НАБОР ВЫСОКОСПЕЦИФИЧНЫХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫХ ПРАЙМЕРОВ И ЗОНДОВ ДЛЯ ДЕТЕКЦИИ И ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ВИРУСОВ АЧС, КЧС И ВД Российский патент 2024 года по МПК C12Q1/68 

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, к современным молекулярно-генетическим методам исследования, а именно, к детекции и дифференциации маркерных участков ДНК вируса африканской чумы свиней и маркерных участков кДНК вирусов классической чумы свиней и вирусной диареи крупного рогатого скота в полимеразной цепной реакции с обратной транскрипции в реальном времени.

Африканская чума свиней (АЧС) - это высококонтагиозное заболевание домашних и диких свиней, вызываемое единственным вирусом-представителем семейства Asfarviridae с двуцепочечной ДНК и имеющим капсидную оболочку. Характерными клиническими признаками являются: лихорадка, цианоз кожи, обширные геморрагии во внутренних органах. Данное заболевание не опасно для человека, однако является разрушительным для свиноводства и сельского хозяйства в целом. Источник возбудителя инфекции - больные животные и вирусоносители. Заражение здоровых свиней происходит при совместном содержании с инфицированными вирусоносителями. Факторы передачи возбудителя - корм, пастбища, транспортные средства, загрязненные выделениями больных животных [1,4]. На данный момент коммерчески доступных вакцин нет, поэтому наличие антител в сыворотке и обнаружение генома вируса в биологических образцах и продуктах свиноводства, является окончательным индикатором возбудителя инфекции. В связи с этим борьба с АЧС основана на ранней диагностике и соблюдении строгих санитарных мер.

Дифференциальная диагностика АЧС в первую очередь включает в себя исключение болезней, для которых также как и для АЧС характерны лихорадка, поражения кожных покровов. Наиболее значимыми являются: классическая чума свиней, рожа свиней, сальмонеллез, болезнь Ауески, дерматит с синдромом нефропатии свиней. По клиническим и патологоанатомически признакам АЧС и КЧС неразличимы, поэтому обязательна лабораторная диагностика для постановки диагноза. Также необходимо отметить, что дифференциация АЧС от классической чумы свиней методом ПЦР может быть затруднена ввиду высокой генетической схожести патогена данного заболевания с вирусом вирусной диареи КРС из рода Pestivirus, семейства Flaviviridae [3].

Несмотря на распространенность серологических методов при диагностике АЧС, КЧС и вирусной диареи КРС, полимеразная цепная реакция (ПЦР) выделяется как наиболее оперативный, точный и широко применяемый метод по всему миру. [2].

Изобретение касается набора олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченных зондов для детекции и дифференциации вирусов африканской чумы свиней, классической чумы свиней и вирусной диареи крупного рогатого скота:

Вирус африканской чумы свиней:

1. f-5'-CCGTAACTGCTCATGGTATCAATCTTATCG-3';

r-5'-CAAAGCAAAGGTAATCATCATCGCA-3';

зонд 5'-AGCTCTTACATACCCTTCCACTACGGAGGCA-3'.

2. Вирус классической чумы свиней:

f-5'- TCCCTGGGTGGTCTAAGTCCTGAGTA-3';

r-5'- CGCTAGGGTTAAGGTGTGTCTTGGG-3';

зонд 5'- TCGAGATGCTATGTGGACGAGGGCAT.

3. Вирус вирусной диареи крупного рогатого скота:

f-5'- CTAGCCATGCCCTTAGTAGGACTAGCAT -3';

r-5'- GAACCACTGACGACTACCCTGTACTCAG -3';

зонд 5'- CAACAGTGGTGAGTTCGTTGGATGGCTTA-3'.

В качестве источника флуоресценции на 5' конце зондов применяются красители: ROX для вируса АЧС, FAM для вируса КЧС, R6G для вируса вирусной диареи КРС, а для тушения флуоресценции на 3' конце BHQ-2, BHQ-1 и BHQ-2 соответственно.

При тестировании пробы на наличие маркерных участков ДНК и кДНК вышеуказанных патогенов учитывают:

- пересечение, кривой флуоресценции, пороговой линии с праймерами на геном вируса свидетельствует о наличии в образце маркерных участков ДНК или кДНК патогена (один или несколько из перечисленных выше видов);

- отсутствие пересечения, кривой флуоресценции, пороговой линии для всех систем праймеров свидетельствует об отсутствии маркерных участков ДНК или кДНК вирусов в исследуемом материале.

