СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ЭМБРИОНОВ ОТЛИЧНОГО КАЧЕСТВА У ЖЕНЩИН В ПРОГРАММАХ ЭКСТРАКОРПОРАЛЬНОГО ОПЛОДОТВОРЕНИЯ Российский патент 2025 года по МПК G01N33/74 G01N33/68 A61B5/107 

Изобретение относится к гинекологии и репродуктологии, и может быть использовано для прогнозирования эмбрионов отличного качества у женщин в программах экстракорпорального оплодотворения (ЭКО).

Стремительное развитие и совершенствование методов культивирования и витрификации эмбрионов при проведении программ ЭКО позволяют культивировать их до стадии бластоцисты на 5-е сутки, что в значительной степени увеличивает шансы на успешную имплантацию (Краснопольская К.В., Бекетова А.Н., Сесина Н.И., Чинченко Н.К., Конеева Ц.О., Бочарова Т.В. Сравнение результативности переносов эмбрионов на 5-е и 6-е сутки развития в свежих циклах или криопротоколах экстракорпорального оплодотворения. Проблемы репродукции. 2019;25(5):86-91). При этом наиболее высокой результативности можно достичь при переносе самых качественных бластоцист с наилучшими морфологическими параметрами, которые учитывают размер полости бластоцисты, количество клеток и характер расположения/компактность внутренней клеточной массы и трофобласта (Громенко Ю.Ю., Исхаков И.Р."Влияние факторов оценки качества перенесенных эмбрионов на прогнозирование частоты наступления беременности в программах экстракорпорального оплодотворения" Медицинский вестник Башкортостана, 2012, Т. 7, № 2, с. 27-30). Однако, даже в случае переноса морфологически безупречных бластоцист может последовать неудача и/или отсутствие имплантации. Поэтому для уточнения прогноза получения качественных эмбрионов предложено несколько способов.

Некоторые из них основаны на определении маркеров (ингибина В и лактоферрина) в фолликулярной жидкости преовуляторных фолликулов (Chang CL, Wang TH, Horng SG, Wu HM, Wang HS, Soong YK. The concentration of inhibin B in follicular fluid: relation to oocyte maturation and embryo development. Hum Reprod. 2002 Jul;17(7):1724-8); Yanaihara A, Mitsukawa K, Iwasaki S, Otsuki K, Kawamura T, Okai T. High concentrations of lactoferrin in the follicular fluid correlate with embryo quality during in vitro fertilization cycles. Fertil Steril. 2007 Feb;87(2):279-82). Однако, эти методики носят инвазивный характер. Для получения фолликулярной жидкости требуется проведение трансвагинальной пункции под наркозом. Дополнительно следует учитывать потенциальное наличие возможностей лабораторного определения указанных маркёров в фолликулярной жидкости.

Следующая группа методов относится к молекулярно-генетическим. К ним можно отнести определение относительного содержания HLA-DR+ моноцитов в венозной крови женщин с бесплодием (патент РФ №2441243, 27.01.2012). Основными недостатками этого метода являются технические сложности с использованием дорогостоящих и узкодоступных реактивов и оборудования: обработка суспензии клеток антителами анти-HLA-DR, конъюгированными с флюоресцеинизотионатом, использование проточного цитометра. Предложены способы прогнозирования путем определения полиморфизма генов HLA II класса DQBl06 и/или DRBl13 в лейкоцитах периферической венозной крови до начала овариальной стимуляции (патент РФ №2474823, 10.02.2013) и генотипирования пациенток по полиморфным локусам: АМН 146 G>T (Ile49Ser) [rs10407022], FSHR 2039 G>A (Ser680Asn) [rs6166], LHCGR 935 A>G (Asn312Ser) [rs2293275], LHCGR 872 A>G (Asn291Ser) [rs12470652] (патент РФ №2577729, 20.03.2016). В этих случаях требуется проведение дорогостоящей полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием специфичных праймеров, а также сложный математический анализ с построением бинарной логистической регрессионной модели.

Третья группа методов основывается на микробиологическом анализе эякулята (патент РФ №2804586, 02.10.2023; патент РФ №2807471, 15.11.2023), что требует проведения ограниченно доступных микробиологических исследований в специальной лаборатории с определением микробного состава эякулята (23 микроорганизмов) с помощью ПЦР и тест-системы Андрофлор. Таким образом, все указанные способы прогнозирования имеют узкоспецифичные технические особенности, которые препятствуют их широкому использованию в отделениях вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ).

