СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ КАЧЕСТВА ЭМБРИОНОВ В ПРОГРАММАХ ВСПОМОГАТЕЛЬНЫХ РЕПРОДУКТИВНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ С УЧЕТОМ ГЕНОТИПА ПАЦИЕНТОК Российский патент 2016 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к области клинико-лабораторной диагностики, целью которой является прогнозирование качества получаемых эмбрионов (а именно эмбрионов низкого качества) и оптимизация проводимого лечения бесплодия у пациенток методом экстракорпорального оплодотворения (ЭКО). Под эмбрионами низкого качества подразумеваются эмбрионы класса C согласно классификации Istanbul consensus workshop on embryo assessment (ESHRE 2011) [1].

Как известно, необходимость во вспомогательных репродуктивных технологиях (ВРТ) непрерывно возрастает. Однако несмотря на постоянные усилия, направленные на повышение вероятности наступления беременности, эффективность программы ЭКО по-прежнему остается около 30-35% на цикл [2]. В свою очередь, благоприятный исход программы ВРТ, а именно рождение живого здорового ребенка, зависит от множества факторов, одним из наиболее значимых является качество полученных эмбрионов. Способность прогнозировать качество получаемых эмбрионов позволит изначально выбрать правильный подход к ведению пациенток, а также персонифицированную тактику эмбриологического этапа. В связи с этим требуются все новые технологии, позволяющие повысить эффективность проводимого лечения, так как прогнозирование качества получаемых ооцитов и эмбрионов представляет собой одну из наиболее важных проблем в современной репродуктологии. Использующиеся на сегодняшний день маркеры исходов программ ВРТ не являются универсальными и зависят от множества сопутствующих факторов, в том числе и экзогенных. С этой точки зрения изучение генетической предрасположенности представляется важным биологическим фактором, предопределяющим многие процессы репродуктивной функции.

Исследование генотипа в отличие от многих других маркеров может проводиться однократно, так как данные, полученные в результате генотипирования пациентки, не меняются в течение жизни, не зависят от веса, от дня менструального цикла и так далее. Изучение ассоциации генетических маркеров со многими биологическими процессами представляется крайне актуальным как с научной, так и с практической точки зрения.

В литературе описаны исследования, согласно которым четко прослеживается ассоциация генотипа пациенток с качеством получаемых эмбрионов. Так, например, показана связь полиморфизма гена ESR1-351 A>G [XBaI] с качеством эмбрионов (Ayvaz et al. (2009)) [3]. Однако в большинстве из них выводы основаны на проведенном однофакторном анализе, не позволяющем оценить значение сочетания генотипов полиморфизма генов. Также недостатками однофакторных моделей являются низкая прогностическая значимость и противоречивость данных [4].

Задача настоящего изобретения - создать мультигенную модель прогнозирования качества получаемых эмбрионов в программах ВРТ путем предварительного генотипирования пациенток. Исследование полиморфизма генов может служить малоинвазивным, легкодоступным, дешевым методом, позволяющим анализировать одновременно большое количество образцов крови, применяемым перед началом проведения программы ЭКО.

Цель настоящего изобретения - создание многофакторной молекулярно-генетической модели для предикции качества получаемых эмбрионов, оптимизации проводимого лечения бесплодия методом ВРТ.

Поставленная цель достигается генотипированием пациенток по следующим полиморфным локусам:

АМН 146 G>T (Ile49Ser) [rs10407022]

FSHR 2039 G>A (Ser680Asn) [rs6166]

LHCGR 935 A>G (Asn312Ser) [rs2293275]

LHCGR 872 A>G (Asn291Ser) [rs12470652]

