Способ получения полипептидов Советский патент 1982 года по МПК C07K1/04 C07K1/06 C07K5/103 A61K38/08 

(Б) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИПЕПТИДОВ

I

Изобретение относится к способу получения новых полипептидов - биологическиактивных соединений, которые могут быть применены в медицине.

Известен метод твердофазного сии- j теза, который широко используют в химии пептидов. Сущность метода состоит в присоединении С-концевой аминокислоты, синтезируемой пептидной цепи,- К твердому полимеру ковалентной свя- ю зью и последовательном присоединении остальных аминокислот ступенчато (одна за другой ) пока не будет собрана вся необходимая аминокислотная последовательность 1 .IS

Известен также метод, при котором синтезированный пептид удаляют с полимерной подложки и отщепляют оставшиеся защитные группы. Метод позволяет в процессе синтеза удалять побоч- ао ные продукты, избыток реагентов филь- трованием и отмывкой. В качестве носителя используют различные нерастворимые полимеры, содержащие в своей структуре функциональные группы, при- 26

годные для ковалентного присоединения первой защищенной аминокислоты, такие .как целлюлоза, поливиниловый спирт, полиметилметакрилат, сульфированный полистирол, хлорметилированный сополимер стирола и дивинйлбензола, бензгидриламинная смола и т.п.. Не вступающие в реакцию функциональные группы аминокислот, из которых строится пептидная цепь, блокируют, используя обычно применяемые в пептидной химии защитные группы, например третбутил оксикарбонильная, бензилоксикарбониль ная, бензильная и т. п. Деблокирование защитных групп конечной пептидной цепи осуществляют обычно с помощью отг носительно мягкой обработки защищенного пептида кислотой (например, трифторуксусной). Использование известных методов синтеза позволяет получит ь полипептид, обладэющий своеобразными фармакологическими свойствами С 2 ..Цель изобретения - получение ново-, го полипептида.

Поставленная цель достигается способом получения полипептидов общей формулы

R - Х- Lys - у - Gin - R, (1 )

X;

L Ala, OAla;

де

С1Г

Y:

dr, DAla, 2 Me Ala;

ег

R: Н, CHgCO, С„Н

,..

