Способ прогнозирования получения эмбрионов отличного и хорошего качества в программах вспомогательных репродуктивных технологий при нормозооспермии Российский патент 2023 года по МПК G01N33/50 

Способ прогнозирования получения эмбрионов отличного и хорошего качества в программах вспомогательных репродуктивных технологий при нормозооспермии.

Изобретение относится к медицине, а именно к области клинико-лабораторной диагностики, репродуктологии и эмбриологии и может быть использовано для прогнозирования уровня бластуляции получаемых эмбрионов и оптимизации проводимого лечения бесплодия у пациенток методом экстракорпорального оплодотворения (ЭКО).

Необходимость в применении вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) непрерывно растает, однако по данным Национального регистра Российской Ассоциации Репродукции Человека, эффективность программы ЭКО составляет не более 38,5% в расчете на перенос эмбриона [1]. Одним из ключевых факторов наступления беременности при использовании ВРТ является получение достаточного количества эмбрионов хорошего качества [2]. Способность прогнозировать количество получаемых эмбрионов хорошего качества позволит оптимизировать подготовку пациентов к проведению ВРТ и выбрать наиболее эффективный вариант ведения эмбриологического этапа.

В настоящее время ведется поиск и апробация маркеров имплантационного потенциала эмбрионов, которые позволяют анализировать метаболомный, протеомный, транскриптомный статусы фолликулярной жидкости и культуральных сред, в которых культивируются эмбрионы [3,4,5,6]. Ранее было предложено использовать для прогнозирования качества получаемых эмбрионов показатели концентрации ингибина В и лактоферрина в фолликулярной жидкости, уровня лептина в периферической крови[4,5].

Однако методы прогнозирования качества эмбрионов с учетом состава фолликулярной жидкости или культуральной среды, в которой находились эмбрионы, могут быть использованы только в момент проведения программы ВРТ, когда невозможно скорректировать тактику проводимого протокола лечения. По этой причине перечисленные способы прогнозирования качества эмбрионов пока не нашли широкого применения в клинической практике.

Поиск дополнительных маркеров, позволяющих повысить эффективность проводимого лечения у конкретной пары, остается важнейшей задачей репродуктологии.

С точки зрения этапности подготовки пары к ВРТ представляется перспективным поиск взаимосвязи между микробиологическими показателями эякулята и эффективностью эмбриологического этапа. Наличие бактерий в эякуляте может являться причиной контаминации эмбриологических сред, а также пагубно влиять на развивающиеся эмбрионы. Однако в литературе можно найти единичные упоминания о влиянии микробного состава эякулята на качество эмбрионов в программах ВРТ [7,8].

Аналогами прогнозирования уровня бластуляции эмбрионов с учетом микробного состава эякулята явились:

1. Способ прогнозирования качества эмбриона при проведении ЭКО у женщин с бесплодием (пат. РФ 2441243, 2010) [11]. При превышении содержания HLA-DR+ моноцитов более 68% в периферической венозной крови женщин с бесплодием прогнозируют получение эмбриона высокого качества.

Недостатки метода. При использовании метода не оцениваются анамнестические данные мужчины за исключением параметров спермограммы. При использовании метода не указаны условия проведения эмбриологического этапа ВРТ, которые могут влиять на качество эмбриона.

2. Способ прогнозирования качества эмбрионов в программе экстракорпорального оплодотворения (пат. РФ 2474823, 2011) [12]. При выявлении носительства аллелей DQBl*06 и/или DRBl*13 генов HLA II класса прогнозируют получение эмбрионов высокого качества, при отсутствии аллелей DQB1*06 и DRBl*13 прогнозируют низкое качество эмбрионов.

Недостатки метода. При использовании метода не учитываются анамнестические данные мужчины. Метод прогнозирует качество эмбрионов только для группы женщин с трубно-перитонеальным бесплодием.

