Способ количественной оценки литической активности бактериофагов Российский патент 2025 года по МПК C12Q1/70 

Изобретение относится к медицине, а именно к микробиологии, и может применяться для определения чувствительности микроорганизмов к бактериофагам при проведении диагностических исследований.

В настоящее время во всем мире отмечается возрастание резистентности бактерий к антибактериальным препаратам, а разработка новых препаратов идет крайне медленно. Особенно существенной угрозой являются не только высоковирулентные возбудители классических заразных заболеваний, сколько возбудители оппортунистических и нозокомиальных (госпитальных) инфекций. В связи с этим встает вопрос о поиске и внедрении в практическое здравоохранение новых средств для борьбы с возбудителями гнойно-септических заболеваний, включая госпитальные инфекции.

Бактериофаги, это альтернатива для пациентов, имеющих противопоказания к лечению антибиотиками, поэтому очень важно знать для этой категории больных возможность их применения. В эту группу входят пациенты с непереносимостью антибиотиков, с аллергией на антибиотики, при антибиотик-ассоциированной диарее, беременные, новорожденные.

Существует общепринятый метод определения чувствительности микроорганизмов к бактериофагам - «Метод стерильного пятна». Метод выполняется на плотных питательных средах. Степень активности бактериофага определяется по величине зоны лизиса («Рациональное применение бактериофагов в лечебной и противоэпидемиологической практике» Федеральные клинические рекомендации. - Москва, 2014, с. 12-15).

Недостатком данного метода является длительность проведения исследования - до 24 часов, а также оценка литических свойств микроорганизмов в «крестах», что является очень субъективной оценкой.

Существует экспресс-метод определения чувствительности грамотрицательных бактерий к бактериофагам. (Патент РФ 2785461, МПК G01N 33/00, опубл. 2022). Предложенный метод предусматривает внесение в питательную среду инокулята бактерии и исследуемые жидкие препараты бактериофага. Через 2,5-3 часа термостатирования при t 36,8°С рассматривают под микроскопом с увеличением не менее 400 крат с последующим подсчетом в поле зрения микроскопа количества выросших микроколоний грамотрицательных бактерий, которое сравнивают с количеством микроколоний в образце без бактериофага. Далее рассчитывают коэффициент по предлагаемой формуле, по значению которого судят о степени чувствительности. Если значение коэффициента больше или равно 10, микроорганизм чувствителен к бактериофагу, если в интервале от 2 до 10 - слабо чувствителен, если меньше 2 - не чувствителен.

Однако предложенный метод имеет существенный недостаток. Он рассчитан на определение чувствительности к бактериофагу грамотрицательных бактерий, а возбудителями гнойно-воспалительных заболеваний могут быть и грамположительные бактерии, а также медленно растущие, которые не дадут микроколонии через 2,2-3 часа.

Наиболее близким способом определения чувствительности микроорганизмов к бактериофагу является способ количественной оценки литической активности бактериофагов (Патент РФ 2587636, МПК C12Q 1/70, опубл. 2016), включающий приготовление бактериальной суспензии суточной культуры микроорганизма, соединение с мясо-пептонным бульоном и специфическим бактериофагом, оценку литической активности бактериофагов осуществляют по значению оптической плотности, а именно, по среднему значению многократных измерений оптической плотности с вычетом оптической плотности фона реакции взаимодействия компонентов.

На исследование одной культуры микроорганизма (включая контроли) отводится 8 лунок одного ряда, т.е. испытуемый микроорганизм и специфический бактериофаг исследуют пятикратно. После термостатирования в течении 18-24 часов при 37°С измеряют оптическую плотность на фотометре микропланшетного формата при длине волны 450/620 нм. Показатель литической активности (ЛА) рассчитывают по формуле: вычисляют среднее значение пяти показателей оптической плотности (ОП средняя) и вычитают оптическую плотность фона (ОП фона) среды. Испытуемый микроорганизм оценивают как чувствительный к бактериофагу при значении показателя ЛА не более 0,045±0,025, при этом значение ОП фона (контроль роста) должен превышать ОП (средняя) в 2 раза, при значении выше указанного - микроорганизм считают устойчивым к исследуемому бактериофагу.

Недостатком этого способа является то, что его применение не позволяет получить результат ранее 18-24 часов, а использование пятикратных повторов увеличивает время проведения преаналитического этапа, кроме того не обеспечивается достаточная точность результатов, поскольку определяются в больших интервалах значения чувствительности и устойчивости микроорганизма к бактериофагу.