Наиболее близкий прототип предлагаемого способа прогнозирования качества эмбрионов упоминается в работе (Lin WQ, Yao LN, Zhang DX, Zhang W, Yang XJ, Yu R. The predictive value of anti-Mullerian hormone on embryo quality, blastocyst development, and pregnancy rate following in vitro fertilization-embryo transfer (IVF-ET). J Assist Reprod Genet. 2013 Jun;30(5):649-55). Авторами показано наличие положительной корреляции между количеством эмбрионов хорошего качества и уровнем Антимюллерова гормона (АМГ) в сыворотке женщин на начало программы ЭКО, на 6-ой день после стимуляции гонадотропином и в фолликулярной жидкости при проведении пункции фолликулов. Однако, в этой и других работах (Kim JH, Lee JR, Chang HJ, Jee BC, Suh CS, Kim SH. Anti-Müllerian hormone levels in the follicular fluid of the preovulatory follicle: a predictor for oocyte fertilization and quality of embryo. J Korean Med Sci. 2014 Sep;29(9):1266-70; Melado Vidales L, Fernández-Nistal A, Martínez Fernández V, Verdú Merino V, Bruna Catalán I, Bajo Arenas JM. Anti-Müllerian hormone levels to predict oocyte maturity and embryo quality during controlled ovarian hyperstimulation. Minerva Ginecol. 2017 Jun;69(3):225-232; Scheffer JB, Carvalho RF, Aguiar APS, Machado IJM, Franca JB, Lozano DM, Fanchin R. Which ovarian reserve marker relates to embryo quality on day 3 and blastocyst; age, AFC, AMH? JBRA Assist Reprod. 2021 Feb 2;25(1):109-114) не уточняется, какие эмбрионы считаются хорошими, либо эмбрионы классов А и В учитываются вместе. В то же время в классификации D. Gardner и W.Schoolcraft (Gardner DK, Schoolcraft WB. Culture and transfer of human blastocysts. Curr Opin Obstet Gynecol. 1999 Jun;11(3):307-11) указано, что эмбрионы 4АА и 5АА считаются отличного качества. Бластоцисты с характеристиками В относятся к хорошим, либо удовлетворительным. Учитывая тот факт, что наибольшая вероятность имплантации у эмбрионов отличного качества с наилучшими морфологическими параметрами, отсутствие соответствующей информации в упомянутых работах можно отнести к недостатку, требующему уточнения. Более того, не проведено определение конкретных диапазонов значений АМГ, имеющих прогностическое значение в отношении эмбрионов хорошего качества. Авторы ссылаются лишь на наличие значимой корреляции. Не учитывалось влияние заболеваний, оказывающих влияние на количество и качество ооцитов.

В одном из исследований была предпринята попытка связать качество эмбрионов с концентрацией ТТГ и антител к тиреопероксидазе без учёта уровня АМГ (Weghofer A, Himaya E, Kushnir VA, Barad DH, Gleicher N. The impact of thyroid function and thyroid autoimmunity on embryo quality in women with low functional ovarian reserve: a case-control study. Reprod Biol Endocrinol. 2015 May 15;13:43). Таким образом, имеющиеся в литературе сведения относительно прогностической значимости некоторых показателей требуют существенного уточнения и дополнения.

Техническим результатом настоящего изобретения является повышение прогностической точности получения эмбрионов отличного качества у женщин в программах экстракорпорального оплодотворения.

Технический результат достигается тем, что осуществляют забор венозной крови у пациентки, определяют уровень антимюллерова гормона (АМГ), дополнительно собирают данные анамнеза о наличии или отсутствии ожирения, противопоказаний к ЭКО и о возрасте пациентки; при этом, если женщине от 26 до 35 лет, у неё нет противопоказаний к ЭКО, уровень АМГ составляет от 3 до 22 нг/мл и пациентка не страдает ожирением, то прогнозируют более высокую вероятность получения эмбрионов отличного качества, а если уровень АМГ менее 2 нг/мл и пациентка страдает ожирением, то прогнозируют низкую вероятность получения эмбрионов отличного качества.