Определяют генотип по данным позициям с применением полимеразной цепной реакции (ПЦР) или аналогичного метода, позволяющего определить указанные генетические маркеры. ГГТТР и определение температуры плавления олигонуклеотидных проб проводят при помощи детектирующего амплификатора ДТ-96 (ООО «НПО ДНК-Технология», Россия). ДНК для генотипирования выделяют из образцов периферической крови, взятой с ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота) в качестве антикоагулянта, объемом 0,5 мл, смешивают в микроцентрифужных пробирках (объемом 1,5 мл) типа Эппендорф с лизирующим раствором (0,5 мл), состоящим из 10 мМ Трис-HCl pH 7,5, 0,32М сахарозы, 5 мМ MgCl, 1% Тритона Х-100, центрифугируют. Центрифугирование проводится в течение 1 мин при 10000 об/мин, супернатант удаляется, осадки клеточных ядер двукратно отмывают соответствующим буфером. В последующем протеолиз проводят в буферном растворе (50 мкл), содержащим 10 мМ Трис-HCl pH 8,3, 50 мМ KCl, 0,45% NP40, 045% Твина 20 и 250 мкг/мл протеиназы К, 2,5 мМ MgCl, в течение 20 минут при 37°C. Инактивация протеиназы К производится в течение 20 минут при температурном режиме 98°C. Концентрация ДНК определяется на ДНК-минифлуориметре (Hoefer, США) и составляет около 50-100 мкг/мл. Идентификацию однонуклеотидных полиморфизмов проводят с помощью модифицированного метода «примыкающих проб» (adjacent probes, kissing probes) с использованием оригинальных олигонуклеотидов [5; 6].

Определение полиморфизма генов сначала проводится ПЦР с праймерами, которые связываются с комплементарными последовательностями, и между циклами нагревания (для денатурации ДНК) и охлаждения (для обеспечения синтеза) синтезируются копии данной области гена [7]. Праймеры общие для обоих вариантов нуклеотидной последовательности, после чего температуру реакционной смеси для гибридизации матрицы с олигонуклеотидными пробами понижают. Для определения типа последовательности используют два варианта олигонуклеотидов. В первом случае олигонуклеотиды метят флуорофором, во втором - гасителем флуоресценции. Этот процесс протекает при помощи ферментов, способных соединять нуклеотидные основания и выдерживать необходимые для денатурации температурные режимы [7]. В качестве такого фермента используется Taq-полимераза, блокированная специфическими антителами, чтобы предотвратить неспецифический отжиг праймеров и повысить чувствительность тест-систем.

В режиме реального времени измеряют уровень флуоресценции в процессе температурной денатурации дуплексов олигонуклеотидов и полученных матриц. Генотип определяется путем анализа кривых плавления. В том случае, если анализируемый образец содержит только один тип нуклеотидной последовательности гена, т.е. гомозиготен по данному полиморфизму, температура плавления для пробы, образующей совершенный дуплекс, выше, чем для пробы, образующей несовершенный дуплекс. В том случае, если анализировался гетерозиготный образец, содержащий два типа нуклеотидной последовательности, каждый из вариантов проб может образовать совершенный дуплекс, поэтому температуры плавления одинаковы [7].

Бинарная логистическая регрессия рассчитывает вероятность наступления события (в данном случае получение эмбрионов низкого качества класса С согласно классификации Istanbul consensus workshop on embryo assessment (ESHRE 2011) [1]) в зависимости от значений независимых переменных (в данном случае полиморфизма исследуемых генов).

Вероятность наступления события (получения эмбрионов низкого качества) (р) для некоторого случая рассчитывается по формуле, имеющий общий вид

$$\text{p}=\text{1/(1}+{\text{e}}^{-\text{z}}\text{)}\text{(1)}$$ ,

где

р - искомая вероятность наступления события;

z (классифицирующая дискриминантная функция) = а+b₁*X₁+b₂*X₂+…+b_n*X_n,

а - некоторая константа; X₁ - независимые переменные; b₁ - коэффициенты, расчет которых является задачей бинарной логистической регрессии.

Если для p получается значение меньшее 0,5, то можно предположить, что событие не наступит; в противном случае предполагается наступление события.

В бинарной логистической регрессионной модели исходом считается факт получения эмбрионов низкого качества, предикторами - полиморфизм генов АМН 146 G>T (Ile49Ser), FSHR 2039 G>A (Ser680Asn), LHCGR 935 A>G (Asn312Ser) и LHCGR 872 A>G (Asn291Ser).