Задачей предлагаемого изобретения является устранение указанных недостатков, повышение точности определения литической активности при одновременном сокращении сроков получения результата, за счет более точно подобранного соотношения компонентов исследуемой смеси, времени проведения исследования и режима ее подготовки.

Для достижения результата в заявленном способе количественной оценки литической активности бактериофагов, включающем приготовление бактериальной суспензии суточной культуры микроорганизма, соединение с мясо-пептонным бульоном и специфическим бактериофагом, оценку литической активности бактериофагов, которую осуществляют по значению оптической плотности, предложено микроорганизм в мясо-пептонном бульоне брать в концентрации 10⁵ КОЕ/мл, а соотношение этой смеси со специфическим бактериофага выбирать как 2:1. При этом оптическую плотность фиксируют в начале исследования и через 6 часов, и при определении соотношения этих показателей в пределах более или равно 10 оценивают бактериофаг как литический, при определении значения соотношения этих показателей в пределах от 5 до менее 10 оценивают бактериофаг как слаболитический, при значении менее 5 определяют отсутствие литической активности.

То, что предложено указанное время проведения исследования, является достаточным для получения точных данных, сокращает время проведения исследований, что является крайне важным для принятия решения по лечению пациентов. Способ дает объективную количественную оценку степени литической активности к клиническому штамму микроорганизма у конкретного пациента. Способ прост в постановке реакции, не требует дополнительных обучающих навыков, не требует дополнительного оборудования, т.к. микропроцессоры или иммуноферментный анализатор присутствует во всех лабораториях лечебно-профилактических учреждениях.

Метод надежен в исполнении, что проверено при сравнении с утвержденным методам «Метод слепого пятна» («Рациональное применение бактериофагов в лечебной и противоэпидемиологической практике» Федеральные клинические рекомендации. - Москва, 2014).

Соотношение 2:1 смеси мясо-пептонного бульона с микроорганизмов в концентрации 10⁵ КОЕ/мл и со специфическим бактериофагом было получено эмпирическим путем.

Способ осуществляется следующим образом.

Для приготовления рабочей суспензии используют суточную культуру исследуемого микроорганизма. Микробную массу чистой суточной культуры берут бактериологической петлей с плотного агара и переносят в пробирку с 4,5 мл стерильного физиологического раствора и тщательно гомогенизируют. Плотность инокулята доводят стерильным физиологическим раствором до 0,5 ЕД по МакФарланду, что соответствует 1,5 10⁸ КОЕ/мл. Для проведения исследования в 2 лунки стерильного планшета и добавляют 50 мкл мясо-пептонного бульона и 50 мкл исследуемой суточной культуры (концентрация рабочей смеси составляет 10⁵ КОЕ/мл). Затем в первую лунку добавляют 50 мкл специфического бактериофага (таким образом получая соотношение 2: 1), во вторую (контроль) 50 мкл стерильного физиологического раствора (таким образом, соотношение также 2: 1) и измеряют оптическую плотность ОП-1 на фотометре микропланшетного формата (при проведении нефелометрии).

Планшет ставят в термостат на 6 часов при 37°С. По окончании инкубации повторно измеряют оптическую плотность ОП-2. Показатель литической активности ЛА рассчитывают по разнице соотношения между первым и вторым показателем ОП: ЛА=ОП-1: ОП-2.

Если разница в показателях составляет 10 и выше, то бактериофаг обладает высокой литической активностью, а микроорганизм чувствителен к бактериофагу, если разница в показателях равна 5, но менее 10 - оценивают бактериофаг как слаболитический (слабая чувствительность), без динамики и ниже 5 - определяют отсутствие литической активности (не чувствителен).

Осуществление способа показано на конкретных клинических примерах.

Пример 1

Пациент А., 47 лет. Находится в отделении хирургии с диагнозом «острый холецистит» При проведении хирургического вмешательства осуществили забор раневого отделяемого с последующим микробиологическим исследованием. Было проведено исследование литической активности выделенного клинического штамма микроорганизма по предлагаемому способу. При этом определяли литическую активность бактериофага «Секстофаг» в отношении клинического штамма микроорганизма Staphylococcus aureus, выделенного из раны.

Результаты исследований. ОП1=1,431; ОП2=0,062. ЛА=ОП1:ОП2=23.

Заключение: литическая активность высокая, рекомендовано использовать как противомикробный препарат «Секстофаг».

Через 5 дней результат лечения признан как удовлетворительный.

