СПОСОБЫ ЛЕЧЕНИЯ МЕТОТРЕКСАТ-УСТОЙЧИВЫХ РАССТРОЙСТВ 10-ПРОПАРГИЛ-10-ДЕАЗААМИНОПТЕРИНОМ Российский патент 2016 года по МПК A61K31/50 A61P35/00 

[0001] Метотрексат ("МТХ") применяют в составе схем комбинированной химиотерапии для лечения многих видов рака. Это обеспечивает лечение многих неопластических расстройств, включая острый лимфобластный лейкоз. Метотрексат также применяют для лечения некоторых аутоиммунных заболеваний, в том числе миастении гравис, полимиозита, дерматомиозита, миозита с включенными тельцами, болезни Бехтерева, болезни Крона, псориаза, пустулезного псориаза, псориатического артрита, ревматоидного артрита, гранулематоза Вегенера и склеродермии.

[0002] 10-пропагрил-10-деазааминоптерин (включая названия "10-пропаргил-10-dAM", "пралатрексат", "рацемический PDX", "(2S)-2-[[4-[(1/RS)-1-[(2,4-диаминоптеридин-6-ил)метил]бут-3-инил]бензоил]амино]глутаровая кислота", "(2RS)-2-[[4-[(1RS)-1-[(2,4-диаминоптеридин-6-ил)метил]бут-3-инил]бензоил]амино]глутаровая кислота" и "PDX") представляет собой соединение, которое было испытано и признано полезным при лечении рака. 10-пропаргил-10-деазааминоптерин одобрен Управлением по контролю качества продовольствия и медикаментов США (FDA) для лечения рецидивирующей и рефрактерной периферической Т-клеточной лимфомы. Кроме того, проводятся исследования возможности применения 10-пропаргил-10-деазааминоптерина при лимфоме, раке легких, раке мочевого пузыря и раке молочной железы.

[0003] 10-пропаргил-10-деазааминоптерин был первоначально описан в DeGraw et al., "Synthesis and Antitumor Activity of 10-Propargyl-10-deazaaminopterin," J. Med. Chem. 36: 2228-2231 (1993); показано, что он действует как ингибитор фермента дигидрофолатредуктазы ("DHFR") и как ингибитор роста линии клеток лимфоцитарного лейкоза мыши L1210. Кроме того, были представлены некоторые результаты о противоопухолевых свойствах этого соединения на модели опухоли молочной железы мыши Е0771.

[0004] В патенте США №6028071 и публикации РСТ №WO 1998/02163 описано, что композиции высокоочищенного 10-пропаргил-10-деазааминоптерина при исследовании на модели ксенотрансплантата были эффективны против опухолей человека. Последующие исследования 10-пропаргил-10-деазааминоптерина показали, его можно применять в чистом виде и в комбинации с другими терапевтическими агентами. Например, Sirotnak et al., Clinical Cancer Research Vol.6, 3705-3712 (2000) сообщал, что одновременное введение 10-пропаргил-10-деазааминоптерина и пробенецида, ингибитора cMOAT/MRP-подобной АТФазы плазматической мембраны, значительно повышает эффективность 10-пропаргил-10-деазааминоптерина против солидных опухолей человека. Показано, что 10-пропаргил-10-деазааминоптерин в комбинации с химиотерапевтическими агентами на основе платины был эффективен против мезотелиомы (Khokar, et al., Clin. Cancer Res. 7: 3199-3205 (2001). Совместное введение с гемцитабином (Gem) для лечения лимфомы описано в WO/2005/117892. Комбинации 10-пропаргил-10-деазааминоптерина с таксолами описаны как эффективные в патенте США №6323205. Кроме того, показано, что 10-пропаргил-10-деазааминоптерин был эффективен при лечении Т-клеточной лимфомы, см. патент США №7622470. В других исследованиях предложен способ оценки чувствительности лимфомы к лечению 10-пропаргил-10-деазааминоптерином путем определения количества восстановленного белка-переносчика фолата 1 (RFC-1), экспрессируемого образцом, причем более высокий уровень экспрессируемого RFC-1 является признаком более высокой чувствительности к 10-пропаргил-10-деазааминоптерину, описанный в публикации РСТ №WO 2005/117892.

[0005] Известно, что 10-пропаргил-10-деазааминоптерин является антифолатом/антиметаболитом. Фолатный путь играет ключевую роль в росте и пролиферации клеток (Appling, 1991; Odin et al, 2003). Фолиевая кислота (фолат) проникает в клетки с помощью восстановленного переносчика фолата 1 (RFC-1), конъюгируется с полиглутаматом фолилполиглутаматсинтетазой (FPGS) и восстанавливается до дигидрофолата, который в дальнейшем преобразуется в тетрагидрофолат (ТГФ) дигидрофолатредуктазой (ДГФР). Различные ферменты и переносчики, участвующие в этом метаболическом пути, являются мишенями важного класса цитотоксических агентов: антифолатов. Метотрексат был одним из первых агентов этого класса и впервые был использован при лечении детского острого лимфобластного лейкоза (Farber et al, 1948). С тех пор метотрексат широко применяют при гематологических и солидных раковых заболеваниях, и с помощью рационального дизайна были получены новые поколения антифолатов для использования различных аспектов фолатного пути (например, ралтитрексед при раке ободочной и прямой кишки (Cocconi и др., 1998) и пеметрексед при злокачественных плевральных мезотелиомах (Vogelzang и др., 2003) и немелкоклеточном раке легкого (НМРЛ) (Hanna et al, 2004)). В большинстве опухолевых клеток RFC-1 опосредует интернализацию аналогов фолиевой кислоты. Попав в клетку, эти аналоги либо связывают дигидрофолатредуктазу (ДГФР), тем самым истощая внутриклеточный запас восстановленного фолата, необходимый для биосинтеза пурина и тимидина, или метаболизируются в полиглутаматы перед связыванием с ДГФР. Конъюгирование с полиглутаматом катализируется фолилполиглутаматсинтетазой (FPGS). Фолилполиглутаматгидролаза (FPGH, также известная как гамма-глутамилгидролаза [GGH]), опосредует расщепление и, следовательно, последующее выведение этих внутриклеточных полиглутаматов антифолатов. Тимидилатсинтаза (TS) и глицинамидрибонуклеотидформилтрансфераза (GARFT) также участвуют в метаболизме фолата, как ферменты "рециклирования" (таким образом, непосредственно влияя на запасы нуклеотидов, доступные для синтеза ДНК).

[0006] Метотрексат является антифолатом. На основании испытаний клеточных линий считается, что 10-пропаргил-10-деазааминоптерин и метотрексат обладают аналогичной картиной цитотоксичности, причем 10-пропаргил-10-деазааминоптерин зачастую является в 3-19 раз более мощным, чем метотрексат.

[0007] Устойчивость к метотрексату обычно возникает в результате мутации или амплификации гена ДГФР. Существуют три известных пути, согласно которым клетки могут приобретать иммунитет к действию этого антагониста фолата. Можно уменьшать концентрацию метотрексата в клетке за счет изменений в транспортных системах, которые переносят лекарственный агент в клетку и из нее. Например, если происходит снижение количества переносчиков, с помощью которых метотрексат поглощается клетками, он будет находиться внутри клетки в меньшем количестве. Кроме того, концентрация лекарственного агента в клетке может регулироваться за счет измененных скоростей его конъюгирования с полиглутаматом и метаболизма. Когда агент медленнее конъюгируется с полиглутаматом или быстрее метаболизируется, он может легче удаляться из клетки, за счет чего его концентрация и активность в клетке снижаются. Амплификация гена ДГФР вызывает повышение количества присутствующей ДГФР и, как показано, коррелирует со снижением ответа на лечение метотрексатом. Метотрексат должен связаться с ДГФР для предотвращения ее активности. Если связывающая область ДГФР модифицируется за счет генетических изменений, снижая связывание метотрексата, ДГФР может продолжать активировать фолаты, и эффективность лечения будет снижаться. Последствия всего вышеуказанного приводят к повышенной устойчивости к метотрексату. Устойчивость к метотрексату может быстро развиться и привести к неэффективности лечения.

[0008] Таким образом, могут быть полезны способы преодоления приобретенной устойчивости к метотрексату.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ [0009]

В одном из вариантов реализации изобретение включает способ лечения

расстройства, устойчивого к метотрексату, у субъекта. Этот способ может включать введение указанному субъекту эффективного количества композиции, которая содержит 10-пропаргил-10-деазааминоптерин или его фармацевтически приемлемые соли.

[0010] В другом варианте реализации настоящее изобретение включает способ лечения субъекта, нуждающегося в лечении неоплазии, устойчивой к метотрексату, причем указанный способ включает введение указанному субъекту эффективного количества 10-пропаргил-10-деазааминоптерина или его фармацевтически приемлемых солей.

[0011] В некоторых вариантах реализации указанное расстройство представляет

собой рак. В других вариантах реализации расстройство представляет собой воспалительное расстройство. В одном из вариантов реализации указанную композицию составляют для внутривенного введения. В другом варианте реализации указанную композицию составляют для перорального введения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

[0012] На Фиг.1 приведена схема синтеза, которую можно использовать при получении 10-пропаргил-10-деазааминоптерина;

[0013] На Фиг.2 показана чувствительность 10-пропаргил-10-деазааминоптерина и других ингибиторов фолата к 15 протестированным линиям раковых клеток;

[0014] На Фиг.3 приведены значения IC50 для клеток DU-145, интактных, адаптированных к 10-пропаргил-10-деазааминоптерину (DU-PDX) и адаптированных к метотрексату (DU-MTX) при лечении 10-пропаргил-10-деазааминоптерином или метотрексатом;

[0015] На Фиг.4 приведены значения 1С₅₀ для клеток НЕР2, интактных, адаптированных к 10-пропаргил-10-деазааминоптерину (HEP-PDX) и адаптированных к метотрексату (НЕР-МТХ) при лечении 10-пропаргил-10-деазааминоптерином или метотрексатом;

[0016] На Фиг.5 показана относительная экспрессия мРНК фолатных генов в линиях клеток, устойчивых к 10-пропаргил-10-деазааминоптерину;

[0017] На Фиг.6 приведены данные по вестерн-блоттингу белка ДГФР в линиях клеток DU145 и НЕР2, чувствительных, и DU-PDX, DU-MTX, HEP-PDX и НЕР-МТХ, устойчивых к 10-пропаргил-10-деазааминоптерину и метотрексату;

[0018] На Фиг.7 приведены данные по экспрессии мРНК ДГФР в линиях клеток DU145 и НЕР2, чувствительных, и DU-PDX, DU-MTX, HEP-PDX и НЕР-МТХ, устойчивых к 10-пропаргил-10-деазааминоптерину и метотрексату.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

[0019] Одна из сохраняющихся проблем с лечением раковых больных представляет собой индивидуальные различия реакций на лечение и генетические изменения в опухолях, приводящие к устойчивости к химиотерапии. Химиотерапия предусматривает применение лекарственных агентов, мишенью которых часто являются быстро делящиеся клетки. Многие химиотерапевтические агенты, в том числе антифолаты, препятствуют процессу репликации ДНК, происходящему перед делением клеток. Хотя существует много достижений в области химиотерапевтических агентов, генетическая нестабильность раковых клеток, особенно на поздних стадиях рака, приводит к высокой частоте устойчивости раковых опухолей к лекарственным агентам.

