СОЕДИНЕНИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ АУТИЗМА Российский патент 2016 года по МПК A61K31/196 A61P25/00 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к соединению, которое ингибирует перенос хлорид-ионов в нейроны, или соединению, которое облегчает выход хлорид-ионов из нейронов, предназначенному для применения с целью лечения аутизма.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Расстройства аутистического спектра (РАС) у детей включают широкий круг нарушений, в том числе врожденную неспособность организовывать эмоциональные связи, отклонения в поведении при реципрокном социальном взаимодействии с другими людьми, при вербальной и невербальной коммуникации, ограниченный интерес к окружающей среде, ассоциированный со стереотипными движениями и повторяющимися действиями (Kanner, 1943; Levy and Hyman, 1993; Levy and Hyman, 2005; Adrien et al, 2001; Blanc et al, 2005; Bourreau et al, 2009). Проведенные до настоящего момента исследования свидетельствуют, что в развитии заболевания определенную роль может играть генетическая предрасположенность, но для проявления симптомов должны присутствовать один или несколько факторов внешней среды, включая загрязнения окружающей среды и, возможно, воздействия, которые оказывались на мать во время беременности (Persico and Bourgeron, 2006; Bourgeron, 2009; Patterson, 2002). Высказано предположение, что генетический риск и опасные воздействия внешней среды изменяют программу развития, что приводит к порокам развития коркового и подкоркового слоя и к образованию неправильно расположенных и содержащих неправильные связи ансамблей нейронов. Первые симптомы проявляются до достижения возраста 3 лет, при этом наиболее вероятно раннее возникновение. В настоящее время отсутствуют эффективные способы биологического/фармацевтического лечения РАС.

Созревание головного мозга связано с последовательной экспрессией по мере развития потенциалзависимых каналов, управляемых рецепторами синапсов, и паттернов мозговой активности (Spitzer et al, 1994; Ben Ari et al, 2007). Одним из примеров таких изменений являются смена в ходе развития образа действия тормозного медиатора ГАМК. Незрелые нейроны содержат большее количество ионов (Cl')i, чем зрелые, что приводит к парадоксальному возбуждающему действию ГАМК (Ben Ari, 2002; Ben Ari et al, 2007). Это происходит из-за ранней экспрессии ко-транспортера NKCC1, который импортирует хлорид-ионы, и запаздывания действия белка КСС2, который экспортирует хлорид-ионы из нейронов (Kahle and Staley, 2008; Rivera et al, 1999; Dzhala et al, 2005; Delpire et al, 1999; Delpire, 2000; Li et al, 2002). Кроме того, регуляция (Cl^-)_l является динамическим процессом и изменяется даже при коротких эпизодах повышения активности (Balena and Woodin, 2008; Fiumelli et al, 2005; Fiumelli and Woodin, 2007; Woodin et al, 2003), а чаще - в результате различных случаев инсультов, повреждений, приступов и неврологических нарушений (Khalilov et al, 2003; Khalilov et al, 2005; Cohen et al, 2002; Huberfeld et al, 2006; Huberfeld et al, 2007). Следовательно, диуретические агенты, которые снижают содержание (Cl^-)_l, представляют собой новые противосудорожные и нейропротекторные агенты (Dzhala et al, 2005; Nardou et al, 2009; Kahle et al, 2008; Payne et al, 2003). В соответствии с этим, в настоящее время проводят клинические испытания, нацеленные на различные типы эпилепсии у детей.

Буметанид (Cohen, 1981; Feit, 1981) - это классический диуретик, который оказывает селективное антагонистическое действие в отношении ко-транспортера NKCC1, тем самым снижая уровень (Cl^-)_l (Delpire etal, 1999; Delpire and Mount, 2002). Буметанид широко используется для лечения взрослых с 1975 г.и для лечения детей с 1986 г., и его фармакокинетика в организме взрослых и детей, а также его побочные эффекты хорошо известны (Lopez-Samblas et al, 1997; Sullivan et al, 1996; Witte et al, 1986; Marshall et al, 1998). Буметанид применяют при острых (отек после черепно-мозговой травмы) и хронических состояниях, включая бронхолегочную дисплазию, нефротические синдромы или застойные явления в сердце (O'Donnell et al., 2004; Mackie et al, 1986; Sullivan et al, 1996), и недавно в описании случая сообщалось, что он снижает степень тяжести приступов (Kahle et al, 2009). Применение буметанида является безопасным при условии, что оно сопровождается непрерывным клиническим и биологическим наблюдением, особенно у детей.

Авторы изобретения исследовали к настоящему времени эффекты действия буметанида у 5 детей, страдающих аутизмом, при непрерывном клиническом и биологическом наблюдении. Пациенты были выбраны без предварительно заданных параметров из большой группы детей с РАС, находящихся в медицинских организациях или дома, с целью обеспечения представленности различных случаев. Диуретик вводили в дозировке 1 мг/24 ч (по 0,5 мг дважды в день) и проводили лечение в течение 3 мес., минимальной продолжительности, которая считается достаточной для оценки влияния на синдром детского аутизма (СДА).

Авторы изобретения сообщают о существенном улучшении проявлений СДА у 5 детей. Эти наблюдения свидетельствуют в пользу проведения широкомасштабного скрининга случаев применения буметанида при СДА и в основном - для лечения аутизма.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Авторы изобретения выдвинули гипотезу о том, что антагонист ко-транспортера NKCC, который ингибирует импорт хлорид-ионов в нейроны и тем самым снижает их внутриклеточные концентрации, может быть полезен для лечения аутизма.

Таким образом, настоящее изобретение относится к соединению, которое ингибирует перенос хлорид-ионов в нейроны, и соединению, которое облегчает выход хлорид-ионов из нейронов, предназначенным для применения с целью лечения аутизма.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для применения с целью лечения аутизма, содержащей соединение по изобретению и фармацевтически приемлемый носитель.

СВЕДЕНИЯ, ПОДТВЕРЖДАЮЩИЕ ВОЗМОЖНОСТЬ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Определения

В описании изобретения используется ряд терминов, определения которых даны в следующих параграфах.

В данном описании термин «аутизм» определяется как семейство нарушений развития нервной системы, которые характеризуются расстройством социального взаимодействия и коммуникации, ограниченным и повторяющимся поведением, сопровождающимся другими нарушениями. Все эти признаки проявляются до достижения ребенком возраста трех лет. Аутизм влияет на переработку информации в головном мозге, изменяя то, как соединяются и организуются нервные клетки и их синапсы; как именно это происходит, пока неизвестно. Другими расстройствами аутического спектра (РАС) являются синдром Аспергера, при котором отсутствуют задержки умственного развития и речи, атипичный аутизм, который диагностируют в случае, когда не соблюдены полностью все критерии для двух других нарушений, и первазивное расстройство развития неуточненное (PDD-NOS), при котором первазивные расстройства развития не уточняются.

При использовании в этом документе аббревиатура NKCC, расшифровывающаяся как «ко-транспортер Na-K-CI», обозначает белок, который способствует активному транспорту ионов натрия, калия и хлорид-ионов в клетку и из нее. Существует несколько разновидностей, или изоформ, этого мембранного транспортного белка, в частности - NKCC1 и NKCC2. Белок NKCC1 широко распространен в организме, имеется также в головном мозге и, в частности, в головном мозге развивающихся животных и человека. Его функцией является повышение уровня хлорид-ионов в нейронах и, тем самым, повышение возбуждающей активности ГАМК (гамма-аминомасляной кислоты). Всесторонние исследования показывают, что блокировка NKCC1 снижает внутриклеточный уровень хлорид-ионов, тем самым усиливая тормозное действие ГАМК. Исследования in vivo и in vitro показали к настоящему времени, что блокада NKCC1 генетическими и/или фармакологическими способами снижает раннюю сетевую активность.

