Способ определения адгезивной активности лактобактерий и/или бифидобактерий пробиотического или аутопробиотического препарата и способ индивидуального подбора указанных препаратов Российский патент 2024 года по МПК C12N1/00 G06N3/02 A61K35/742 

Группа изобретений относится к области медицины, а именно к микробиологии, и может быть использовано в бактериологических лабораториях для индивидуального подбора пробиотических препаратов, содержащих лактобактерии и/или бифидобактерии, а также для идентификации выделенных у обследуемого аутоштаммов лактобактерий и/или бифидобактерий.

Известно, что лактобациллы являются одним из важных компонентов кишечного биоценоза. У этих бактерий имеется выраженная антагонистическая активность по отношению к патогенным и условно-патогенным бактериям, что является важным механизмом предотвращения дисбактериозов кишечника. По мнению многих исследователей, поддержание нормальной численности лактобацилл на слизистых желудочно-кишечного тракта является важным этапом лечения дисбактериоза кишечника и, связанного с ним, дисбактериоза влагалища.

Сформировавшиеся дисбактериозы кишечника трудно поддаются лечению и для полного выздоровления, сопровождающегося нормализацией микрофлоры и восстановлением эубиоза, требуется длительное время. Для этих целей неоднократно предлагалось использовать препараты, содержащие живые лактобактерий, например, лактобактерин. Главным условием эффективности такого лечения является прикрепление лактобактерий к клеткам эпителия желудочно-кишечного тракта - т.е. адгезия. Способность к адгезии является одним из важнейших свойств микроорганизмов, способствующих формированию определенных микробных ценозов, в том числе и аутохтонных ценозов, ведущая роль в которых принадлежит бифидобактериям и лактобактериям. [Мельников В.А. Стулова С.В. Тюмина О.В. Денисова Н.Г. Щукин В.Ю Аутотрансплантация лактобацилл в восстановлении индивидуального биоценоза влагалища женщины. Фундаментальные исследования. - 2012. - №1 - С. 64-67].

Известно, что адгезия лактобацилл носит специфический характер и зависит от соответствия рецепторов конкретного штамма лактобацилл к рецепторам эпителиальных клеток конкретного человека. С момента рождения у ребенка формируется толерантность к нормальной микрофлоре матери [тендеров Б.А. Нормальная микрофлора и ее роль в поддержании здоровья человека. Росс. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. 1998; 8 (1): 61-65]. В течение жизни сайты адгезии - места прикрепления бактерий к слизистой и рецепторы нормофлоры к эпителиоцитам желудочно-кишечного тракта (далее - ЖКТ) становятся генетически детерминированными, специфическими для каждого конкретного человека. К сайтам адгезии могут надежно прикрепиться только аутоштаммы этого конкретного человека или производственные штаммы бактерий нормофлоры с рецепторами, близкими по строению к аутоштаммам.

Адгезивность является важным свойством для успешного приживления пробиотических штаммов коммерческих препаратов на основе латобактерий. Интенсивность адгезии может существенно варьировать в зависимости от используемых пробиотических штаммов и от условий проведения эксперимента по ее оценке.

Известен способ определения адгезивной активности лактобактерий к буккальному и влагалищному эпителию, где доказана возможность использования буккального эпителия при оценке адгезивности пробиотических штаммов лактобактерий [Бойцов А.Г., Рищук С.В., Ильясов Ю.Ю., Гречанинова Т.А. Адгезия лактобактерий к клеткам вагинального и буккального эпителия // Вестник Санкт-Петербургской Медицинской академии им И.И. Мечникова. - 2004. - №4(5). С. 191-193]. Согласно известному методу, взятие буккального эпителия производили путем соскоба клеток эпителия с внутренней поверхности щеки стерильными шпателями. Затем соскобленный эпителий погружали в буфер и осаждали центрифугированием. Клетки помещали в пробирки Эппендорфа с цитрат-фосфатным буфером.

Известен способ определения антагонистической активности пробиотиков по патенту RU 2187801 (опубл. 20.08.2002), включающий воздействие пробиотика на бактериальную тест-культуру, отличающийся тем, что в качестве тест-культуры используют люминисцентные бактерии, а антагонистическую активность пробиотика оценивают по изменению интенсивности биолюминесценции бактерий тест-культуры.

