СПОСОБ ОТДЕЛЕНИЯ ТРИПТОФАНА Российский патент 2016 года по МПК C07D209/20 B01D15/18 

Настоящее изобретение относится к способу выделения триптофана из водных смесей веществ, прежде всего из уже частично подвергнутых переработке ферментационных бульонов, путем хроматографии с псевдодвижущимся слоем (ПДС-хроматографии, англ. "simulated moving bed chromatography", называемой также хроматографией с псевдопротивотоком) и к устройству для осуществления этого способа.

Уровень техники

Триптофан в целом получают ферментативным путем, т.е. с помощью микроорганизмов. Сказанное относится в особенности к его биологически утилизируемой L-форме. По завершении ферментации биомассу инактивируют и отделяют, а жидкую фракцию (надосадочную жидкость) подвергают дальнейшей переработке. Завершающей стадией процесса очистки обычно является кристаллизация, при которой триптофан получают в виде высокочистого твердого вещества путем отделения от жидкой фракции, так называемого маточного раствора. Он насыщен триптофаном и помимо него содержит еще соли, другие аминокислоты, а также иные более подробно не определимые органические компоненты, образовавшиеся в процессе ферментации.

В том случае, когда в результате ферментации помимо целевого продукта образуются фенилаланин и тирозин, которые представляют собой также ароматические аминокислоты и которые присутствуют при этом в не пренебрежимо малых концентрациях, их выделение из маточного раствора в целях их отделения от триптофана затруднительно по причине схожих с ним физико-химических свойств, и поэтому маточный раствор часто отбраковывают.

В US 5300653 описан способ выделения ароматических аминокислот из водных растворов путем катионообменной хроматографии без указания определенных параметров технологического режима. Описанным в указанной публикации способом невозможно было разделить обе ароматические аминокислоты - триптофан и фенилаланин.

В статье Ribeiro и др., опубликованной в Bioprocess Engineering, 12, 1995, сс.95-102, описано выделение триптофана из смесей с серином, представляющим собой алифатическую аминокислоту, и индолом путем избирательной адсорбции триптофана на различных видах активированного угля и на абсорбентах из органических полимеров при pH 8,0. Помимо прочего при этом использовали полимер XAD-7 (фирмы Rohm & Haas, Филадельфия, США). Исходный материал представлял собой раствор, который содержал серии и индол и из которого с помощью иммобилизованных микроорганизмов получали триптофан. Разделяемая смесь кроме трех этих веществ не содержит никакие иные аминокислоты, соответственно аналогичные им компоненты. Помимо этого состав смеси не подвержен в отличие от полученных ферментативным путем исходных сред никаким колебаниям. Процесс разделения проводили в периодическом режиме. В качестве неорганического десорбента на водной основе согласно указанной публикации использовали раствор NaOH (0,05-молярный), а также раствор HCl (0,1-молярный). Десорбция чистой водой в данной публикации не упоминается. Из другого адсорбента (XAD-4, фирма Rohm & Haas, Филадельфия, США) триптофан удалось десорбировать лишь путем добавления органического растворителя, например метанола или изопропанола.

В статье Wu и др., опубликованной в Industrial and Engineering Chemistry Research, 37, 1998, сс.4023-4035, описано разделение определенной двухкомпонентной смеси ароматических аминокислот - триптофана и фенилаланина - в воде без температурного градиента. В качестве адсорбента использовали ПВП (поли-4-винилпиридин, Reillex HP polymer, фирмы Vertellus Specialties Inc, Индианаполис, США). В качестве десорбента использовали воду. Процесс разделения проводили аналогично известному 4-зонному способу с псевдодвижущимся слоем и с замкнутым внутренним контуром циркуляции жидкости. Задачу по разделению существенно упрощает сама двухкомпонентная смесь строго определенного состава, поскольку в ней в отличие от полученных ферментативным путем исходных растворов невозможно протекание побочных реакций с неопределенными другими соединениями.

Адсорбция аминокислот на нейтральных полимерных адсорбентах описана далее у Doulia и др. в Journal of Chemical Technology and Biotechnology, 76, 2001, сс.83-89. В данном случае наиболее сильное связывание ароматических аминокислот - триптофана и фенилаланина - наблюдалось с двумя абсорбентами XAD-2 и XAD-4 (Rohm & Haas, Филадельфия, США). Повышение ионной силы раствора приводило к увеличению степени адсорбции. Однако в данной публикации отсутствуют всякие сведения о десорбции.

