ШТАММ RHODOBACTER CAPSULATUS PG - ПРОДУЦЕНТ ЛИПОПОЛИСАХАРИДА, АНТАГОНИСТА ЭНДОТОКСИНОВ Российский патент 2010 года по МПК C12N1/20 C12P19/00 C12R1/01 

Изобретение относится к микробиологии, биотехнологии и фармакологии и может быть использовано для получения препарата, обладающего антагонистической активностью в отношении эндотоксинов.

Известен штамм Rhodobacter capsulatus В10 из Американской коллекции культур микроорганизмов (ATCC®Number 33303), культивируемый на среде 1139 (АТСС medium: Defined medium for Rhodopseudomonas). Характеризуется образованием на агаризованной среде колоний R-типа кирпичного цвета, плотно сидящих на поверхности агара с морщинистой, полусухой поверхностью с неравномерными извилистыми краями.

Задача изобретения - штамм, продуцирующий липополисахарид, обладающий антагонистической активностью в отношении эндотоксинов.

Поставленная задача решается штаммом Rhodobacter capsulatus PG, полученным методом селекции культуральных сред.

Штамм Rhodobacter capsulatus PG получен из известного штамма Rhodobacter capsulatus В10 селекцией питательной среды в результате многократных пересевов штамма Rhodobacter capsulatus В10 на среду Хатнера (Cohen-Bazire G., Sistrom W.R., Stanier R.Y. Kinetic studies of pigment synthesis by non-sulfur purple bacteria. J. Cellular Comp. Physiol. 1957) и культивированием в анаэробных условиях при 30°C, освещении 1000-2000 лк в жидкой культуре и на твердой среде с добавлением 1,5% агара в течение 4-5 суток.

Штамм Rhodobacter capsulatus PG депонирован в Российской коллекции микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН под номером ВКМ В-2381Д. Штамм Rhodobacter capsulatus PG является продуцентом липополисахарида, обладающего антагонистической активностью в отношении эндотоксинов.

Новый штамм, названный авторами Rb. capsulatus PG, образует на агаризованной среде блестящие, гладкие колонии S-типа кирпичного цвета с ровным контуром, равномерно возвышающейся центральной частью и более светлой уплощенной периферической вуалью. Колонии легко снимаются с поверхности агара.

Характерным отличием штамма Rb. capsulatus В10 от PG было то, что бактерии Rb. capsulatus В10 росли на среде LB, a Rb. capsulatus PG - нет.

Клетки нового штамма Rhodobacter capsulatus PG отличаются от клеток своего прототипа штамма Rhodobacter capsulatus В10 по скорости агглютинации в растворе NaCl (Lindberg, 1980) - 0,01 мм/мин и 0,05 мм/мин соответственно.

Выделение ЛПС из ацетонового порошка клеток Rb. capsulatus PG проводили методом Вестфаля (Westphal et al., 1952) в модификации Кульшина и др. (1987).

Для получения беспигментной биомассы (ацетонового порошка) использовали модифицированный нами метод Pietsch (1990). Сырые бактериальные клетки (100 г) дважды отмывали 90%-ным ацетоном (300 мл), один раз 100%-ным ацетоном (300 мл), дважды смесью ацетон/метанол, 7:2 (100 мл) и дважды диэтиловым эфиром (50 мл). Выход ацетонового порошка составлял 17%.

20 г сухого ацетонового порошка суспендировали в 350 мл воды при 65-68°C на водяной бане, затем при сильном перемешивании добавляли 350 мл 90%-ного фенола, предварительно нагретого до 65-68°C, и смесь выдерживали 10-15 мин при 65°C. Смесь охлаждали до 10°C, поместив сосуд со смесью на баню со льдом. Образовавшуюся эмульсию диализовали в течение 3-4 суток против дистиллированной воды для удаления фенола. После диализа осадок отделяли центрифугированием. Раствор, содержащий ЛПС, подвергали очистке от нуклеиновых кислот. Очистку проводили путем подкисления водного раствора неочищенного препарата ЛПС ледяной уксусной кислотой до pH 3,2-3,4 и выдерживали при данном значении pH в течение 3-4-х часов, с последующим осаждением нуклеиновых кислот центрифугированием при 5000 об/мин. При необходимости процедуру повторяли. Супернатант концентрировали на роторном испарителе при 40°C до 50-80 мл. ЛПС осаждали путем добавления по каплям водного раствора ЛПС к 8 объемам охлажденного 96%-ного этилового спирта, выдерживали несколько часов в холодильнике и отделяли центрифугированием при 5000 об/мин. Дополнительную очистку препарата ЛПС от низкомолекулярных примесей проводили с помощью диализа против дистиллированной воды. Водный раствор ЛПС лиофилизировали. Выход лиофилизированного препарата ЛПС составлял до 1,8% от массы ацетонового порошка.