При использовании в этом документе термин КСС, являющийся аббревиатурой для термина «ко-транспортер ионов калия и хлорид-ионов», обозначает ко-транспортер хлорид-ионов. Имеется несколько вариантов, или изоформ, в частности - KСС2. Белок KСС2 обнаруживается во многих органах, в частности, в головном мозге, и его функцией является выведение внутриклеточных хлорид-ионов и, тем самым, усиление тормозного действия ГАМК. Блокаторы белка KСС2 превращают ГАМК в возбуждающий медиатор и способствуют возникновению приступов, а подавление активности KСС2 генетическими способами у мышей является летальным. Кроме того, KСС2 экспрессируется на относительно поздних этапах развития, параллельно с переключением действия ГАМК с возбуждающего на тормозное. Кроме того, широкий спектр инсультов и приступов вызывают снижение уровня функционально активного КСС2, приводя тем самым к сохраняющемуся тормозному действию ГАМК и дополнительным приступам.

При использовании в этом документе термин «диуретик» обозначает любое лекарственное средство, которое повышает частоту мочеиспускания и, тем самым, обеспечивает средство для форсированного диуреза. Существует несколько категорий диуретиков. Все диуретики усиливают выведение воды из организма, хотя каждый класс делает это своим собственным способом.

При использовании в этом документе термин «петлевой диуретик» обозначает диуретики, которые могут воздействовать на восходящее колено петли Генле в почке.

При использовании в этом документе термин «лечение» или «проведение лечения» обозначает обращение вспять, ослабление, подавление прогрессирования или предотвращение нарушения или состояния, к которому применяется данный термин, или обращение вспять, ослабление, подавление прогрессирования или предотвращение одного или нескольких симптомов нарушения или состояния, к которому применяется данный термин.

Антагонисты и способы их применения

Первая цель изобретения относится к соединению, которое ингибирует перенос хлорид-ионов в нейроны, или соединению, которое облегчает выход хлорид-ионов из нейронов, предназначенному для применения с целью лечения аутизма.

В предпочтительном варианте воплощения соединение по изобретению ингибирует ко-транспортер NKCC или активирует ко-транспортер КСС.

В другом предпочтительном варианте воплощения соединение по изобретению является антагонистом ко-транспортера NKCC или агонистом ко-транспортера КСС.

В одном из вариантов воплощения указанный антагонист белка NKCC или агонист белка КСС могут являться низкомолекулярным антагонистом или агонистом, например, малой органической молекулой (естественного происхождения или нет).

Термин «малая органическая молекула» обозначает молекулу (естественного происхождения или нет), имеющую размер, сопоставимый с размерами органических молекул, обычно применяемых в лекарственных препаратах. Термин не включает в себя биологические макромолекулы (например, белки, нуклеиновые кислоты и т.д.) Предпочтительные малые органические молекулы имеют размер в диапазоне примерно до 5000 Да, более предпочтительно - до 2000 Да, и наиболее предпочтительно - примерно до 1000 Да.

В другом варианте воплощения антагонист NKCC или агонист КСС по изобретению может состоять из антитела, которое ингибирует NKCC или активирует КСС, или фрагмента антитела, который ингибирует NKCC или активирует КСС.

Антитела, выработанные против NKCC или КСС, можно получить в соответствии с известными способами, путем введения пригодного антигена или эпитопа животному-хозяину, выбранному среди прочих, например, из свиней, коров, лошадей, кроликов, козлов, овец и мышей. Можно применять различные адъюванты, известные специалистам в данной области, для повышения образования антител. Хотя антитела, полезные для практического применения изобретения, могут быть поликлональными, предпочтительными являются моноклональные антитела. Моноклональные антитела против NKCC или КСС можно получить и выделить с применением методик, которые обеспечивают выработку молекул антител стабильными клеточными линиями в культуре. Методики получения и выделения включают в качестве неограничивающих примеров гибридомную методику, первоначально описанную Келлером и Мильштейном (Kohler and Milstein, 1975); гибридомную методику на основе В-лимфоцитов человека (Cote et al, 1983) и методику EBV-гибридом (Cole et al. 1985). В соответствии с другим вариантом, методики, описанные для получения одноцепочечных антител (см., например, патент США №4946778), можно адаптировать для получения одноцепочечных антител против NKCC или против КСС. Антагонисты NKCC или агонисты КСС, полезные для практического применения настоящего изобретения, также включают фрагменты антител против NKCC или фрагменты антител против КСС, включая в качестве неограничивающих примеров F(аb')₂-фрагменты, которые могут быть получены путем переваривания пепсином интактной молекулы антитела, и Fab-фрагменты, которые могут быть получены путем восстановления дисульфидных мостиков в F(аb')₂-фрагментах. В соответствии с другим вариантом, можно сконструировать экспрессионные библиотеки Fab- и/или scFv-фрагментов с целью быстрой идентификации фрагментов, обладающих требуемой специфичностью к NKCC или КСС.

Гуманизированные антитела против NKCC или антитела против КСС и фрагменты этих антител также можно получить с помощью известных методик. «Гуманизированные антитела» - это формы химерных антител, принадлежащих не человеку (например, грызунам), которые содержат минимальную последовательность, имеющую происхождение из иммуноглобулина, не принадлежащего человеку. В большинстве случаев Гуманизированные антитела являются иммуноглобулинами человека (реципиентное антитело), в которых остатки из гипервариабельной области (CDR) реципиента заменены на остатки из гипервариабельной области вида, отличного от человека (донорное антитело), такого как мышь, крыса, кролик или отличные от человека приматы, имеющей требуемую специфичность, аффинность и функциональную активность антитела. В некоторых случаях остатки каркасной области (FR) иммуноглобулина человека заменяют соответствующими остатками вида, отличного от человека. Дополнительно, Гуманизированные антитела могут содержать остатки, которые не обнаружены в реципиентном антителе или в донорном антителе. Эти модификации производят для дополнительного улучшения функциональных характеристик антитела. В целом, гуманизированное антитело будет содержать в существенной мере все или по меньшей мере один, в типичном случае два, вариабельных домена, в которых все или в существенной мере все гипервариабельные петли соответствуют таковым иммуноглобулина, не принадлежащего человеку, и все или в существенной мере все FR являются таковыми с последовательностью из иммуноглобулина человека. Гуманизированное антитело также, возможно, будет содержать по меньшей мере часть консервативной области иммуноглобулина (Fc), в типичном случае - таковой области из иммуноглобулина человека. Способы получения гуманизированных антител описаны, например, Уинтером (Winter, патент США №5225539) и Боссом (Boss, Celltech, патент США №4 816 397).

В еще одном варианте воплощения антагонисты NKCC или агонисты КСС могут быть выбраны из аптамеров. Аптамеры - это класс молекул, которые предоставляют альтернативу антителам с точки зрения молекулярного узнавания. Аптамеры являются олигонуклеотидными или олигопептидными последовательностями, способными узнавать фактически любой класс целевых молекул с высокой аффинностью и специфичностью. Такие лиганды можно выделить с помощью систематической эволюции лигандов при экспоненциальном обогащении (SELEX), примененной к библиотеке случайных последовательностей, как описано в публикации Tuerk С.and Gold L, 1990. Библиотеку случайных последовательностей получают с применением комбинаторного химического синтеза ДНК. В такой библиотеке каждый ее член представлен линейным олигомером уникальной последовательности, иногда химически модифицированным. Обзор возможных модификаций, применений и преимуществ этого класса молекул был сделан в публикации Jayasena S.D., 1999. Пептидные аптамеры состоят из имеющей ограниченную конформационную свободу вариабельной области антитела, расположенной на служащем платформой белке, таком как тиоредоксин А из Е. coli, и выбранной из комбинаторных библиотек двугибридными способами (Colas et al, 1996).

Малые интерферирующие РНК (siPHK) также могут выполнять функции ингибиторов экспрессии гена ко-транспортера NKCC, пригодных для применения в настоящем изобретении. Экспрессия гена ко-транспортера NKCC может быть снижена при контакте субъекта или клетки с малыми двуцепочечными РНК (дцРНК) или с вектором или конструкцией, вызывающими образование малых двуцепочечных РНК, таких, что экспрессия гена ко-транспортера NKCC специфично подавляется (т.е., имеет место РНК-интерференция или PHKi). Способы отбора подходящих дцРНК или векторов, кодирующих дцРНК, хорошо знакомы специалистам в данной области в случае генов, чьи последовательности известны (см., например, TuschI, Т. et al. (1999); Elbashir, S.M. et al. (2001); Hannon, GJ. (2002); McManus, MT. et al. (2002); Brummelkamp, TR. et al. (2002); патенты США №№6 573 099 и 6 506 559 и международные публикации заявок на патенты №№WO 01/36646, WO 99/32619 и WO 01/68836).