При построении бинарной логистической регрессионной модели используют метод обратной селекции. Качество приближения регрессионных моделей при каждом последующем шаге оценивают при помощи функции подобия. Мерой правдоподобия служит отрицательное удвоенное значение логарифма этой функции (-2LL). В качестве начального значения для -2LL применяется значение, которое получается для регрессионной модели, содержащей только константы. После добавления переменной влияния значение -2LL равно 180,962. Разность между значением -2LL начальной и конечной модели составила 22,807 (p=0,004). Подобное снижение величины означает улучшение полученной модели.

Мера определенности показывает ту часть дисперсии, которую можно объяснить с помощью логистической регрессии. Мера определенности по Коксу и Шелу имеет тот недостаток, что значение равное 1 является теоретически не достижимым; этот недостаток устранен благодаря модификации данной меры по методу Наделькеркеса. Часть дисперсии, объяснимой с помощью логистической регрессии, в данном уравнении составляет 18,5% (вычисляется по методу Наделькеркеса).

Результаты рассчитанных коэффициентов в логистической регрессии и проверка их значимости приведены в таблице (табл. 1).

Проверка значимости отличия коэффициентов от нуля проводится при помощи статистики Вальда, использующей распределение хи-квадрат, которое представляет собой квадрат отношения соответствующего коэффициента к его стандартной ошибке.

Согласно полученной константе и согласно значимым коэффициентам для прогнозирования вероятности получения эмбрионов низкого качества (р) классифицирующая дискриминантная функция имеет вид:

Z=-22,36-0,79*AMH_T/G-20,621*AMH_G/G+0,993*FSHR_A/G+0,364*FSHR_G/G-1,206*LHCGR (935 A>G)_A/G+1,164*LHCGR (935 A>G)_A/A+22,888*LHCGR (872 A>G)_A/G+21,6*LHCGR (872 A>G)_A/A,

где

AMH_T/G - наличие у пациентки генотипа АМН: 146 T/G (1 - да, 0 - нет),

АМН_G/G - наличие у пациентки генотипа АМН: 146 G/G (1 - да, 0 - нет),

FSHR_A/G - наличие у пациентки генотипа FSHR: A/G (1 - да, 0 - нет),

FSHR_G/G - наличие у пациентки генотипа FSHR: G/G (1 - да, 0 - нет),

LHCGR (935 A>G)_A/G - наличие у пациентки генотипа LHCGR: 935 A/G (1 - да, 0 - нет),

LHCGR (935 A>G)_A/A - наличие у пациентки генотипа LHCGR: 935 А/А (1 - да, 0 - нет),

LHCGR (872 A>G)_A/G - наличие у пациентки генотипа LHCGR: 872 A/G (1 - да, 0 - нет),

LHCGR (872 A>G)_A/A - наличие у пациентки генотипа LHCGR: 872 А/А (1 - да, 0 - нет).

Точность прогнозирования качества эмбрионов с использованием полиморфизма генов АМН 146 G>T (Ile49Ser), FSHR 2039 G>A (Ser680Asn), LHCGR 935 A>G (Asn312Ser) и LHCGR 872 A>G (Asn291Ser) составляет 82,9%.

Провели ROC-анализ для валидации полученной модели (фиг. 1). Чувствительность составила 82,9%, специфичность 40%, значение AUC (площадь под кривой) для данной модели составляет 0,699, 95% доверительный интервал - от 0,616 до 0,783.

Пример.

Прогнозирование получения эмбрионов низкого качества класса С провели у пациентки М. 32 лет, обратившейся для проведения программы ЭКО по поводу бесплодия трубного происхождения. Из анамнеза: беременностей 2, родов 0, абортов 0. В 2010 г. левосторонняя трубная беременность, проведена лапароскопия, тубэктомия слева. В 2012 г. правосторонняя трубная беременность, проведена лапароскопия, тубэктомия справа. Данная попытка ЭКО первая.