3. Способ прогнозирования качества эмбрионов в программах вспомогательных репродуктивных технологий с учетом генотипа пациенток (пат. РФ 2577729, 2016) [13]. Женщине, планирующей проведение ВРТ, проводят генотипирование полиморфных локусов АМН 146 G>T(Ile49Ser), FSHR 2039 G>A (Ser680Asn), LHCGR 935 A>G (Asn312Ser), LHCGR 872 A>G (Asn291Ser) и по формуле рассчитывают вероятность получения эмбрионов низкого качества.

Недостатки метода. При описании метода не учитываются данные о микробиологическом исследовании эякулята, используемого для оплодотворения.

4. Способ прогнозирования получения незрелых ооцитов в программах вспомогательных репродуктивных технологий с использованием молекулярно-технологических маркеров (пат. РФ 2577712, 2016) [14]. При выявлении в периферической крови пациенток с трубно-перитонеальным фактором бесплодия полиморфных локусов AMHR2 (-482 A>G), LHCGR (Ser312Asn), ESR2 G>A, LHCGR (Asn291Ser) прогнозируют получение незрелых ооцитов в программах ВРТ с вероятностью 92,5%.

Недостатки метода. Метод не учитывает вклад мужского фактора в результативность программ ЭКО, не оценивает дальнейшее развитие эмбрионов. Метод учитывает только группы цациенток с трубно-перинеальным фактором бесплодия.

Таким образом перед авторами была поставлена задача разработать эффективный способ прогнозирования получения эмбрионов хорошего и отличного качества в программах вспомогательных репродуктивных технологий при нормозооспермии.

Поставленная задача достигается путем комплексного исследования эякулята на этапе предгравидарной подготовки, включающее оценку параметров спермограммы по стандарту ВОЗ, и определение микробного состава эякулята с помощью количественной полимеразной цепной реакции (ПЦР) с детекцией результатов в реальном времени (ПЦР-РВ) с помощью тест-системы Андрофлор (ООО «ДНК-Технология ТС», Москва).

Материал для исследования (нативный эякулят) собирали в день оплодотворения яйцеклеток в пробирку Эппендорф, содержащую 0,5 мл физиологического раствора. ДНК выделяли с использованием комплекта реагентов ПРОБА-ГС (ООО «ДНК-Технология ТС», Москва). ПЦР-РВ проводили согласно инструкции производителя (https://www.dna-technology.ru/equipmentpr/nabory-reagentov-dlya-pcr-nabory-reagentov-dlya-vydeleniya-nukleinovyh-kislot-i-3).

Проводилось определение 24 показателей: общей бактериальной массы (ОБМ) образца и 23 групп микроорганизмов, из них 4 определяли качественно, остальные - количественно. На Фиг. 1. представлен Образец заключения. Анализ «Андрофлор».

Для обработки и анализа полученных данных использовалась компьютерная программа StatPlus:mac 8.0.3 (AnalystSoft, США).

В предлагаемом способе прогнозирования получения эмбрионов хорошего и отличного качества впервые в репродуктологии предложена уникальная формула для определения вероятности получения не менее 40% эмбрионов хорошего и отличного качества до начала программы ВРТ. Наличие не менее 40% бластоцист (эмбрионов 5 дня развития) хорошего и отличного качества является одним из индикаторов успешности проведения эмбриологического этапа [9].

Для исследования, мужчины, проходящие лечение методом ВРТ, собирали эякулят в стерильный контейнер в соответствии с рекомендациями ВОЗ по сбору эякулята для микробиологических исследований (пункт 2.2.4 Руководства ВОЗ) [10]. Анализ концентрации и подвижности сперматозоидов проводили с использованием анализатора Биола АФС-500 (НПФ «Биола», Москва). Морфологию сперматозоидов оценивали в окрашенных препаратах при 1000х увеличении микроскопа с использованием иммерсионного объектива. Для подсчета пероксидазо-положительных лейкоцитов использовали тест Лейкоскрин.