Рибозимы также могут выполнять функции ингибиторов экспрессии гена ко-транспортера NKCC, пригодных для применения в настоящем изобретении. Рибозимы - это молекулы РНК, обладающие ферментативной активностью и способные катализировать специфичное расщепление РНК. Механизм действия рибозимов включает сиквенс-специфичную гибридизацию молекулы рибозима с комплементарной целевой РНК с последующим эндонуклеолитическим расщеплением. Созданные генно-инженерными методами рибозимные молекулы с мотивами шпилечной структуры или структуры типа «головки молотка», которые специфически и эффективно катализируют эндонуклеолитическое расщепление последовательностей мРНК ко-транспортера NKCC входят, таким образом, в объем настоящего изобретения. Сначала в составе любой потенциальной РНК-мишени идентифицируют специфические сайты рибозимного расщепления путем сканирования целевой молекулы на наличие сайтов расщепления рибозимами, которые в типичном случае включают следующие последовательности: GUA, GUU и GUC. После идентификации короткие последовательности РНК, длиной примерно от 15 до 20 рибонуклеотидов, соответствующие области целевого гена, содержащей сайт расщепления, можно оценить на наличие предсказанных структурных свойств, таких как вторичная структура, которые могут делать олигонуклеотидную последовательность непригодной. Пригодность кандидатных мишеней также можно оценить, проверяя их способность гибридизоваться с комплементарными олигонуклеотидами, с применением, например, анализа защиты от действия рибонуклеазы.

Как антисмысловые олигонуклеотиды, так и рибозимы, полезные в качестве ингибиторов экспрессии гена ко-транспортера NKCC, можно получить известными способами. Они включают методики химического синтеза, такие как, например, твердофазный фосфорамидитный химический синтез. В соответствии с другим вариантом, молекулы антисмысловых РНК можно получить с помощью транскрипции in vitro или in vivo последовательностей ДНК, кодирующих молекулы РНК. Такие молекулы ДНК можно вставлять в различные векторы, которые содержат пригодные промоторы для РНК-полимеразы, такие как промоторы для полимераз Т7 или SP6. Для повышения внутриклеточной стабильности и времени полужизни могут вноситься различные модификации олигонуклеотидов по изобретению. Возможные модификации включают в качестве неограничивающих примеров добавление фланкирующих последовательностей рибонуклеотидов или дезоксирибонуклеотидов к 5'- и/или 3'-концам молекулы или применение фосфоротиоатных или 2'-O-метильных связей вместо фосфодиэфирных в составе олигонуклеотидного остова.

Доставку in vivo антисмысловых олигонуклеотидов siPHK и рибозимов по изобретению можно осуществлять в виде отдельных молекул или в составе вектора. В самом широком понимании «вектор» - это любой носитель, способный облегчать перенос антисмыслового олигонуклеотида siPHK или нуклеиновой кислоты-рибозима в клетку, и предпочтительно - в клетку, экспрессирующую ко-транспортер NKCC. Предпочтительно, вектор переносит нуклеиновую кислоту в клетки, при этом снижается степень деградации по сравнению со степенью деградации, которая наблюдалась бы в отсутствие вектора. В общем случае, векторы, полезные для изобретения, включают в качестве неограничивающих примеров плазмиды, фагмиды, вирусы, другие носители, полученные из вирусных или бактериальных источников, которые были подвергнуты манипуляции путем вставки или внедрения последовательностей антисмыслового олигонуклеотида siPHK или нуклеиновой кислоты-рибозима. Вирусные векторы являются предпочтительным типом векторов и включают в качестве неограничивающих примеров последовательности нуклеиновых кислот из следующих вирусов: ретровирусы, такие как вирус мышиного лейкоза Молони, вирус саркомы мышей Харви, вирус опухоли молочной железы мышей и вирус саркомы Рауса; аденовирусы, аденосателлитные вирусы; вирусы 8У40-типа; вирусы полиомы; вирусы Эпштейна-Барр; вирусы папилломы; вирус герпеса; вирус коровьей оспы, полиовирус и РНК-содержащие вирусы, такие как ретровирусы. Специалист легко может применить другие вектора, которые не перечислены, но известны в данной области.

В предпочтительном воплощении соединение, которое ингибирует ко-транспортер NKCC, является диуретиком.

В другом предпочтительном воплощении диуретик является петлевым диуретиком.

В предпочтительном варианте воплощения соединение по изобретению является антагонистом NKCC1.

В еще одном предпочтительном варианте воплощения соединение по изобретению является буметанидом.

В предпочтительном воплощении соединение по изобретению выбрано из фуросемида, этакриновой кислоты, торсемида, азосемида, музолимина, пиретанида, трипамида и т.п.; тиазидных и тиазидоподобных диуретиков, таких как бендрофлюметиазид, бензтиазид, хлоротиазид, гидрохлоротиазид, гидрофлуметиазид, метилклотиазид, политиазид, трихлорметиазид, хлорталидон, индапамид, метолазон и квинетазон; и аналогов и функциональных производных таких соединений.

В предпочтительном варианте воплощения аналог по изобретению может иметь формулу, описанную в заявке на патент WO2006110187.

В предпочтительном варианте воплощения аналог может являться альдегидом буметанида, дибензиламидом буметанида, диэтиламидом буметанида, морфолиноэтиловым сложным эфиром буметанида, 3-диметиламинопропиловым сложным эфиром буметанида, N,N-диэтилгликольамидным сложным эфиром буметанида, диметилгликольамидным сложным эфиром буметанида, пиваксетиловым сложным эфиром буметанида, метокси-(полиэтиленокси)_n-i этиловым сложным эфиром буметанида, бензилтриметил аммониевой солью буметанида и цетилтриметиламмониевой солью буметанида.

В другом предпочтительном варианте воплощения аналог может являться альдегидом фуросемида, этиловым сложным эфиром фуросемида, цианометиловым сложным эфиром фуросемида, бензиловым сложным эфиром фуросемида, морфолиноэтиловым сложным эфиром фуросемида, 3-диметиламинопропиловым сложным эфиром фуросемида, N,N-диэтилгликольамидным сложным эфиром фуросемида, дибензиламидом фуросемида, бензилтриметиламмониевой солью фуросемида, цетилтриметиламмониевой солью фуросемида, N,N-диметилгликольамидным сложным эфиром фуросемида, метокси-(полиэтиленокси)п-гэтиловым сложным эфиром фуросемида, пиваксетиловым сложным эфиром фуросемида и пропаксетиловым сложным эфиром фуросемида.

В другом предпочтительном варианте воплощения аналог может являться альдегидом пиретанида, метиловым сложным эфиром пиретанида, цианометиловым сложным эфиром пиретанида, бензиловым сложным эфиром пиретанида, морфолиноэтиловым сложным эфиром пиретанида, 3-диметиламинопропиловым сложным эфиром пиретанида, N,N-диэтилгликольамидным сложным эфиром пиретанида, диэтиламидом пиретанида, дибензиламидом пиретанида, бензилтриметиламмониевой солью пиретанида, цетилтриметиламмониевой солью пиретанида, N,N-диметилгликольамидным сложным эфиром пиретанида, метокси-(полиэтиленокси)_n-iэтиловым сложным эфиром пиретанида, пиваксетиловым сложным эфиром пиретанида и/или пропаксетиловым сложным эфиром пиретанида.

В еще одном предпочтительном воплощении аналог может являться тетразолил-замещенными азосемидами (такими как метоксиметилтетразолил-замещенные азосемиды, метилтиометилтетразолил-замещенные азосемиды, и N-mПЭГ350-тетразолил-замещенные азосемиды), бензилтриметиламмониевой солью азосемида и/или цетилтриметиламмониевой солью азосемида.

В другом предпочтительном воплощении аналог может являться четвертичными аммониевыми солями пиридин-замещенного торсемида или соответствующими внутренними солями (цвиттер-ионами). В том числе включая в качестве неограничивающих примеров соли метосиметилпиридиния торсемида, соли метилтиометилпиридиния торсемида и соли М-mПЭГ350-пиридиния торсемида.