Из EP 1106602 B1 известно выделение основной аминокислоты (L-лизина) из растворов, содержащих L-лизин и дополнительно примеси, методом хроматографии с псевдодвижущимся слоем. Процесс проводят в последовательно соединенных хроматографических колонках, заполненных сильным катионообменником.

Однако катионообменники не пригодны для отделения триптофана в том случае, когда растворы дополнительно содержат фенилаланин и/или тирозин, поскольку такие соединения сравнимым образом взаимодействуют с ионообменником.

В US 5071560 описана избирательная адсорбция фенилаланина на нейтральном полимере XAD-7 с последующей десорбцией фенилаланина водой, спиртом, кетонами или сложными эфирами. Этим способом адсорбируемый фенилаланин отделяют от других, не взаимодействующих с адсорбентом компонентов и путем десорбции вновь отделяют от адсорбента. Переработке подобным способом подвергают ферментационный бульон, который наряду с фенилаланином главным образом содержит соли, молочную кислоту, а также другие, более подробно не определимые аминокислоты.

Основные принципы ПДС-метода впервые были описаны в патенте US 2985589 (1961). В последние годы исследовалось множество различных вариантов осуществления этого метода. Обзорную информацию в этом отношении можно найти, например, у Guiochon и др. в "Fundamentals of Preparative and Nonlinear Chromatography" (изд-во Academic Press, New York, U.S.A., 2006) или у Seidel-Morgenstern и др. в Chemical Engineering and Technology, 31, 2008, сс.826-837.

ПДС-метод, основанный на использовании растворителя меняющегося состава (градиента растворителя) и на использовании трех активных зон, а также одной вынесенной зоны для компенсации колебаний градиента, описан, например, у L.C. Keßler и др. в Journal of Chromatography, A 1176, 2007, сс.69-78, на примере очистки антител и протеинов. Решающее значение для этого метода является применение солей в разных концентрациях для достижения разных сил взаимодействия. Десорбентом служили растворы хлорида натрия различных концентраций.

В основу настоящего изобретения была положена задача разработать способ выделения триптофана из водных смесей веществ, прежде всего из маточных растворов, образующихся после кристаллизации триптофана из ферментационных бульонов, и повысить тем самым выход триптофана в качестве продукта ферментации.

Объектом настоящего изобретения является способ выделения растворенного триптофана из водной, прежде всего содержащей другие ароматические аминокислоты смеси веществ по одному из вариантов хроматографии с псевдодвижущимся слоем (ПДС-хроматографии), заключающийся в том, что в разделительной части с колоночной системой, состоящей из не менее чем двух последовательно соединенных колонок, заполненных пригодным для применения в качестве адсорбента органическим полимером, и подразделенной на несколько функциональных зон, предпочтительно на три функциональные зоны,

а) содержащую растворенный триптофан смесь веществ и воду в качестве десорбента непрерывно подают в раздельных местах колоночной системы и

б) в расположенном между этими подводами месте отводят обогащенный триптофаном поток экстракта и отдельно от него в еще одном месте, расположенном по ходу потока перед подводом триптофансодержащей смеси веществ, отводят содержащий другие соединения из исходной смеси веществ поток рафината, при необходимости подвергают поток экстракта дальнейшей переработке, а также предпочтительно

в) колонки, насыщенные не десорбированными соединениями из смеси веществ, очищают от этих соединений.

Термин "обогащенный" означает, что поток экстракта содержит триптофан со степенью чистоты, соответственно в концентрации, которая выше, чем в исходно подаваемой смеси веществ.

В одном из вариантов под смесью веществ подразумеваются прежде всего ферментационные бульоны, которые образуются продуцирующим триптофан микроорганизмом при ферментации и наряду с другими примесями содержат также фенилаланин и/или тирозин и от которых в предпочтительном варианте предварительно была отделена биомасса.