Способ позволяет рассчитывать прогноз для случаев нормозооспермии. Критериям нормозооспермии соответствовали пробы с объемом эякулята не менее 1,5 мл, концентрацией сперматозоидов не менее 15 млн/мл, общей подвижностью не менее 40% или прогрессивной подвижностью не менее 32%, нормальной морфологией сперматозоидов не менее 4%, рН 7,2, количеством лейкоцитов не более 1 млн/мл, отсутствием эритроцитов, выраженной агглютинации и агрегации сперматозоидов, отсутствием повышенной вязкости.

В исследование было включено 111 пациентов из супружеских пар, страдающих бесплодием и планирующих реализовать репродуктивную функцию с помощью экстракорпорального оплодотворения (ЭКО). В зависимости от количества сформировавшихся бластоцист хорошего и отличного качества на эмбриологическом этапе культивирования пациенты были разделены на 2 группы. В первую группу включено 49 пациентов, у которых были получены не менее 40% бластоцист хорошего и отличного качества. Во вторую группу включено 62 пациента, у которых сформировалось менее 40% бластоцист хорошего и отличного качества.

Для удобства оценки вероятности получения не менее 40% эмбрионов хорошего и отличного качества для пар, в которых параметры спермограммы у мужчины соответствовали критериям нормозоосперии, нами был разработан способ прогнозирования с расчетом прогностического индекса ЭХО-Про-N (Эмбрионы Хорошего и Отличного качества Прогноз Нормозооспермия). Для разработки прогностического индекса в полученных матрицах клинико-лабораторных показателей проведен дискриминантный анализ переменных в исследуемых группах.

Для определения относительного вклада каждого отдельного микроорганизма в формирование вероятности получения более 40% бластоцист хорошего и отличного качества и разработки прогностического индекса проведено ранжирование признаков с помощью расчета канонических коэффициентов дискриминантной функции (ККДФ).

Наиболее значимыми микроорганизмами, необходимыми для расчета вероятности получения эмбрионов отличного и хорошего качества являлись следующие группы микроорганизмов: Staphylococcus spp., Haemophilus spp., Pseudomonas aeruginosa/Ralstonia spp./Burkholderia spp., Enter obacteriaceae/Enterococcus spp., Gardnerella vaginalis, Eubacterium spp., Sneathia spp./Leptotrihia spp./Fusobacterium spp., Megasphaera spp./Veillonella spp./Dialister spp., Bacteroides spp./Porphyromonas spp./Prevotella spp., Anaerococcus spp., Peptostreptococcus spp./Parvimonas spp., Atopobium cluster, Ureaplasma urealyticum, Ureaplasma parvum, Lactobacillus spp. Также учитывалась общая бактериальная масса (ОБМ). Данные были определены в формате Lg ГЭ/мл (геномэквивалентов в мл).

Индекс ЭХО-Про-N рассчитывается по формуле:

где X1 - ОБМ - общая бактериальная масса,

Х2 - Lactobacillus spp.,

Х3 - Staphylococcus spp.,

Х4 - Gardnerella vaginalis,

X5 - Megasphaera spp./Veillonella spp./Dialister spp.,

X6 - Sneathia spp./Leptotrichia spp./Fusobacterium spp.,

X7 - Ureaplasma urealyticum,

X8 - Ureaplasma parvum,

X9 - Atopobium cluster,

X10 - Bacteroides spp./Porphyromonas spp./Prevotella spp.,

X11 - Anaerococcus spp.,

X12 - Peptostreptococcus spp./Parvimonas spp.,

X13 - Eubacterium spp.,

X14 - Haemophilus spp.,

X15 - Pseudomonas aeruginosa/Ralstonia spp./Burkholderia spp.,

X16 - Enterobacteriaceae spp./Enterococcus spp.

Если значение прогностического индекса ЭХО-Про-NX) - прогнозируют, что вероятность получения более 40% бластоцист хорошего и отличного качества низкая, если ЭХО-Про-N≤0 - высокая.

Среднее значение ЭХО-Про-N в группах 1 и 2 составило соответственно - 0,25 (-0,93-0,3) и 0,34 (0-0,74). Различия статистически значимы (р<0,001). На Фиг. 2 графически представлены значения индекса ЭХО-Про-N в группах 1 и 2.