В предпочтительном варианте воплощения соединение по изобретению является агонистом KСС2.

В предпочтительном варианте воплощения соединение по изобретению является соединением, которое снижает уровень белка NKCC на поверхности клетки или повышает уровень белка KСС на поверхности клетки.

В другом предпочтительном воплощении клетка является нейроном.

Еще одна цель изобретения относится к способу лечения аутизма, включающему введение субъекту, которому это необходимо, соединения, которое ингибирует перенос хлорид-ионов в нейроны, или соединения, которое усиливает выход хлорид-ионов из нейронов.

Одной из особенностей изобретения является то, что оно относится к способу лечения аутизма, включающему введение субъекту, которому это необходимо, антагониста NKCC, такого как описанные выше.

Соединения по изобретению можно вводить в форме фармацевтической композиции, как указано ниже.

Предпочтительно, указанное соединение, которое ингибирует транспорт хлорид-ионов в нейроны или которое повышает выход хлорид-ионов из нейронов, предпочтительно, указанный антагонист белка NKCC или указанный агонист белка КСС вводят в терапевтически эффективном количестве.

Под «терапевтически эффективным количеством» понимают количество соединения, достаточное для лечения и/или профилактики заболеваний, таких как описаны ранее.

Понятно, что суммарная суточная доза соединений или композиций по настоящему изобретению будет выбираться лечащим врачом по результатам тщательной медицинской оценки. Специфический уровень терапевтически эффективной дозы для каждого конкретного пациента будет зависеть от различных факторов, включая нарушение, которое лечат, и степень тяжести нарушения; активность применяемых специфических соединений; применяемую специфическую композицию, возраст, массу тела, общее состояние здоровья, пол и диету пациента; время введения, способ введения и скорость выведения применяемого специфического соединения; длительность лечения; лекарственные средства, применяемые в сочетании или одновременно с применяемым специфическим полипептидом и тому подобные факторы, известные специалистам в области медицины. Например, специалистам хорошо известно, что начальная доза соединения может быть на уровне, ниже, чем необходимо для достижения требуемого терапевтического эффекта, и дозировку постепенно повышают до достижения терапевтического эффекта. Однако суточная дозировка продуктов может изменяться в широком диапазоне от 0,01 до 1000 мг на взрослого пациента в день. Предпочтительно, композиции содержат 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1,0, 2,5, 5,0, 10,0, 15,0, 25,0, 50,0, 100, 250 и 500 мг активного вещества для симптоматической корректировки дозировки для получающего лечение пациента. Лекарственный препарат в типичном случае содержит от примерно 0,01 мг до примерно 500 мг активного вещества, предпочтительно - от 1 мг до примерно 100 мг активного вещества. Эффективное количество лекарственного средства обычно доставляется при уровне дозировки от 0,0002 мг/кг до примерно 20 мг/кг массы тела в день, главным образом, от примерно 0,001 мг/кг до 7 мг/кг массы тела в день.

Соединения по изобретению можно применять при приготовлении фармацевтической композиции для применения с целью лечения аутизма.

Следовательно, настоящее изобретение также направлено на создание фармацевтической композиции, содержащей эффективную дозу соединения по изобретению, которое ингибирует ко-транспортер NKCC, предпочтительно -антагониста NKCC, или которое активирует ко-транспортер КСС.

Любой терапевтический агент по изобретению может быть скомбинирован с фармацевтически приемлемыми вспомогательными веществами и, возможно, матрицами, обеспечивающими пролонгированное действие, такими как биодеградируемые полимеры, с образованием терапевтических композиций.

«Фармацевтически» или «фармацевтически приемлемый» относится к молекулярным субстанциям или композициям, которые не вызывают нежелательных, аллергических или других неблагоприятных реакций при введении при необходимости млекопитающему, в частности, человеку. Фармацевтически приемлемый носитель или вспомогательное вещество относится к нетоксичным твердому, полутвердому или жидкому наполнителю, растворителю, материалу для инкапсулирования или добавке любого типа к композиции.

Форма фармацевтических композиций, способ введения, дозировка и режим обычно зависят от расстройства, которое необходимо лечить, степени тяжести заболевания, возраста, массы тела и пола пациента и т.д.

Фармацевтические композиции по изобретению могут быть приготовлены для местного, перорального, интраназального, парентерального, внутриглазного, внутривенного, внутримышечного или подкожного введения и т.п.

Предпочтительно, фармацевтические композиции содержат носители, которые фармацевтически приемлемы для лекарственной формы, которую можно вводить в виде инъекции. В частности, это могут быть изотонические стерильные солевые растворы (фосфата мононатрия или динатрия, хлорида натрия, калия, кальция или магния и т.п.или смесей таких солей) или сухие, в частности, лиофилизированные композиции, которые при добавлении, в зависимости от конкретного случая, стерилизованной воды или физиологического солевого раствора позволяют осуществить восстановление инъекционных растворов.

Дозы, применяемые для введения, могут быть адаптированы в зависимости от различных параметров, и в частности, в зависимости от применяемого способа введения, соответствующей патологии или, в соответствии с другим вариантом, от требуемой длительности лечения.

Дополнительно, другие фармацевтически приемлемые формы включают, например, таблетки или другие твердые формы для перорального введения; капсулы с замедленным высвобождением и любые другие формы, доступные для применения в настоящее время.

Фармацевтическая композиция по изобретению также может содержать другие соединения, которые могут быть биологически активными или неактивными. Например, один или несколько лечебных агентов по настоящему изобретению могут быть скомбинированы с еще одним агентом при комбинированной терапии и введены согласно режиму лечения по настоящему изобретению. Такие сочетания можно вводить как отдельные композиции, объединенными для введения в подходящей системе доставки или приготовленными в форме комбинированной композиции, такой как смесь или химерное соединение. Дополнительно, вышеупомянутая лечебная комбинация может включать усилитель проницаемости ГЭБ и/или гиперосмотический агент.

В соответствии с другим вариантом, соединения по изобретению, которые ингибируют ко-транспортер NKCC или активируют ко-транспортер КСС, могут быть дополнительно идентифицированы с помощью способов скрининга, как описано далее.

Способы скрининга

Еще одна цель изобретения относится к способу проведения скрининга соединения, которое ингибирует ко-транспортер NKCC или активирует ко-транспортер КСС.

В частности, изобретение направлено на создание способа скрининга антагониста белка NKCC или агониста белка КСС для лечения аутизма.

Например, способ скрининга может заключаться в определении связывания кандидатного соединения с NKCC или КСС, или с клетками или с мембранами, несущими NKCC или КСС или содержащий их химерный белок, посредством внесения метки, прямо или опосредованно связанной с кандидатным соединением. В соответствии с другим вариантом, способ скрининга может включать измерение или качественную или количественную детекцию конкурентного связывания с рецептором кандидатного соединения и меченого конкурентного соединения (например, антагониста).

Дополнительно, способы скрининга могут заключаться в проверке того, приводит ли кандидатное соединение к возникновению сигнала, порождаемого антагонистом белка NKCC или агонистом белка KСС, с применением систем детекции, соответствующих клеткам, несущим рецептор.

В одном варианте воплощения способ скрининга по изобретению включает этап, состоящий из:

a) получения нейронов, экспрессирующих на своей поверхности белки NKCC или КСС;

b) инкубации указанных клеток с кандидатным соединением;

c) определения того, способно ли указанное кандидатное соединение связываться с NKCC и ингибировать его или связываться с KСС и активировать его;

и

d) выбора кандидатного соединения, которое связывается с NKCC и ингибирует его или связывается с КСС и активирует его.

В одном из вариантов воплощения ко-транспортер NKCC или ко-транспортер КСС, применяемые при способе скрининга, могут являться их ортологами или производными, как указано в настоящем изобретении.

В общем случае, такие способы скрининга включают получение соответствующих клеток, которые экспрессируют NKCC или КСС, их ортологи и производные на своей поверхности. В частности, можно применить нуклеиновую кислоту, кодирующую NKCC или КСС, для трансфекции клеток, и тем самым обеспечить экспрессию рецептора по изобретению. Такая трансфекция может быть выполнена способами, хорошо известными специалистам в данной области.