[0020] В настоящем изобретении разработаны клеточные линии с приобретенной устойчивостью к метотрексату и 10-пропаргил-10-деазааминоптерину на основе линий раковых клеток DU145 (рак предстательной железы) и Нер2 (рак головы и шеи). Обладая более чем 200-кратной устойчивостью к 10-пропаргил-10-деазааминоптерину, чем исходные клетки, клетки DU-PDX и HEP-PDX с приобретенной устойчивостью к 10-пропаргил-10-деазааминоптерину демонстрировали перекрестную устойчивость к метотрексату; клетки DU-MTX и НЕР-МТХ по-прежнему демонстрировали значительную чувствительность к 10-пропаргил-10-деазааминоптерину.

[0021] Наблюдали различные механизмы приобретенной устойчивости к 10-пропаргил-10-деазааминоптерину и метотрексату. Приобретенная устойчивость к 10-пропаргил-10-деазааминоптерину была связана со значительным снижением экспрессии мРНК RFC1 в обеих линиях клеток DU-PDX и HEP-PDX, кроме того, также наблюдалось незначительное увеличение экспрессии мРНК MDR1. В настоящем изобретении также показано небольшое снижение экспрессии мРНК FPGS в клетках, устойчивых к 10-пропаргил-10-деазааминоптерину, что свидетельствует о роли конъюгирования с полиглутаматом в устойчивости к 10-пропаргил-10-деазааминоптерину. В ходе исследований, проведенных три десятилетия назад, обнаружили, что частым механизмом приобретенной устойчивости к метотрексату является амплификация гена ДГФР и, как следствие, избыточная экспрессия фермента (обзор Assaraf 2007; Chen et al, 1995). Таким образом, при выборе культивируемых опухолевых клеточных линий и постепенном возрастании концентраций метотрексата приобретенная устойчивость к антифолатам часто бывает обусловлена амплификацией гена ДГФР. Фактически, в настоящем изобретении линия клеток НЕР-МТХ с приобретенной устойчивостью к метотрексату демонстрировала резкое увеличение экспрессии белка ДГФР по сравнению с исходной эквивалентной линией, что указывает на возможную амплификацию гена ДГФР в этой модели. Такого повышения количества белка не наблюдалось в линиях клеток, устойчивых к 10-пропаргил-10-деазааминоптерину. Эти данные указывают на различные молекулярные механизмы устойчивости к метотрексату и 10-пропаргил-10-деазааминоптерину в этих линиях клеток.

[0022] Рак "чувствителен" к терапевтическому агенту, или имеет место "хороший ответ" на лечение, если скорость его роста ингибируется в результате контакта с терапевтическим агентом, по сравнению с ростом рака в отсутствие контакта с терапевтическим агентом. Рост рака можно измерить различными способами, например, можно измерить размер опухоли или экспрессию опухолевых маркеров, соответствующих этому типу опухоли. Эти критерии определяют тип измеряемого ответа, а также характеризуют время до прогрессирования болезни, которое является еще одной важной мерой чувствительности опухоли к терапевтическому агенту. Параметр чувствительности к 10-пропаргил-10-деазааминоптерину является изменчивым, причем различные виды рака демонстрируют различные уровни «чувствительности» к данному терапевтическому агенту в различных условиях. Дополнительные характеристики чувствительности можно оценить с помощью дополнительных критериев, не относящихся к росту размера опухоли, в том числе качества жизни пациентов, степень метастазирования и т.д. Кроме того, в соответствующих ситуациях можно оценивать клинические прогностические маркеры и переменные.

[0023] Рак «нечувствителен» или характеризуется «плохим ответом» на терапевтический агент, например, 10-пропаргил-10-деазааминоптерин, или имеет место плохой ответ на лечение, если скорость его роста не ингибируется или ингибируется в очень низкой степени в результате контакта с терапевтическим агентом по сравнению с ростом рака в отсутствие контакта с терапевтическим агентом. Как указано выше, рост рака можно измерить различными способами, например, можно измерить размер опухоли или экспрессию опухолевых маркеров, соответствующих этому типу опухоли. Параметр нечувствительности к терапевтическому агенту является крайне изменчивым, причем различные виды рака демонстрируют различные уровни «нечувствительности» к данному терапевтическому агенту в различных условиях. Дополнительные характеристики нечувствительности можно оценить с помощью дополнительных критериев, не относящихся к росту размера опухоли, в том числе качества жизни пациентов, степень метастазирования и т.д. Кроме того, в соответствующих ситуациях можно оценивать клинические прогностические маркеры и переменные. Такие нечувствительные или плохо реагирующие виды рака могут не реагировать или первоначально реагировать на агент, но приобретать устойчивость к нему. Устойчивость или нечувствительность можно измерить по сравнению с другими, более чувствительными видами рака или линиями опухолевых клеток или по сравнению с раком или линиями опухолевых клеток этого же типа. Эти виды рака также можно называть «устойчивыми» к определенным химиотерапевтическим агентам видами рака, например, рак, устойчивый к метотрексату, может быть первоначально устойчив к метотрексату, или может приобрести устойчивость к метотрексату во время курса или курсов лечения метотрексатом или другим химиотерапевтическим агентом. Устойчивость может быть обусловлена мутацией или мутациями в белках, в одном из белков фолатного пути, пути импорта фолиевой кислоты, или возникать за счет мутации любого другого белка, имеющего отношение к ответу на метотрексат.

[0024] Соответственно, в одном варианте реализации настоящее изобретение включает способ лечения расстройства, устойчивого к метотрексату, у субъекта, причем указанный способ включает введение субъекту эффективного количества 10-пропаргил-10-деазааминоптерина и его фармацевтически приемлемых солей.

[0025] Способность опухоли приобретать устойчивость к воздействию лекарственных агентов, которые ранее были токсичны для них, может привести к устойчивости. Такая приобретенная устойчивость может являться следствием хромосомного нарушения. Снижение проницаемости является распространенной формой врожденной устойчивости. Модификация или инактивация лекарственного агента является, возможно, наиболее распространенным механизмом устойчивости к лекарствам. Устойчивость к лекарственному агенту также являться следствием изменения сайта мишени, на который действует указанный агент. Ситуации, при которых расстройство, например, рак, обладает приобретенной устойчивостью к метотрексату, можно определить путем оценки лечащим врачом или другими специалистами, и включают ремиссию или стаз расстройства после лечения, с последующим прогрессированием заболевания спустя определенное время лечения. Отмечено, что при многих расстройствах, включая рак, указанные расстройства проявляют приобретенную устойчивость к лечению.

[0026] Таким образом, в еще одном варианте реализации настоящее изобретение относится к способу лечения заболеваний или злокачественных состояний, зависимых от фолатного пути, приобретших устойчивость к метотрексату во время лечения метотрексатом, включающему введение терапевтически эффективного количества композиции, которая содержит 10-пропаргил-10-деазааминоптерин или его фармацевтически приемлемые соли.

[0027] «Лечение» может означать применение терапевтических средств для предотвращения или ингибирования дальнейшего роста опухоли, а также уменьшения опухоли и обеспечения более длительного времени выживания. Подразумевается, что лечение включает предотвращение метастазирования опухоли. Опухоль «ингибируется» или «лечится», если по меньшей мере один симптом (согласно определению чувствительности/нечувствительности, времени до прогрессирования или показателей, известных в данной области техники и описанных в настоящем документе) рака или опухоли улучшается, прекращается, замедляется, снижается до минимального значения или предотвращается. Любое уменьшение выраженности любого симптома опухоли, физическое или иное, в результате лечения с использованием курса терапии (например, 10-пропаргил-10-деазааминоптерином), как описано в настоящем документе, входит в рамки настоящего изобретения. В общем случае термины «лечение» и «лечить», используемые в настоящем документе, означают "облегчить симптомы", "ликвидировать причину рака или воспалительного расстройства на временной или постоянной основе", "замедлить появление симптомов и/или прогрессирования расстройства" или "предотвратить заболевание" (то есть осуществлять профилактическое лечение). Субъект, получающий профилактическое лечение, в общем случае является млекопитающим, подверженным риску развития рака или воспалительного состояния вследствие, например, генетической предрасположенности, диеты, воздействия агентов, вызывающих расстройство, воздействия патогенных агентов и т.п.

[0028] В одном из вариантов реализации настоящего изобретения композиция, которую применяют в способах согласно настоящему изобретению, может содержать 10-пропаргил-10-деазааминоптерин, включая «высокоочищенный» 10-пропаргил-10-деазааминоптерин, и диастереоизомеры 10-пропаргил-10-деазааминоптерина. При использовании в настоящем описании и формуле изобретения, композиции, которые являются «высокоочищенными», содержат 10-пропаргил-10-деазааминоптерин, практически не содержат других производных фолиевой кислоты, в частности, 10-деазааминоптерина, который может мешать противоопухолевой активности 10-пропаргил-10-деазааминоптерина. Композиция согласно настоящему изобретению может содержать переносчики или вспомогательные вещества для получения состава 10-пропаргил-10-деазааминоптерина в виде подходящей дозируемой формы для терапевтического применения, а также дополнительные, не являющиеся фолатами, терапевтические агенты.

[0029] 10-пропаргил-10-деазааминоптерин содержит асимметричные центры при 10 атоме углерода (С10) и 19 атоме углерода (С19). В одном из вариантов реализации 10-пропаргил-10-деазааминоптерин включает рацемические смеси R- и S-конфигураций по хиральному центру С10 в соотношении приблизительно 1:1 и ≥98,0% S-диастереомера по хиральному центру С19. 10-пропаргил-10-деазааминоптерин включает С10-диастереомеры PDX-10a [S-конфигурация] с химическим названием: (25)-2-[[4-[(15)-1-[(2,4-диаминоптеридин-6-ил)метил]бут-3-инил]бензоил]амино]глутаровая кислота и PDX-10b [R-конфигурация] с химическим названием: (25)-2-[[4-[(1R)-1-[(2,4-диаминоптеридин-6-ил)метил]бут-3-инил]бензоил]амино]глутаровая кислота.