Для оценки эффективности предлагаемого способа прогнозирования был проведен ROC-анализ. На Фиг. 3 представлена ROC-кривая для индекса ЭХО-Про-N. Площадь под кривой (areaundercurve - AUC) составила 0,752 (ДИ 95% 0,66-0,84), что соответствует хорошему качеству модели прогнозирования.

Для определения чувствительности и специфичности представленного способа прогнозирования использовалась экзаменационная выборка.

Показатели чувствительности и специфичности составили соответственно 73,47% и 72,58%, эффективность способа - 72,97%) (таблица 2).

Новизна предлагаемого способа заключается в том, что впервые на основании показателей микробного состава и параметров спермограммы эякулята проводится высокоэффективное прогнозирование получения достаточного количества эмбрионов отличного и хорошего качества.

Отличительные признаки способа: с помощью теста «Андрофлор» получают данные о микробном составе эякулята у пациентов с нормозооспермией и на основании полученных данных рассчитывают вероятность получения не менее 40% бластоцист отличного и хорошего качества.

Примеры практического использования заявляемого способа.

Пример 1. Супруги В. обратились для проведения программы ЭКО по поводу первичного трубного бесплодия в течение 6 лет. Пациент В., 37 лет, параметры спермограммы соответствуют нормозооспермии. Пациентка В., 35 лет, из анамнеза: 6 лет назад проведена лапароскопия и аднексэктомия справа по поводу осложнения после аппендэктомии. Через 4 года проведена гистеросальпингография (ГСГ) - левая маточная труба проходима, еще через 3 года проведена гистероскопия, в результате которой проведена полипэктомия, удалены железисто-фиброзные полипы. Через 2 года предпринята первая попытка ЭКО: проведена стимуляция суперовуляции по короткому протоколу с антагонистами ГнРГ, в день аспирации получено 4 ооцит-кумулюсных комплекса (ОКК), получено 2 эмбриона, беременность не наступила.

Данная попытка ЭКО вторая. Согласно, заявляемого способа, взят образец нативного эякулята в день аспирации ооцитов. Проведен тест «Андрофлор». Заключение по результатам теста: Структура бактериального микробиома соответствует норме. ДНК патогенных микроорганизмов не выявлена. Candida spp.ниже порогового уровня.

На Фиг. 1 представлены результаты теста «Андрофлор» пациента В. Определены значения степени количества микроорганизмов в lg ГЭ/мл.: X1-3,5; Х2, Х3, Х4, Х5, Х6, Х7, Х8, Х9, Х, 10, Х11, Х12, Х14, Х15, Х16-0; Х13-3,1.

Используя результаты теста рассчитываем индекс ЭХО-Про-N:

Значение полученного индекса показывает, что прогноз получения эмбрионов отличного и хорошего качества высокий. В результате траснвагинальной пункции аспирировано 4 ОКК, 3 из них - зрелые яйцеклетки. В результате оплодотворения методом ЭКО получены 2 нормальные зиготы, на 5 день из них выросли 2 бластоцисты, одна из которых - отличного качества, что составило 50%. В результате переноса 2 эмбрионов наступила беременность.

Пример 2. Супруги К., обратились для проведения программы ЭКО по поводу вторичного бесплодия в течение 7 лет, причина бесплодия - отсутствие овуляции. Пациент К, 33 лет, параметры спермограммы соответствуют норме. Пациентка К., 33 лет, в анамнезе - 1 беременность в возрасте 20 лет, наступила спонтанно, завершилась срочными родами.

Данная попытка ЭКО первая. Взят образец нативного эякулята в день аспирации ооцитов. Заключение по результатам теста «Андрофлор»: ДНК патогенных микроорганизмов не выявлена. Candida spp. - ниже порогового уровня. Структура бактериального микробиома изменена: присутствуют условно-патогенные микроорганизмы.

На Фиг. 4 представлены результаты теста «Андрофлор» пациента К. Определены значения степени количества микроорганизмов в lg ГЭ/мл: X1-4,4; Х-3,9; Х3-0; Х4-4,0; Х5-4,0; Х6-0; Х7-2,3; Х8-2,2; Х9-3,1; Х10-3,4; X11-0; Х12-0; Х13-3,7; Х14-0; Х15-0; Х16-0; Рассчитываем индекс ЭХО-Про-N.