Качественный состав ЛПС определяли методом электрофореза в геле (Krauss et al., 1988), по реакции с карбоцианином (Janda & Work, 1971) и по содержанию кетодезокси-D-манно-октолузоновой кислоты (КДО) (Karkhanis et al., 1978).

Электрофореграмма ЛПС штаммов Rb. capsulatus В10 и PG показывает наличие дополнительных полос в области 21 кДа только у штамма Rb. capsulatus PG. Зоны в области низких молекулярных масс (12,5 кДа), соответствующие липиду А, присутствуют у обоих штаммов.

Спектральные характеристики комплексов ЛПС с карбоцианином показывают, что максимум поглощения комплекса ЛПС-карбоцианин для ЛПС из Rb. capsulatus В10 соответствует 458 нм, а из Rb. capsulatus PG - 468 нм.

Определение содержания КДО в ЛПС двух штаммов Rb. capsulatus показало, что весовая доля КДО в препарате ЛПС из Rb. capsulatus PG меньше, чем в ЛПС из Rb. capsulatus В10.

Для нетоксичного липополисахарида из штамма Rhodobacter capsulatus PG показана способность защитного действия от некоторых эффектов эндотоксинов, в том числе:

в экспериментах in vivo

1) в острых опытах на беспородных мышах - от летального действия эндотоксинов из Pseudomonas aurogenosus, Salmonella typhimurium (выживаемость 56%);

2) на крысах линии Wistar - от летального действия эндотоксина из Salmonella typhimurium (выживаемость 54%);

3) на мышах линии С57/В16 - от ингибирующего действия эндотоксинов из Pseudomonas aurogenosus, Salmonella typhimurium на ферментативную активность, связанную с системой цитохрома Р450;

3) на крысах линии Wistar - от падения артериального давления после внутривенного введения сублетальных доз эндотоксина из Salmonella typhimurium и Escherichia coli O5:B55;

в экспериментах in vitro

1) на нейтрофилах человека - подавление Ca²⁺-ответа клеток, вызываемого эндотоксинами из Pseudomonas aurogenosus, Salmonella typhimurium;

2) на нейтрофилах человека - подавление экспрессии β₂-интегринов и снижение адгезивной активности клеток, индуцированной эндотоксинами из Salmonella typhimurium и Escherichia coli O5:B55;

3) на нейтрофилах и моноцитах человека - подавление дыхательного взрыва, индуцированного эндотоксинами ряда патогенных бактерий;

4) на нейтрофилах и моноцитах человека - ингибирование замедления апоптоза, индуцированного эндотоксином из Escherichia coli;

5) на нейтрофилах человека - сохранение активности нейтрофилов к фагоцитозу без активации дыхательного взрыва.

Таким образом, заявленный штамм Rhodobacter capsulatus PG является продуцентом нетоксичного липополисахарида, обладающего антагонистической активностью в отношении эндотоксинов и может быть использован для получения препарата, необходимого в практическом здравоохранении.

Изобретение относится к биотехнологии. Штамм Rhodobacter capsulatus PG ВКМ В-2381Д, депонированный в Российской коллекции микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН, является продуцентом липополисахарида и может быть использован для получения препарата, обладающего антагонистической активностью в отношении эндотоксинов.

Штамм Rhodobacter capsulatus PG - продуцент липополисахарида, антагониста эндотоксинов, депонированный в Российской коллекции микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН под номером ВКМ В-2381Д.