В предпочтительном варианте предлагаемый в изобретении способ выполняют непосредственно после кристаллизации, при которой триптофан получают в виде высокочистого твердого вещества и отделяют от него надосадочную жидкость, так называемый маточный раствор. Он насыщен триптофаном и помимо него содержит еще соли, иные аминокислоты, такие, например, как фенилаланин и/или тирозин, а также другие, более подробно не определимые и действующие в качестве загрязняющих примесей соединения, образовавшиеся в ходе ферментации. Такой маточный раствор в предпочтительном варианте разделяют заявленным способом на

а) продуктсодержащий поток (экстракт), в котором присутствует преобладающее количество содержащегося в маточном растворе триптофана и который одновременно значительно очищен от примесных веществ, соответственно значительно обеднен ими, а также

б) отбросный поток (рафинат), в котором присутствуют остальные нежелательные компоненты маточного раствора.

Схема подобного процесса представлена на прилагаемом к описанию единственном чертеже.

Полученный продуктсодержащий поток затем вновь объединяют с основным потоком процесса переработки ферментационного бульона перед стадией кристаллизации, при необходимости после концентрирования путем сгущения, и таким путем подвергают дальнейшей переработке.

Продуктсодержащий поток в том случае, когда исходно используемый поток представляет собой не содержащий клеток ферментационный раствор, можно также непосредственно подвергать дальнейшей переработке как таковой. Благодаря этому повышается выход триптофана при его ферментативном получении. Данный аспект является частью настоящего изобретения.

Предлагаемый в изобретении способ может также заменить собой описанную выше кристаллизацию.

Для отделения триптофана используют органический полимер, который характеризуется средней полярностью. При создании настоящего изобретения было установлено, что такой материал способен практически полностью отделять триптофан от ароматических аминокислот - фенилаланина и тирозина - и одновременно значительно снижать содержание других примесей. К таковым в особенности относятся также УФ-активные побочные продукты (англ. "UV-by products"), которые при анализе на содержание загрязняющих примесей стандартным методом согласно европейской фармакопее, дополнение 6.3 (European Pharmacopoeia 6.3), элюируются либо перед триптофаном ("UV-BP before"), либо после него ("UV-BP after").

Для применения в качестве адсорбента особенно пригодны неионогенные полимерные адсорбенты, способные обратимо адсорбировать триптофан благодаря тому, что их взаимодействие с триптофаном сильнее, чем с примесями. Прочнее удерживаемый адсорбентом триптофан можно затем вновь десорбировать водой при температуре в предпочтительном интервале от 20 до примерно 80°С, при этом с увеличением температуры процесс десорбции ускоряется, а тем самым снижается и степень удерживания триптофана адсорбентом. Преобладающая часть органических примесей, которые также содержатся в исходных ферментационных бульонах, например, фрагментов протеинов микробного происхождения или побочных продуктов, таких как фенилаланин или тирозин, на протекающей в соответствии с изобретением стадии разделения не взаимодействует с адсорбентом или взаимодействует с ним явно слабее, чем триптофан, и поэтому их можно обнаружить в элюате, соответственно в рафинате. Немногие примеси также адсорбируются и остаются на адсорбенте даже при десорбции водой. Такие примеси десорбируют щелочными, соответственно кислыми растворами на последующей стадии очистки. Затем очищенные таким путем колонки вновь включают в процесс разделения. К пригодным для применения адсорбентам относятся полимеры из группы материалов, содержащих акрильные/метакрильные группы, и полимеров на основе полистирола.

Предпочтительными адсорбентами являются акриловые полимеры, такие, например, как XAD7, XAD7HP^® (фирма Rohm & Haas) или HP2MG^® (фирма Diaion).

Наиболее пригодны для применения адсорбенты, которые

а) имеют остов из акрилатов, предпочтительно метакрилатов, акриловой кислоты и ее производных,

б) сшиты поперечными алифатическими связями, предпочтительно полифункциональными мономерами,

в) обладают вытекающим из обоих вышеуказанных свойств дипольным моментом, который выше, чем у материалов на основе сополимера стирола с дивинилбензолом,

г) имеют макросетчатую пористую структуру,

д) обладают приемлемо высокой удельной поверхностью,

е) характеризуются отсутствием ионообменного взаимодействия.