Полученный результат прогноза - вероятность получения эмбрионов отличного и хорошего качества низкая. В результате траснвагинальной пункции аспирировано 17 ооцитов, 8 из них - зрелые. В результате оплодотворения методом ЭКО получены 8 нормальных зигот, на 5 день из них выросли 3 бластоцисты, две из которых - хорошего и отличного качества, что составило 25%. В результате переноса 2 эмбрионов беременность не наступила.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет прогнозировать эффективность эмбриологического этапа ВРТ у пар, планирующих процедуру ЭКО, при показателях эякулята, соответствующих критериям нормозооспермии.

Данный способ может быть использован на этапе предварительного обследования мужчин из пар, планирующих проведение ВРТ. В случае выявления отклонений в микробном составе эякулята по результатам теста «Андрофлор» врач-андролог предлагает провести корректирующую терапию до начала программы ВРТ и подобрать оптимальную тактику ведения эмбриологического этапа программы ВРТ. В случае если прогноз получения достаточного количества эмбрионов низкий, рекомендуется проведение оплодотворения методом интрацитоплазматической инъекции сперматозоида в яйцеклетку (ИКСИ), а также применение более тщательного этапа «отмывки» сперматозоидов, используемых для оплодотворения.

Способ удобен в применении, так как не требует дополнительных инвазивных вмешательств, легкодоступен, обеспечивает быстрое получение необходимой информации, применим перед проведением начала лечения бесплодия методом ВРТ. Оценка микробиоты эякулята методом ПЦР-РВ может быть выполнена одновременно со спермограммой из одного образца.

Список литературы.

1. Национальный регистр РАРЧ // Российская ассоциация репродукции человека: ежегодн. отчет. 2019. URL: https://rahr.ru/d_registr_otchet/RegistrART2019.pdf (Дата обращения: 01.02.2022).

2. Ильина А.А., Калинина И.И., Трошина Т.Г., Ильин К.А., Болтовская М.Н., Степанова И.И., Аншина М.Б. Фолликулярная жидкость как среда, определяющая качество ооцита и исход программ ВРТ (обзор литературы) // Проблемы репродукции. - 2008. - №4. - С. 27-38.

3. Валиахметова Э.З. и др. Неинвазивное тестирование преимплантационных эмбрионов человека in vitro как способ прогнозирования исходов программ экстракорпорального оплодотворения //Акушерство и гинекология. - 2021. - №. 5. - С. 5-16.

4. Yanaihara A., MitsukawaK., Iwasaki S., Otsuki K., Kawamura Т., Okai Т. High concentrations of lactoferrin in the follicular fluid correlate with embryo quality during in vitro fertilization cycles // Fertil. Steril - 2007. - Vol. 87. - N.2. - P.279-282

5. Chang C.L., Wang T.H., Horng S.G., Wu H.M., Wang H.S., Soong Y.K. The concentration of inhibinBin follicular fluid: relation to oocyte maturation and embryo development // Hum.Reprod. - 2002. - Vol. 17. - N.7. - P. 1724-1728.

6. Georgios A., Eleni K., Ioannis S., Vassilios L., Constantinos L., ThemisM., Nikolaos V. Serum and follicular fluid leptin levels are correlated with human embryo quality // Reproduction. - 2005. Vol. 130 - P. 917-921.

7. Stsepetova J. et al. The complex microbiome from native semen to embryo culture environment in human in vitro fertilization procedure //Reproductive Biology and Endocrinology. - 2020. - T. 18. - №. 1. - C. 1-13.

8. Zeyad A. et al. Relationships between bacteriospermia, DNA integrity, nuclear protamine alteration, sperm quality and ICSI outcome // Reproductive biology. - 2018. - Т. 18. - №. 1. - C. 115-121.