R: ОН, NH

2

заключающийся в том, что замещенный по аминогруппе L-глутамин присоедини- Ю

ют к нерастворимой полимерной смоле ковалентной связью предпочтительно в среде абсолютного этанола при удаляют oi-аминозащитную груплу от Lглутамина обработкой продукта присо- 15 единения аминокиЪлота-полимерная смола трифторукйусной кислотой, деблокированную аминогруппу L-глутамина подвергают взаимодействию с У-аминокислотой, защищенной по oi-аминогруппе, 20 используя предпочтительно карбодиимидный метод, после удаления о -аминозащитной группы обработкой трифторуксусной кислотой,продукт вводят во взаимодействие с L-лизином, защищенным по 25 о -аминогоуппе, .предпочтительно используя, карбодиимидный метод, полученную защищенную по oi-аминогруппе трипептидпрлимерную смолу деблокируют обработкой трифторуксусной кислотой и трипептид-полимерную смолу конденсируют с N-R-замещенной с Х-аминокислотой, защищенной по ее об-аминогруппе, предпочтительно используя карбодиимидный метод, обработкой .полученного продукта кислотой, если R-OH, или аммиаком в диметилформамиде, если R-MHg отщепляют пептидную цепь от смолы и защищенный пептид деблокируют обработкой трифторуксусной кислотой, и в случае использования бензгидриламиновой смолы (R-NH2) независимо от обработки продукта кислотой или аммиаком. Предпочтительным вариантом способа является использование в качестве полимерной смолы хлорметилированного полистиролдивинилбензола и бензгидрил аминовой смолы. Пример 1. При получении полипептида используют о-нитрофенидовый эфир Fтpeтбyтилoкcикapбoнил-L.-fлутамина, М-третбутилоксикарбонил-М-2-хлорбензилоксикар6онил-1-лизин, N-т рётбутилоксикарбонил-0-бензил-L-ceрин, № третбутилоксикарбонил-1-аланин В этих реагентах третбутилоксикарбонильная группа в дальнейшем будет обозначаться сокращенно как ВОС-группа. Реагенты для определения аминокислотной последовательности марки.Секвенал (Sequenal), а именно: дициклогексилкарбодиимид, флуорескамин и смола для твердофазного синтеза. Смола, использованная для синтеза, представляла собой хлорметилированную полистирол-дивинилбензольную смолу в виде гранул размером 200-(00 меш, сохлора на грамм смолы. Для получения полипептида 2 ммоль ci-BOC-L-глутамина этерифицируют 2 ммоль хлорметилированной смолы в среде абсолютного спирта., содержащего 1 ммоль триэтиламина, в течение 2 ч. при 80 С. Полученную смолу, содержащую остаток ВОС-глутамина, присоединенный к ней сложноэфирной связью, отделяют фильтрованием, промывают абсолютным спиртом и сушат до постоянного веса. Затем аналогичным образом присоединяют другие о -ВОС-аминокислоты1 которые сочетают с деблокированной oi-аминогруппой на конце пептидной цепи, связанной с полимерной подложкой (смолой), в надлежащей последовательности,.используя в качествеконденсирующего (сочетающего ) реагента эквивалентное количестдержащую 1 дивинилбензола-и 0,75 ммоль о дициклогексилкарбодиимида. В результате этой последовательности реакций был получен полипептид формулы (О, причем после каждой реакции сочетания отбирают аликвоту смо.г1ы, которую анализируют с помосцью флуорескамина на полноту протекания реакции и, если при этом обнаруживают положительную флуоресценцию, что свидетельствует о неполном сочетании, то реакцию сочетания повторяют с ToiJ же о(.-защищенной аминокислотой. 8 результате нескольких таких сочетаний получают промежуточный продукт - смолу, содержащую защищенный тетрапептид. Эту пептидсодержащую смолу расщепляют с одновременным удалением защитных групп в аппарате Kel-F, используя безводный фтористый водород при 0°С в течение 60 мин,в присутствии 1,2 мл анизола на грамм пептидсодержащей смопы. Реакционную смесь, содержащую пептидный продукт, промывают безводным диэтиловым эфиром и экстрагируют водной кислотой. Полученный экстракт лиофилизируют и высушенный таким образом пептид хроматографируют на Био-Геле Р-6 в 1 N уксусной кислоте. Полученный полипептид имеет степень чистоты, характеризуется аминокислотной последовательностью

Н - Ala - Lys - Ser - Glu - ОН

Для идентификации используют тонкослойную хроматографию и электрофо- 5 рез, при которой тонкослойную хроматографию проводят на пластинках с тонким слоем силикагеля (силикагель компании Бринкман с флуоресцентным индикато- , ром) толщиной 0,1 мм. Пластинки разме- ром см. Хроматографирование проводят с использованием 30 мкг образца исследуемого пептидного продукта и следующих элементов

Rfн-бутанол: пиридин: уксусная 5 кислота: вода 30:15:3:12

frf этилацетат:пиридин:уксусная;кислота:вода 5:5:1:3

R этилацетат:н-бутанол:уксусная кислота: вода 1:1:1:1.20

Электроферетическое исследование проводят на образце весом 100 мкг с использованием 3 миллиметровой Ватмановской бумаги (11,,5 см) и пиридин-ацетатного буферного раствора с 5 рН . Электрофорез осуществляют при Для идентификации и доказательства гомогенности полученных пептидов использованы тонкослойная хроматография и электрофорез, которые проводят следующим образом: для тонкослойной хроматографии использованы образцы продуктов весом 20 мкг, хроматографию проводят на пластинках с тонким слоем силикагеля (Кизельгель фирмы Мерк, ФРГ, размер пластинок см), используя в качестве элюента систему растворителей: н-бутанол-уксусная кис лота - этилацетат-вода в объемном отношении 1:1:1:1, а также на пластинках с тонким слоем целлюлозы марки

наг1ряжении 1000 В в течение одного часа. Для опрыскивания тонкослойных хроматографических пластинок и электрофореграмм используют реагент Паули и раствор нингидрина. В итоге получают следующие резульУаты: | Ri вещест52-1

во осталось на старте, R вещество осталось на старте и R О,336.Электрофорез в указанных условиях приводит к перемещению вещества на , см по направлению к катоду.