Изобретение поясняется фигурами.

Фиг. 1. График, демонстрирующий достоверную (r = 0.477, p < 0,001) положительную корреляционную зависимость количества эмбрионов отличного качества (по основной вертикальной оси) от уровня АМГ (нг/мл) (по основной горизонтальной оси).

Способ основан на сравнительном исследовании клинико-анамнестических и лабораторно-инструментальных данных женщин (n = 171), проходивших программы ЭКО в Областном Перинатальном Центре г. Курска в 2021 году. Культивирование эмбрионов осуществлялось до стадии бластоцисты. Качество эмбрионов оценивали на 5-е сутки перед переносом эмбрионов по классификации D. Gardner и W.Schoolcraft (Gardner DK, Schoolcraft WB. Culture and transfer of human blastocysts. Curr Opin Obstet Gynecol. 1999 Jun;11(3):307-11). К бластоцистам отличного качества относили эмбрионы класса 5АА и 4АА. Согласно результатам, получение 5 и более эмбрионов отличного качества было возможно при более высоких уровнях антимюллерова гормона (АМГ) (Таблица 1). Во всей исследуемой когорте наблюдалась высоко значимая положительная корреляция между уровнем АМГ в венозной крови женщин непосредственно перед началом программы ЭКО и количеством эмбрионов отличного качества (r = 0,477, p < 0,001) (Фиг. 1). Дополнительно выявлены отрицательная корреляция (r = - 0,187, p < 0,015) между количеством эмбрионов отличного качества и наличием у пациенток ожирения и положительная корреляция (r = 0,221, p < 0,004) между количеством эмбрионов отличного качества и наличием синдрома поликистозных яичников (СПКЯ).

Известно, что АМГ является предиктором количества и качества ооцитов. При этом, у пациенток с СПКЯ уровень АМГ достоверно повышен (Боярский, К. Ю., Гайдуков, С. Н., Машкова, Е. А. Роль антимюллерова гормона (амг) в норме и при различных гинекологических заболеваниях. Журнал акушерства и женских болезней. 2009. LVIII (3), 75-85). Согласно результатам недавнего исследования группа пациенток с СПКЯ гетерогенна и включает в себя женщин с разными значениями показателя FORT (follicular output rate). В случае высокого значения FORT получают эмбрионы высокого качества и высокую вероятность наступления беременности (Yang H, Lin J, Jin C, Meng L, Wu S, Chen Y. The Predictive Value of the Follicular Output Rate on Pregnancy Outcome of Patients with Polycystic Ovary Syndrome Undergoing In Vitro Fertilization and Embryo Transfer. Med Sci Monit. 2020 Dec 11;26:e916175). По данным другого исследования, у пациенток с СПКЯ получают значимо больше ооцитов в программах ЭКО (Nikbakht R, Mohammadjafari R, Rajabalipour M, Moghadam MT. Evaluation of oocyte quality in Polycystic ovary syndrome patients undergoing ART cycles. Fertil Res Pract. 2021 Jan 5;7(1):2). Однако, достоверных различий качества ооцитов и эмбрионов по сравнению с женщинами, не страдающими СПКЯ, не отмечено. В настоящем исследовании пациентки с СПКЯ были включены в программы ЭКО. В 75% у них зафиксированы высокие значения АМГ (как правило, выше 5 нг/мл), большее количество ооцитов и эмбрионов отличного качества. Однако, у приблизительно 25%, несмотря на высокие значения АМГ, эмбрионов отличного качества не было, либо их получено мало (всего 1 или 2). Следует отметить, что получение эмбрионов отличного качества у пациенток с СПКЯ не гарантирует наступления беременности ввиду сопутствующих эндокринных нарушений. Отрицательный эффект ожирения на количество эмбрионов отличного качества обусловлен прежде всего липотоксичностью, снижающей количество, качество и даже размер ооцитов. Повышенный уровень жирных кислот оказывает токсичное воздействие на ооциты: повреждаются их митохондрии и эндоплазматическая сеть, нарушается формирование веретена деления в мейозе, хромосомы не выравниваются в метафазных пластинках, усиливается апоптоз ооцитов. Помимо этого, жировая ткань продуцирует провоспалительные адипокины (например, лептин), создающие условия хронического воспаления. Повышенный уровень лептина нарушает стероидогенез в клетках гранулёзы фолликулов. Показано, что у женщин с повышенным индексом массы тела ооциты после оплодотворения имеют тенденцию останавливаться в развитии и часто не достигают стадии бластоцисты (Broughton DE, Moley KH. Obesity and female infertility: potential mediators of obesity's impact. Fertil Steril. 2017 Apr;107(4):840-847; Gonzalez MB, Robker RL, Rose RD. Obesity and oocyte quality: significant implications for ART and emerging mechanistic insights. Biol Reprod. 2022 Feb 22;106(2):338-350). Таким образом, использование уровня АМГ в венозной крови и наличие факта ожирения для прогностической оценки получения эмбрионов отличного качества вполне обоснованы.

