (vanC-2/3).

Условия хранения: лиофильно высушенная культура при температуре 4±2°C в защищенном от прямых солнечных лучей месте при относительной влажности воздуха не более 60% в течение 2-х лет или культура, выращенная в течение суток при 37°C в полужидкой среде СТА, в условиях бытового холодильника при температуре 4±2°C в течение 6 месяцев.

Штамм Enterococcus faecium 1251 идентифицирован с использованием полимеразной цепной реакции по видоспецифическому гену, кодирующему синтез супероксиддисмутазы (Jackson C.R., Fedorka-Cray P.J., Barrett J.B. Use of a genus- and species-specific multiplex PCR for identification of enterococci. J. Clin. Microbiol. 2004. 42(8): 3558-3565), как штамм вида Enterococcus faecium.

Антагонистическая активность.

Исследование антагонистической активности штамма Enterococcus faecium 1251 проводили чашечным методом (принцип отсроченного антагонизма) на плотной среде - Schaedler агар (Кудлай М.Г., Лиходед В.Г. Бактериоциногения. Л.: «Медицина». 1966. С. 15-24) на тест-штаммах Staphylococcus aureus, Micrococcus luteus, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, K. oxytoca, Enterobacter cloacae, Moraxella morganii, Candida albicans, Enterococcus faecalis, Listeria monocytogenes.

Результаты исследований приведены в таблице 1.

Как видно из таблицы антагонистическая активность Enterococcus faecium 1251 установлена в отношении Enterococcus faecalis, Listeria monocytogenes и не выявлена в отношении Staphylococcus aureus, Micrococcus luteus, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, К. oxytoca, Enterobacter cloacae, Moraxella morganii, Candida albicans. Степень антагонизма выражается коэффициентом антагонистической активности и определяется по следующим критериям: 2 и менее - низкая, 2-5 - средняя, 5 и более - высокая.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1.

Суточную культуру штамма Enterococcus faecium 1251 засевали уколом в питательный Schaedler-агар. После инкубации при температуре 37°C в течение 24 часов выросшую культуру инактивировали парами хлороформа в течение одного часа. Затем чашку просушивали 30 мин на воздухе и на поверхность агара наслаивали второй слой (4-5 мл) расплавленного и остуженного до 50°C 0,7% Schaedler-агара, смешанного с 0,1 мл тестируемых культур - Enterococcus faecalis, Listeria monocytogenes, L. seeligeri, L. ivanovii, L. innocua (их мутность составляет 2 по шкале МакФарланда).

Через 24 ч инкубации при температуре 37°C проводили учет результатов: для этого с помощью линейки и циркуля измеряли диаметр зон задержки роста тестируемой культуры (d₁) и диаметр роста штамма-продуцента (d₂). По отношению зоны задержки роста тестируемой культуры к зоне роста штамма-продуцента антагонистически активных субстанций вычисляли коэффициент его антагонистической активности (КА).

Результаты исследований приведены в таблице 2.

Коэффициент антагонистической активности в отношении Listeria monocytogenes составляет от 2,9 до 9,7; Enterococcus faecalis от 3,6 до 6,5; также штамм проявляет антагонистическую активность в отношении других видов рода Listeria: L. seeligeri, L. ivanovii, L. innocua.

Пример 2.

Аналогично примеру 1 проводили эксперименты по определению коэффициента антагонистической активности (КА) у Enterococcus faecium 1251 и диких штаммов Enterococcus faecium, выделенных из кишечного биотопа по отношению к тест-штаммам (таблица 3).

Авторами экспериментально установлено, что коэффициент антагонистической активности (КА) у Enterococcus faecium 1251 в отношении L. monocytogenes составил 7,0, Enterococcus faecalis 5,1; L. innocua 7,2; L. ivanovii 6,9; L. seeligeri 10,1.

Тогда как коэффициент антагонистической активности диких штаммов Enterococcus faecium составлял: в отношении L. monocytogenes от 1,4 до 3,7; Enterococcus faecalis от 1,4 до 2,2; L. innocua от 2,7 до 3,8; L. ivanovii от 2,1 до 3,2; L. seeligeri от 3,9 до 4,2, что свидетельствует о высокой антагонистической активности заявляемого штамма Enterococcus faecium 1251 в отношении бактерий рода Listeria и вида Enterococcus faecalis по сравнению с изученными дикими штаммами Enterococcus faecium.

Таким образом, заявляемый штамм Enterococcus faecium 1251 отличается высокой антагонистической активностью в отношении бактерий рода Listeria и вида Enterococcus faecalis и может быть использован в производстве пробиотических препаратов, оказывающих антагонистическое влияние на бактерии рода Listeria и вида Enterococcus faecalis, вызывающих заболевания у сельскохозяйственных животных.

Изобретение относится к биотехнологии. Штамм бактерий Enterococcus faecium Ef79OSAU, обладающий антагонистической активностью в отношении бактерий рода Listeria и вида Enterococcus faecalis, депонирован в Государственной коллекции микроорганизмов нормальной микрофлоры человека (ГКНМ) ФБУН «МНИИЭМ им Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора» под регистрационным номером-1251 и может быть использован для приготовления пробиотических препаратов. Изобретение позволяет повысить антагонистическую активность в отношении бактерий рода Listeria и вида Enterococcus faecalis. 3 табл., 2 пр.

Штамм бактерий Enterococcus faecium, обладающий антагонистической активностью в отношении бактерий рода Listeria и вида Enterococcus faecalis, депонированный в Государственной коллекции микроорганизмов нормальной микрофлоры человека (ГКНМ) ФБУН «МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора» под регистрационным номером -1251.