В одном варианте воплощения клетки выбраны из группы, состоящей из глиальных клеток, нейрональных клеток, нейронов, трансфецированных линий клеток, предназначенных для исследований, или клеток почки, принадлежащих любому биологическому виду (мыши, человеку и т.д.).

Способ скрининга по изобретению можно применять для определения антагониста или агониста по контакту таких клеток с соединениями, скрининг которых проводят, и определению того, способно ли такое соединение ингибировать или активировать ко-транспортер.

Определение ингибирования белка NKCC можно проводить путем определения жизнеспособности клеток. Считается, что соединение снижает жизнеспособность клеток, если оно дает отрицательный ответ при осуществлении любого из способов, описанных ниже в качестве примеров активности по обеспечению выживаемости клеток.

В соответствии с одним из вариантов воплощения настоящего изобретения кандидатное соединение может быть выбрано из библиотеки ранее синтезированных соединений, или из библиотеки соединений, для которых в базе данных указана структура, или из библиотеки соединений, синтезированных de novo, или природных соединений.

Кандидатное соединение может быть выбрано из группы (а) белков или пептидов; (b) нуклеиновых кислот и (с) органических или химических соединений (природного происхождения или нет). В качестве примера, библиотеки предварительно отобранных кандидатных нуклеиновых кислот можно получить с помощью способа SELEX, как описано в документах US 5475096 и US 5270163. В качестве дополнительного примера, кандидатное соединение может быть выбрано из группы антител, выработанных против NKCC или КСС.

Такой способ можно применять для скрининга антагонистов белка NKCC или агонистов белка КСС по изобретению.

Изобретение будет дополнительно проиллюстрировано следующими таблицами и примерами. Однако данные примеры и численные значения не следует трактовать как ограничивающие каким-либо образом объем настоящего изобретения.

Таблица 1 Резюме пациентов, включенных в исследование. Четыре мальчика и одна девочка в возрасте от 3 лет 8 месяцев до 11 лет 5 месяцев с классическими признаками аутизма (F84.0 de I'ICD 10)   Возраст Пол Диагноз ADI1 ADI2 ADI3 ADI4 1 8 лет 11 мес. М F84.00 18(10) 13(8) 5(3) 5(1) 2 3 года 8 мес. Ж F84.00 20(10) 8(7) 4(3) 5(1) 3 8 лет 7 мес. М F84.00 21(10) 8(7) 5(3) 4(1) 4 11 лет 5 мес. М F84.00 24(10) 14(7) 4(3) 5(1) 5 10 лет 1 мес. М F84.00 17(10) 20(8) 4(3) 3(1)

Таблица 2 Резюме оценок эффектов буметанида у пяти пациентов (К=контрольные значения до начала лечения, Бум.=значения через 3 месяца после приема буметанида)   1 2 3 4 5   К Бум. К Бум. К Бум. К Бум. К Бум. Шкала для оценки детского аутизма CARS, сумма 38,5 28 40,5 36 38 30 53,5 49 32 28 Шкала CARS, кол-во пунктов с оценкой выше 3 7 1 7 4 9 4 14 11 3 1 Поведенческий опросник для диагностики аутизма 84 57 79 49 89 62 93 79 46 36 АВС, сумма                     АВС1 20 17 9 3 20 12 15 15 18 17 АВС2 9 1 19 11 12 5 26 19 10 7 АВС3 12 6 10 6 13 3 15 12 3 1 АВС4 39 28 41 29 32 33 37 33 15 11 АВС5 4 5 0 0 12 9 0 0 0 0 Шкала общего клинического впечатления CGI1 5 5 7 7 5 5 7 7 4 4 Шкала общего клинического впечатления CGI2   3   3   3   3   3 Шкала общего клинического впечатления CGI3   3,00   3,00   2,00   2,00   3,00 Оценочная таблица нарушения регуляции RDEG, сумма 49 28 60 48 39 37 75 69 49 40 Оценочная таблица RDEG, нарушение регуляции 30 20 37 34 29 31 50 45 32 25 Оценочная таблица RDEG, медлительность 12 5 14 8 6 5 15 14 10 9 Шкала оценки ограниченных и повторяющихся моделей поведения RRB, сумма 51 32 69 26 63 31 46 40 46 38 Шкала RRB F1 21 15 21 13 12 6 16 14 11 9 Шкала RRB F2 1 1 12 0 20 7 2 2 8 9 Шкала RRB F3 17 6 18 9 19 9 18 16 5 5 Шкала RRB F4 10 8 14 4 9 8 8 6 18 12

ОПИСАНИЕ ПРИМЕРОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Пример

Материалы и методы

Авторы изобретения исследовали эффекты буметанида у 5 детей, страдающих аутизмом, при непрерывном клиническом и биологическом наблюдении. Пациенты были выбраны без предварительно заданных параметров из большой группы детей с СДА, находящихся в медицинских организациях или дома, с целью обеспечить представленность различных случаев. Диуретик вводили в дозировке 1 мг/24 ч (по 0,5 мг дважды в день) и проводили лечение в течение 3 мес., то есть минимальной продолжительности, которая считается достаточной для оценки влияния на синдром детского аутизма (СДА). Мы сообщаем о существенном улучшении проявлений СДА у 5 детей. Эти наблюдения свидетельствуют в пользу проведения широкомасштабного скрининга случаев применения буметанида при СДА и в основном - для лечения аутизма.

Диагноз был поставлен детям опытным клиническим специалистом с применением строгих критериев Международной классификации болезней 10-го пересмотра (ICD-10, ВОЗ, 1993) для аутического расстройства. У детей не было истории неврологического заболевания (нормальная ЭЭГ). Систематически проводимые генетические тесты имели отрицательные результаты, свидетельствуя об отсутствии выявляемых мутаций (кариотип и «ломкая» Х-хромосома). Для всех принимавших участие в исследовании с целью подтверждения диагноза были собраны данные по адаптированному варианту Опросника для диагностики аутизма (ADI-R; Le Couteur et al, 1989; Lord et al, 1994). Клинический и биологический осмотры показали, что ни у одного из детей не было противопоказания к приему буметанида (в частности, ионограмма крови, определение уровней трансаминаз, щелочных фосфатаз, уремия, креатинемия, клиренс креатинина, γ-глутамилтрансфераза, гликемия). Так как гипокалиемия может вызывать взрывное распространение аритмии, получали ЭКГ, чтобы убедиться, что ни у одного из пациентов не наблюдалось удлинения интервала QT из-за повышенной склонности к возникновению аритмии. Еженедельный клинический осмотр проводили в течение первого, второго и третьего месяца после начала лечения, в том числе определение уровней натрия и калия в крови через одну неделю и через 2 мес. после начала лечения. Ни у одного ребенка не было сопутствующих неврологических нарушений, и ни один не проходил лечение в течение по меньшей мере трех месяцев.

Для определения возможной эффективности терапевтического индекса применяли 5 классических способов определения степени тяжести СДА на основе оценки поведения, включая следующие.

i) Шкала для оценки детского аутизма (CARS) - это оценочная шкала из 15 пунктов, которая применяется в качестве инструмента скрининга и для оценки изменений симптомов аутизма с течением времени. Эти пункты включают широкий диапазон симптомов аутизма и оцениваются по шкале от 1 до 4, где 1 свидетельствует о нормальном поведении, а 4 означает тяжелую степень аномального и/или несоответствующего поведения. Суммарную оценку определяют сложением оценок по 15 пунктам. Количество пунктов с оценкой по шкале, равной 3 или более, является сильным показателем степени тяжести синдрома, тогда как снижение после лечения суммарной оценки и/или количества пунктов с оценкой по шкале, равной 3 или более, свидетельствует об улучшении с точки зрения степени тяжести симптомов аутизма (Rogers et al, 1993). Данный инструмент был разработан как вспомогательный для процесса постановки диагноза, но он также чувствителен к развитию изменений симптомов аутизма (Schopler et al, 1980; Mesibov et al, 1989) и может применяться для определения изменений, вызванных лечением (Di Lalla and Rogers 1994, см. также версию на французском языке: В. Roge 1989). Записи были получены во время сеанса, в течение которого детей вовлекали в игру, и активного обсуждения с родителями поведения ребенка во время последней недели.