[0030] 10-пропаргил-10-деазааминоптерин можно синтезировать с помощью способа, описанного в Примере 7 из DeGraw et al., патента США №5354751, относящегося к производству 10-пропаргил-10-деазааминоптерина, полностью включенного в настоящий документ посредством ссылки. 10-пропаргил-10-деазааминоптерин также можно синтезировать с помощью способов, представленных в патенте США №6028071, особенно в примере 1, включенном в настоящий документ посредством ссылки.

[0031] Для получения диастереоизомеров 10-пропаргил-10-деазааминоптерина можно синтезировать 10-пропаргил-10-деазааминоптерин, согласно информации из настоящего описания и других источников, а затем использовать конечный продукт или более ранний промежуточный продукт в качестве исходного материала для разделения С10-диастереоизомеров. В качестве альтернативы можно использовать хиральный синтез, при котором напрямую получают практически чистый PDX-10а и/или PDX-10b из любого числа исходных материалов. Для разделения диастереоизомеров конечного 10-пропаргил-10-деазааминоптерина или более ранних промежуточных продуктов можно использовать хиральные колонки для разделения энантиомеров или диастереоизомеров, известные в данной области техники. Подходящие хиральные колонки для разделения диастереоизомеров включают хиральные колонки CHIRALPAK AD, доступные от Daicel Chemical Industries Ltd., Япония, использующие этанол в качестве подвижной фазы.

[0032] В некоторых вариантах реализации заболевание или расстройство, зависимое от фолатного пути, представляет собой рак. В других вариантах реализации заболевание или расстройство, зависимое от фолатного пути, представляет собой воспалительное расстройство. В некоторых вариантах реализации рак или воспалительное расстройство представляет собой расстройство, которое было первоначально чувствительно к метотрексату, по меньшей мере в некоторой степени, а затем приобрело устойчивость к метотрексату. Способы определения того, обладает ли заболевание или расстройство, зависимое от фолатного пути, присущей или приобретенной устойчивостью к метотрексату, могут быть выбраны специалистом и могут включать такие способы, как культивирование или выделение соответствующих клеток, например, опухолевых клеток, из организма пациента, и определение уровня экспрессии различных ферментов фолатного пути, ассоциированных с устойчивостью или чувствительностью к метотрексату. Еще один из таких способов заключается в определении и/или мониторинге реакции больного на лечение метотрексатом для выявления врожденной или приобретенной устойчивости. Соответствующие клетки можно генотипировать или фенотипировать, для определения относительной экспрессии маркеров, указывающих на устойчивость к метотрексату.

[0033] В одном из вариантов реализации фенотипический анализ для использования в настоящем изобретении включает получение эксплантата опухоли от пациента, культивирование фрагментов эксплантата, выращивание монослоя соответствующих клеток из эксплантата, воздействие кандидата в лекарство на монослой и оценку способности кандидата в лекарство модифицировать фенотип опухолевых клеток.

[0034] Анализ генотипа согласно настоящему изобретению осуществляют любым известным способом. Предпочтительный способ включает сравнение генотипа клеток, полученных от пациента, или его части с генотипами, заведомо ассоциированными с устойчивостью к лекарствам в целом или специфической устойчивостью по отношению к оцениваемому терапевтическому средству-кандидату. Например, наличие полиморфного варианта среди клеток пациента, заведомо или предположительно придающего устойчивость к терапевтическому средству-кандидату, могло бы исключить это средство из потенциальных терапевтических агентов против этих клеток. Генетические характеристики клеток пациента определяют с помощью способов, известных в данной области техники (например, секвенирования, полиморфизмов), изложенных ниже. Влияние генотипа пациента на устойчивость к лекарственному агенту можно определить путем обращения к генетическим базам данных или библиотекам, в которых перечислены известные мутации или полиморфизмы, связанные с устойчивостью.

[0035] Независимо от механизма действия, примеры мутаций в клетках, связанных с устойчивостью или приобретенной устойчивость к метотрексату, включают увеличение экспрессии мРНК и/или белка ДГФР по сравнению с чувствительными клетками или клетками до приобретения устойчивости, но не ограничиваются ими.

[0036] В некоторых вариантах реализации рак или воспалительное расстройство обладает приобретенной устойчивостью к метотрексату. Раковые заболевания, подлежащие лечению, включают, например, рак предстательной железы, рак молочной железы, меланому, рак легких и Т-клеточную лимфому. В случае Т-клеточной лимфомы существуют разнообразные состояния, подлежащие лечению с использованием диастереоизомеров согласно настоящему изобретению, и включающие: (а) лимфобластные лимфомы, при которых злокачественность возникает в примитивных лимфоидных предшественниках из тимуса; (b) неоплазии зрелых или периферических Т-клеток, включая Т-клеточный пролимфоцитарный лейкоз, Т-клеточный гранулярно-лимфоцитарный лейкоз, агрессивный-NK-клеточный лейкоз, кожную Т-клеточную лимфому (фунгоидный микоз/синдром Сезари), анапластическую крупноклеточную лимфому Т-клеточного типа, Т-клеточную лимфому энтеропатического типа, Т-клеточный лейкоз/лимфому взрослых, в том числе связанные с HTLV-1, и ангиоиммунобластную Т-клеточную лимфому и подкожную панникулитную Т-клеточную лимфому; и (с) периферические Т-клеточные лимфомы, которые первоначально затрагивают околокорковое вещество лимфоузлов и никогда не разрастаются до истинной фолликулярной структуры. Другие виды рака, подлежащие лечению, включают гематологические злокачественные заболевания, рак головы и шеи, рак желудочно-кишечного тракта, рак яичников и остеосаркому.

[0037] Термин «воспалительное расстройство», используемый в настоящем документе, относится к любому расстройству, вызванному воспалением, или расстройству, симптомы которого включают воспаление. Например, воспалительное расстройство, вызванное воспалением, может представлять собой септический шок, а воспалительное расстройство, симптомы которого включают воспаление, может представлять собой ревматоидный артрит. Воспалительные расстройства согласно настоящему изобретению включают сердечно-сосудистые заболевания, ревматоидный артрит, рассеянный склероз, болезнь Крона, воспалительные заболевания кишечника, системную красную волчанку, полимиозит, септический шок, реакцию "трансплантат против хозяина", астму, ринит, псориаз и экзему, но не ограничиваются ими. В одном из вариантов реализации воспалительное заболевание, подлежащее лечению, включает ревматоидный артрит и ювенильный ревматоидный артрит.

[0038] Термин "пациент" или "млекопитающее", используемый в данном документе, относится к любому животному, относящемуся к млекопитающим, включая человека, домашних и сельскохозяйственных животных, а также животных, содержащихся в зоопарках или домашних условиях, например, собак, лошадей, кошек, крупный рогатый скот и т.д. Предпочтительно, млекопитающее представляет собой человека.

[0039] 10-пропаргил-10-деазааминоптерин для применения в соответствии с настоящим изобретением, как правило, вводят пациенту согласно режиму дозирования, обеспечивающему наиболее эффективное лечение (с точки зрения как эффективности, так и безопасности), которому подвергают пациента, как известно в данной области техники. При осуществлении способа лечения согласно настоящему изобретению, 10-пропаргил-10-деазааминоптерин для применения при расстройстве, устойчивом к метотрексату, и/или раке, чувствительном к 10-пропаргил-10-деазааминоптерину в соответствии с настоящим изобретением, можно вводить любым эффективным способом, известным в данной области, например, пероральным, местным, внутривенным, внутрибрюшинным, внутримышечным, внутрисуставным, подкожным, интраназальным, внутриглазным, вагинальным, ректальным, внутричерепным или внутрикожным путем, в зависимости от типа рака, подвергаемого лечению, и медицинского заключения лечащего врача, основанного, например, на результатах опубликованных клинических исследований.

[0040] 10-пропаргил-10-деазааминоптерин для применения при расстройствах, устойчивых к метотрексату, и/или раке, чувствительном к 10-пропаргил-10-деазааминоптерину, в соответствии с настоящим изобретением можно составить в виде части фармацевтического препарата. Конкретная дозированная форма зависит от способа введения, но может включать таблетки, капсулы, жидкости для перорального применения и растворы для инъекций для перорального, внутривенного, внутримышечного, внутричерепного или внутрибрюшинного введения и т.п. Дозировку можно выразить в мг/м². В качестве альтернативы, дозировку можно выразить в мг/кг массы тела любым образом, приемлемым для специалиста. Один из способов получения эквивалентной дозировки в мг/кг массы тела включает применение коэффициента пересчета, принимающего для среднего человека дозировку 0,025 мг/кг как приблизительно эквивалентную 1 мг/м². Согласно этому расчету, дозировка 150 мг/м² приблизительно равна 3,75 мг/кг.

[0041] Соответствующие дозировки в онкологии для лечения расстройства, устойчивого к метотрексату, и/или рака, чувствительного к 10-пропаргил-10-деазааминоптерину, включает следующие режимы дозирования. В одном из вариантов реализации эти дозировки предназначены для внутривенного введения. Например, подходящими являются дозы порядка 10-120 мг/м² площади поверхности тела/сут (приблизительно 0,25-3 мг/кг массы тела в сутки). Кроме того, подходящими являются дозировки 30 мг/м² (приблизительно 0,75 мг/кг) раз в неделю в течение 3 недель, затем одна неделя отдыха, 30 мг/м² (приблизительно 0,75 мг/кг) раз в неделю ×6 недель, затем одна неделя отдыха, или постепенно возрастающие дозировки 10-пропаргил-10-деазааминоптерина в соответствии с графиком раз в неделю ×6-недель. По мере необходимости можно использовать более низкие дозировки, основываясь на переносимости пациентом и типе злокачественного заболевания. При менее частом введении можно использовать повышенные дозировки. Таким образом, в общем смысле, дозировки от 10 до 275 мг/м² (приблизительно 0,25-6,9 мг/кг) подходят для применения с различными графиками дозирования, например, приблизительно от 100 до 275 мг/м² (приблизительно 2,5-6,87 мг/кг) для дозирования раз в две недели, и приблизительно от 10 до 150 мг/м² (приблизительно 0,25-3,75 мг/кг), или, конкретнее, приблизительно 10-60 мг/м² для дозирования раз в неделю.