Разделительная система не подвергается воздействию органических растворителей, поскольку согласно изобретению для разделения требуется только вода, прежде всего деминерализованная вода, подаваемая с температурой от 20 до примерно 98°С, предпочтительно от 60 до 70°С. Благодаря этому обеспечивается возможность простого ведения технологического процесса и исключается внесение дополнительных посторонних веществ, соответственно примесей. Аппаратурное оформление реализуется по варианту процесса с псевдодвижущимся слоем, проиллюстрированному на прилагаемом к описанию чертеже.

Колонки соединяют между собой с помощью клапанных систем, которые имеются на рынке, и в одном из вариантов реализации по истечении определенного времени ("времени периодического переключения") одновременно переключают или перемещают по кругу с помощью такой клапанной системы. В данном случае для этого используется центральный переключающий или распределительный клапан фирмы Knauer (Knauer Wissenschaftliche Gerätebau GmbH, Берлин). Однако для реализации предлагаемого в изобретении способа можно использовать и иные клапанные системы, например, соединенные по соответствующей схеме двухходовые клапаны. Противоток твердой фазы (адсорбента) в этом варианте реализации предлагаемого в изобретении способа имитируется путем изменения местоположения подводов и отводов. В данном случае возможно также не одновременное поэтапное включение подводов и отводов согласно патенту US 6136198. Еще одна возможность заключается в последовательном выполнении описанных ниже стадий примерно по принципу последовательного ПДС (S. Baudouin и X. Lancrenon, Industries Alimentaires et Agricoles, 120, 2003, сс.42-48). Основной принцип предлагаемого в изобретении способа принципиально позволяет адаптировать его ко всем уже известным вариантам непрерывной и периодической хроматографии и благодаря этому придать ей новые функциональные возможности.

Поток жидкости при работе в ПДС-режиме проходит через несколько заполненных адсорбентом колонок с его неподвижным слоем. Предлагаемое в изобретении устройство путем непрерывной подачи, соответственно непрерывного отбора потоков исходного материала (Q_Feed), десорбента (Q_Des), экстракта (Q_Ex) и рафината (Q_Ra) подразделяют на три функциональные зоны, как это показано на прилагаемом к описанию чертеже. Каждая отдельная из числа этих зон выполняет при этом особую функцию по разделению, соответственно по переработке. При использовании разделяемых смесей не точно определенного состава предпочтителен согласно изобретению незамкнутый кругооборот жидкости ("open loop"). Каждая функциональная зона содержит от одной до нескольких хроматографических колонок.

Помимо этого существует также возможность, предпочтительно при добавлении четвертой зоны, расположенной по ходу потока перед местом отбора рафината, реализовать замкнутый кругооборот жидкости.

При осуществлении ПДС-способа по предпочтительному согласно изобретению варианту с незамкнутым кругооборотом жидкости существуют в основном три внутренних (Q_I, Q_II и Q_III) и четыре внешних материальных потока (Q_Feed, Q_Des, Q_Ex и Q_Ra), которые связаны между собой следующими уравнениями баланса:

Q_I=Q_Des,

Q_II=Q_I-Q_Ex,

Q_III=Q_II+Q_Feed=Q_Ra.

Для задания рабочей точки значения массового, соответственно объемного расхода, а также продолжительность такта t_s необходимо специфицировать таким образом, чтобы решалась задача по разделению и чтобы тем самым достигалась экономически оптимальная работа при соблюдении заданного объема производства в единицах продукции. Продолжительностью такта t_s при этом определяется "скорость" мнимого противотока ("псевдопротивотока") твердой фазы и тем самым в решающей степени определяется результат разделения. Значения расхода можно задавать в соответствии с уровнем техники различными путями, например, способом, описанным у Guiochon и др. в "Fundamentals of Preparative and Nonlinear Chromatography" (изд-во Academic Press, New York, U.S.A., 2006).

Создаваемый в ПДС-процессе противоток используется для отделения триптофана от смешанной фракции загрязняющих примесей. В основе разделения лежат при этом соответствующие различия в скорости миграции соединений, используемые для направления триптофана, а также смешанной фракции загрязняющих примесей ("нейтральные отходы") к двум разным выходам (см. чертеж). С выхода, обозначаемого как "экстракт", можно на протяжении всего процесса отбирать содержащий триптофан в качестве целевого продукта поток, т.е. продуктсодержащий поток, тогда как примесные вещества удаляются с потоком, обозначаемым как "рафинат". Помимо этого через вход, обозначаемый как "десорбент", непрерывно подается термостатированная вода, т.е. вода, температура которой поддерживается на постоянном уровне. Результат разделения определяется надлежащим выбором скоростей подводимых и отводимых потоков, а также временем периодического переключения.