Известен по патенту RU 2412989 (опубл. 27.02.2011) способ индивидуального выявления антагонистической активности пробиотических препаратов, содержащих лактобактерий и/или бифидобактерии, в отношении условно-патогенных микроорганизмов, выделенных при диагностике дисбактериоза кишечника, при котором выделяют штаммы условно-патогенных микроорганизмов (УПМ) из фекалий обследуемого, затем выделяют лактобактерий и/или бифидобактерии, входящие в состав пробиотического препарата в чистой культуре. Определяют антагонистическую активность лактобактерий и/или бифидобактерии одновременно методом двухслойного агара и методом перевернутого агара, при этом посев осуществляют по Gold. Оценивают мощность антагонистического воздействия пробиотических штаммов по степени интенсивности подавления штаммов УПМ по сравнению с контролем. При индивидуальном выявлении антагонистической активности пробиотических препаратов, содержащих лактобактерий, при отсутствии антагонистической активности или выявлении низкой или средней степени интенсивности подавления УПМ антагонистическую активность дополнительно определяют капельной методикой.

Известен по патенту RU 2428468 (опубл. 10.09.2011) способ индивидуального подбора пробиотических препаратов, содержащих лактобактерий и/или бифидобактерии, для элиминации условно-патогенных микроорганизмов, выделенных от пациента при исследовании на дисбактериоз кишечника. Индивидуальный подбор пробиотиков осуществляют при средней или высокой степенях адгезивной активности пробиотических штаммов с использованием буккального эпителия конкретного пациента, а также наличии биосовместимости пробиотических и индигенных лакто- и бифидобактерий и высокой степени антагонистической активности пробиотических штаммов несколькими способами в отношении УПМ, выделенного от конкретного пациента.

Недостатками известных способов является то, что оценка адгезивной активности ведется визуально, образцы при длительном нахождении на свету высыхают, выцветают, подсчет ведется длительно и работа превращается в рутинную. Также не исключен человеческий фактор - ошибки при подсчете, поэтому необходима автоматизация оценки индекса адгезивности в образцах.

Технической проблемой, решаемой данным изобретением, является повышение точности способа для оптимизации подбора пробиотических препаратов для конкретного человека и идентификации аутоштаммов микроорганизмов, а также снижение времени получения результата.

Решение технической проблемы достигается тем, что способ определения адгезивной активности лактобактерий и/или бифидобактерий пробиотического или аутопробиотического препарата включает получение буккального эпителия обследуемого, выделение входящих в состав пробиотического или аутопробиотического препарата лактобактерий и/или бифидобактерий в чистой культуре, проведение реакции адгезии клеток буккального эпителия с лактобактериями и/или бифидобактериями, определение адгезивной активности в образцах по индексу адгезивности, при этом изображения образцов переводят в электронный вид с помощью цифрового микроскопа, и загружают в программу, в которой осуществляют распознавание клеток с помощью нейронной сети с глубоким обучением.

Индекс адгезивности определяют как отношение количества адгезированных бактерий к единице площади клетки буккального эпителия с учетом корректирующего коэффициента. Индекс адгезивности в диапазоне 0,1-0,32 характеризует низкую степень адгезивной активности, в диапазоне 0,321-0,97 - среднюю, выше 0,97 - высокую.

Данная градация была получена эмпирическим путем и позволяет более точно относить каждый случай к конкретному значению качественной характеристики, а также вносить новые необходимые корректировки в связи с обновлением статистики.

Корректирующий коэффициент - величина, учитывающая масштаб и габариты изображения для более наглядного предоставления результатов.

Решение технической проблемы достигается также тем, что способ индивидуального подбора пробиотического или аутопробиотического препарата, содержащих лактобактерий и/или бифидобактерии, включает определение адгезивной активности лактобактерий и/или бифидобактерий, при этом адгезивную активность определяют как описано выше с последующим подбором пробиотического или аутопробиотического препарата на основании индекса адгезивности, характеризующего среднюю или высокую степень адгезивной активности.

Согласно предложенному способу взятие буккального эпителия производят путем соскоба клеток эпителия с внутренней поверхности щеки стерильными шпателями. Соскобы помещают в цитрат-фосфатный буфер и доставляют в лабораторию в течение 2-3 часов. Непосредственно перед началом исследования эпителиальные клетки отмывают путем трехкратного центрифугирования (1000 об/мин - 5 минут) для удаления клеточных обломков.

Стандартными способами выделяют чистую культуру лактобактерий и/или бифидобактерий из аутоштаммов, выделенных из фекалий обследуемого, с целью для подтверждения идентичности аутоштаммов лактобактерий и бифодобактерий.

Для проведения исследования по адгезии лактобактерий и/или бифидобактерий к буккальному эпителию, лактобактерий и/или бифидобактерий трижды отмывают цитрат-фосфатным буфером Мак-Илвейна с рН 5,4 путем центрифугирования. Из осадка готовят суспензию лактобактерий с титром 10⁶ клеток в 1 мл по «стандарту мутности».