Т.к. у большинства женщин, у которых получено 5 и более эмбрионов отличного качества, уровень АМГ составлял от 3 (25-й процентиль или первый квартиль, Таблица 1) до 22 нг/мл (максимальное значение в изученной когорте), то прогностические значения АМГ находятся в диапазоне от 3 до 22 нг/мл. При указанных значениях АМГ у 60% женщин было получено 5 и более эмбрионов отличного качества, у 29% - от 2-х до 4-х эмбрионов отличного качества. Первый квартиль или 25-й процентиль значений АМГ, при которых получено менее 5 эмбрионов отличного качества составляет от 2 нг/мл (Таблица 1). Самое низкое значение АМГ в исследованной группе 0,8 нг/мл. При значениях АМГ ниже 2 нг/мл и отсутствии у женщины ожирения в среднем было получено около 2-х эмбрионов отличного качества (2,2±0,34) (Таблица 2). Если факт наличия ожирения был зафиксирован в медицинской карте пациентки, то при уровне АМГ ниже 2 нг/мл, как правило, было получено не более 1 эмбриона отличного качества (0,86±0,26).

Таблица 1

Уровень АМГ (нг/мл) (Me [Q1;Q3]) у женщин с различным количеством эмбрионов отличного качества в программах ЭКО (n=171).

5 и более эмбрионов отличного качества Менее 5 эмбрионов отличного качества при наличии бластоцист среднего и плохого качества значение р 5 [3; 13,5] 3 [2; 9,5] 0,000007

Таблица 2

Количество эмбрионов отличного качества (Me [Q1;Q3]) у женщин в программах ЭКО

(n=171) в зависимости от уровня АМГ.

АМГ ≥3 нг/мл АМГ <2 нг/мл значение р 7 [6; 15] 1,5 [0; 5,25] 0,0004

Способ осуществляется следующим образом. Осуществляют забор венозной крови у пациентки, определяют уровень антимюллерова гормона (АМГ), дополнительно собирают данные анамнеза о наличии или отсутствии ожирения, противопоказаний к ЭКО и о возрасте пациентки; при этом, если женщине от 26 до 35 лет, у неё нет противопоказаний к ЭКО, уровень АМГ составляет от 3 до 22 нг/мл, и пациентка не страдает ожирением, то прогнозируют более высокую вероятность получения эмбрионов отличного качества, а если уровень АМГ менее 2 нг/мл, и пациентка страдает ожирением, то прогнозируют низкую вероятность получения эмбрионов отличного качества.

Пример 1 конкретного выполнения.

Женщина 33 года, вступила в программу ЭКО с уровнем АМГ 3,5 нг/мл, ожирением не страдает. После культивирования на 5-е сутки получено 5 эмбрионов отличного качества и 1 эмбрион удовлетворительного качества.

В данном случае у женщины в возрастной группе 26-35 лет при отсутствии ожирения и уровне АМГ от 3 до 22 нг/мл получено 5 эмбрионов отличного качества.

Пример 2.

Женщина 27 лет, вступила в программу ЭКО с уровнем АМГ 8,2 нг/мл, ожирением не страдает. После культивирования на 5-е сутки получено 5 эмбрионов отличного качества и 1 эмбрион хорошего качества.

В данном случае у женщины в возрастной группе 26-35 лет при отсутствии ожирения и уровне АМГ от 3 до 22 нг/мл получено 5 эмбрионов отличного качества.

Пример 3.