Согласно изобретению в разделительной части, состоящей из трех зон, поддерживают температурный градиент. Температура подаваемой термостатированной воды в общем случае на 10-40°C выше температуры разделяемого раствора (разделяемой смеси), подаваемой через вход для исходного материала. При создании изобретения было установлено, что входная температура десорбента предпочтительно должна составлять по меньшей мере 60°C, а входная температура разделяемой смеси предпочтительно должна составлять 45°C.

Используемая в качестве десорбента вода в предпочтительном варианте полностью обессолена. Однако возможно также использование воды, содержащей соли, предпочтительно в количестве от 0,01 до 10 мас. %, прежде всего от 0,01 до 3 мас. %. Отделение триптофана происходит и в подобных условиях. При этом, однако, необходимо учитывать, что поток экстракта в этом случае неизбежно будет загрязнен такими солями.

Для разделения используют водные смеси веществ, прежде всего растворы, содержащие триптофан в количестве от 0,1 до 39 г/л, прежде всего от 0,5 до 38 г/л, особенно предпочтительно от 10 до 18 г/л.

Содержание триптофана зависит прежде всего от того, должны ли подвергаться переработке маточные растворы или иные не очищенные растворы триптофана, а также от их значения pH.

Значение pH исходных смесей, соответственно растворов варьируется от 2 до 9, главным образом от 2,5 до 7, и прежде всего составляет 5,8.

При осуществлении предлагаемого в изобретении способа те колонки, которые в регулярно повторяющемся цикле не требуются для разделения, подвергают в очистительной части параллельно процессу разделения обработке различными агентами с целью удаления прочно связывающихся с адсорбентом и плохо растворимых загрязняющих примесей с адсорбента.

Для этого колонки сначала обрабатывают приемлемым водным щелочным очистительным средством. Для применения в этих целях в особенности пригодны, но не ограничиваясь только ими, растворы гидроксида натрия концентрацией от 0,05-молярной до 1-молярной. Помимо этого возможно применение других растворов, которые согласно уровню техники способны удалять с адсорбента прочно связывающиеся с ним загрязняющие примеси. В качестве примера при этом можно назвать, но не ограничиваясь только ими, смешивающиеся с водой органические растворители, такие как этанол, метанол, ацетон или изопропанол.

На еще одной выполняемой параллельно стадии уже обработанные первым очистительным средством колонки промывают пригодной для этого средой. Для применения в качестве таковой в особенности пригодна обессоленная вода, однако возможно использование и иных водных растворов с буферным действием. При использовании приемлемого очистительного средства можно также отказаться от выполнения стадии промывки перед второй стадией очистки.

На еще одной выполняемой параллельно стадии с уже обработанными первым очистительным средством и при необходимости промытыми колонками вводят в контакт второе очистительное средство. Для применения в качестве такового особенно пригоден кислый водный раствор, например, 0,01-0,1-молярная, прежде всего 0,05-молярная серная кислота. Помимо этого возможно также применение иных очистительных средств, которые согласно уровню техники способны в нейтральной, соответственно щелочной среде лучше растворять труднорастворимые вещества.

На еще одной выполняемой параллельно стадии уже обработанные обоими очистительными средствами колонки вновь или в первый раз промывают пригодной для этого водной средой. Для применения в качестве таковой в особенности пригодна обессоленная вода, однако возможно использование и иных водных растворов.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения все стадии очистки проводят в непрерывном режиме и параллельно с текущим процессом разделения.

В другом варианте можно исключить отдельные подстадии.

В еще одном варианте все или только выбранные стадии очистки можно также выполнять независимо от процесса разделения. Так, например, проведение очистки возможно с лишь ежедневной или соотнесенной с определенным периодом процесса разделения периодичностью.