Кровь для генотипирования у пациентки М. брали натощак из локтевой вены в стерильную пробирку. Определяли замены однонуклеотидных последовательностей с применением ПЦР. ПЦР и определение температуры плавления олигонуклеотидных проб проводили при помощи детектирующего амплификатора ДТ-96 (ООО «НПО ДНК-Технология», Россия). Центрифугирование проводили в течение 1 мин при 10000 об/мин, супернатант удалялся, осадки клеточных ядер двукратно отмывали соответствующим буфером. В последующем протеолиз проводили в буферном растворе (50 мкл), содержащем 10 мМ Трис-HCl pH 8,3, 50 мМ KCl, 0,45% NP40, 045% Твина 20 и 250 мкг/мл протеиназы К, 2,5 мМ MgCl, в течение 20 минут при 37°C. Концентрация ДНК определяли на ДНК-минифлуориметре (Hoefer, США). Идентификацию однонуклеотидных полиморфизмов проводили с помощью модифицированного метода «примыкающих проб» (adjacent probes, kissing probes) с использованием оригинальных олигонуклеотидов.

Определение полиморфизма генов сначала проводили ПЦР с праймерами, которые связываются с комплементарными последовательностями, и между циклами нагревания (для денатурации ДНК) и охлаждения (для обеспечения синтеза) синтезируются копии данной области гена.

Результат генотипирования пациентки М.:

АМН 146 G>T (Ile49Ser) - T/G

FSHR 2039 G>A (Ser680Asn) - A/G

LHCGR 935 A>G (Asn312Ser) - A/G

LHCGR 872 A>G (Asn291Ser) - A/G

Значение дискриминантной функции составило:

z=-22,36-0,79*1+0,993*1-1,206*1+22,888*1=-0,475.

Вероятность (р) получения незрелых ооцитов у данной пациентки расчитывали по формуле 1:

р=1/(1+е^-0,475)=0,622.

Рассчитанная вероятность р указывает на исполнение прогноза, в данном случае - на получение эмбрионов низкого качества класса С с вероятностью 62,2%.

В результате проведения программы ВРТ у пациентки всего было получено 8 эмбрионов, из них 5 эмбрионов - класса С, 3 эмбриона класса В (согласно классификации Istanbul consensus workshop on embryo assessment (ESHRE 2011) [1]).

Согласно полученным данным, предикция получения эмбрионов низкого качества при проведении программ ВРТ на основании молекулярно-генетических маркеров носит статистически достоверный характер.

Полученный результат свидетельствует о независимой генетической детерминации процессов эмбриогенеза. Следовательно, способ прогнозирования качества эмбрионов в программах вспомогательных репродуктивных технологий с учетом генотипа пациенток может быть использован в клинико-лабораторной практике с целью предикции исходов программы ЭКО.

Фиг.1

ROC-анализ ассоциации полиморфизма генов АМН 146 G>T (Ile49Ser), FSHR 2039 G>A (Ser680Asn), LHCGR 935 A>G (Asn312Ser) и LHCGR 872 A>G (Asn291Ser) с получением эмбрионов класса С (sensitivity - чувствительность; specificity - специфичность).

Список использованных источников

1. The Istanbul consensus workshop on embryo assessment: proceedings of an expert meeting // Human reproduction. - 2011. - Vol. 26. - №6. - P. 1270-1283.

2. Серебренникова К.Г. и т.д. Современные технологии лечения бесплодия у женщин с оперированными яичниками // Международный журнал экспериментального образования. 2010. - №9. С. 115-117.

3. Ayvaz О.U., Ekmekci A., Baltaci V., Onen Н.I., Unsal Е. Evaluation of in vitro fertilization parameters and estrogen receptor alpha gene polymorphisms for women with unexplained infertility // Journal of assisted reproduction and genetics. - 2009. - Vol. 26. - №9-10. - P. 503-510.

4. van Disseldorp J., Franke L., Eijkemans R., Broekmans F., Macklon N., Wijmenga C, Fauser B. Genome-wide analysis shows no genomic predictors of ovarian response to stimulation by exogenous FSH for IVF // Reproductive biomedicine online. - 2011. - Vol. 22. - №4. - P. 382-388.