Женщина 27 лет, вступила в программу ЭКО с уровнем АМГ 3,9 нг/мл, ожирением не страдает. После культивирования на 5-е сутки получено 8 эмбрионов отличного качества и 1 эмбрион неудовлетворительного качества.

В данном случае у женщины в возрастной группе 26-35 лет при отсутствии ожирения и уровне АМГ от 3 до 22 нг/мл получено 8 эмбрионов отличного качества.

Пример 4.

Женщина 34 года, вступила в программу ЭКО с уровнем АМГ 5 нг/мл, ожирением не страдает. После культивирования на 5-е сутки получено 8 эмбрионов отличного качества и 1 эмбрион удовлетворительного качества.

В данном случае у женщины в возрастной группе 26-35 лет при отсутствии ожирения и уровне АМГ от 3 до 22 нг/мл получено 8 эмбрионов отличного качества.

Пример 5.

Женщина 35 лет, вступила в программу ЭКО с уровнем АМГ-1,2 нг/мл, страдает ожирением. После культивирования на 5-е сутки получен 1 эмбрион отличного качества и 1 эмбрион удовлетворительного качества.

В данном случае у женщины в возрастной группе 26-35 лет при наличии ожирения и уровне АМГ менее 2 нг/мл получен лишь 1 эмбрион отличного качества.

Пример 6.

Женщина 35 лет, вступила в программу ЭКО с уровнем АМГ-1,3 нг/мл, страдает ожирением. После культивирования на 5-е сутки получен 1 эмбрион хорошего качества и 1 эмбрион удовлетворительного качества.

В данном случае у женщины в возрастной группе 26-35 лет при наличии ожирения и уровне АМГ менее 2 нг/мл не получено эмбрионов отличного качества.

Пример 7.

Женщина 31 лет, вступила в программу ЭКО с уровнем АМГ-1,3 нг/мл, страдает ожирением. После культивирования на 5-е сутки получен 1 эмбрион отличного качества и 1 эмбрион неудовлетворительного качества.

В данном случае у женщины в возрастной группе 26-35 лет при наличии ожирения и уровне АМГ менее 2 нг/мл получен лишь 1 эмбрион отличного качества.

Таким образом, проведенные исследования демонстрируют, что предложенный способ учёта уровня АМГ и ожирения в совокупности с общепринятыми лабораторными и инструментальными методами исследования позволяет повысить прогностическую точность получения эмбрионов отличного качества у женщин программах ЭКО.

Изобретение относится к медицине, а именно к гинекологии и репродуктологии, и может быть использовано для прогнозирования эмбрионов отличного качества у женщин в программах экстракорпорального оплодотворения. Осуществляют забор венозной крови у пациентки, определяют уровень антимюллерова гормона (АМГ). Дополнительно собирают данные анамнеза о наличии или отсутствии ожирения, противопоказаний к ЭКО и о возрасте пациентки. Если женщине от 26 до 35 лет, у неё нет противопоказаний к ЭКО, уровень АМГ составляет от 3 до 22 нг/мл и пациентка не страдает ожирением, то прогнозируют более высокую вероятность получения эмбрионов отличного качества. Если уровень АМГ менее 2 нг/мл и пациентка страдает ожирением, то прогнозируют низкую вероятность получения эмбрионов отличного качества. Способ обеспечивает возможность повышения прогностической точности получения эмбрионов отличного качества у женщин в программах ЭКО за счет определения уровня АМГ в крови пациентки и сбора данных анамнеза: наличия ожирения, противопоказаний к ЭКО и возраста пациентки. 1 ил. 2 табл., 7 пр.

Способ прогнозирования эмбрионов отличного качества у женщин в программах экстракорпорального оплодотворения, отличающийся тем, что осуществляют забор венозной крови у пациентки, определяют уровень антимюллерова гормона (АМГ), дополнительно собирают данные анамнеза о наличии или отсутствии ожирения, противопоказаний к ЭКО и о возрасте пациентки; при этом если женщине от 26 до 35 лет, у неё нет противопоказаний к ЭКО, уровень АМГ составляет от 3 до 22 нг/мл и пациентка не страдает ожирением, то прогнозируют более высокую вероятность получения эмбрионов отличного качества, а если уровень АМГ менее 2 нг/мл и пациентка страдает ожирением, то прогнозируют низкую вероятность получения эмбрионов отличного качества.