Объектом настоящего изобретения является также устройство для выделения целевых органических соединений из водной смеси веществ путем хроматографии с псевдодвижущимся слоем (ПДС-хроматографии), имеющее колоночную систему, состоящую из не менее чем двух последовательно соединенных и заполненных адсорбентом колонок и подразделенную на три функциональные зоны, в которых реализуются следующие задачи:

- подача потока исходного материала,

- отбор потока элюата,

- отбор потока рафината,

- подача десорбента

и в которых между I-й и III-й зонами создается температурный градиент величиной от 10 до 40°C, прежде всего от 15 до 25°C согласно прилагаемому к описанию чертежу, обусловленный подачей десорбента и исходного материала с различающимися между собой входными температурами. Указанный температурный градиент способствует разделению и снижает расход десорбента.

Подобная конструкция отличается от известных устройств тем, что в разделительной части хроматографические колонки расположены в виде трехзонной системы с незамкнутым кругооборотом жидкости и с температурным градиентом и что эта часть установки связана с очистительной частью, содержащей колонки, которые заполнены тем же адсорбентом и которые поочередно с колонками из разделительной части очищаются от адсорбированных загрязняющих примесей.

Количество колонок в зонах в общем случае составляет от 2 до 32, прежде всего 16. Каждая зона содержит по меньшей мере одну колонку. Общее количество колонок и их распределение по зонами можно в согласовании с температурой, концентрацией триптофана, требуемой скоростью миграции и чистотой продукта определять проведением стандартных опытов. Количество колонок зависит далее и от способа ведения технологического процесса, а также от практической реализации ПДС-метода.

В ходе лабораторных экспериментов при разделении маточного раствора с концентрацией в нем триптофана от 9 до 22 г/кг маточного раствора и с чистотой от 7 до 15% (в пересчете на общую массу сухого вещества) предлагаемым в изобретении способом удалось получить продуктсодержащие потоки со средней степенью чистоты более 85%, со средним выходом триптофана выше 85%, а также с концентрацией триптофана в экстракте от 4 до 5 г/кг.

Тем самым предлагаемый в изобретении способ позволяет с высоким выходом выделять триптофан в очищенном виде из содержащего его маточного раствора и экономичным путем возвращать в процесс переработки ферментационного бульона в целях повышения общего выхода.

Описание чертежа

На прилагаемом к описанию чертеже представлена схема используемого согласно изобретению ПДС-процесса с колоночной системой.

Вся система подразделена на разделительную и очистительную части.

В разделительной части в колоночную систему подаются, например, поток десорбента Q_Des с температурой 60°C и разделяемая водная смесь Q_Feed с температурой 45°C, а из колоночной системы отбираются рафинат Q_Ra и экстракт Q_Ex, в котором присутствует отделенный триптофан.

В очистительной части, например, в местах B и D подводится вода, в месте A подводится 0,05-молярная серная кислота, а в месте C подводится 0,5-молярный NaOH.

После прохождения через очищаемые колонки в месте E выходит отработанная серная кислота, в месте F выходит раствор слабее связанных, водорастворимых загрязняющих примесей, в месте G выходит отработанный NaOH, а в месте H выходит раствор прочно связанных загрязняющих примесей. (Аббревиатура OHM означает очистку на месте).

Примеры

1. Технологические параметры

Применяемый адсорбент: Amberlite XAD-7 HP (фирма Rohm & Haas)

Размеры колонок (D×L): 1,5×15 см

НДС-оборудование: Knauer CSEP 916 (Knauer Wissenschaftliche Gerätebau GmbH, Берлин, Германия)

Насосы: Watson-Marlow U101 (Уилмингтон, шт. Массачусетс, США)

Разделяемая смесь: маточный раствор из процесса кристаллизации

Вещество Интервал концентраций [г/кг] Триптофан 12-22 Тирозин 1,2-2,1 Фенилаланин 1,1-4,8 Другие побочные продукты 220-260

От указанных параметров не зависят остальные параметры, такие, например, как рассматриваемое время периодического переключения, которое составляло от 8 до 14 мин. Однако не существует никаких оснований для его ограничения. Применявшиеся в лабораторной установке значения расхода составляли от 0,07 до 0,33 кг/ч, лимитированные использовавшимися шланговыми насосами, однако объем изобретения не ограничен только указанными значениями расхода. В данном случае также возможно применение насосов любого типа, которые способны перемещать потоки со скоростями, необходимыми для достижения требуемой производительности и обеспечивающими разделение.

