Способ получения L - фенилаланина Советский патент 1991 года по МПК C12P13/22 C12N15/00 

со

00

Изобретение относится к микробиологической про1Ф1тленности и касается получения незаменимой at iHOкислоты фенилаланина, которая при™ меняется э медицине, а также может служить исходш 1м продуктом при син тезе аспартама-пептида, нспользуемо го в качестве интенсивного подсластителя в пищевой промьшшенности. Целью изобретения является повышение выхода Ь-фенилаланииа и сокращение времени ферментации. Способ заключается и использовании в качестве продуцентов L-фенилаланина новых штаммов Bacillus subtilis ВКПМ В-3549 ИЛИ BJOM В-3550, или ВКПМ B-3S51,- или ВКПМ В-3552, устойчивык к р-фторфеиилаланину и D-тирозину. Штамм ВКПМ В-3552. устойчив еще и к гидроксаматам феннлаланнна и тирозина/ а штамм ВКПМ В-3556 - к /з-тианнд- аланину. fflтaм &l накапливают в среде от 8,6 до 13 г/л Ь-фенилапанина. 2 табл. . с (О с

to

Жо

1чЭ

Изобретение относится к микро™ биологической промышленности и каса ется способа получения незаменимой аминокислоты Ь-фенилаланина, который применяется в медицине, а также может служить исходным продуктом при си ттезе аспартама-пептида, используемого в качестве интенсивного подсластителя в пищевой промыгален ности.

Целью изобретения является повышение выхода Ь-фенилаланииа и ускорение процесса.

Способ заключается в применении новых штаммов Bacillus subtilis, полученных с помбщыо генетической трансформации, мутагенеза и отбора мутантов, устойчивых к анйлогам ароматических аминокислот а также к антибиотику митомицину С.

В качестве исходного штамма служит штамм Вас. subtilifi 92А - продуцент, триптофана, ,из которого получен продуцент фенйлаланина генетическими методами на основе общности путей синтеяа ароматических а1чинокислот и того, что у продуцента триптофана в процессе селекции уже созданы оп ределенные предпосылки и дли сверх синтеза фенйлаланина. Исходный штамм 924 трансформируют хромосомной ДНК донорного штамма Вас. subtilie 39, в составе которой имеется дефектный ген trp. Е, кодирующий первый фермент в пути синтеза триптофана и ген аго Н, который кодирует высокоактивный изофермент хоризматмутазу, отсутствующую у продуцента трипто фана. В результате получают трансформанты, требуюп1ие для роста трип- тофан и имеющие BijicoKHri уровень активности хоризматмутазы. Среди них после проверки на способность продуцировать фенилаланин отбирают трансформант , накапливающий 3 г/л этой аминокислоть, из которого путе селекции получают мутант, устойчивый к 0,5 мкг/мл мито1У ицина С и вы делающий 5 г/л фенйлаланина. След:/ю щие этапы отбора заключаются в последовательном получении (после воздействия на клетки нитрозогуани- дина) мутантов, устойчивык к аналогам ароматических амин 7кислот р фторфенилаланину (рФФ) в концентра ции 9 мг/мл, Д-тирозину (ДТ) 0,075 мг/мл, гидрокса мату тирозина (ГТ) 1 мг/мл, гидроксамату фенил-

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

аланина (ГФ) 0,5 мг/мл, -тиеиил аланину (TEA) 7,5 мг/мл, В результате на разных этапах селекции получают штаммы Вас. subfilis ВНИИге нетика П, ВНИИгенетика 33, ВНИЙге- нетика , От штамма Вас, subti- lis ВНИИгенетика II получен спонтанный ревертант к триптофаннезависимо- сти прототрофный штамм ВНИИгенетиЛа 19п.

Перечисленные новые штаммы-продуценты ЬтфеНилапанина - Вас. subti- lis ВНИИгенетика II, Вас. subttlis ВНИИгенетика 33, Вас. subtilie ВНИИ- генетика I-II, Вас, subtilis ВНИИгенетика 19п хранятся во Всесоюзном музее промышленных микроорганизмов (ВКПМ) и имеют регистрационные номе- .ра В-3549, В-3552, В-3550 и В-355 соответственно.