ii) АВС (Поведенческий опросник для диагностики аутизма) - это опросник, который заполняет лечащий врач во время обсуждения с участием родителей (Aman et al, 1985; Rojahn and Helsel 1991). Его широко применяют во время клинических испытаний лекарственных средств с целью оценки влияния молекул на поведение. АВС - это опросник из 58 пунктов, касающихся стандартных поведенческих проблем, который позволяет оценивать каждый пункт по 4-балльной шкале от 0 (не проявляется вообще) до 3 (тяжелая степень). Вопросы опросника разделены на 5 под-шкал: раздражительность (АВС1), социальная замкнутость (АВС2), стереотипия (АВСЗ), гиперактивность (АВС4) и чрезмерная разговорчивость (АВС5). Опросник АВС был валидирован в крупномасштабных исследованиях в США и адаптирован для исследований в детской популяции. В данном исследовании применяли версию на французском языке (Bouvard 2000).

iii) Шкала общего клинического впечатления (CGI) широко применяется в большинстве клинических испытаний для определения степени тяжести заболевания. Шкала содержит оценки от 0 до 7, где 1 соответствует нормальному значению, и считается хорошим показателем общего состояния пациента. Клинициста просят дать оценку заболевания в зависимости от его/ее опыта работы с другими пациентами, включенными в исследование. Второй опрос о впечатлении дает оценку общего улучшения состояния пациента и уменьшения интенсивности симптомов по сравнению с началом клинического испытания. Имеется 7 уровней; нулевое значение свидетельствует об отсутствии изменений. Третий опрос о впечатлении наиболее полезен, так как он касается терапевтического индекса и требует единичной оценки, которая отражает как терапевтические, так и побочные эффекты. Он применяется при исследовании психопатических агентов нового поколения, которые обладают слабыми побочными эффектами (Guy 1976).

iv) RDEG - оценочная таблица нарушения регуляции - это французская шкала оценки активности (96), которая позволяет детектировать уровень нарушения регуляции и замедленности ответа у детей (Adrien 1996; Adrien et al. 2001, Blanc et al. 2005). Опросник заполняется родителями и касается поведения детей в течение последней недели.

v) Шкала оценки ограниченных и повторяющихся моделей поведения (RRB) (Bourreau et al 2009) - это стандартный опросный лист из 35 пунктов, который позволяет оценить каждый пункт по 5-балльной шкале от 0 (поведение никогда не наблюдалось у пациента) до 4 (поведение выражено в тяжелой степени и характерно для пациента). С помощью факториального анализа получают четыре клинически значимых фактора, а именно, чувственно-моторные стереотипные движения (F1), реакция на изменение (F2), ограниченные модели поведения (F3) и недостаточная модуляция (F4).

Результаты

Резюме пациентов представлено в таблице 1. 3 мальчика использовали функциональный язык, тогда как еще один мальчик и девочка - нет. Оценки по ADI-R выше порогового значения, что служит подтверждением клинического диагноза. Дети 1, 3, 5 посещают стандартную школу вместе с сопровождающим лицом. В течение года за детьми 1 и 2 наблюдает психолог, используя методику АВА (Прикладного анализа поведения) (один раз в неделю в случае ребенка 1 и 3 раза в неделю в случае ребенка 2). Ребенок 2 также проходит 2-недельный сеанс ортофонии, основанной на системе общения посредством картинок (PECS). Ребенок 3 получает ортофоническое лечение еженедельно, а ребенок 5 не получает лечения. Ребенок 4 лечится в медицинском учреждении, специализирующемся на лечении детей с задержкой умственного развития. Испытание буметанида проводили во время летних каникул, когда поведенческая терапия и занятия в школе были прерваны.

В таблице 2 показаны оценки по различным применявшимся шкалам, которые были получены до и спустя три месяца после лечения. Перед началом лечения 4 ребенка (1, 2, 3, 4) имели оценки по шкале CARS более 36, что указывает на тяжелую степень СДА. У ребенка 5 была умеренная степень аутизма. Результаты демонстрируют улучшение суммарных оценок CARS, ABC, RDEG и RRB у всех детей через три месяца после лечения. Показатель CGI1 значимо не изменился, но данный тест касается степени тяжести заболевания, которая на данном этапе не показывает значимых изменений. Мы также наблюдали небольшое общее улучшение показателя CGI2 у 5 детей. У пациентов 1, 2 и 5 значение показателя CGI3 равнялось 3, что свидетельствует об умеренном действии при отсутствии побочных эффектов. У пациентов 3 и 4 значение показателя равнялось 2, что свидетельствует о минимальном действии при отсутствии побочных эффектов. Количество пунктов шкалы CARS, оценки по которым равны или выше 3, снизилось в результате лечения у пяти детей. Оценка по под-шкале АВС5 в результате лечения не изменилась. У пяти детей показатели АВС2, АВСЗ, АВС4, RDEG -нарушение регуляции, RDEG - медлительность, RRB F4; RRB F1 улучшились в различной степени. В противоположность этому, результаты для АВС1, RRB F2, RRB F3 разнонаправлены.

Начиная с одной недели после лечения, один раз в месяц проводили клиническое обследование, включая исследование наличия обезвоживания, ортостатической гипотензии, гиперчувствительности, судорог, астении, диареи, миалгии, артралгии, тошноты, головокружения. Уровни натрия и калия оставались постоянными (исследования проводили через неделю и через 2 мес. после начала лечения). Нежелательных эффектов не обнаружено.

Обсуждение

Настоящие результаты свидетельствуют, что буметанид улучшает поведенческие особенности при СДА, что указывает на то, что диуретик оказывает общее действие. Насколько нам известно, это первое сообщение, в котором говорится о возможности изменений уровней хлорид-ионов при аутизме.

Сделать выводы из этих наблюдений сложно из-за ряда ограничений, включая отсутствие рандомизированных, двойных слепых и плацебо-контролируемых исследований, что связанно с ограниченным количеством случаев. Эффекты плацебо более выражены у детей, чем у взрослых (Rheims et al., 2008), что справедливо также и для аутизма (Sandier 2005). Очевидно, что необходимы крупномасштабные исследования с целью подтверждения или опровержения данных наблюдений. Мы осознаем наличие этих ограничений в отношении демонстрации положительного влияния буметанида и сложность понимания его действия в случае СДА. Тем не менее, наши наблюдения свидетельствуют, что буметанид не имеет побочных эффектов и обладает общей переносимостью, характерной для диуретика. Кроме того, к представлению данных наблюдений нас побудили значительные поведенческие улучшения, на которые указывают результаты, и утверждения родителей о том, что их дети стали в большей мере проявлять присутствие, а также их желание продолжать лечение, говорящее в пользу значимости действия буметанида. Несмотря на сложности использования такой субъективной оценки, интересно отметить, что один и тот же термин «присутствия» использовали все родители.

Сейчас невозможно определить, оказывает ли буметанид предпочтительное действие на один из аспектов симптоматологии. Отсутствие эффектов буметанида на показатель АВС5 - неуместная, чрезмерная разговорчивость, не связанная с контекстом - является ожидаемой, так как маловероятно, что улучшение речевого аспекта произойдет через 3 месяца. В противоположность этому, почти все оценки улучшились в различной степени, что указывает на общее действие буметанида. Изменение когнитивного и эмоционального аспектов поведения - это основная особенность СДА (Kanner, 1943; Hill and Frith, 2003; Hill, 2004; Bieberich and Morgan, 2004), и тот факт, что буметанид способствует улучшению когнитивной регуляции, возможно, коррелирует с улучшением «присутствия», которое отмечали родители. Результаты по оценкам согласно под-шкалам АВС указывают на улучшение с точки зрения состояний настороженности и социальных взаимодействий, стереотипных движений и гиперактивности, что опять же соответствует признакам когнитивной регуляции. Фармакодинамику буметанида исследовали у новорожденных детей человека (Sullivan et al, 1996; Lopez-Samblas et al, 1997), и в недавних сообщениях указывается, что буметанид снижает степень тяжести приступов у детей с эпилепсией (Kahle et al, 2009). Широкий диапазон экспериментальных исследований указывают на то, что буметанид снижает степень тяжести приступов (Kahle and Staley, 2008; Kahle et al, 2008; Nardou et al., 2009). В настоящее время буметанид изучается в, качестве нового средства для лечения приступов у новорожденных (проект EU FP7 NEMO).