Затем проводят реакцию адгезии клеток буккального эпителия с лактобактериями и/или бифидобактериями. Для изучения адгезивной активности в пробирку Эппендорфа вносят 800 мкл суспензии эпителиальных клеток и 600 мкл суспензии лактобактерий (бифидобактерий). Содержимое пробирок тщательно перемешивают и инкубируют в течение 2 часов при температуре 37°С с периодическим повторным перемешиванием путем переворачивания пробирок. После инкубации не адсорбированные бактериальные клетки удаляют путем двукратного отмывания путем центрифугирования (1000 об/мин в течение трех минут). Далее проводят контрастное окрашивание образцов спиртовым раствором 0,5% кристаллического фиолетового. Образец считают пригодным для дальнейшего исследования, если при микроскопии (увеличение ×900) в каждом поле зрения было не менее 2-3 эпителиальных клеток. При микроскопии препарата подсчитывают количество бактериальных клеток, прикрепившихся к поверхности каждой эпителиальной клетки. Ручным способом в каждом препарате анализируют не менее 5-ти клеток, определяют индекс адгезивности по среднеарифметическому числу адгезированных микроорганизмов (см. табл.). Результат выражают в виде среднеарифметического числа лактобактерий (бифидобактерий) на поверхности одного эпителиоцита, в частности для подтверждения идентичности выделенных аутоштаммов лактобактерий, поскольку к эпителиоцитам щечного эпителия конкретного человека могут надежно прикрепиться только аутоштаммы этого конкретного человека или производственные штаммы бактерий нормофлоры с рецепторами, близкими по строению к аутоштаммам.

Изображения образцов переводят в электронный вид с помощью цифрового микроскопа, и загружают в программу, в которой осуществляется распознавание клеток с помощью нейронной сети с глубоким обучением.

Для успешного и эффективного использования методов машинного обучения крайне важно решить первичную ключевую задачу - создать data-set, набор данных, на основании которого будут осуществляться все дальнейшие эксперименты по применению технических решений. Методы распознавания изображений крайне чувствительны к тому, на основании какой выборки осуществляется обучение моделей, и то на какой выборке данных она будет эксплуатироваться в дальнейшем. Как следствие вышесказанного, возникает задача - стандартизация полученных изображений, но поскольку ключевым возможным фактором вариативности получаемых изображений является изменчивость исходных образов, то возникает задача - стандартизация исследуемых объектов. Исследуемые образцы, прошедшие стадии подготовки к исследованию, например, отмывание и окрашивание, имеют ряд факторов, которые могут повлиять на изменчивость. Вторичным фактором изменчивости получаемых изображений является настройка микроскопа и экспозиции камеры, с помощью, которых осуществляется фотосъемка образцов.

На следующем этапе подготовки изображений осуществлялось формирование выборки изображений с клетками лакто- и бифидобактерий. В результате, было отобрано около 500 изображений, которые с наибольшей дисперсионностью описывают полноту выборки с требуемыми свойствами, и на основании которой осуществлялось тестирование инструментов распознавания.

В рамках поиска технического решения рассматриваемой задачи были протестированы алгоритмические методы распознавания с использованием машинного обучения, нейронные сети с глубоким обучением, нейронные сети с кластеризацией выборки и их различные технологии; в результате тестирования и оценки качества, скорости распознавания было принято решением использовать нейронные сети с глубоким обучением.

В рамках используемого метода распознавания было протестировано 50 обученных моделей нейронных сетей. Скорость распознавания одного изображения занимает около 2-х секунд. Погрешность вычислений многократно ниже методов ручного подсчета.

Разработка системы распознавания образов на основе нейронных сетей с глубоким обучением позволяет ускорить процесс оценки адгезионных процессов в несколько раз, повысить точность получаемых результатов. Многократно снизить нагрузку на органы зрения специалистов.

Пример 1. У обследуемого С.О.С. производят взятие буккального эпителия путем соскоба клеток эпителия с внутренней поверхности щеки стерильным шпателем. Получают суспензию лактобактерий, выделенных из чистой культуры пробиотического препарата. Далее проводят реакцию адгезии клеток буккального эпителия с лактобактериями, как описано выше. Затем полученные изображения образцов отбирают и переводят в цифровой вид согласно заявляемому способу. Далее изображения анализируют с помощью нейронной сети с глубоким обучением. В результате анализа был получен ответ, что индекс адгезивности составляет 0,34.

Пример 2. У обследуемого К.В.И. производят взятие буккального эпителия путем соскоба клеток эпителия с внутренней поверхности щеки стерильным шпателем. Затем получают аутоштамм следующим образом: пробу содержимого толстой кишки отбирают в предварительно взвешенную стерильную емкость. Определяют количество отобранной пробы путем повторного взвешивания контейнера. Для декантаминации биоматериала от транзиторной микрофлоры проводят последовательны е десятикратные разведения испытуемого образца физиологическим раствором до 10^-8.

