СПОСОБ СНИЖЕНИЯ ЛЕТАЛЬНОГО ЭФФЕКТА БАКТЕРИАЛЬНОГО ЛИПОПОЛИСАХАРИДА IN VITRO Российский патент 2016 года по МПК A61N5/67 

Изобретение относится к экспериментальной медицине и может быть использовано в поиске путей уменьшения патогенных свойств бактериального липополисахарида.

Бактериальный липополисахарид (ЛПС, эндотоксин) представляет собой амфифильный биополимер, содержащий гидрофильные (О-специфические цепи, олигосахарид кора) и гидрофобный (липид А) фрагменты. Он является важнейшим фактором патогенности грамотрицательных микроорганизмов, ответственным за развитие бактериального эндотоксикоза и его наиболее тяжелой формы - бактериально-токсического шока. Влияние ЛПС на макроорганизм проявляется в стимуляции лейкоцитов, тромбоцитов и эндотелиальных клеток, усилении продукции интерлейкинов, фактора некроза опухолей-альфа и ряда других медиаторов, в активации системы комплемента и факторов свертывания крови, что может заканчиваться развитием диссеминированного внутрисосудистого свертывания крови, эндотоксинового шока и острой полиорганной недостаточности (Ильина А.Я. Патогенетические механизмы и клинические аспекты действия термостабильного эндотоксина кишечной микрофлоры / Ильина А.Я., Лазарева С.И., Лиходед В.Г. и др. // Рус.мед. журн. - 2003. - Т. 11. - С.126-129; Dauphinee S.M. Lipopolysaccharide signaling in endothelial cells / Dauphinee S.M., Karsan A. // Laboratory Invest. -2006.-Vol.86. -P. 9-22.).

Чрезвычайно актуальным в настоящее время является поиск способов уменьшения летальных эффектов ЛПС, что может открыть новые перспективы в детоксикации организма. В литературе описаны разнообразные способы изменения патогенных свойств молекулы эндотоксина. Обычно для снижения токсичности ЛПС применяются различные химические вещества (катионные амфифильные молекулы, синтетические пептиды, полиамины, нетоксичный полисахарид хитозан), уменьшающие патогенное действие ЛПС в результате образования с ним макромолекулярных комплексов (Давыдова В.Н. Взаимодействие бактериальных эндотоксинов с хитозаном. Влияние структуры эндотоксина, молекулярной массы хитозана и ионной силы раствора на процесс комплексообразования / Давыдова В.Н., Ермак И.М., Горбач В.И. // Биохимия. - 2000. - Т. 65. - С.1278-128; Ермак И.М. Модификация биологических свойств липополисахарида при образовании им комплекса с хитозаном / Ермак И.М., Давыдова В.Н., Горбач В.И. // Бюл. эксперим. биол. мед. - 2004. - Т. 137. - С.430-434; Kaconis Y. Biophysical mechanisms of endotoxin neutralization by cationic amphiphilic peptides / Kaconis Y., Kowalski I., Howe J. // Biophys J. - 2011. - Vol.100(11). - P. 2652-2661; Sil D. Biophysical mechanisms of the neutralization of endotoxins by lipopolyamines / Sil D., Heinbockel L., Kaconis Y. // Open Biochem J. - 2013. Vol.7. - P.82-93).

Новым направлением является создание олигонуклеотидных аптамеров, специфически связывающихся с ЛПС и снижающих его патогенную активность (Wen A. A novel lipopolysaccharide-antagonizing aptamer protects mice against endotoxemia / Wen A., Yang Q., Li J. // Biochemical and Biophysical Research Communications. - 2009. - Vol.382. - P. 140-144; Bruno J.G. In vitro antibacterial effects of antilipopolysaccharide DNA aptamer-Clqrs complexes / Bruno J.G., Carrillo M.P., Phillips T. // Folia Microbiol. - 2008. - Vol.53 (4). - P. 295-302).

Однако химическая модификация молекулы ЛПС не всегда оказывается доступной, удобной и приемлемой в силу дороговизны и малой доступности применяемых для этой цели веществ. Кроме того, вещества, использующиеся для модификации токсической молекулы, сами могут обладать биологической активностью и оказывать влияние на исследуемые функции.

Более приемлемым и доступным способом изменения токсических свойств бактериального ЛПС является воздействие на него физических факторов, а именно электромагнитного излучения (Lin С.Т. Long-term continuous exposure to static magnetic field reduces popolysaccharide-induced cytotoxicity of fibroblasts / Lin C.T., Lee S.Y., Chen C.Y. // Int. J. Radiat. Biol. -2008. - Vol.84(3). - P. 219-226).

Известно модифицирующее влияние на патогенные свойства бактериального ЛПС излучения низкоинтенсивного красного лазера (Брилль Г.Е. Лазерное облучение бактериального липополисахарида модифицирует его влияние на микроциркуляцию / Брилль Г.Е., Агаджанова К.В., Гаспарян Л.В., Макела A.M. // Лазерная медицина. - 2009. - Т. 13, вып.4. - С.46-49). Предварительное облучение ЛПС светом красного лазера длиной волны 660 нм и плотностью энергии 17 Дж/мл существенно ослабляет патогенное влияние эндотоксина на систему микроциркуляции, уменьшая количество лейкоцитов, участвующих в ролинге, а также препятствует развитию дилатации венозных сосудов, ослабляет процесс коагрегации тромбоцитов и лейкоцитов, ингибирует адгезию тромбоцитов на мультимерной молекуле фактора фон Виллебранда.