Наблюдения соответствуют рабочей гипотезе о том, что буметанид усиливает эффективность нейрональных интегративных процессов путем снижения внутриклеточного уровня хлорид-ионов и восстановления тормозной активности ГАМК. Основная концепция этих исследований заключается в том, что нейроны, которые неспособны соответствовать программе развития, сохраняют характерные для незрелых клеток свойства - в том числе, возможно, высокий уровень (Cl^-)_l и другие электрические и структурные особенности (Ben-Ari, 2008). Другие наблюдения свидетельствуют, что существует связь между ГАМК-эргическими сигналами и аутизмом (Minshew, 1997; Hussman, 2001; Schmitz et al., 2005). Кроме того, несколько исследований изображений головного мозга указывают на существенное снижение уровня рецепторов для ГАМК/бензидиазепинов при аутизме, особенно в гиппокампе, мозжечке и различных лимбических структурах (Garreau et al, 1993; Oblak et al, 2009; Guptill et al, 2007; Blatt, 2005).

В заключение, появляющиеся серии исследований указывают, что хлорид-ионы накапливаются в ходе созревания головного мозга в связи с различными пороками развития. Настоящие наблюдения показывают, что стандартный диуретик, который снижает это накопление и действует таким образом, что восстанавливает тормозную активность ГАМК, может оказывать благоприятное воздействие при аутизме, что свидетельствует о необходимости более тщательных экспериментальных и клинических исследований связи между ГАМК/(Сl^-)_l и СДА.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

В тексте настоящей заявки различные ссылки описывают современное положение дел в области, к которой относится настоящее изобретение. Содержание этих ссылок включено в настоящее описание путем такой ссылки.

Adrien JL, Rossignol-Deletang N, Martineau J, Couturier G, Barthelemy С (2001) Regulation of cognitive activity and early communication development in young autistic, mentally retarded, and young normal children. Dev Psychobiol 39:124-136.

Adrien J.-L (1996) Autisme du jeune enfant: développement psychologique et regulation de I'activite. Paris: Expansion scientifique Francaise.

Aman MG, Singh NN, Stewart AW et al. (1985) The Aberrant Behavior Checklist: a behaviour rating scale for assessment of treatment effects. American Journal of Mental Deficiency 89 (5): 485-491.

Balena T, Woodin MA (2008) Coincident pre- and postsynaptic activity downregulates NKCC1 to hyperpolarize E(CI) during development. Eur J Neurosci 27:2402-2412.

Ben Ari Y (2002) Excitatory actions of GABA during development: The nature of the nurture. Nature Reviews Neuroscience 3:728-739.

Ben Ari Y, Gaiarsa JL, Tyzio R, Khazipov R (2007) GABA: A Pioneer Transmitter That Excites Immature Neurons and Generates Primitive Oscillations. Physiol Rev 87:1215-1284.

Ben-Ari Y (2008) Neuro-archaeology: pre-symptomatic architecture and signature of neurological disorders. Trends Neurosci 31:626-636.

Bieberich AA, Morgan SB (2004) Self-regulation and affective expression during play in children with autism or Down Syndrome: a short-term longitudinal study. J Autism Dev Disord 34:439-448.

Blanc R, Adrien JL, Roux S, Barthelemy С (2005) Dysregulation of pretend play and communication development in children with autism. Autism 9:229-245.

Blatt GJ (2005) GABAergic cerebellar system in autism: a neuropathological and developmental perspective. Int Rev Neurobiol 71:167-178.

Bourgeron T (2009) A synaptic trek to autism. Curr Opin Neurobiol 19:231-234.

Bourreau Y., Roux S., Gomot M., Bonnet-Brilhault F., Barthélémy C. (2009) Validation of the repetitive and restricted behaviour scale in autism spectrum disorders. European Child and adolescent psychiatry, Nov 18(11): 675-682.

Bourreau Y, Roux S, Gomot M, Barthelemy С (2009) [Repetitive and restricted behaviours (RRB) in autism: clinical evaluation]. Encephale 35:340-346.

Bouvard M (2000) Liste des comportements aberrants- version traduite, Issy les moulineaux, EAP/ECPA.

Cohen I, Navarro V, Clemenceau S, Baulac M, Miles R (2002) On the origin of interictal activity in human temporal lobe epilepsy in vitro. Science 298:1418-1421.

Cohen M (1981) Pharmacology of bumetanide. J Clin Pharmacol 21:537-542.

Delpire E (2000) Cation-Chloride Cotransporters in Neuronal Communication. News Physiol Sci 15:309-312.

Delpire E, Lu J, England R, Dull C, Thorne T (1999) Deafness and imbalance associated with inactivation of the secretory Na-K-2CI co-transporter. Nat Genet 22:192-195.

Delpire E, Mount DB (2002) Human and murine phenotypes associated with defects in cation-chloride cotransport. Annu Rev Physiol 64:803-843.

DiLalla D.L, Rogers S.J. (1994) Domains of the Childhood Autism Rating Scale: relevance for diagnosis and treatment. J. Autism Dev Disord. Apr 24(2):115-28

Dzhala VI, Talos DM, Sdrulla DA, Brumback AC, Mathews GC, Benke ТА, Delpire E, Jensen FE, Staley KJ (2005) NKCC1 transporter facilitates seizures in the developing brain. NatMed 11:1205-1213.

Feit PW (1981) Bumetanide-the way to its chemical structure. J Clin Pharmacol 21:531-536.

Fiumelli H, Cancedda L, Poo MM (2005) Modulation of GABAergic transmission by activity via postsynaptic Ca2+-dependent regulation of KCC2 function. Neuron 48:773-786.

Fiumelli H, Woodin MA (2007) Role of activity-dependent regulation of neuronal chloride homeostasis in development. Current Opinion in Neurobiology 17:81-86.

Garreau B, Herry D, Zilbovicius M, Samson Y, Guerin P, Leiord G (1993) Theoretical aspects of the study of benzodiazepine receptors in infantile autism. Acta Paedopsychiatr 56:133-138.

Guptill JT, Booker AB, Gibbs TT, Kemper TL, Bauman ML, Blatt GJ (2007) [3H]-flunitrazepam-labeled benzodiazepine binding sites in the hippocampal formation in autism: a multiple concentration autoradiographic study. J Autism Dev Disord 37:911-920.

Guy W. ECDEU (1976) Assessment Manual for psychopharmacology, National institute of Mental Health (Ed.). (Early Clinical Drug Evaluation Unit)

Hill EL (2004) Executive dysfunction in autism. Trends Cogn Sci 8:26-32.

Hill E.L, Frith U. (2003) Understanding autism: insights from mind and brain. Philos Trans R Soc Lond В Biol Sci. Feb 28; 358 (1430): 281-9.

Hussman JP. (2001) Suppressed gabaergic inhibition as a common factor in suspected etiologies of autism, J of Autism and Developmental Disorders. 31 (2): 247-248.

Huberfeld G, Wittner L, Clemenceau S, Baulac M, Kaila K, Miles R, Rivera С

(2006) Perturbed Cl-homeostasis and gabaergic signaling in human temporal lobe epilepsy. Epilepsia 47:20.

Huberfeld G, Wittner L, Clemenceau S, Baulac M, Kaila K, Miles R, Rivera С

(2007) Perturbed chloride homeostasis and GABAergic signaling in human temporal lobe epilepsy. J Neurosci 27:9866-9873.

Kahle KT, Barnett SM, Sassower КС, Staley KJ (2009) Decreased seizure activity in a human neonate treated with bumetanide, an inhibitor of the Na(+)-K(+)-2Cl(-) cotransporter NKCC1. J Child Neurol 24:572-576.

Kahle KT, Staley KJ (2008) The bumetanide-sensitive Na-K-2CI cotransporter NKCC1 as a potential target of a novel mechanism-based treatment strategy for neonatal seizures. Neurosurg Focus 25:E22.

Kahle KT, Staley KJ, Nahed BV, Gamba G, Hebert SC, Lifton RP, Mount DB (2008) Roles of the cation-chloride cotransporters in neurological disease. Nat Clin Pract Neurol 4:490-503.