Применяемые температуры лежали в интервале от комнатной (25°C) до 60°C, а в качестве оптимальной зарекомендовала себя температура десорбента по меньшей мере 60°C, но не выше 80°C, а также температура в 45°C для остальных потоков и колонок.

2. Примеры на применение

2.1. Определение адсорбционных свойств

В рамках аналитической процедуры исследовали адсорбционные и десорбционные свойства триптофана, фенилаланина и тирозина, используя колонки, описанные выше в разделе 1. С этой целью 100 мкл образца впрыскивали в проходящий через колонку поток воды и регистрировали время, по истечении которого аминокислоты появлялись на выходе колонки. При этом было установлено, что из числа ароматических аминокислот триптофан удерживается дольше всех не только в нейтральной, слегка кислой среде, но и в кислой среде. Повышение температуры приводило к сокращению времени удерживания триптофана.

Время удерживания триптофана при pH 5,9 (в минутах)

  45°C 60°C 5 г/кг 37,3 31,9 10 г/кг 37,1 31,1 17 г/кг - 33,5

Время удерживания фенилаланина при pH 5,9

  45°C 60°C 5 г/кг 15,6 15,3 10 г/кг 15,2 15,1

Время удерживания тирозина находилось на том же уровне, что и время удерживания фенилаланина. При значении pH 2,5, при температуре 45°C и при концентрации 10 г/кг время удерживания триптофана составляло 39,1 мин, а время удерживания фенилаланина при тех же условиях составляло 15,8 мин.

Полученные данные подтверждают тем самым возможность разделения и при кислом значении pH.

2.2. Первый экспериментальный ПДС-цикл

В данном случае экспериментально проверяли три рабочие точки. Исходными материалами служили различные партии триптофансодержащего технологического маточного раствора, а также описанные в разделе 1 растворы. Эксперименты проводили при следующих условиях:

  Q_Des Q_Feed Q_Ex Q_Ra t_s Рабочая точка 1 5,49 г/мин 1,18 г/мин 3,21 г/мин 3,47 г/мин 14,0 мин Рабочая точка 2 5,74 г/мин 1,26 г/мин 3,30 г/мин 3,69 г/мин 12,9 мин Рабочая точка 3 5,59 г/мин 1,27 г/мин 3,26 г/мин 3,60 г/мин 12,75 мин

Температура десорбента составляла 60°C, а температура колонок и других растворов составляла 45°C. В ходе экспериментов получили следующие результаты:

  Чистота триптофана (сухое вещество) [%] Выход триптофана [%] Удаление фенилаланина [%] Удаление тирозина [%] Удаление побочных продуктов "UV BP before" [%] Удаление побочных продуктов "UV BP after" [%] Рабочая точка 1 87,1 37 100 100 не определяли не определяли Рабочая точка 2 82,2 76 100 100 92,4 34,9 Рабочая точка 3 87,6 85 99,1 96,1 93,5 41,8

2.3. 12-Дневный эксперимент

В ходе еще одного эксперимента оценивали долговременную стабильность. Эксперимент проводили в течение 12 дней при следующих параметрах (Q_BasicWash означает расход щелочного промывочного раствора, Q_AcidWash означает расход кислого промывочного раствора):

Q_Des Q_Feed Q_Ex Q_Ra t_s 5,6 г/мин 1,3 г/мин 3,26 г/мин 3,60 г/мин 12,75 мин Q_NaOH Q_BasicWash Q_H2SO4 Q_AcidWash   2,35 г/мин 1,91 г/мин 2,89 г/мин 2,02 г/мин

Исходными материалами служили маточные растворы из процесса кристаллизации триптофана. В ходе процесса удалось достичь средней чистоты в 89,3% (в пересчете на общую массу сухого вещества), а также выхода в 90,4% (в пересчете на массу триптофана в исходном материале). Концентрации фенилаланина и тирозина удалось снизить в среднем до 0,002 г/л, соответственно до 0,001 г/л. В ходе эксперимента удалось далее успешно реализовать возврат в процесс кристаллизации триптофана безо всяких негативных последствий.

