СОРБЦИННО-ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЙ СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ДОКСИЦИКЛИНА В ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТАХ Российский патент 2012 года по МПК G01N33/15 G01N21/64 

Изобретение относится к аналитической химии, конкретно к способу сорбционно-флуоресцентного определения доксициклина в лекарственных препаратах, и может быть использовано для экспресс-анализа лекарственных препаратов, преимущественно для определения количественного содержания активнодействующего вещества и его наличия.

Доксициклин относится к группе антибиотиков тетрациклинового ряда и широко используется в клинической практике. Для его определения используют различные методики, основанные на принципах вольтамперометрии, спектрофотометрии, люминесценции, тонкослойной и жидкостной хроматографии (Charoenraks Т., Palaharn S. Flow injection analysis of doxycycline or chlorotetracycline in pharmaceutical formulations with pulsed amperometric detection // Talanta. 2004. Vol.64, №5. P.1247-1252; Sunaric S. ML, Mitic S.S. Determination of doxycycline in pharmaceuticals based on its degradation by Cu(II)/H₂O₂ reagent in aqueous solution // Журнал аналитической химии. 2009. Vol.64, №3. P.248-253; Zhang Li-Wei, Luo Li. Спектрофлуориметрическое определение следовых количеств доксициклина с системой диэтил-O-β-циклодекстрин-доксициклин-Eu³⁺ // Chin. J. Anal. Chem. 2008. Vol.36, №11. P.1547-1550; Березкин В.Г. и др. Применение нового варианта капиллярной тонкослойной хроматографии для анализа антибиотиков группы тетрациклина // Сорбционные и хроматографические процессы. 2008. Т.8, вып.4. С.570-576; Fiori J., Grassigli G. HPLC-DAD and LC-ESI-MS analysis of doxycycline and related impurities in doxipan mix, a medicated premix for incorporation in medicated feedstuff // J. Pharm. and Biomed. Anal. 2005. Vol.37, №5. P.979-985).

Данные методы обладают высокой чувствительностью, но мало подходят для массового анализа, также к недостатку относится необходимость в дорогостоящем оборудовании и квалифицированном персонале.

Известен фармакопейный метод определения антибиотиков [Фирсов А.А., Алексеева М.Е., Кулешов С.У. // Хим.-фарм. журн. 1995. №3. С.24], который предполагает диффузию антибиотика в агар, содержащий питательную среду для микроорганизмов и сопоставление степени угнетения их роста испытуемым препаратом со стандартными растворами антибиотика. Минимальная определяемая концентрация составляет 0.05 мкг/мл.

Микробиологические способы широко используются на практике, просты и не требуют дорогостоящего оборудования. Однако они характеризуются длительностью анализа, зависимостью аналитического сигнала от свойств антибиотика (его растворимости, молярной массы и т.п.); не связанного с его биологической активностью, чувствительностью питательной среды к качеству агара.

Известен способ экспрессного определения антибиотиков в различных объектах биологическим методом (патент РФ №2188421, МПК G01N 33/48, опубликован 27.08.2002). Способ включает инкубацию тест-культуры совместно с пробой исследуемого объекта. В качестве тест-культуры берут высокочувствительные (предел обнаружения 0,0025 до 0,005 мкг/мл) к антибиотикам штаммы термофильных бактерий Bacillus licheniformis или Bacillus stearothermophilus с оптимумом роста при температуре 50-60°С и по отсутствию роста определяют наличие антибиотика в объекте.

Недостатком этого способа является использование дорогостоящих реагентов.

Наиболее близким по технической сущности является способ определения соединений тетроциклинового ряда, включая доксициклин, включающий пробоподготовку, модифицирование реагентом сорбента, нанесенного на подложку, и добавление к сорбенту анализируемой пробы (SU 1742713 A1, 23.06.1992).

Задачей изобретения является разработка сорбционно-флуоресцентного экспресс-метода определения доксициклина в лекарственных препаратах, исключающего использование дорогостоящих реагентов. Технический результат заключается в возрастании интенсивности собственной флуоресценции антибиотика. Кроме того, предлагаемый способ позволяет упростить методику определения при сокращении времени, необходимого для анализа и снижении его себестоимости.