Kanner L. (1943) Autistic disturbances of affective contact. Nervous Child 2: 217-50

Khalilov I, Holmes GL, Ben Ari Y (2003) In vitro formation of a secondary epileptogenic mirror focus by interhippocampal propagation of seizures. Nat Neurosci 6:1079-1085.

Khalilov I, Le Van QM, Gozlan H, Ben Ari Y (2005) Epileptogenic Actions of GABA and Fast Oscillations in the Developing Hippocampus. Neuron 48:787-796.

Le Couteur A, Rutter M, Lord C, Rios P, Robertson S, Holdgrafer M, McLennan J (1989) Autism diagnostic interview: a standardized investigator-based instrument. J Autism Dev Disord 19:363-387.

Levy SE, Hyman SL (1993) Pediatric assessment of the child with developmental delay. Pediatr Clin North Am 40:465-477.

Levy SE, Hyman SL (2005) Novel treatments for autistic spectrum disorders. Ment Retard Dev Disabil Res Rev 11:131-142.

Li H, Tornberg J, Kaila K, Airaksinen MS, Rivera С (2002) Patterns of cation-chloride cotransporter expression during embryonic rodent CNS development. Eur J Neurosci 16:2358-2370.

Lopez-Samblas AM, Adams JA, Goldberg RN, Modi MW (1997) The pharmacokinetics of bumetanide in the newborn infant. Biol Neonate 72:265-272.

Lord C, Rutter M, Le Couteur A (1994) Autism Diagnostic Interview-Revised: a revised version of a diagnostic interview for caregivers of individuals with possible pervasive developmental disorders. J Autism Dev Disord 24:659-685.

Mackie K, DePasquale M, Cserr HF (1986) Increased permeability of a glial blood-brain barrier during acute hyperosmotic stress. Am J Physiol 251:R1186-R1192.

Marshall JD, Wells TG, Letzig L, Kearns GL (1998) Pharmacokinetics and pharmacodynamics of bumetanide in critically ill pediatric patients. J Clin Pharmacol 38:994-1002.

Mesibov GB, Schopler E, Caison W (1989) The Adolescent and Adult Psychoeducational Profile: assessment of adolescents and adults with severe developmental handicaps. J Autism Dev Disord 19:33-40.

Minshew N1. (1997) In vivo brain chemistry of autism: 31 P Magnetic resonance spectroscopy studies, in Bauman ML and Kemper TL, The neurobiology of autism, Baltimore: Johns Hopkins University Press.

Nardou R, Ben-Ari Y, Khalilov I (2009) Bumetanide, an NKCC1 antagonist, does not prevent formation of epileptogenic focus but blocks epileptic focus seizures in immature rat hippocampus. J Neurophysiol 101:2878-2888.

O'Donnell ME, Lam TI, Tran L, Anderson SE (2004) The role of the blood-brain barrier Na-K-2CI cotransporter in stroke. Adv Exp Med Biol 559:67-75.

Oblak A, Gibbs TT, Blatt GJ (2009) Decreased GABAA receptors and benzodiazepine binding sites in the anterior cingulate cortex in autism. Autism Res 2:205-219.

Patterson PH (2002) Maternal infection: window on neuroimmune interactions in fetal brain development and mental illness. CurrOpin Neurobiol 12:115-118.

Payne JA, Rivera C, Voipio J, Kaila К (2003) Cation-chloride co-transporters in neuronal communication, development and trauma. Trends Neurosci 26:199-206.

Persico AM, Bourgeron Т (2006) Searching for ways out of the autism maze:

genetic, epigenetic and environmental clues. Trends Neurosci 29:349-358.

Rheims S, Cucherat M, Arzimanoglou A, Ryvlin P (2008) Greater response to placebo in children than in adults: a systematic review and meta-analysis in drug-resistant partial epilepsy. PLoS Med 5:e166.

Rivera C, Voipio J, Payne JA, Ruusuvuori E, Lahtinen H, Lamsa K, Pirvola U, Saarma M, Kaila К (1999) The K+/CI- co-transporter KCC2 renders GABA hyperpolarizing during neuronal maturation. Nature 397:251-255.

Roge B. (1989) Echelle devaluation de I'autisme infantile-version traduite (CARS-T). Issy les moulineaux, EAP/ECPA.

Rogers SJ, Ozonoff S, Maslin-Cole C (1993) Developmental aspects of attachment behavior in young children with pervasive developmental disorders. J Am Acad Child Adolesc Psychiatry 32:1274-1282.

Rojahn J, Helsel WJ (1991) The Aberrant Behavior Checklist with children and adolescents with dual diagnosis. J Autism Dev Disord 21:17-28.

Sandier A. (2005) Placebo Effects in Developmental Disabilities: Implications for Research and Practice, Mental Retardation and Developmental Disabilities Research Reviews 11: 164-170.

Schmitz C, van K, I, Hof PR, van EH, Patterson PH, Steinbusch HW (2005) Autism: neuropathology, alterations of the GABAergic system, and animal models. Int Rev Neurobiol 71:1-26.

Schopler E, Reichler RJ, De Vellis RF, Dally K. (1980) Toward Objective Classification of Childhood Autism: Childhood Autism Rating Scale (CARS), J. of Autism and Developmental disorders 10 (1): 91-103.

Spitzer NC, Gu X, Olson E (1994) Action potentials, calcium transients and the control of differentiation of excitable cells. Curr Opin Neurobiol 4:70-77.

Sullivan JE, Witte MK, Yamashita TS, Myers CM, Blumer JL (1996) Pharmacokinetics of bumetanide in critically ill infants. Clin Pharmacol Ther 60:405-413.

The ICD-10 Classification of Mental and Behavioural disorders: Diagnostic criteria for research (1993), World Health Organization.

Witte MK, Stork JE, Blumer JL (1986) Diuretic therapeutics in the pediatric patient. Am J Cardiol 57:44A-53A.

Woodin MA, Ganguly K, Poo Mm (2003) Coincident Pre- and Postsynaptic Activity Modifies GABAergic Synapses by Postsynaptic Changes in CI- Transporter Activity. Neuron 39:807-820.

Группа изобретений относится к применению ингибитора переноса хлорид-ионов в нейроны, который представляет собой ингибитор ко-транспортёра Na-K-Cl буметанид, или альдегид буметанида, дибензиламид буметанида, диэтиламид буметанида, морфолиноэтиловый сложный эфир буметанида, 3-диметиламинопропиловый сложный эфир буметанида, N,N-диэтилгликольамидный сложный эфир буметанида, диметилгликольамидный сложный эфир буметанида, пиваксетиловый сложный эфир буметанида, метокси-(полиэтиленокси)n-i-этиловый сложный эфир буметанида, бензилтриметил аммониевую соль буметанида и цетилтриметиламмониевую соль буметанид для лечения аутизма, и к применению фармацевтической композиции на его основе. Технический результат: эффективность по заявленному назначению при отсутствии нежелательных побочных эффектов (обезвоживания, ортостатической гипотензии, гиперчувствительности, судорог, астении, диареи, миалгии, артралгии, тошноты, головокружения). 2 н. и 1 з.п. ф-лы, 2 табл.

1. Применение соединения, которое ингибирует перенос хлорид-ионов в нейроны, для лечения аутизма, при этом указанное соединение представляет собой ингибитор ко-транспортера Na-K-Cl (NKCC), представляющий собой буметанид или альдегид буметанида, дибензиламид буметанида, диэтиламид буметанида, морфолиноэтиловый сложный эфир буметанида, 3-диметиламинопропиловый сложный эфир буметанида, N,N-диэтилгликольамидный сложный эфир буметанида, диметилгликольамидный сложный эфир буметанида, пиваксетиловый сложный эфир буметанида, метокси-(полиэтиленокси)n-i-этиловый сложный эфир буметанида, бензилтриметил аммониевую соль буметанида и цетилтриметиламмониевую соль буметанида.

2. Применение соединения по п. 1, где указанное соединение является буметанидом.

3. Применение фармацевтической композиции для лечения аутизма, где указанная композиция содержит соединение по любому из пп. 1-2 и фармацевтически приемлемый носитель.