[0042] Определение подходящей дозировки с использованием протоколов, аналогичных описанным в патенте США №6323205, входит в рамки настоящего изобретения. В одном из вариантов реализации 10-пропаргил-10-деазааминоптерин для применения при расстройстве, устойчивом к метотрексату, и/или раке, чувствительном к 10-пропаргил-10-деазааминоптерину, в соответствии с настоящим изобретением можно вводить в количестве от приблизительно 10 до приблизительно 275 мг/м² (от приблизительно 0,25 до приблизительно 6,87 мг/кг) на дозу. Способы согласно настоящему изобретению также включают введение 10-пропаргил-10-деазааминоптерина для применения при расстройстве, устойчивом к метотрексату, и/или раке, чувствительном к 10-пропаргил-10-деазааминоптерину, в соответствии с настоящим изобретением еженедельно; в дозе приблизительно 10 мг/м² (0,25 мг/кг) или 30 мг/м² (0,75 мг/кг), в количестве от приблизительно 10 до приблизительно 150 мг/м² (приблизительно 0,25-3,75 мг/кг) на дозу; раз в две недели; и в дозировке приблизительно 100-275 мг/м² (приблизительно 2,5-6,9 мг/кг). В одном из вариантов реализации 10-пропаргил-10-деазааминоптерин для применения при расстройстве, устойчивом к метотрексату, и/или раке, чувствительном к 10-пропаргил-10-деазааминоптерину, в соответствии с настоящим изобретением можно вводить в количестве между приблизительно 0,25 мг/кг и приблизительно 4 мг/кг, между приблизительно 0,75 мг/кг и приблизительно 3 мг/кг, в количестве между приблизительно 1,0 мг/кг и приблизительно 2,5 мг/кг, в количестве приблизительно 0,25 мг/кг или приблизительно 0,75 мг/кг (или эквивалентном количестве в пересчете на площадь поверхности тела (ППТ)).

[0043] 10-пропаргил-10-деазааминоптерин можно применять в комбинации с другими цитотоксическими и противоопухолевыми соединениями, включая алкалоиды барвинка, например, винбластин, навелбин и виндезин, аналоги нуклеотидов, например, гемцитабин, 5-фторурацил и цитарабин; алкилирующие агенты, например, циклофосфамид или ифосфамид; цисплатин или карбоплатин; лейковорин; таксаны, например, паклитаксел или доцетаксел; моноклональные антитела против CD20, с радиоизотопами или без них, и антибиотики, например, доксорубицин и митомицин.

Кроме того, можно применять комбинации 10-пропаргил-10-деазааминоптерина с несколькими из этих других противоопухолевых агентов или ингибиторами факторов роста и антиангиогенными агентами.

[0044] 10-пропаргил-10-деазааминоптерин и другие агенты можно одновременно вводить или применять в комбинации как часть общего курса лечения, согласно которому 10-пропаргил-10-деазааминоптерин и другой(ие) агент(ы) вводят в разное время. Например, другой агент можно ввести раньше, непосредственно после или через определенный период времени (например, 24 часа) по сравнению с введением 10-пропаргил-10-деазааминоптерина. Таким образом, для целей настоящей заявки термин введение обычно относится к одновременному введению или последовательному введению лекарственных агентов и в любом порядке в соответствии с курсом параллельного лечения с разделением или без разделения препаратов во времени, если не указано иное.

[0045] Для лечения воспалительного расстройства 10-пропаргил-10-деазааминоптерин можно вводить пероральным, внутримышечным, внутривенным, внутриартериальным или интратекальным путем. Специалисты могут использовать другие пути введения. Для лечения воспалительного расстройства, включающего, без ограничений, псориаз, ревматоидный артрит и/или ювенильный ревматоидный артрит, дозировка может включать следующее. Способы согласно настоящему изобретению при ревматоидном артрите взрослых или ювенильном ревматоидном полиартрите включают пероральное введение от приблизительно 1 до приблизительно 30 мг раз в неделю; в одном из вариантов вводили приблизительно 7,5 мг раз в неделю. Другие дозировки могут включать 10 мг/м² раз в неделю. Дозировки можно постепенно корректировать для достижения оптимального ответа. При более высоких дозировках, например, свыше 20 мг/м²/нед, или от 0,65 до 1,0 мг/кг/нед, лучшее всасывание может достигаться за счет внутримышечного или подкожного введения. Соответствующая дозировка также может включать 7,5 мг в неделю, или разделенные пероральные дозы от приблизительно 0,5 до приблизительно 10 мг; в одном из вариантов реализации доза может представлять собой пероральную дозу, разделенную на три дозы по 2,5 мг через 12-часовые интервалы в качестве еженедельного курса. Дозирование можно продолжать, пока терапия является эффективной, включая терапию в течение до двух лет и более.

[0046] 10-пропаргил-10-деазааминоптерин целесообразно применять в комбинации с добавлением фолиевой кислоты и витамина В12 для уменьшения побочных эффектов лечения. Например, пациентов можно лечить фолиевой кислотой (1 мг/м² ежедневно, начиная с 1 недели до начала лечения 10-пропаргил-10-деазааминоптерином или, в качестве альтернативы, 1 мг периорально (п/о) ежедневно, не основываясь на площади поверхности тела (ППТ)) и В12 (1 мг/м² ежемесячно, или, в качестве альтернативы, внутримышечно (в/м) каждые 8-10 недель по 1 мг (не основываясь на ППТ), или, в качестве альтернативы, п/о 1 мг ежедневно (не основываясь на ППТ)).

[0047] В одном из вариантов реализации 10-пропаргил-10-деазааминоптерин в соответствии с настоящим изобретением составляют для перорального введения. В еще одном варианте реализации 10-пропаргил-10-деазааминоптерин в соответствии с изобретением составляют для внутривенного введения.

[0048] 10-пропаргил-10-деазааминоптерин можно вводить в виде широкого спектра различных дозированных форм. Например, 10-пропаргил-10-деазааминоптерин в предпочтительном случае можно вводить перорально или парентерально.

[0049] 10-пропаргил-10-деазааминоптерин можно вводить с различными фармацевтически приемлемыми инертными носителями в форме таблеток, капсул, драже, пастилок, леденцов, порошков, спреев, кремов, бальзамов, суппозиториев, желе, гелей, паст, лосьонов, мазей, эликсиров, сиропов и т.п. Введение таких дозированных форм можно осуществлять в виде однократной или нескольких доз. Носители включают твердые разбавители или наполнители, стерильные водные среды и различные нетоксичные органические растворители и другие носители. Фармацевтические композиции для перорального применения можно соответствующим образом подсластить и/или ароматизировать. Для перорального введения 10-пропаргил-10-деазааминоптерина таблетки, содержащие одно или оба активные вещества в сочетании с любым из различных вспомогательных веществ, например микрокристаллической целлюлозой, цитратом натрия, карбонатом кальция, фосфатом кальция и глицином, а также различными разрыхлителями, например крахмалом (предпочтительно кукурузным, картофельным или крахмалом тапиоки), альгиновой кислотой и некоторыми комплексными силикатами, вместе с такими связующими для грануляции, как поливинилпирролидон, сахароза, желатин и гуммиарабик. Кроме того, очень часто для целей таблетирования используют смазывающие агенты, например стеарат магния, лаурилсульфат натрия и тальк. Твердые композиции подобного типа также можно применять в качестве наполнителей в желатиновых капсулах; предпочтительные материалы в этой связи также включают лактозу, или молочный сахар, а также высокомолекулярные полиэтиленгликоли. Если для перорального введения желательны водные суспензии и/или эликсиры, 10-пропаргил-10-деазааминоптерин можно объединять с различными подсластителями или вкусоароматическими добавками, пигментами и красителями и, при желании, эмульгирующими и/или суспендирующими агентами, а также с такими разбавителями, как вода, этанол, пропиленгликоль, глицерин и их различные комбинации. Таблетку, содержащую композицию согласно настоящему изобретению, можно изготовить путем прессования или формования, необязательно, с одним или более вспомогательных ингредиентов или адъювантов. Прессованные таблетки можно получить прессованием в соответствующем аппарате активного ингредиента в сыпучей форме, например, в виде порошка или гранул, необязательно смешанных со связующим, скользящим веществом, инертным разбавителем, поверхностно-активным или диспергирующим агентом. Формованные таблетки можно получить формованием в соответствующем аппарате порошкообразного соединения, увлажненного инертным жидким разбавителем. Каждая таблетка предпочтительно содержит от приблизительно 0,05 мг до приблизительно 10 г активного ингредиента, и каждая облатка или капсула предпочтительно содержит от приблизительно 0,05 мг до приблизительно 10 г активного ингредиента; таблетки могут также содержать приблизительно 2,5 мг активного ингредиента на таблетку или приблизительно 7,5 мг на таблетку.

[0050] Для парентерального введения 10-пропаргил-10-деазааминоптерина можно применять растворы, а также стерильные водные растворы, содержащие активное вещество или его соответствующие водорастворимые соли. Такие стерильные водные растворы предпочтительно являются забуференными, а также предпочтительно являются изотоническими, например, с помощью физиологического раствора или глюкозы достаточной концентрации. Именно эти водные растворы особенно подходят для внутривенных, внутримышечных, подкожных и внутрибрюшинных инъекций. Масляные растворы подходят для внутрисуставных, внутримышечных и подкожных инъекций. Изготовление всех этих растворов в стерильных условиях легко осуществляется с помощью стандартных фармацевтических методик, хорошо известных специалистам.

[0051] Для ветеринарных целей активные вещества можно вводить животным по отдельности или вместе, используя любую из форм и любой из путей, описанных выше. В предпочтительном варианте реализации 10-пропаргил-10-деазааминоптерин вводят в виде капсулы, болюса, таблетки, жидкого вливания, путем инъекции или в качестве имплантата. В качестве альтернативы 10-пропаргил-10-деазааминоптерин можно вводить с кормом для животных, и для этой цели можно изготовить концентрированную кормовую добавку или премикс для нормального корма для животных. Такие составы готовят обычным способом в соответствии со стандартной ветеринарной практикой.

[0052] Настоящее изобретение также включает способ лечения субъекта, нуждающегося в лечении неоплазии, устойчивой к метотрексату, причем указанный способ включает введение указанному субъекту эффективного количества 10-пропаргил-10-деазааминоптерина и его фармацевтически приемлемых солей.