Поставленная задача решается тем, что в способе определения содержания доксициклина в лекарственных препаратах, включающем пробоподготовку, модификацию реагентом сорбента, нанесенного на подложку, и добавление к сорбенту анализируемой пробы, согласно изобретению в качестве сорбента выбран силикагель, а в качестве реагента - неионный ПАВ Бридж-35 в количестве не менее 1.5 мкл 1·10^-1М, определяют интенсивность флуоресценции в зоне нанесения пробы, по которой судят о содержании доксициклина на основе градуировочного графика, при этом объем исследуемого раствора выбран в диапазоне от 1.5-3.0 мкл.

Изобретение поясняется чертежом, на котором приведен градуировочный график определения доксициклина, где по оси абсцисс указан рС(ДЦ) - отрицательный логарифм концентрации доксициклина, М; а по оси ординат - RGB (G)-интенсивность флуоресценции доксициклина.

Способ реализуется следующим образом. В качестве пробы берут раствор лекарственного препарата. Если препарат в виде таблеток, то для приготовления раствора таблетки измельчают в ступке и растворяют в кислоте HCl. Полученный раствор наносят на силикагель, предварительно модифицированный неионным ПАВ, и измеряют интенсивность окраски RGB (G), обусловленной собственной флуоресценцией антибиотика, которую записывают с помощью видеоденситометра. В состав видеоденситометра входит осветительная камера (λ=365 нм), цветная видеокамера, платы ввода и захвата изображения, компьютер и программы расчета параметров RGB (G). В качестве основного цвета флуоресценции доксициклина является зеленый - RGB (G), который обусловлен собственной флуоресценцией доксициклина (λ_возб=365 нм, λ_фл=540 нм). Для обработки полученного изображения использовалась программа Adobe Photoshop CS3 (цветовая модель RGB). Содержание доксициклина в лекарственном препарате определяют методом градуировочного графика.

Пример 1. Построение градуировочного графика зависимости интенсивности флуоресценции доксициклина RGB (G) от концентрации его в растворе.

Готовят стандартный раствор гидрохлорида доксициклина (фирмы «Fluka BioChemika», содержание основного вещества не менее 99,0%) 1.0·10^-2 М в 0.01 М HCl, раствор неионного ПАВ - оксиэтилированного спирта Бридж-35 (фирмы «Acros», основного вещества не менее 99,0%) концентрации 1-10^-1 М в бидистиллированной воде.

На пластины наносят на расстоянии 3 см друг от друга 0.5-5.0 мкл 1.0·10^-1 М Бридж-35 и к ним добавляют 2.0 мкл 2·10^-5-1·10^-3 М раствора доксициклина. Интенсивность флуоресценции на пластинах силикагеля «Сорбфил АТСХ» измеряют с помощью видеоденситометра «Сорбфил» 02-29-50-01 (λ=365 нм) с привлечением компьютерной программы Adobe Photoshop CS3 (цветовая модель RGB). Содержание определяют по интенсивности флуоресценции RGB(G) (см. чертеж). В таблице 1 представлены некоторые метрологические характеристики предлагаемого способа определения доксициклина.

Таблица 1 Некоторые метрологические характеристики доксицикцина Диапазон определяемых концентраций, М Предел обнаружения, М Уравнение градуировочного графика r² 2·10^-5-1·10^-3 1·10^-5 у=15.9х+77,5 0.993

Пример 2. Определение оптимальной концентрации Бридж-35 из условия получения максимального аналитического сигнала.

На пластины наносят на расстоянии 3 см друг от друга 0.5-5.0 мкл 1.0·10^-1 M Бридж-35, добавляют к ним 2.0 мкл 5·10^-3 M раствора доксициклина, измеряют интенсивность флуоресценции доксициклина.

Таблица 2 Определение оптимальной концентрации Бридж-35 п/№ 1 2 3 4 5 6 7 V_{Бридж-35}, мкл 0,5 1,0 1,5 2,0 3,0 4,0 5,0 RGB (G) 15 20 29 27 29 27 30

Как видно из таблицы 2, при заявляемых концентрациях Бридж-35 наблюдается максимальная флуоресценция (п/№3-7), которая практически не изменяется в случае использования больших концентраций.

Пример 2. Определение необходимого объема анализируемого раствора.