9. The Vienna consensus: report of an expert meeting on the development of ART laboratory performance indicators // Reproductive BioMedicine Online. - 2017. - T. 35. - №. 5. - C. 494-510.

10. Руководство ВОЗ по исследованию и обработке эякулята человека, пятое издание // Москва, 2012.

11. Патент на изобретение РФ №2441243 от 27.01.2012 «Способ прогнозирования качества эмбриона при проведении ЭКО у женщин с бесплодием» / Сотникова Н.А., Речистова И.В., Посисеева Л.В. и др.

12. Патент на изобретение РФ №2474823 от 10.02.2013 «Способ прогнозирования качества эмбрионов в программе экстракорпорального оплодотворения» / Малышкина А.И., Липин М.А., Фетисова И.Н. и др.

13. Патент на изобретение РФ №2577729 от 20.03.2016 «Способ прогнозирования качества эмбрионов в программах вспомогательных репродуктивных технологий с учетом генотипа пациентов» / Донников А.Е., Калинина Е.А., Владимирова И.В. и др.

14. Патент на изобретение РФ №2577712 от 20.03.2016 «Способ прогнозирования получения незрелых ооцитов в программах вспомогательных репродуктивных технологий с использованием молекулярно-технологических» / Калинина Е.А., Донников А.Е., Владимирова И.В. и др.

Изобретение относится к медицине, а именно к репродуктологии. На основе сведений о показателях микробного состава эякулята, определяемых в lg ГЭ/мл, тест «Андрофлор», рассчитывают прогностический индекс - ЭХО-Про-N по оригинальной формуле. И если значение ЭХО-Про-N>0 - вероятность получения более 40% эмбрионов отличного и хорошего качества низкая, если ЭХО-Про-N≤0 - высокая. Способ обеспечивает быстрое получение результатов прогнозирования, не требует дополнительных инвазивных вмешательств, легкодоступен, применим перед проведением начала лечения бесплодия методом ВРТ. 2 пр., 2 табл., 4 ил.

Способ прогнозирования получения эмбрионов отличного и хорошего качества в программах вспомогательных репродуктивных технологий при нормозооспермии, характеризирующийся тем, что проводят тест «Андрофлор» в эякуляте, выделяют значение общей бактериальной массы и значения показателей микроорганизмов, в lg ГЭ/мл: Staphylococcus spp., Haemophilus spp., Pseudomonas aeruginosa/Ralstonia spp./Burkholderia spp., Enterobacteriaceae/Enterococcus spp., Gardnerella vaginalis, Eubacterium spp., Sneathia spp./Leptotrihia spp./Fusobacterium spp., Megasphaera spp./Veillonella spp./Dialister spp., Bacteroides spp./Porphyromonas spp./Prevotella spp., Anaerococcus spp., Peptostreptococcus spp./Parvimonas spp., Atopobium cluster, Ureaplasma urealyticum, Ureaplasma parvum, Lactobacillus spp. и рассчитывают прогностический индекс ЭХО-Про-N по формуле:

где X1 - ОБМ - общая бактериальная масса,

Х2 - Lactobacillus spp.,

Х3 - Staphylococcus spp.,

Х4 - Gardnerella vaginalis,

X5 - Megasphaera spp./Veillonella spp./Dialister spp.,

X6 - Sneathia spp./Leptotrichia spp./Fusobacterium spp.,

X7 - Ureaplasma urealyticum,

X8 - Ureaplasma parvum,

X9 - Atopobium cluster,

X10 - Bacteroides spp./Porphyromonas spp./Prevotella spp.,

X11 - Anaerococcus spp.,

X12 - Peptostreptococcus spp./Parvimonas spp.,

X13 - Eubacterium spp.,

X14 - Haemophilus spp.,

X15 - Pseudomonas aeruginosa/Ralstonia spp./Burkholderia spp.,

X16 - Enter ohacteriaceae spp./Enterococcus spp.,

и если значение прогностического индекса ЭХО-Про-N≤0 - вероятность получения более 40% эмбрионов отличного и хорошего качества высокая, а если ЭХО-Про-N>0 - низкая.