[0053] Термин "фармацевтически приемлемые соли" относится к солям, полученным из фармацевтически приемлемых нетоксичных оснований или кислот. Если соединение по настоящему изобретению является кислым, его соответствующую соль можно легко получить из фармацевтически приемлемых нетоксичных оснований, включая неорганические основания и органические основания. Соли, полученные из таких неорганических оснований, включают соли алюминия, аммония, кальция, меди (II и I), железа (III), железа (II), лития, магния, марганца (III и II), калия, натрия, цинка и т.п. Особенно предпочтительными являются соли аммония, кальция, магния, калия и натрия. В одном из вариантов реализации указанная соль представляет собой гидрохлорид. Соли, полученные из фармацевтически приемлемых органических нетоксичных оснований, также включают соли первичных, вторичных и третичных аминов, а также циклических аминов и замещенных аминов, например, естественных и синтезированных замещенных аминов. Другие фармацевтически приемлемые органические нетоксичные основания, из которых можно образовать соль, включают ионообменные смолы, например, аргинин, бетаин, кофеин, холин, N',N-дибензилэтилендиамин, диэтиламин, 2-диэтиламиноэтанол, 2-диметиламиноэтанол, этаноламин, этилендиамин, N-этилморфолин, N-этилпиперидин, глюкамин, глюкозамин, гистидин, гидрабамин, изопропиламин, лизин, метилглюкамин, морфолин, пиперазин, пиперидин, полиаминные смолы, прокаин, пурины, теобромин, триэтиламин, триметиламин, трипропиламин, трометамин и т.п.

[0054] В дополнение к обычным лекарственным формам, изложенным выше, 10-пропаргил-10-деазааминоптерин (включая фармацевтически приемлемые соли, сложные эфиры, сольваты и полиморфные формы каждого его компонента) можно также вводить с помощью средств контролируемого высвобождения и/или устройств доставки.

[0055] Если не указано иное, все числа, выражающие количества ингредиентов, размеры, условия реакции и т.д., используемые в описании и формуле изобретения, во всех случаях следует понимать как модифицированные термином «приблизительно».

[0056] В настоящей заявке и формуле изобретения использование единственного числа включает множественное число, если иное не указано недвусмысленным образом. Кроме того, использование "или" означает "и/или", если не указано иное. Кроме того, использование термина "включая", а также других форм, таких, как "включает" и "включал", не является ограничивающим. Кроме того, такие термины, как "элемент" или "компонент" охватывают как элементы и компоненты, содержащие один блок, так и элементы и компоненты, которые включают более чем одну единицу, если иное не указано недвусмысленным образом.

[0057] Настоящее изобретение частично основано на данных, свидетельствующих о том, что клетки с приобретенной устойчивостью к метотрексату сохраняют чувствительность к пралатрексату, в то время как клетки, которые приобрели устойчивость к пралатрексату, также приобрели устойчивость к метотрексату. С учетом прогнозируемых генетических факторов чувствительности к пралатрексату, разработали две клеточные линии с приобретенной устойчивостью к этому препарату из линий раковых клеток DU145 (предстательной железы) и Нер2 (головы и шеи). Обладая более чем 200-кратной устойчивостью к пралатрексату, чем исходные клетки, DU-PDX и HEP-PDX демонстрировали частичную перекрестную устойчивость к метотрексату. Приобретенная устойчивость к пралатрексату была ассоциирована со сниженной экспрессией RFC-1 и повышенной экспрессией MDR1. Fotoohi et al (2009) описали антифолат-устойчивые линии лейкоза с более чем двукратно пониженным уровнем мРНК RFC-1 в клетках, устойчивых к метотрексату, что подчеркивает важную роль входящего транспорта в устойчивости к антифолатам. Аналогичные данные были получены ранее в работах Jansen (1998), Rothen (2004) и Ifergan (2003) при использовании других моделей клеток, устойчивых к метотрексату. Повышенная экспрессия MDR1, по-видимому, не играет роли в наблюдаемой приобретенной устойчивости к пралатрексату, поскольку ингибирование MDR1 не восстанавливает чувствительности к пралатрексату. Показано, что пониженная активность FPGS ассоциирована с приобретенной устойчивостью к метотрексату в клетках лейкоза человека CCRF-CEM (Mauritz, 2002). В одном из исследований, в клетках, устойчивых к пралатрексату, наблюдали небольшое снижение экспрессии FPGS, что указывает на роль конъюгирования с полиглутаматом при устойчивости к пралатрексату. В ходе исследований, проведенных три десятилетия назад, обнаружили, что еще одним частым механизмом приобретенной устойчивости к метотрексату является амплификация гена ДГФР и, как следствие, избыточная экспрессия фермента (обзор Assaraf 2007; Chen et al, 1995). В данном исследовании линия клеток НЕР-МТХ с приобретенной устойчивостью к метотрексату демонстрировала резкое увеличение экспрессии мРНК и белка ДГФР по сравнению с исходной эквивалентной линией. В линиях клеток, устойчивых к пралатрексату, не наблюдали повышенной экспрессии DHFR. Эти данные указывают на различные молекулярные механизмы устойчивости к метотрексату и пралатрексату в этих линиях клеток.

[0058] Таким образом, настоящее изобретение показывает, что, как ни странно, линии клеток, которые стали устойчивыми к метотрексату, не стали устойчивыми к пралатрексату и/или сохранили значительно большую степень исходной чувствительности к пралатрексату.

[0059] Дополнительные цели, преимущества и новые признаки настоящего изобретения станут очевидны для специалистов при рассмотрении следующих примеров, которые не следует рассматривать как ограничивающие. Кроме того, каждый из различных вариантов реализации и аспектов настоящего изобретения, как описано выше и указано в формуле изобретения, находит экспериментальное подтверждение в следующих примерах.

ПРИМЕРЫ

[0060] Следующие примеры приведены только для иллюстративных целей и не

предназначены для ограничения рамок изобретения.

Пример 1:

[0061] На Фиг.1 показана схема синтеза, которую можно использовать при получении 10-пропаргил-10-деазааминоптерина. Смесь 60% NaH в масляной дисперсии (1,06 г, 26,5 ммоль) в 18 мл высушенного просеиванием ТГФ охлаждали до 0°С. Холодную смесь обрабатывали раствором диметилового эфира гомотерефталевой кислоты (5,0 г, 24 ммоль, соединение 1 на Фиг.1) в безводном ТГФ (7 мл) и перемешивали смесь в течение 1 часа при температуре 0°С. Вносили пропаргилбромид (26,4 ммоль) и перемешивали смесь при 0°С в течение еще 1 часа, а затем при комнатной температуре в течение 16 часов. Полученную смесь обрабатывали 2,4 мл 50% уксусной кислоты, а затем выливали в 240 мл воды. Смесь экстрагировали эфиром (2×150 мл). Эфирные экстракты объединяли, высушивали над Na₂SO₄ и концентрировали до оранжево-желтого масла. За счет хроматографии на силикагеле (600 мл, 230-400 меш) с элюированием циклогексан-EtOAc (8:1) получали продукт диметиловый эфир α-пропаргилгомотерефталевой кислоты (соединение 2) в виде белого твердого вещества (4,66), который, согласно ТСХ (циклогексан-EtOAc, 3:1), был однородным. В то же время данные масс-спектрометрии этого продукта показали, что он представлял собой смесь желаемого продукта 2 и дипропаргилированного соединения. Исходный материал 1 не обнаружили. ВЭЖХ показала, что соотношение моно- и дипропаргилированных продуктов составляло приблизительно 3:1. Так как дипропаргилированный продукт, в отличие от соединения 1, не мог образовывать нежелательного побочного продукта на следующем этапе реакции, этот материал являлся подходящим для преобразования в соединение 3. Отсутствие исходного соединения 1 в продукте, используемом для продолжения синтеза, было очень важно для предотвращения последующего образования 10-dAM во время преобразований, ведущих к образованию конечного продукта, поскольку полное удаление 10-dAM из 10-пропаргил-10-деазааминоптерина представляет очень сложную задачу.

[0062] Смесь формировали путем объединения 0,36 г 60% NaH (9 ммоль) в масляной дисперсии с 10 мл безводного ДМФ и охлаждали до 0-5°С. Холодную смесь обрабатывали, внося по каплям раствор продукта первой реакции (соединение 2) (2.94 г, 12 ммоль) в 10 мл безводного ДМФ и перемешивали при 0°С в течение 30 минут. После охлаждения до -25°С по каплям вносили раствор 2,4-диамино-6-(бромметил)-птеридингидробромид-0.2 2-пропанола (1.00 г, 2.9 ммоль) в 10 мл безводного ДМФ, поддерживая температуру около -25°С. Температуре перемешиваемой смеси позволяли подняться до -10°С в течение 2 часов. Спустя дополнительные 2 часа при -10°С температуре позволяли подняться до 20°С, перемешивание продолжали при комнатной температуре в течение еще 2 часов. рН реакционной смеси доводили до 7 путем добавления твердого СО₂. После концентрирования в вакууме для удаления растворителя остаток перемешивали с диэтиловым эфиром, нерастворимый в эфире материал собирали, промывали водой и высушивали в вакууме, получая 1,49 г неочищенного продукта. Этот неочищенный продукт растворяли в CHCl₂-МеОН (10:1) для нанесения на колонку с силикагелем. Элюирование этой же системой растворителей позволяло получить метиловый эфир 10-пропаргил-10-карбометокси-4-дезокси-4-амино-10-деазаптериновой кислоты (соединение 3), который являлся однородным согласно ТСХ, с 40% выходом (485 мг).

[0063] Перемешиваемую суспензию соединения 3 (400 мг, 0,95 ммоль) в 2-метоксиэтаноле (5 мл) обрабатывали водой (5 мл), а затем 10% раствором гидроксида натрия (3,9 мл). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 4 часов, в течение которых образовывался раствор. Раствор доводили до рН 8 уксусной кислотой и концентрировали в глубоком вакууме. Полученный остаток растворяли в 15 мл воды и подкисляли до рН 5.5-5.8, что приводило к образованию осадка. Осадок собирали, промывали водой и высушивали в вакууме, восстанавливая 340 мг соединения 4 (91% выход). ВЭЖХ-анализ показал 90% чистоту продукта.