Изобретение может быть использовано в лабораторной диагностике для индикации маркерных участков ДНК вируса АЧС и кДНК вирусов КЧС и ВД КРС в пробах патологического материала.

Технический результат от предлагаемого изобретения заключается в разработке современной, высокоспецифичной и высокочувствительной тест-системы, предназначенной для индикации маркерных участков ДНК и кДНК выявляемых вирусов в полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией в режиме реального времени.

Сущность изобретения в высокоспецифичной идентификации и дифференциации маркерных участков ДНК вируса АЧС и кДНК вирусов КЧС и ВД КРС методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией в режиме реального времени при одном термическом профиле в одной пробирке, праймеры подобраны таким образом, чтобы минимизировать конкуренцию между ними во время амплификации.

Для разработки праймеров из базы данных GenBank были взяты полногеномные последовательности классической чумы свиней, вируса вирусной диареи КРС I и II генотипов; участок p72 гена B646L и полная последовательность вируса африканской чумы свиней. Выравнивание последовательностей производилось в программе Ugene v.49.1, далее визуально оценивали консервативные участки с последующим BLAST-анализом. Специфичность каждого участка составляет более 99%. Далее в программе VectorNTI91, в соответствии с единым термическим профилем, был получен ряд праймеров. В результате проведения контрольного BLAST-анализа была получена оптимальная комбинация праймеров и зондов, которые показывают высокую специфичность и возможность амплификации при одном термическом профиле.

ОТ-ПЦР-РВ проводится в одну стадию с использованием ПЦР смесей, общий объем реакционной системы 25 мкл, включая следующее: 12,5 мкл буферный раствор для ПЦР с обратной транскрипцией, 0,5 мкл Taq-ДНК-полимераза, 0,5 мкл каждого праймера и зонда в концентрации 25пмоль/л. Параметры амплификации были следующими: обратная транскрипция при 42°С в течение 5 мин, пред денатурация при 95°С в течение 10 с, 40 циклов денатурации при 95°С в течение 5 с, отжиг и удлинение при 56°С в течение 34 сек. Флуоресцентные сигналы определяли в конце каждого цикла.

Результаты интерпретируют на основании наличия или отсутствия пересечения кривой флуоресценции с пороговой линией, что соответствует наличию или отсутствию значения порогового цикла «Ct» в соответствующей графе в таблице результатов реакции, выведенной в результате машинного анализа.

Образец считается положительным, если значение «Ct» не более 35 Однако в случае, если значение «Ct» для проб находится в пределах от 30 до 37, необходимо повторить реакцию с этапа выделения ДНК или РНК, с целью подтвердить или опровергнуть наличие нуклеиновой кислоты искомого вируса в исследуемой пробе.

Образец считается отрицательным на наличие маркерной ДНК или кДНК, если для него значение «Ct» отсутствует или более 37.

Таким образом, изобретение может быть использовано в ветеринарной практике для индикации и дифференциации генетического материала вирусов АЧС, КЧС и ВД КРС в патологических образцах для постановки и уточнения диагноза, для своевременного выявления зараженных животных и проведения соответствующих мер по борьбе с распространением диагностируемых таким образом болезней.

Для оценки специфичности набора в качестве положительного контроля использовали плазмидные ДНК с клонированными нуклеотидными последовательностями вирусов АЧС, КРЧ и ВД КРС.

Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента РФ на «Набор высокоспецифичных олигонуклеотидных праймеров и зондов для детекции и дифференциации вирусов африканской чумы свиней, классической чумы свиней и вирусной диареи крупного рогатого скота»:

1. Гнездилова Л. А. и др. МОНИТОРИНГ И СПОСОБЫ ДИАГНОСТИКИ И ПРОФИЛАКТИКИ ИНФЕКЦИОННЫХ БОЛЕЗНЕЙ ЖИВОТНЫХ //Вакцины нового поколения для профилактики особо опасных болезней сельскохозяйственных животных. - 2023. - С. 36-50.

2. Мельникова П.С., Горячева М.М. ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА АФРИКАНСКОЙ ЧУМЫ СВИНЕЙ // Вестник науки. 2023. №5 (62).