Изобретение относится к способу выделения триптофана из водных смесей веществ, прежде всего из уже частично подвергнутых переработке ферментационных бульонов, путем хроматографии с псевдодвижущимся слоем. 13 з.п. ф-лы, 1 ил., 2 пр.

1. Способ выделения растворенного триптофана из водной смеси веществ путем хроматографии с псевдодвижущимся слоем, заключающийся в том, что в разделительной части с колоночной системой, состоящей из не менее чем двух последовательно соединенных колонок, заполненных пригодным для применения в качестве адсорбента органическим полимером, и подразделенной на несколько функциональных зон,
а) триптофансодержащую смесь веществ и воду в качестве десорбента непрерывно подают в раздельных местах колоночной системы и
б) в расположенном между этими подводами месте отводят обогащенный триптофаном поток экстракта и отдельно от него в еще одном месте, расположенном по ходу потока перед подводом триптофансодержащей смеси веществ, отводят содержащий другие соединения из исходной смеси веществ поток рафината, при необходимости подвергают поток экстракта дальнейшей переработке, а также предпочтительно
в) колонки, насыщенные не десорбированными соединениями из смеси веществ, очищают от этих соединений,
отличающийся тем, что при осуществлении которого создают температурный градиент между зоной, в которой подают десорбент, и зоной, из которой отводят рафинат.

2. Способ по п. 1, при осуществлении которого подают предпочтительно обессоленную воду с температурой в пределах от 20 до 98°C.

3. Способ по п. 1, при осуществлении которого используют смесь веществ, содержащую триптофан в концентрации от 0,1 до 39 г/л.

4. Способ по п. 1, при осуществлении которого используют смесь веществ со значением pH в пределах от 2,5 до 9.

5. Способ по одному из пп. 1-4, при осуществлении которого используют полученную при ферментации смесь веществ, которая наряду с триптофаном содержит также фенилаланин и/или тирозин.

6. Способ по п. 5, при осуществлении которого в качестве смеси веществ используют маточный раствор, образующийся при кристаллизации триптофана из ферментационного бульона.

7. Способ по п. 1, при осуществлении которого в качестве адсорбента используют неионогенный полимер, который обратимо адсорбирует триптофан и с которого триптофан десорбируют водой с температурой в пределах от 10 до примерно 98°C.

8. Способ по одному из пп. 1-4, при осуществлении которого используют адсорбенты, выбранные из группы, включающей XAD7^®, XAD7HP^® и HP2MG^®.

9. Способ по одному из пп. 1-4, при осуществлении которого разделение проводят в непрерывном режиме.

10. Способ по одному из пп. 1-4, при осуществлении которого разделение проводят в полунепрерывном режиме.

11. Способ по одному из пп. 1-4, при осуществлении которого параллельно выделению триптофана те колонки колоночной системы, которые в зависимости от продолжительности такта выведены из участия в процессе разделения, после этого подвергают в очистительной части обработке десорбирующими соединениями.

12. Способ по одному из пп. 1-4, при осуществлении которого в очистительной части адсорбент подвергают обработке способом со следующими стадиями:
а) для этого колонки сначала обрабатывают приемлемым водным щелочным очистительным средством, прежде всего растворами гидроксида натрия концентрацией от 0,05-молярной до 1-молярной, при необходимости в сочетании
б) с еще одной выполняемой параллельно стадией, на которой обработанные на стадии а) колонки при необходимости промывают пригодной для этого водной средой, представляющей собой предпочтительно обессоленную воду, или водными растворами с буферным действием,
в) на еще одной выполняемой параллельно стадии с обработанными на стадиях а) и б) колонками вводят в контакт второе водное очистительное средство, прежде всего кислый водный раствор, предпочтительно 0,01-0,05-молярную серную кислоту, и
г) на еще одной выполняемой параллельно стадии обработанные колонки при необходимости промывают либо водной средой, представляющей собой предпочтительно обессоленную воду, или водными растворами, позволяющими использовать их в качестве буфера.

13. Способ по одному из пп. 1-4, при осуществлении которого триптофансодержащий поток экстракта добавляют в полученную при ферментации триптофансодержащую водную смесь веществ до кристаллизации из нее триптофана.

14. Способ по п. 13, при осуществлении которого все указанные стадии очистки по п. 12 или их части проводят независимо от процесса разделения с заданной периодичностью.