[0064] Соединение 4 (330 мг) декарбоксилировали путем нагревания в 15 мл ДМСО при 115-120°С в течение 10 минут. Проверка с помощью HPLC через 10 минут подтвердила, что преобразование было практически полным. ДМСО удаляли дистилляцией в вакууме (на бане при 40°С). Остаток перемешивали с 0,5 н. NaOH, получая прозрачный раствор. Подкисление до рН 5,0 1 н. HCl позволяло получить 10 пропаргил-4-дезокси-4-амино-10-деазаптериновую кислоту (соединение 5) в виде желтого твердого вещества с 70% выходом. ВЭЖХ показала 90% чистоту продукта на данном этапе.

[0065] Соединение 5 (225 мг, 0,65 ммоль) связывали с диметил-L-

глутаматгидрохлоридом (137 мг, 0,65 ммоль) с помощью ВОР-реагента (бензотриазол-1-илокситрис(диметиламино)фосфонийгексафторфосфата (287 мг, 0,65 ммоль, Aldrich Chemical Со.) в ДМФ (10 мл), содержащем триэтиламин (148 мг, 1,46 ммоль). Смесь перемешивали в течение 3 часов при 20-25°С, а затем выпаривали досуха. Остаток перемешивали с водой, нерастворимый в воде неочищенный продукт собирали и высушивали в вакууме. Неочищенный продукт (350 мг) очищали хромотографией на силикагеле с элюированием CHCl₃-МеОН (10:1), содержащим триэтиламин (0,25% по объему), восстанавливая 165 мг диметилового эфира 10-пропаргил-10-деазааминоптерина (соединение 6, 50% выход), который был однородным согласно ТСХ (CHCl₃-МеОН (5:1). [0066] Соединение 6 (165 мг, 0,326 ммоль) суспендировали в 10 мл перемешиваемого МеОН, к которому добавляли 0.72 мл (0.72 мг-экв) 1 н. NaOH. Перемешивание при комнатной температуре продолжали до образования раствора через несколько часов. Раствор хранили при 20-25°С в течение 8 часов, затем разбавляли 10 мл воды. Выпариванием при пониженном давлении удаляли метанол, а концентрированный водный раствор оставляли при 20-25°С в течение еще 24 часов. Затем ВЭЖХ показала, что гидролиз эфира был завершен. Прозрачный водный раствор подкисляли уксусной кислотой до рН 4.0, осаждая 10-пропаргил-10-деазааминоптерин в виде бледно-желтого твердого вещества. Масса собранного, промытого водой и высушенного в вакууме продукта составила 122 мг (79% выход). Элементный анализ, протонный ЯМР и масс-спектроскопия полностью согласовывались с назначенной структурой. ВЭЖХ анализ показал 98% чистоту и позволил установить, что продукт не содержал 10-деазааминоптерина.

В этом случае количество 10-пропаргил-10-деазааминоптерина (определенное по площади ВЭЖХ-пика) приближалось к 98%, а пик, соответствующий 10-деазааминоптерину, не определялся обрабатывающим программным обеспечением, хотя в этой области имели место небольшие пульсации фона.

Пример 2:

[0067] Для изучения активности 10-пропаргил-10-деазааминоптерина по

отношению к различным типам солидных опухолей исследовали чувствительность 15 линий клеток солидных опухолей человека к цитотоксической активности 10-пропаргил-10-деазааминоптерина.

[0068] Материалы и методики: Линии клеток

[0069] Панель линий клеток рака ободочной кишки (НТ29, НСТ116, COLO205, НСС2998), молочной железы (MCF7, MDA-MB-435), легких (НОР62, НОР92), яичников (OVCAR3, IGROV1), предстательной железы (DU145, РС3) и головы и шеи (SCC61, НЕР2, SQ20B) человека приобрели в коллекциях АТСС (Роквилл, штат Мэриленд, США) и Национального института рака (National Cancer Institute). Клетки выращивали в виде монослоя в среде RPMI, дополненной 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мм глутамина, 100 ед мл^-1 пенициллина и 100 мкМ мл^-1 стрептомицина.

[0070] Анализы цитотоксичности клеток

[0071] Все полученные данные представляли собой результат трех отдельных экспериментов, выполненных в двух повторениях. Жизнеспособность клеток определяли с помощью МТТ-анализа, который выполняли, как описано ранее (Hansen, 1989). Вкратце, клетки сеяли на 96-луночные планшеты при плотности 2×10³ клеток на лунку. Клетки инкубировали в течение 120 часов, а затем добавляли 0,4 мг мл^-1 красителя МТТ (3-[4,5-диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенилтетразолийбромида) на 4 часа при 37°С. Монослой суспендировали в 0,1 мл ДМСО и измеряли поглощение при 560 нм с помощью считывающего устройства для микропланшетов. Положительные и отрицательные контроли включали лунки с необработанными клетками или носитель, содержащий МТТ без клеток, соответственно. Преобразование желтого водорастворимого тетразолиевого МТТ в фиолетовый нерастворимый формазан катализировалось митохондриальными дегидрогеназами и использовалось для оценки числа жизнеспособных клеток. Контрольное значение, соответствующее необработанным клеткам, принимали как 100%, и жизнеспособность обработанных образцов выражали в процентах от контроля. Значения IC₅₀ определяли как концентрации, сокращавшие жизнеспособность клеток на 50%. [0072] Для исследований одиночных агентов клетки сеяли и позволяли колонизировать лунки за 24 часа до начала обработки возрастающими концентрациями 10-пропаргил-10-деазааминоптерина в течение 72 ч. После инкубирования клеткам позволяли восстановиться в среде, не содержавшей соединения, в течение 48 ч, после чего определяли ингибирование роста, используя МТТ-анализ.

[0073] Вестерн-блоттинг.

[0074] Клетки лизировали в буфере, содержащем 50 мм HEPES (рН 7.6), 150 мм NaCl, 1% тритона Х-100, 2 мМ ванадата натрия, 100 мм NaF и 0,4 mg.ml^-1 фенилметилсульфонилфторида. Равные количества белка (20-50 мкг/дорожку) подвергали электрофорезу в ДСН-ПААГ и переносили на нитроцеллюлозные мембраны. Мембраны обрабатывали зондами, используя специфические первичные антитела против расщепленной PARP, расщепленной каспазы 3, каспазы 9 (Cell Signaling, Сен-Кантен Ивелин, Франция), ДГФР (Abcam, Франция), β-актина (Sigma-Aldrich, Сен-Кантен Фаллавье, Франция), а затем вторичные антитела, конъюгированные с пероксидазой, и визуализацию за счет хемилюминесценции.

[0075] На Фигуре 2 показана относительная чувствительность 15

протестированных линий раковых клеток человека к 10-пропаргил-10-деазааминоптерину. Обнаружено, что девять из этих линий клеток были чувствительны к цитотоксической активности 10-пропаргил-10-деазааминоптерина (IC₅₀<0.1 мкМ), в то время как 6 из этих линий клеток были относительно устойчивы (IC₅₀>9 мкМ).

[0076] Антипролиферативное действие одиночного агента

[0077] Антипролиферативное действие пралатрексата оценивали на 15 линиях раковых клеток, как показано в Таблице 1. Эксперименты по определению зависимости от времени показали, что оптимальное антипролиферативное действие достигалось при воздействии пралатрексата на клетки в течение 72 ч (Фигура 1А). IC50 пралатрексата находились в диапазоне от 0.0110.002 мкМ для линии клеток рака предстательной железы РС3 до >350 мкМ для линии клеток MDA-MB-435. Примечательно, что наблюдали две группы клеточных линий с более чем 100-кратным различием в IC50: одна группа, включавшая клетки РС3, SCC61, DU145, НТ29, НОР62, SQ20B, НОР92, НЕР2 и IGROV1, демонстрировавшие IC50<0.1 мкМ, в то время как клетки Colo205, НСС2998, MCF7, НСТ116, OVCAR3 и MDA-MB-435 демонстрировали значения IC₅₀>9 мкМ.

[0078] Антипролиферативное действие пралатрексата сравнивали с аналогичным действием метотрексата и нескольких широко используемых антиметаболитов, например, пеметрекседа, 5-FU и 5'-DFUR, активного метаболита капецитабина (Фигура 1 В и Таблица 1). IC50 пралатрексата были в среднем почти в 10 раз ниже, чем аналогичные значения для метотрексата. Профили цитотоксичности этих двух антифолатов были аналогичны и характеризовались одними и теми же четко различающимися группами чувствительных и устойчивых линий клеток. Профиль цитотоксичности пралатрексата отличался от профилей 5-FU, 5'-DFUR и пеметрекседа, что указывало на различия в метаболизме, механизме действия и/или устойчивости пралатрексата и других указанных антиметаболитов. Примечательно, что между пралатрексатом и пеметрекседом, антифолатом, считающимся главным образом ингибитором тимидилатсинтетазы (TS), наблюдалась ограниченная перекрестная чувствительность.

[0079] Экспрессия генов, участвующих в транспорте и метаболизме фолата [0080] Экспрессию генов, заведомо вовлеченных в механизмы чувствительности к антифолатам, анализировали с использованием панели линий раковых клеток. Экспрессию мРНК ДГФР, FPGS, TS/TYMS (тимидилатсинтетазы), SCL19A1/RFC-1, GARFT (глицинамидрибонуклеотидформилтрансферазы), SLC25A32 (митохондриального переносчика фолата) и ABC переносчика B1 (АВСВ1 или MDR1) определяли с помощью количественной ПЦР с обратной транскриптазой (Фигура 3а). Линии клеток экспрессировали различные уровни этих генов фолатного пути, однако существенной корреляции между чувствительностью к пралатрексату и экспрессией мРНК TS, SCL19A1/RFC-1, GARFT, SLC25A32 и MDR1 не обнаружено. Клетки, чувствительные к пралатрексату, экспрессировали относительно более высокий уровень ДГФР, мишени пралатрексата, чем клетки «устойчивой» группы, но этот показатель не достигал статистической значимости (р=0,083, Фигура 3А). Клетки, чувствительные к пралатрексату, экспрессировали значимо более высокий уровень мРНК FPGS, чем устойчивые клетки (t-тест, р=0,002). В целом, обнаружена тенденция к положительной корреляции между экспрессией мРНК FPGS и чувствительностью к пралатрексату (IC₅₀s) (R²=0.47, р<0.01), что указывало на важную роль конъюгирования с полиглутаматом для антипролиферативной активности пралатрексата.