На пластины наносят на расстоянии 3 см 1.5 мкл 1·10^-1 М Бридж-35, добавляют различные объемы 0,5-5,0 мкл раствора доксициклина (1·10^-2-1·10^-3 М), оставляя постоянным количество вещества, измеряют интенсивность флуоресценции доксициклина RGB (G).

Таблица 3 Определение необходимого объема анализируемого раствора п/№ 1 2 3 4 5 6 7 V_{доксицикл,} МКЛ 0,5 1,0 1,5 2,0 3,0 4,0 5,0 С_{доксицикл}, М 1·10^-2 5.0·10^-3 3.3·10^-3 2.5·10^-3 1.7·10^-3 1.3·10^-3 1·10^-3 υ, кол-во в-ва, моль 5·10^-12 5·10^-12 5·10^-12 5·10^-12 5·10^-12 5·10^-12 5·10^-12 RGB (G) 15 20 30 27 29 20 10

Где V - объем раствора, мкл; С - концентрация, М; υ - количество вещества, моль.

Установлено, что максимальная интенсивность флуоресценции достигается при использовании объема анализируемого раствора доксициклина от 1.5 до 3.0 мкл (п/№3-5), которая уменьшается при использовании больших объемов раствора антибиотика (п/№6, 7).

Пример 3. Определение доксициклина в лекарственном препарате «Доксициклин».

20 таблеток препарата «Доксициклин» (фирма ОАО «Синтез») измельчали в ступке и 0,35 г полученного порошка растворяли в 25 мл 0,01 М HCL, с помощью бумажного фильтра (синяя лента) отделяли нерастворившуюся часть лекарственного препарата, 1.0-2.0 мл фильтрата помещали в мерную колбу емкостью 25 мл и разбавляли дистиллированной водой до метки. 2 мкл полученного раствора наносили на силикагель, предварительно модифицированный 1.5 мкл 1·10^-1 М Бридж-35 и измеряли интенсивность флуоресценции доксициклина. Содержание доксициклина определяли по градуировочному графику и рассчитывали по формуле:

, где а - концентрация доксициклина, найденная по градуировочному графику, М; V - объем исследуемого раствора, взятого для анализа, мл.

Результаты определения доксициклина в фармпрепарате «Доксициклин» представлены в таблице 4. Правильность контролировали методом стандартной добавки, погрешность определения S_r не превышала 0,48.

Таблица 4 Результаты определения доксициклина в фармацевтическом препарате «Доксициклин» (n=6, p=0.95) № пробы Аттестованное содержание, г Х_ср+ΔХ, г S_r 1 0,1 0,13±0,05 0,38 2   0,13±0,06 0,46

S_r - относительное стандартное отклонение, S_r=S/χ, где S - стандартное отклонение, равное S=∑(χ_i-χ)²/(n-1)^1/2, χ_i - единичный результат определения, χ - средний результат, n - число определений, p - доверительная вероятность.

Предлагаемый способ позволяет отказаться от дорогостоящего оборудования и привлечения квалифицированного персонала.

Изобретение относится к аналитической химии применительно к экспресс-анализу лекарственных препаратов, преимущественно для обнаружения и количественного определения активнодействующего вещества. В способе определения содержания доксициклина в лекарственных препаратах, включающем пробоподготовку, осуществляют модификацию силикагеля, нанесенного на подложку, неионным ПАВ Бридж-35 с последующим добавлением пробы анализируемого раствора лекарственного препарата, о содержании судят по интенсивности окраски в зоне нанесения пробы, соответствующей интенсивности флуоресценции, определяемой с помощью видеоденситометра и компьютерной обработки на основе градуировочного графика, построенного в аналогичных условиях для стандартных растворов доксициклина. Достигается упрощение, ускорение и повышение эффективности анализа. 3 пр., 4 табл., 1 ил.

Способ определения содержания доксициклина в лекарственных препаратах, включающий пробоподготовку, модификацию реагентом сорбента, нанесенного на подложку, и добавление к сорбенту анализируемой пробы, отличающийся тем, что в качестве сорбента выбран силикагель, а в качестве реагента - неионный ПАВ Бридж 35 в количестве не менее 1.5 мкл 1·10^-1 М, определяют интенсивность флуоресценции в зоне нанесения пробы, по которой судят о содержании доксициклина на основе градуировочного графика, при этом объем исследуемого раствора выбран в диапазоне 1.5-3.0 мкл.