Штаммы имеют следующие культураль- но-морфологическую и физиолого-био- химическую характеристики.

Основные характерН ики новых штаммов Вас. subtilis соответствуют таксономическому описанию этого вида микроорганизмов (Стейниер Р. и др. Мир микробов, т. 3, с. 184, МИР, 1979).

Йтаммьт Вас. subtil is ВКПМ В-3549, ВКПМ В-3550, ВКПМ В-3551 и ВКПМ В-3552 являются грамположительными спорообразующими палочками размером (2,5-4,5) 0,7 мкм. Размер спор (1,0- 1,2) (0,6-0,7) мкм.

Мясо-пептонный агар. Колонии после 24 ч инкубации при 37 С достигают 4-6 мм в диаметре, сплошные, круглые, с изрезанным краем, поверхность гладкая,

Агаризованная среда Спицайзена с 100 мкг/мл триптофана и 0 мкг/мл аденина. Колонии после 48 ч инкубации при 37 С имеют I мм в диаметре, поверхность гладкая, блестящая.

Отношение к источникам углерода: используют глюкозу, сахарозу, м,альто- зу, маннозу, майнит, глицерин, ацетат.

Отношение к источникам азота: ассимилируют мочевину и соли аммония.

Не растут на молоке, желатину разжижают слабо, хорошо растут на крахмале.

Отношение к аналогам аминокислот; все штаммы устойчивы к р-фтор- фенилаланину (рФФ) и Д-тирозину (ДТ), штамм ВКПМ В-3552 устойчив еще к

гидроксаматам фенилаланина (ГФ) н тирозина (ГТ), штаьт BKIIM В- 3550 устойчив еще и к /j-тиенилаланииу (TEA).

Потребность в факторах роста: рост всех штаммов стимулируе.тся аде- кином, штаммы ВКПМ В-3549, В-3550 и требуют для роста трипто фан, штамм ВКПМ В-2551 не требует для роста триптофан. Отличительные признаки штаммов представлены в табл. 1 .

В общем виде способ получения L-фенилаланика осуществляют следую- ци.м образом, К.петки новых штаммов продуцентав Вас. subtilis ВКПМ В-3549, , В--3551 и В-3552 выращивают в течение I сут на ага- ризованной среде Хоттингера, пересевают в колбы со стерильной питательной средой, содержащей источники углерода, азота, ростовых веществ и необходимь е минеральные соли, и культивируют в течение 18-24 ч на качалк при 220 об/мин и 28-37 с.

Получен 1Ый посевной материал вносят . в колбы или ферментеры со стерильной питательной средой, содержащей источники углерода, азота, ростовых веществ и минеральные соли. В качестве источника углерода используют сахарозу или содержащие ее субстраты, например, технический сахар, в качестве источника азота - мочевину или соли аммония, в качестве ростовых веществ - триптофан и кукурузный экстракт Ферментацию осуществляют в течение 46-72 ч в условиях аэрации, при 28-37 С, рН 6-8, в Колбах на качалке или в ферментере, при расходе продуваемого через культур ал ьнуто жидкость воздуха 400 мл/мин скорости вращения мешалки 1000 об/мин В результате в культуральной жидкости накапливается до 13 г/л L-фенилала- нина

Определение содержания фенйлала- нина в культуральной жидкости проводят с помощью бумажной или тонко- алойной хроматогр афии в системах растворителей бутанол;уксусная кис- лотагвода (40s10:23) и изопропанол: аммиак (7s3) соответственно.

Выделение L-феиилаланина из культуральной жидкости осуществляют путем его селективной сорбции на слабоосновном анионите с последующей десорбцией водой и повторной де0

5

0

5

0

5

0

5

0

5

сорбцией из водного элюата на сульФ(к катионите в П-форме (авт. св. СССР № 749889). Элюирование Ь-фени.чалани- на и сульфокатионита горячим водип- этаиольным раствором -лммиака получить в ысококонцентриропанный раствор выделяемой аминокислоты, из которого последняя кристаллизуется по мере охлаждения раствора и нейтрализации аммиака кислотой.