[0081] Для определения потенциальной роли переносчиков фолиевой кислоты для активности пралатрексата, авторы выполнили оценку корреляции значений IC₅₀, полученных после воздействия лекарственного агента в течение 72 ч, с уровнем экспрессии мРНК SCL19A1/RFC-1 и SLC25A32 в девяти линиях клеток, чувствительных к пралатрексату (Фигура 3В). Клетки, экспрессировавшие высокий уровень мРНК SCL19A1/RFC-1 и SLC25A32, демонстрировали повышенную чувствительность к пралатрексату, что указывало на потенциальную роль SCL19A1/RFC-1 и SLC25A32 в поглощении пралатрексата клетками.

Таблица 1. Цитотоксичность (IC₅₀, мкМ) после 72 ч воздействия пралатрексата, метотрексата, 5-FU, 5'-DFUR или пеметрекседа на панель линий клеток карциномы человека. Линия клеток* Пралатрексат Метотрексат Пеметрексед 5-FU 5'-DFUR РС3 0,01 0,1 2,7 11,5 25 SCC61 0,011 0,03 0,015 11,2 3,2; DU145 0,015 0,3 0,048 7 28 НТ29 0,02 0,22 0,023 3 16 НОР62 0,023 0,15 0,029 78 380 SQ20B 0,03 0,26 0,025 10 27 НОР92 0,031 0,6 0,02 18 135 НЕР2 0,05 0,25 0,1 86 250 IGROV1 0,08 0,33 300 8 29 COLO205 9 30 0,024 0,8 3,9 НСС2998 100 >350 1,5 10 34 MCF7 200 300 0,022 1,3 7,8 НСТ116 280 >350 350 10 45 OVCAR3 >350 >350 0,025 31 230 MDA435 >350 >350 300 5 33 [0083] * Использованные линии клеток: рака ободочной кишки (НТ29, НСТ116, COLO205, НСС2998), молочной железы (MCF7), меланомы (MDA-MB-435, ранее считавшиеся линией рака молочной железы), НМРЛ (НОР62, НОР92), яичников (OVCAR3, IGROV1), предстательной железы (DU145, РС3), и головы, и шеи (SCC61, НЕР2, SQ20B)

Пример 3:

[0084] Разработка линий клеток, устойчивых к 10-пропаргил-10-деазааминоптерину и метотрексату.

[0085] Для исследования характеристик прогнозируемых факторов антипролиферативного действия 10-пропаргил-10-деазааминоптерина на основе исходных клеток DU145 и НЕР2 разработали линии клеток DU-PDX и HEP-PDX, соответственно, путем воздействия поэтапно увеличивающихся концентраций 10-пропаргил-10-деазааминоптерина в течение 6 месяцев. Полученные клетки DU-PDX и HEP-PDX обладали по меньшей мере в 200 и 500 раз меньшей чувствительностью к 10-пропаргил-10-деазааминоптерину, чем исходные клетки. После 5 пересевов на среде, не содержавшей лекарственного агента, устойчивые клетки сохраняли свою устойчивость к лекарственному агенту, что указывало на стабильность этих линий клеток.

[0086] Для сравнения механизмов устойчивости к 10-пропаргил-10-деазааминоптерину и метотрексату, на основе исходных клеток DU145 и НЕР2 разработали линии клеток DU-MTX и НЕР-МТХ путем воздействия поэтапно увеличивающихся концентраций метотрексата. DU-MTX и НЕР-МТХ демонстрировали устойчивость к метотрексату и 10-пропаргил-10-деазааминоптерину по сравнению с исходными клетками. В то же время активность 10-пропаргил-10-деазааминоптерина по-прежнему оставалась выше (примерно 10-кратно более низкие IC₅₀) активности метотрексата в раковых клетках DU-MTX и НЕР-МТХ.

[0087] На Фигуре 3 показаны IC₅₀ для 10-пропаргил-10-деазааминоптерина или метотрексата для клеток DU145 и DU145, адаптированных к 10-пропаргил-10-деазааминоптерину или метотрексату. Эти данные показывают, что по отношению к DU-MTX 10-пропаргил-10-деазааминоптерин сохранял значительную эффективность; IC₅₀ для 10-пропаргил-10-деазааминоптерина для линии клеток DU-145, адаптированных к метотрексату, составила 0,02 мкМ. По сравнению с этим, IC₅₀ 10-пропаргил-10-деазааминоптерина для интактных клеток DU-145 составляла 0,01 мкМ. Клетки DU-145, адаптированные к метотрексату, демонстрировали приблизительно 10-кратное увеличение IC₅₀ метотрексата. В целом, клетки DU-145, адаптированные к 10-пропаргил-10-деазааминоптерин, также стали нечувствительны к метотрексату, в то время как клетки DU-145, адаптированные к метотрексату, по-прежнему демонстрировали приблизительно такую же чувствительность к 10-пропаргил-10-деазааминоптерин, как и интактные клетки DU-145.

[0088] На Фигуре 4 показаны IC₅₀ для 10-пропаргил-10-деазааминоптерина или метотрексата для клеток НЕР2 и НЕР2, адаптированных к 10-пропаргил-10-деазааминоптерину или метотрексату. Эти данные показывают, что по отношению к НЕР-МТХ (адаптированным к метотрексату) 10-пропаргил-10-деазааминоптерин сохранял значительную эффективность; согласно измерениям IC₅₀, эффективность 10-пропаргил-10-деазааминоптерина была в десять раз выше.

[0089] Генетические изменения, связанные с приобретенной устойчивостью к 10-пропаргил-10-деазааминоптерину.

[0090] ОТ-ПЦР

Теоретические и практические аспекты количественной ПЦР с обратной транскрипцией при использовании системы обнаружения последовательностей ABI Prism 7900 Sequence Detection System (Perkin-Elmer Applied Biosystems, Фостер-Сити, Калифорния, США) известны специалистам. Результаты выражали как n-кратное различие в экспрессии гена-мишени по сравнению с геном ТВР (контроль эндогенной РНК) и калибратором (1X образец), состоявшим из образца линии клеток из тестируемого набора, содержавшего наименьшее количество мРНК гена-мишени. Эксперименты выполняли в двух повторениях.

[0091] Для определения возможных механизмов устойчивости к антифолатам авторы оценивали экспрессию мРНК нескольких генов, участвующих в метаболизме фолатов, включая ДГФР, TS, FPGS, RFC1/SCL19A1, SLC25A32 и ABCB1/MDR1 в исходных и устойчивых клетках. Как показано на Фигуре 5, существенных изменений экспрессии мРНК ДГФР, TS и SLC25A32 в клетках, устойчивых к 10-пропаргил-10-деазааминоптерину, не происходило. В клетках DU-PDX и HEP-PDX наблюдали небольшое снижение экспрессии мРНК FPGS по сравнению с исходными эквивалентными линиями. И наоборот, экспрессия RFC1/SCL19A1 была более чем в 10 раз понижена в этих двух линиях клеток, устойчивых к 10-пропаргил-10-деазааминоптерину. Уровни мРНК ABCB1/MDR1 были в 40 и 2 раза выше в DU-PDX и HEP-PDX, соответственно, по сравнению с DU145 и НЕР2. Эти данные указывают на важную роль переносчиков для антипролиферативной активности 10-пропаргил-10-деазааминоптерина и приобретенной устойчивости к нему. Верапамил, блокатор кальциевых каналов, устраняет устойчивость за счет действия в качестве конкурентного субстрата MDR1, независимо от присущей ему фармакологической функции. Различные клинические исследования также показали, что такие лекарственные средства, как верапамил, могут устранять устойчивость к противораковым препаратам. Для изучения роли MDR1 в устойчивости к 10-пропаргил-10-деазааминоптерину клетки DU-PDX и HEP-PDX инкубировали с 30 мкМ верапамила и 3 мкМ циклоспорина А одновременно с 10-пропаргил-10-деазааминоптерином в течение 72 часов. Изменений цитотоксичности 10-пропаргил-10-деазааминоптерина в присутствии и при отсутствии верапамила и циклоспорина А не наблюдали, что указывает на отсутствие существенной роли сверхэкспрессии MDR1 в приобретенной устойчивости этих линий клеток (результаты не показаны).

[0092] Анализ экспрессии ДГФР, мишени 10-пропаргил-10-деазааминоптерина и метотрексата, показал значительное повышение белка в клетках НЕР-МТХ по сравнению с исходными клетками НЕР2, что указывало на возможную амплификацию гена (Фигура 6), и значительное повышение мРНК (Фигура 7). Экспрессия белка ДГФР была слегка повышена после краткого (24 часа) воздействия 10-пропаргил-10-деазааминоптерина, но не после длительного (6 месяцев) воздействия 10-пропаргил-10-деазааминоптерина, что указывало на отличие молекулярного механизма приобретенной устойчивости к 10 пропаргил-10-деазааминоптерину в клетках HEP-PDX от устойчивости к метотрексату в клетках НЕР-МТХ.

[0093] Для оценки перекрестной устойчивости клеток, устойчивых к пралатрексату, к другим лекарственным агентам, клетки DU145, DU-PDX, НЕР2 и HEP-PDX подвергали воздействию пеметрекседа и 5-FU в течение 72 ч. Для цитотоксичности 5-FU существенных различий между исходными и PDX-устойчивыми клетками не наблюдали. Воздействие пеметрекседа в течение 72 ч было лишь слегка менее цитотоксическим по отношению к клеткам DU-PDX и HEP-PDX по сравнению с их исходными эквивалентами (данные не показаны). Эти данные указывали на то, что приобретенная устойчивость к пралатрексату может не означать устойчивости к пеметрекседу и 5-FU, возможно, из-за различий в механизмах действия этих соединений.

[0094] Пралатрексат представляет собой антифолат с высоким сродством к восстановленному белку-переносчику фолата 1 (RFC-1) и фолилполиглутаматсинтетазе (FPGS), что приводит к интенсивной интернализации и накоплению в опухолевых клетках. В настоящее время ведутся исследования пралатрексата в качестве агента для монотерапии и в комбинациях с различными злокачественными заболеваниями. Для определения направления дальнейших клинических разработок, необходимо установить молекулярные механизмы чувствительности к пралатрексату и получить данные доклинических исследований о комбинированной терапии.

[0095] Пралатрексат демонстрировал мощную антипролиферативную активность (IC₅₀<0.1 мкМ) в девяти из 15 линий клеток солидных опухолей человека. Определены две четко различающиеся группы линий клеток с более чем 100-кратным различием значений IC₅₀ пралатрексата: чувствительные и относительно устойчивые линии клеток. Антипролиферативное действие пралатрексата in vitro с точки зрения значений IC₅₀ было в среднем почти в 10 раз лучше, чем действие метотрексата. При сравнении цитотоксической активности этих двух сходных антифолатов с другими антиметаболитами, включая 5-FU, 5'-DFUR и пеметрекседом, оказалось, что пралатрексат сохранял активность в некоторых клетках, слабочувствительных к 5-FU и 5' DFUR, например, линии клеток НМРЛ НОР62 и НОР92. Аналогично, профиль чувствительности к пеметрекседу отличался от профиля пралатрексата, что можно объяснить различиями в молекулярных механизмах действия этих соединений.