Примеры II-W.

Использу)Ч способ, аналогичный вышеописанному, для получения замещен ных полипептидов, синтезирован ряд полипептидов общей формулы

R - )С - Lys -Y - Glu - R

Эти пептиды получают твердофазным методом, с использованием в качестве твердой полимерной подложки бензгидриламинной смолы.

Результаты получения этих пептидов представлены в табл. 1. Таблица 1 боб (производства фирмы Истмен Кодак, размером 20jC20 см) и использованием в качестве элюента системы растворителей н-бутанол-пиридин-уксусная кислота-вода в отношении 15:10:3-12 (Rj). Электрофорез проводят на образцах весом 50 мкг, которые наносят на бумагу Ватман Н 3 (размер листа $5 см), используя пиридин-ацетатный буферный раствор и разность потенциалов между электродами 1000 В; электрофорез в этих условиях продолжают в течение 1 ч. Для опрыскивания тонкослойных хроматограмм и электрофоретограмм с целью проявления пятен используют реагент Паули и раствор нингидрина.

Результаты получения представлены в таб/1. 2 (величины Rf и пробег вев результате использования аналогичных методик тонкослойной хроматографии и электрофореза для исследования пептидного соединения, полученного в примере IV было показано, что для него свойственны следующие характеристики: R (0,155J, R| вещество остается .на старте, R| 0,2б5; при электрофорезе в указанных выше условиях вещество перемещается от старта на расстояние 13,1 см по направлению к катоду. Примеру. Тетрапептидсодержащие смолы, имеющие защищенные остатки лизина и серина, полученные, какописяно в примерах I и Н,, ацилируют уксусным ангидридом в соответствующих условиях, после чего удаляют защитные группы и отщепляют полимерную подложку. В итоге получают следующие ацилированные производные . еНчСО - Ala - Lys - Ser - Gin - ОН f .- г . . CH; CO-Sar - Lys-Sar- Gin - OH Приме p VI. Защищенные тетрапептид ные смолы,полученные,как описано в примерах I и I I ,переэтерифицируют сметила том натрия а метиловом спирте в условиях обеспечивающих протекание реакции переэтерификации, приводящей к отщеплению пептидных продуктов от полимерной подложки. Последующее удаление защитных групп от полученных продуктов переэтерификации приводит к получению этерифицированных пептидных производных, соответствующих формулам

ществ при электрофорезе приведены от носительно тех же величин для эталонного пептида H-Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-ОН).

Таблица2 Н - Ala - Lys - Ser - GlnOCH Н - Sar - Lys - Sar - GlnOCHj. П p и M e p VI I. Тетрапептидсодержащие смолы, имеющие защищенные остатки лизина и серина, и полученные, как описано в примерах I и 11, подвергают обработке диэтиламином с целью отщепления защищенных пептидов от твердой полимерной подложки в условиях, обычных для проведения реакций такого рода. Последующее удаление защитных . групп приводит к получению следующих диэтиламидных производных указанных пептидов Н -Ala- Lys-Ser- G1,n,-H {CjHj) H-Sar-Lys - Sar-Gin -HCCgHj). П p и M e p VI I. Используя методы, описанные в примерах I и f, но замещая Ы-концевые остатки аланина и серина этильными группами, на заключительном этапе пептидного синтеза вместо защищенный аланина и сарколизина в реакцию сочетания вводят эквивалентные количества соответствующим образом защищенных N-oi-этил-L-aлaнинa или Н-Ы-этил-сарколизина, в результате чего получают следующие N-этилированные пептиды С2Н5-Ala- Lys - Ser- Gin - ОН С. - Lys - Sar - Gin - OH. П p и M e p IX. От1Деплен1ие защищенных тетрапептидов, полученных в примере VIII от смолы с использованием раствора аммиака в диметилформамиде в условиях, обычных для проведения реакции амидирования, с последующим

998

удалением защитных групп приводит к получению амидов соответствующих N- } этилированных пептидов

CjiHy - Ala - Lys - Ser - Gl n - NH,.