Выделение L-фенилаланина по описанной схеме обеспечивает выход фе- нплаланина до 60-80%. Содержание основного вещества в хроматографичес- ,ки однородном продукте составляет не менее 95%. Дополнительная перекристаллизация позволяет полу(Ить Препараты фенилзланина с содержанием осиовного вещества не менее 99%.

Пример 1. Культуру штамма Вас. subtilis ВКШЧ В-35А9 пыращивают в течение 18 ч npti на ягарияо- ванной среде Хоттингера. Затем петлей засевают колбы объемом 250 мл, содержащего 10-30 мл nocepHofi среды. Состав посевной среды, г/я: сахароза; кукурузньй экстракт 10; К.рНР04 1,4; КН2Р040,6, триптофан 0,1, RO- допроводная вода до 1 л, рИ до стерилизации 7,2-7,5, после стерилизации 7,0-7,2. Посевну среду стерилизуют в автоклаве при 0,8 атм в течение 30 мин,. После посева колбы устанавливают на круговую качалку (220 об/мин) и инкубируют при в течение 18ч. Готовый посевной материал вносят в количест-ве 5Z (по объему) в колбы емкостью 2000 мп с 75 мл ферментационной среды. Состав ферментационной среды, г/л: сахароза I00;. кукурузный экстракт 30,К2НР04 ,4; КН.РО 0,6; NaCl 0,5; MgF;04l,0, мочевина 5,0, триптофан 0,1, водопроводная юда до 1 л, рН среды 7,2. Мочевину добавляют перед засевом в готовую среду в виде 40%-ного раствора, простерили- зованного при 0,5 атм в течении 30 мин. После засева колбы устанавливают на качалку. Через 72 ч роста культуры при 30°С в культуральной х идкости накапливается iO г/л 1..-фе- ниляланина.

С целью вьщеления Ь-фенила17ан 1на л полученного ферментацио 1ного раствора пропускают через колонку с 0,4 л слабоосновного анионита . По окончании сорбции колонку

npoNn-inatC T л воды, поело чего, подсоединив к выходу колонки с колонку с Of07 л супьфокйтиокита в Н-форме, пропускают воду уже через систему из двук колонок. После прохожде1шя 9 л воды колонки рлзъедийяют, Ь фенилалании, перешед™ ший с анионита ИА--1р на г атиоиит КУ-2- 8, элюируют раствором .аммиака в 50%-ном водном эталоне при , пропуская злюэнт через колон ку с . Фракцию выходящего раствора;, содержащего Ь-феимлапэнин в концентрации более 8,0 г/л, обрабатывают уксусной кислотой до рН 6,0 и охлаждают. Выпавшие кристаплы L- фенилалапина отфильтровывают, вают этанолом и высушивают, В ре- лультате получают 6,07 г кристаллического продукта с ссздержаиием Ь-фе- нилаланина 97% (выход 59,8%). Доиз- |злечег ие целевого продукта из маточ™ ика и низкокондентрированнык ий аммиачного элюата по описанной tMiue схеме (предварительно нейтрализуют аммиак уксусной кислотой и отгоняют этанол) позволяет получить до по л ни тел Е но г кристаплическо : о продукта (содержание основного вещества 95%), с учетом которого общий выход кристаллического Ь-фе™ иилапанина составляет 74,,6%,

.Пример 2, Вырапсчвание ПО севного материала и культивирование штамма Вас, subtilis ВКГМ проводят, как в примере I, но ферментационная среда содержит 130 г/л сахарозы. Через 72 ч в культуральной Жидкости накапливается 11,3 г/л фе иилаланина, Вьщеленне феиилаланина нз I л культуральной жидкости осу ществляют, , В результате получают 7f8 г кристалли ческого продукта с содержарГнем фе нилаланина 96%, Выход кристаПлииес- кого фенилаланина 66,,,3%.