Для выделения бифидобактерий готовят 1 ряд из 10 пробирок со средой Блаурокка. Для выделения лактобактерий готовят 7 пробирок со средой МРС-4. Исследуемый материал из разведений 10^-6 засевают на соответствующие питательные среды для выделения лактобактерий и бифидобактерий. Через двое суток материал из изолированных колоний лактобактерий, выросших на среде МРС-4, в наибольшем разведении (103) и из изолированных колоний бифидобактерий, выросших на питательной среде Блаурокка, в наибольшем разведении (10⁷), вновь пересевают на соответствующие селективные питательные среды. Выросшие через 2 суток после второго пассажа изолированные колонии бифидобактерий и лактобактерий пересевают на жидкие среды МРС-4 и Блаурокка для получения биомассы микроорганизмов, которая используется в виде аутоштаммов для лечения дисбактериоза кишечника.

Контроль полученного аутопробиотического препарата осуществляют общепринятыми методами посева на селективные питательные среды: Эндо, Плоскирева, МПА для определения посторонней микрофлоры - на этих средах в аэробных условиях рост бактерий отсутствует.

Оценку количественного содержания бактерий аутоштаммов в биомассе аутопробиотика бифидобактерий проводят на среде Блаурокка и лактобактерий на агаризованной среде МРС-4 (путем подсчета колоний в среде Блаурокка в 10^-8, 10^-9 разведениях, на агаризованной среде МРС-4 в 10^-6, 10^-7 разведениях и выражают в КОЕ/г кишечного содержимого). В биомассе аутопробиотика содержание бифидобактерий составило (1,0-2,4)×10⁹ КОЕ/г, содержание лактобактерий - (1,0-2,5)×10⁷ КОЕ/г. Уровень кислотообразующей активности бифидобактерий составил (98±4) Т° (единиц Тернера), лактобактерий.. (114±4) Т°.

Получают суспензию бифидобактерий, выделенных из чистой культуры аутопробиотика. Далее проводят реакцию адгезии клеток буккального эпителия с бифидобактерими, как описано выше. Затем полученные изображения образцов отбирают и переводят в цифровой вид согласно заявляемому способу. Далее изображения анализируют с помощью нейронной сети с глубоким обучением. В результате анализа был получен ответ, что индекс адгезивности составляет 0,64.

Изобретение относится к области биотехнологии. Описана группа изобретений, включающая способ определения адгезивной активности лактобактерий и/или бифидобактерий пробиотического или аутопробиотического препарата и способ индивидуального подбора пробиотического или аутопробиотического препарата, содержащих лактобактерии и/или бифидобактерии, включающий определение адгезивной активности лактобактерий и/или бифидобактерий вышеуказанным способом. Изобретение расширяет арсенал способов оптимизации подбора пробиотических препаратов для конкретного человека и идентификации аутоштаммов микроорганизмов. 2 н. и 3 з.п. ф-лы, 1 табл., 2 пр.

1. Способ определения адгезивной активности лактобактерий и/или бифидобактерий пробиотического или аутопробиотического препарата, включающий получение буккального эпителия обследуемого, выделение входящих в состав пробиотического или аутопробиотического препарата лактобактерий и/или бифидобактерий в чистой культуре, проведение реакции адгезии клеток буккального эпителия с лактобактериями и/или бифидобактериями, определение адгезивной активности в образцах по индексу адгезивности, отличающийся тем, что изображения образцов переводят в электронный вид с помощью цифрового микроскопа, и загружают в программу, в которой осуществляют распознавание клеток с помощью нейронной сети с глубоким обучением.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что индекс адгезивности определяют как отношение количества адгезированных микроорганизмов к единице площади клетки буккального эпителия с учетом корректирующего коэффициента.

3. Способ по п. 2, отличающийся тем, что индекс адгезивности в диапазоне 0,1-0,32 характеризует низкую степень адгезивной активности, в диапазоне 0,321-0,97 - среднюю, выше 0,97 - высокую.

4. Способ по п. 2, отличающийся тем, что корректирующий коэффициент представляет собой величину, учитывающую масштаб и габариты изображения.

5. Способ индивидуального подбора пробиотического или аутопробиотического препарата, содержащих лактобактерий и/или бифидобактерий, включающий определение адгезивной активности лактобактерий и/или бифидобактерий, отличающийся тем, что адгезивную активность определяют по пп. 1-4 с последующим подбором пробиотического или аутопробиотического препарата на основании индекса адгезивности, характеризующего среднюю или высокую степень адгезивной активности.