CjHy-Sar-Lys-Sar - Gin - NHj

П p им ер X, Защищенные ацетилированные тетрапептидные смолы, полученные в примере V, подвергают обработке раствором аммиака в диметилфор.мамиде в условиях, обычных для проведения реакций амидирования, и после удаления защитных групп получают следующие амиды пептидов

CHjCO - Ala - Lys - Ser - - NH,;,.

CH CO-Sar-Lys-Sar- Gin - NH2

Приме p Ы XI-XXVI. использовании совокупности реакций и методов, описанных выше, для удлинения пептидной цепи, получены следующи е полипептиды, замещенные по , концевым амино- и карбоксильным группам радикалами R и RR-Ala-Lys-Ser-Gin-R, где R и R обозначают заместители при аминокислотных остатках, приведенные в табл. 3 Таблица 3

Используя методики проведения тон,кослойной хроматографии и электрофореза, описанные в примерах II и III для соединения примера XXII получены следующие характеристики: ,23 R2 0,25, электрофоретическая миграция (перемещение) по направлению к катоду 0,88.

..10

Продолжение табл. 3

inj-i :::..j..,...

,

р,

H

Gly

H

Gly-Gly

H

Gly-Gly-Sar .

H Gly-Gly-Ser-Asn

Gin Gly

CIn

Gly-Gly

Gin Gly-Gly-Ser

Sar Gly

Sar

.. Gly-Gly

Sv Gly-Gly-Ser

Sar Gly-Gly-Ser-Asn

Gin Gly-Gly-Ser-Asn

Анализируя полученные пептидные прюдукты методами тонкослойной хроматографии и электрофореза, при использовании соответствующих методик, описанных к Т1римере I )ля соединений, описанных в примерах XI и Х11.

Полученные результаты представле55 -ны в табл. k.

Таблица

Формула изобретения

1 Способ-получения полипептидов об.щей формулы

R - X - Lys -Y - G1 n - R, где X - Sar, L-Ala,

55

Y - Ser, Sar, D-Ala, ZMeAla;. R - H, CHjCO, OH, NH2,

1198061512

отличающийся тем, что за- ногруппе, предпочтительно используя мещенный по аминогруппе {.гяутамин карбодиимидный метод; обработкой поприсоединяют к нерастворимой полимер- лученного продукта кислотой, если Rной смоле ковалентной связью предпоч- ОН, или аммиаком в диметилформамиде, тительно в среде абсолютного этанола 5 бсли R- Ш, отщепляют пептидную цепь при , удаляют ot-аминозащитную от смолы и деблокируют защищенный пепгруппу от L-глутамина обработкой про- тид обработкой трифторуксусной кисло.дукта присоединения аминокислота-по- той и в случае использования бензгидлймерная смола трифторуксусной кисло- риламиновой смолы ( R- NHg) независитой, деблокированную аминогруппу L- Ю мо от обработки продукта кислотой или глутамина подвергают взаимодействию аммиаком.

с У-аминокислотой, защищенной по об- 2. Способ поп. 1,отличаюаминогруппе, используя предпочтитель- щ и и с я тем, что в качестве полимерно карбодиимидный метод, после удале- ной смолы используют хлорметилированния ot-аминозащитной группы обработкой 5 ный полистирол дивинилбензола и бензтрифторуксусной кислотой, продукт вво- гидриламиновую смолу. дят во взаимодействие с L-лизином,Источники информации,

защищенным по ot-аминогруппе, предпоч- принятые во внимание при экспертизе тительно используя карбодиимидный ме- 1. Шредер 3., Любке К.Пептиды. Ч. I, тод, полученную защищенную по о -амино-20 М., Мир, 19б7, с. 398. группе трипептид-полимерную смолу де- 2. Horiki К., tgano К,, Inonye К. блокируют обработкой трифторуксусной Synthesis of the Merrifield Resin esКИСЛОТОЙ и трипептид-полимерную смо- ters of N-protected amino acids with ЛУ конденсируют с N-R-замещенной Х- the aid of Hydrogen bouding. Chem. аминокислотой, защищенной по ее о -ами-25 Letters, 1978, с. 165.