[0096] В целом, приобретенная устойчивость к 10-пропаргил-10-деазааминоптерину ассоциировалась с пониженной экспрессией RFC-1 и повышенной экспрессией MDR1 в линиях клеток DU-PDX и HEP-PDX. Фармакологическое ингибирование MDR1 не влияло на устойчивость к 10-пропаргил-10-деазааминоптерину в этих моделях, что указывало на ограниченную роль MDR1 для наблюдаемой устойчивости. В клетках, устойчивых к 10-пропаргил-10-деазааминоптерину, не обнаружили изменений экспрессии мРНК ДГФР. И наоборот, в клетках НЕР-МТХ отмечали значительное повышение экспрессии мРНК и белка ДГФР. Наблюдались различия в механизмах приобретенной устойчивости к 10-пропаргил-10-деазааминоптерину и метотрексату; эти данные указывают на целесообразность дальнейшей разработки 10-пропаргил-10-деазааминоптерина при раковых заболеваниях, чувствительных к метотрексату, а также в условиях приобретенной устойчивости к метотрексату.

[0097] Влияние пралатрексата (PDX) и изомеров PDX-10a и PDX-10b (3 дозы), вводимых внутривенно 17 дней крысам с развивающимся коллаген-индуцированным артритом типа II (RTTC/AL-2)

Дизайн исследования:

Животные (10 особей в группе для артрита, 4 особи в группе для нормального контроля) помещались в клетки в количестве 4-5 особей в одну клетку, животным давали акклиматизироваться в течение 4-8 дней.

Группу артрита анестезировали изофлураном и животным делали инъекции коллагена (день 0, D0); каждое животное получало 400 мкл смеси, разделенной на 3 подкожных участка на спине.

На 6-й день (D6) животных снова анестезировали и делали вторую инъекцию коллагена (200 мкл, 3 участка).

Внутривенное (IV) дозирование тестируемых соединений, проводимое с интервалом в 24 часа (QD), инициировали на день 0 с использованием дозы объемом 1 мл/кг.

На 17-й день все животные были анестезированы и умерщвлены.

Коленные суставы удаляли и помещали в формалин для обработки для микроскопии.

Обработка суставов:

После выдерживания в фиксаторе в течение 1-2 дней, а затем в декальцинаторе в течение 4-5 дней, коленные суставы разрезали пополам во фронтальной плоскости, обрабатывали, закрепляли, делали срезы и окрашивали толуидиновым синим.

Подсчет оценки суставов:

Коленные суставы с коллаген-индуцированным артритом получали оценку от 0 до 5 за воспаление, образование паннуса, повреждение хряща и костной резорбции, как указано ниже.

Воспаление:

0 = Нормальное состояние;

0,5 = Минимальное очаговое воспаление;

1 = Минимальная инфильтрация клеток воспалительного инфильтрата клеток в синовиальную оболочку/околосуставные ткани;

2 = Легкая инфильтрация;

3 = Умеренная инфильтрация, сопровождающаяся умеренным отеком;

4 = Отчетливо выраженная инфильтрация, сопровождающаяся заметным отеком;

5 = Сильная инфильтрация, сопровождающаяся тяжелым отеком.

Паннус коленного сустава:

0 = Нормальное состояние;

0,5 = Минимальная инфильтрация паннуса в хрящ и субхондральную кость, затронуты только маргинальные зоны и затронуты только несколько суставов;

1 = Минимальная инфильтрация паннуса в хрящ и субхондральную кость, затронуто примерно 1-10% поверхности хряща или субхондральной кости;

2 = Легкая инфильтрация (распространяется на до 1/4 части поверхности или субхондральной области голени или бедра), затронуто примерно 11-25% поверхности хряща или субхондральной кости;

3 = Умеренная инфильтрация (распространяется на более чем 1/4, но менее чем 1/2 части поверхности или субхондральной области голени или бедра), затронуто примерно 26-50% поверхности хряща или субхондральной кости;

4 = Отчетливо выраженная инфильтрация (распространяется на от 1/2 до 3/4 части поверхности или субхондральной области голени или бедра), затронуто примерно 51-75% поверхности хряща или субхондральной кости;

5 = Сильная инфильтрация, затронуто примерно 76-100% поверхности хряща или субхондральной кости.

Повреждение коленного хряща:

0 = Нормальное состояние;

0,5 = Минимальное снижение толуидиновой голубой окраски, затронуты только маргинальные зоны;

1 = Минимальное = минимальное до легкого снижение толуидиновой голубой окраски, без потери хондроцитов или нарушений коллагена;

2 = Легкое = легкое снижение толуидиновой голубой окраски, с очаговой легкой (поверхностной) потерей хондроцитов и/или нарушением коллагена, на нескольких небольших зонах возможно повреждение на глубину хряща 50%;

3 = Умеренное = умеренное снижение толуидиновой голубой окраски, с многоочаговой до диффузной умеренной (глубиной до срединной зоны) потерей хондроцитов и/или нарушением коллагена, возможно наличие 1-2 небольших зон с потерей на всю толщину, затронута менее чем общая ширина поверхности и не более чем 25% общей ширины всех поверхностей;

4 = Отчетливо выраженное = отчетливо выраженное снижение толуидиновой голубой окраски, с многоочаговой до диффузной заметной (до глубинной зоны) потерей хондроцитов и/или нарушением коллагена, либо с 1 поверхностью с почти полной потерей или частичной потерей, общая потеря менее чем 50% от суммарной ширины всех поверхностей;

5 = Сильное = сильное диффузное снижение толуидиновой голубой окраски, с многоочаговой сильной (до пограничной линии) потерей хондроцитов и/или нарушением коллагена на бедренной кости и/или большеберцовой кости, общая потеря более чем 50% от суммарной ширины всех поверхностей.

Костная резорбция колена:

0 = Нормальное состояние;

0,5 = Минимальная резорбция, затронуты только маргинальные зоны;

1 = Минимальная = небольшие зоны резорбции, не легко определяются при небольшом увеличении, затронуто примерно 1-10% общей ширины сустава субхондральной кости;

2 = Легкая = более многочисленные зоны резорбции, выраженная потеря субхондральной кости, затронуто примерно 11-25% общей ширины сустава субхондральной кости;

3 = Умеренная = явная резорбция субхондральной кости, затронуто примерно 26-50% общей ширины сустава субхондральной кости;

4 = Отчетливо выраженная = явная резорбция субхондральной кости, затронуто примерно 51-75% общей ширины сустава субхондральной кости;

5 = Сильная = деформация всего сустава из-за того, что затронуто примерно 76-100% общей ширины сустава субхондральной кости.

Коленные суставы животных с коллаген-индуцированным артритом типа II, гистопатологические данные:

[0098] Вышеизложенное обсуждение изобретения представлено для целей иллюстрации и описания. Вышесказанное не преследует цели ограничить изобретение формой или формами, описанными в настоящем документе. Хотя описание изобретения включает описание одного или нескольких вариантов реализации и определенные изменения и модификации, в рамки изобретения входят другие изменения и модификации, например, изменения, которые могут сделать специалисты благодаря своим навыкам и знаниям после понимания настоящего описания. Настоящая заявка предназначена для получения прав, которые включают в себя альтернативные варианты реализации в соответствии с законодательством, включая альтернативные, взаимозаменяемые и/или эквивалентные структуры, функции, диапазоны или этапы по отношению к структурам, функциям, диапазонам или этапам, изложенным в формуле изобретения, независимо от того, описаны ли такие альтернативные, взаимозаменяемые и/или эквивалентные структуры, функции, диапазоны или этапы в настоящем документе или нет, и не подразумевая публичного описания любого патентоспособного объекта.

Группа изобретений относится к медицине и может быть использована для лечения приобретенного расстройства, устойчивого к метотрексату, у субъекта. Для этого указанному субъекту, страдающему приобретенным расстройством, устойчивым к метотрексату, вводят фармацевтически эффективное количество композиции, которая содержит 10-пропаргил-10-деазааминоптерин или его фармацевтически приемлемые соли. Также предложен способ лечения субъекта, нуждающегося в лечении приобретенной неоплазии. Группа изобретений обеспечивает эффективное лечение приобретенных расстройств, устойчивых к метотрексату, у субъекта, таких как: неоплазии, ревматоидный артрит. 2 н. и 10 з.п. ф-лы, 20 ил., 6 табл., 2 пр.

1. Способ лечения приобретенного расстройства, устойчивого к метотрексату, у субъекта, включающий введение указанному субъекту, страдающему приобретенным расстройством, устойчивым к метотрексату, фармацевтически эффективного количества композиции, которая содержит 10-пропаргил-10-деазааминоптерин или его фармацевтически приемлемые соли.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанное расстройство представляет собой рак.

3. Способ по п. 2, отличающийся тем, что рак, подлежащий лечению, представляет собой рак предстательной железы, Т-клеточную лимфому, рак молочной железы, рак легких, гематологические злокачественные заболевания, рак головы и шеи, рак желудочно-кишечного тракта, рак яичников и остеосаркому.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанное расстройство представляет собой воспалительное расстройство.

5. Способ по п. 4, отличающийся тем, что указанное воспалительное расстройство представляет собой ревматоидный артрит.

6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанная композиция приготовлена для перорального введения.

7. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанная композиция приготовлена для внутривенного введения.

8. Способ лечения субъекта, нуждающегося в лечении приобретенной неоплазии, устойчивой к метотрексату, включающий введение указанному субъекту композиции, которая содержит эффективное количество 10-пропаргил-10-деазааминоптерина или его фармацевтически приемлемых солей.

9. Способ по п. 8, отличающийся тем, что указанное расстройство представляет собой рак.

10. Способ по п. 9, отличающийся тем, что рак, подлежащий лечению, представляет собой рак предстательной железы, Т-клеточную лимфому, рак молочной железы, рак легких, гематологические злокачественные заболевания, рак головы и шеи, рак желудочно-кишечного тракта, рак яичников и остеосаркому.

11. Способ по п. 8, отличающийся тем, что указанная композиция приготовлена для перорального введения.

12. Способ по п. 8, отличающийся тем, что указанная композиция приготовлена для внутривенного введения.