5. Кофиади И.А., Ребриков Д.В. Методы детекции однонуклеотидных полиморфизмов: аллель-специфичная ПЦР и гибридизация с олигонуклеотидной пробой // Генетика 2006. - Т. 42 (1). С. 22-32.

6. Lyon Е. Mutation detection using fluorescent hybridization probes and melting curve analysis // Expert Rev Mol Diagn. - 2001. - Vol. 1. - №1. - P. 92-101.

7. Элдер К., Дэйл Б. Экстракорпоральное оплодотворение. М.: МЕДпресс-информ, 2008. - 276 с.

Изобретение относится к области методов молекулярно-генетической диагностики в программах вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) и касается прогнозирования качества получаемых эмбрионов. Сущность способа: пациентку генотипируют по полиморфным локусам, по результатам генотипирования определяют вероятность получения эмбрионов низкого качества по формуле р=1/(1+е^-z), где Z=-2236-0,79*AMH_T/G - 20,621*AMH_G/G +0,993*FSHR_A/G+ 0,364*FSHR_G/G - 1,206*LHCGR(935 A>G)_A/G + 1,164*LHCGR(935 A>G)_A/A + 22,888*LHCGR(872 A>G)_A/G + 21,6*LHCGR(872 A>G)_A/A. При значениях p больше 0,5 прогнозируют получение эмбрионов низкого качества, а при значениях р меньше 0,5 не прогнозируют получение эмбрионов низкого качества. Изобретение может быть полезным в выборе персонализированной схемы стимуляции суперовуляции, разработке индивидуальной тактики эмбриологического этапа в ходе лечения пациентки методом экстракорпорального оплодотворения (ЭКО). Генотипирование может служить малоинвазивным, доступным, недорогим тестом, применяемым однократно перед началом проведения программы ВРТ. 1 пр., 1 табл., 1 ил.

Способ прогнозирования качества эмбрионов в программах вспомогательных репродуктивных технологий, характеризующийся тем, что пациентку генотипируют по полиморфным локусам:
АМН 146 G>T (Ile49Ser) [rs10407022],
FSHR 2039 G>A (Ser680Asn) [rs6166],
LHCGR 935 A>G (Asn312Ser) [rs2293275],
LHCGR 872 A>G (Asn291Ser) [rs12470652],
выявленным генотипам присваивают следующие значения:
AMH_T/G - наличие у пациентки генотипа АМН: 146 T/G (1 - да, 0 - нет),
AMH_G/G - наличие у пациентки генотипа АМН: 146 G/G (1 - да, 0 - нет),
FSHR_A/G - наличие у пациентки генотипа FSHR: A/G (1 - да, 0 - нет),
FSHR_G/G - наличие у пациентки генотипа FSHR: G/G (1 - да, 0 - нет),
LHCGR (935 A>G)_A/G - наличие у пациентки генотипа LHCGR: 935 A/G (1 - да, 0 - нет),
LHCGR (935 A>G)_A/G - наличие у пациентки генотипа LHCGR: 935 А/А (1 - да, 0 - нет),
LHCGR (872 A>G)_A/G - наличие у пациентки генотипа LHCGR: 872 A/G (1 - да, 0 - нет),
LHCGR (872 A>G)_A/A - наличие у пациентки генотипа LHCGR: 872 А/А (1 - да, 0 - нет),
по результатам генотипирования определяют вероятность получения эмбрионов низкого качества по формуле
р=1/(1+е^-z), где
Z=-2236-0,79*AMH_T/G-20,621*AMH_G/G+0,993*FSHR_A/G+0,364*FSHR_G/G-1,206*LHCGR(935 A>G)_A/G+1,164*LHCGR(935 A>G)_A/A+22,888*LHCGR(872 A>G)_A/G+21,6*LHCGR(872 A>G)_A/A,
и при значениях p больше 0,5 прогнозируют получение эмбрионов низкого качества, а при значениях р меньше 0,5 не прогнозируют получение эмбрионов низкого качества.