Однако в данном исследовании не упоминается об изменении летальных свойств бактериального ЛПС при лазерном воздействии.

Наиболее близким аналогом заявляемого способа является снижение летальных свойств бактериального ЛПС, вызываемое его облучением электромагнитными волнами УВЧ-диапазона (1,0 ГГц, 0,0001 мВт/см, 10 мин) (Брилль Г.Е., Егорова А.В. Способ снижения летального действия бактериального липополисахарида in vitro. Патент на изобретение №2544171. Заявка №2014109509. Приоритет изобретения 12.03.14 г. Зарегистрировано в госреестре изобретений РФ 04.02.2015). Однако длина волны излучения и параметры воздействия (плотность мощности и время воздействия) отличаются от способа, предлагаемого нами.

Для расширения арсенала средств, используемых для снижения летального эффекта бактериального ЛПС, нами предложен простой и доступный способ уменьшения летального действия ЛПС путем облучения его взвеси in vitro линейно-поляризованным светом низкоинтенсивного красного лазера длиной волны 660 нм при плотности энергии 4,0 Дж/мл в течение 20 минут.

Способ реализуется следующим образом. В работе используется ЛПС кишечной палочки 055:В5 (Sigma, США). 24 мг ЛПС разводится в 24 мл дистиллированной воды (концентрация ЛПС=1000 мкг/мл). Затем раствор ЛПС делится на 2 пробы: 12 мл - для контроля, 12 мл - для облучения. Облучение раствора ЛПС производится в полимерной пробирке диаметром 1,5 см. Источником излучения служит полупроводниковый лазер фирмы «EMRED Оу» (Финляндия), генерирующий линейно-поляризованный свет в красной области спектра (λ - 660 нм). Плотность энергии - 4,0 Дж/мл, время облучения - 20 мин. Выбор времени облучения обоснован тем, что в течение этого времени происходят изменения процесса спонтанного структурообразования молекул ЛПС, обнаруженные в экспериментах с использованием метода клиновидной дегидратации (Агаджанова К.В. Влияние низкоинтенсивного лазерного излучения на структурообразовательные свойства и биологические эффекты бактериального липополисахарида. Автореф. дис... канд. мед. наук. - Саратов, 2010), что позволяет предположить изменение при этом летальных свойств ЛПС.

Летальные дозы (ЛД) эндотоксина определяются на 2 группах мышей-самцов. Масса каждого животного 20 г. Мышам первой группы (контроль) внутрибрюшинно вводится нативный (необлученный) ЛПС в дозах 100, 200, 300 и 400 мкг/мышь (соответственно 0,1, 0,2, 0,3 и 0,4 мл ЛПС). Число животных для каждой дозы 10. Мыши второй (опытной) группы получают внутрибрюшинные инъекции предварительно облученного ЛПС в тех же дозах (объемах). Число животных для каждой дозы 10. Наблюдение за животными проводится в течение 24 часов после введения ЛПС. Расчет летальных доз ЛПС производится методом пробит-анализа. Полученные результаты представлены в таблице.

Расчетные параметры ЛД для группы контроля составили:

ЛД₁₆ - 113,3 мкг/мышь

ЛД₅₀ - 191,0 мкг/мышь

ЛД₈₄ - 268,8 мкг/мышь

ЛД₁₀₀ - 307,6 мкг/мышь

Расчетные параметры ЛД для опытной группы составили:

ЛД₁₆ - 153,2 мкг/мышь

ЛД₅₀ - 279,5 мкг/мышь

ЛД₈₄ - 405,7 мкг/мышь

ЛД₁₀₀ ^_ 468,8 мкг/мышь

Для группы контроля М±m ЛД₅₀ составило - 191,0±20,1

Для опытной группы М±m ЛД₅₀ составило - 279,5±32,6

Достоверность разницы между группой контроля и опытной группой: р<0,02

Следовательно, облучение ЛПС линейно-поляризованным светом красной области спектра при плотности энергии 4,0 Дж/мл в течение 20 мин достоверно снижает летальный эффект бактериального ЛПС на 46% (p<0,02).

Способ прост в реализации, не требует дорогостоящего оборудования и высокоэффективен.

Изобретение относится к экспериментальной медицине и может быть использовано для уменьшения патогенных свойств бактериального липополисахарида (ЛПС). Облучают взвесь ЛПС линейно-поляризованным светом красного лазера с длиной волны 660 нм. Плотность энергии 4,0 Дж/мл. Длительность облучения 20 минут. Способ обеспечивает снижение летального эффекта бактериального ЛПС за счет изменения процесса спонтанного структурообразования молекул ЛПС. 1 табл.

Способ снижения летального эффекта бактериального липополисахарида in vitro, включающий однократное электромагнитное воздействие, отличающийся тем, что облучают взвесь липополисахарида низкоинтенсивным линейно-поляризованным светом красного лазера с длиной волны 660 нм при плотности энергии 4,0 Дж/мл в течение 20 минут.