3. De Oliveira L.G., Mechler-Dreibi M.L., Almeida H.M.S., Gatto R.H.I. Bovine viral diarrhea virus: Recent findings about its occurrence in pigs. Viruses. 2020;12:600. doi: 10.3390/v12060600.

4. Zhang C, Li S, Zhang M, Li Y, Gimenez-Lirola LG, Li B and Li W (2023) Editorial: Diagnostics and detection of African swine fever virus. Front. Vet. Sci. 10:1195138. doi: 10.3389/fvets.2023.1195138.

This XML file does not appear to have any style information associated with it. The document tree is shown below.

--->

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="Набор высокоспецифичных

олигонуклеотидных праймеров и зондов для детекции и дифференциации вирусов АЧС,

КЧС и ВД.xml" softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="2.3.0" 

productionDate="2024-09-03">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>2024115680/10(035203)</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2024-06-07</FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<EarliestPriorityApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>2024115680/10(035203)</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2024-06-07</FilingDate>

</EarliestPriorityApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode="ru">Федеральное государственное бюджетное

образовательное учреждение высшего образования "Казанская государственная

академия ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана"</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>Federal State Budgetary Educational Institution of Higher

Education "Kazan State Academy of Veterinary Medicine named after N.E.

Bauman"</ApplicantNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Набор высокоспецифичных олигонуклеотидных

праймеров и зондов для детекции и дифференциации вирусов АЧС, КЧС и

ВД</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>9</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>30</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..30</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q2">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>African swine fever virus</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ccgtaactgctcatggtatcaatcttatcg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>25</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..25</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q4">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>African swine fever virus</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>caaagcaaaggtaatcatcatcgca</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="3">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>31</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..31</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q6">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>African swine fever virus</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>agctcttacatacccttccactacggaggca</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="4">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>26</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..26</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q8">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Pestivirus C</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>tccctgggtggtctaagtcctgagta</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="5">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>25</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..25</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q10">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Pestivirus C</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>cgctagggttaaggtgtgtcttggg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="6">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>26</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..26</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q12">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Pestivirus C</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>tcgagatgctatgtggacgagggcat</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="7">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>28</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..28</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q14">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Pestivirus A</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ctagccatgcccttagtaggactagcat</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="8">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>28</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..28</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q16">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Pestivirus A</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gaaccactgacgactaccctgtactcag</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="9">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>29</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..29</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q18">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Pestivirus A</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>caacagtggtgagttcgttggatggctta</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к биотехнологии в области ветеринарной вирусологии, а именно к диагностическим средствам молекулярной биологии. Подобраны высокоспецифичные олигонуклеотидные праймеры и флуоресцентно-меченые зонды для детекции и дифференциации маркерных участков ДНК вируса африканской чумы свиней и кДНК вирусов классической чумы свиней и вирусной диареи КРС в реакции полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией в реальном времени. Изобретение расширяет арсенал средств для диагностики и дифференциальной диагностики в ветеринарной вирусологии.

Набор для амплификации и детекции маркерных участков ДНК и кДНК вирусов африканской чумы свиней, классической чумы свиней и вирусной диареи крупного рогатого скота, включающий олигонуклеотидные праймеры и флуоресцентно-меченые зонды:

праймеры и зонд для вируса африканской чумы свиней:

1. f-5’-CCGTAACTGCTCATGGTATCAATCTTATCG-3’;

2. r-5’-CAAAGCAAAGGTAATCATCATCGCA-3’;

3. зонд 5’-AGCTCTTACATACCCTTCCACTACGGAGGCA-3’,

праймеры и зонд для вируса классической чумы свиней:

4. f-5’- TCCCTGGGTGGTCTAAGTCCTGAGTA-3’;

5. r-5’- CGCTAGGGTTAAGGTGTGTCTTGGG-3’;

6. зонд 5’- TCGAGATGCTATGTGGACGAGGGCAT-3’,

праймеры и зонд для вируса вирусной диареи крупного рогатого скота:

7. f-5’- CTAGCCATGCCCTTAGTAGGACTAGCAT -3’;

8. r-5’- GAACCACTGACGACTACCCTGTACTCAG -3’;

9. зонд 5’- CAACAGTGGTGAGTTCGTTGGATGGCTTA-3’.