Пример 3, Выращивание по™ севного материала и культивирйванне штамма Вас. subtilis ВКПН B-355I осуществляют9 как в примгре I, Отлн чием является то что посевная н ферментационная среды ие содержат триптофана, Через 72 ч куль- гурапьной жидкости накапливается 9,1 г/л фени-паланикй. Вы,целенне фе чилаланина из культуральяой лаадкос- ти осуществляют, кз.к в примере 1 ,

0

5

0

0

5

5

Выход кристаллического продукта 69,5%, содержание феиилапянина 96%. Пример Л. Посевной материал штаммув-продуцр.нтов фенялаланина Вас, subtilis ВКПМ В-3549, В-3550, В-3551 и В-3552 выращивают, как в примере 1 . Готовь м посевным материалом каждого п тамма (20 мл) засева™ ют 400 мл ферментационной среды того же состава, что и в примере . Для штамма ВКИН B-355i среды не содержат триптофана. Культивирование ведут в лабораторных ферментерах емкостью 600 мл при , расходе продуваемого через культурапьную жидкость воздуха 400 мл в 1 мин, скорости вршцения мешалки 1000o6/N H, Культивирование заканчиваютs как только из питательной среды исчерпывается сахар, Результаты показаны в табл. 2. Выделение.фенилаланина проводят, как в примере I, Выход кристаллического проду кта 77%, содержание феиилаланина 98%.

Пример 5. Посевной материал штамма Вас. subtilis ВЮШ В-3550 выращивают, как в примере Готовым посевным материалом (20 мл) засевают 400 мл ферментационной среды того же состава, что и в примере 1, с тем отличием что концентрация сахара в среде уменьшена до вместо мочевинь5 внесено 0,5% сер

нокислого аммония.

1

КультиБИрованне ведут в лабораторном ферментере, оснащенном системой .автоматического рН-статирова- нйЯ} при 30°С5 расходе продуваемого через культуральную жидкость возду- ка 400 МП/мин, скорости вращения мешалки 1000 об/мин о Значение рН куль туральной жидкости поддерживают на уровне ,1. В ходе культивирования в ферментер по сигналу датчика рН добавляют смесь 40%-ного раствора сахарозы и 25%-ного раствора аммяака в соотношении 0:1 по объе- . Продолжитепьность культивирова- НИИ 58 ч„ Уровень накопления фенил- штанина составляет lljl г/л.

Выделение фенилаланина ведут, как в примере 1. Выход кристаллического продукта 70%, содержание фенил- йланина 98%,

Предлагаемый способ отличается от прототипа более высоким уровнем образования фенилаланина - до I3 г/л (у прототипа 2,88 г/л), более корот- КИМ сроком ферментации - 46-72 ч (У прототипа 96 ч), на простых по составу средах, содержащих сахарозу, источники азота (мочевииа или соли аммония), минеральные соли, а в качестве источника ростовых веществ - кукурузный экстракт и трир- 1тофан, если используемый щтамм нуж- даегся в этой аминокислоте. При выделении фенилаланина из ферментацйон rtoro раствора выход составляет 60- 80% кристаллического продукта.

В-3549 В-3552

В-3550 В-3551

р-фторфенилаланин; Д-тирозин; гидроксамат фенилаланина; гидроксамат тирозина; /S -тиешшаланин

Таблица 2

Показатель

Формула изобретени

Способ получения L-фенилалапина, включающий выращивание продуцирующих его штаммов Bacillus subtilis в условиях аэрации на питательной среде, содержащей источники углерода, азота, минеральные соли и ростовые вещества, до максимального някопления целевого продукта с последующим его вьщелеиием, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта и ускорения процесса, в качестве продуцентов используют ВКПМ В-3549 или ВКПМ В-3550, или ВКПМ В-3551, или ВКПМ В-3552.

Таблица

Нуждается

Нуждается

Нуждается

Не нуждается

Штамм Вас. subtilis ВКПМ

В-355||В-3550 В-3549|В-3552