Пример 2

Пациент Р., 60 лет. Находится в отделении хирургии с диагнозом «Флегмона шеи». При проведении хирургического вмешательства осуществили забор раневого отделяемого с последующим микробиологическим исследованием. Было проведено исследование литической активности выделенного клинического штамма микроорганизма по предлагаемому способу. При этом определяли литическую активность бактериофага «Секстофаг» в отношении клинического штамма микроорганизма Staphylococcus aureus, выделенного из раны.

Результаты исследований ОП1=1,02; ОП2=0,102. ЛА=ОП1:ОП2=10.

Заключение: литическая активность высокая, рекомендовано использовать как противомикробный препарат «Секстофаг».

Через 10 дней результат лечения признан как удовлетворительный.

Пример 3

Пациент Ф., 21 год. Находится в отделении хирургии с диагнозом «Митральный порок сердца»». При проведении хирургического вмешательства осуществили забор мочи с последующим микробиологическим исследованием. Было проведено исследование литической активности выделенного клинического штамма микроорганизма по предлагаемому способу. При этом определяли литическую активность бактериофага «Секстофаг» в отношении клинического штамма микроорганизма Staphylococcus aureus, выделенного из крови.

Результаты исследования. ОП1=1,812; ОП2=0,206. ЛА=ОП1:ОП2=8,8.

Заключение. Культура слабо чувствительна к бактериофагу, не рекомендовано использовать как противомикробный препарат.

Пример 4

Пациент В., 61 год. Находится в отделении урологии с диагнозом «Нефролитиаз». При проведении хирургического вмешательства осуществили забор мочи. При этом определяли литическую активность бактериофага «Секстофаг» в отношении клинического штамма микроорганизма Staphylococcus aureus, выделенного из мочи по предлагаемому способу.

Результаты исследований ОП1=1,353; ОП2=0,275. ЛА=ОП1:ОП2=5.

Оценивают бактериофаг как слаболитический, т.е. культура слабо чувствительна к бактериофагу, не рекомендовано использовать как противомикробный препарат.

Заключение: литическая активность не высокая, не рекомендовано использовать как противомикробный препарат «Секстофаг».

Пример 5

Пациент В., 41 год. Находится в отделении терапии с диагнозом «Пневмония». Осуществили забор мокроты с последующим микробиологическим исследованием. Было проведено исследование литической активности выделенного клинического штамма микроорганизма по предлагаемому способу. При этом определяли литическую активность бактериофага «Секстофаг» в отношении клинического штамма микроорганизма Staphylococcus aureus, выделенного из мочи по предлагаемому способу.

Результаты исследований ОП1=1,253; ОП2=1,008. ЛА=ОП1:ОП2=1,24.

Определяют отсутствие литической активности, культура не чувствительна к бактериофагу, не рекомендовано использовать как противомикробный препарат.

Заключение: литическая активность отсутствует, не рекомендовано использовать как противомикробный препарат «Секстофаг».

Контроль: показатель ОП первого исследования 1,2766, второго 2,0220, культура жизнеспособна.

Пример 6

Пациент Ф., 30 лет. Находится в отделении хирургии с диагнозом «Хронический панкреатит». При проведении хирургического вмешательства осуществили забор раневого отделяемого с последующим микробиологическим исследованием. Было проведено исследование литической активности выделенного клинического штамма микроорганизма по предлагаемому способу. При этом определяли литическую активность бактериофага «Бактериофаг клебсиелл поливалентный очищенный», в отношении клинического штамма микроорганизма Klebsiella pneumonia, выделенного из раны по предлагаемому способу.

Результаты исследования. ОП1=1,331; ОП2=0,101. ЛА=ОП1:ОП2=13. Заключение. Литическая активность высокая, рекомендовано использовать как противомикробный препарат.

Через 10 дней результат лечения признан как удовлетворительный.

Пример 7

Пациент А., 35 лет. Находится в отделении хирургии с диагнозом «Кишечный свищ». При проведении хирургического вмешательства осуществили забор раневого отделяемого с последующим микробиологическим исследованием. Было проведено исследование литической активности выделенного клинического штамма микроорганизма по предлагаемому способу. При этом определяли литическую активность бактериофага «Бактериофаг клебсиелл поливалентный очищенный», в отношении клинического штамма микроорганизма Klebsiella pneumonia, выделенного из раны по предлагаемому способу.

Результаты исследования. ОП1=0,930; ОП2=0,093. ЛА=ОП1:ОП2=10.

Литическая активность высокая, рекомендовано использовать как противомикробный препарат.

Через 7 дней результат лечения признан как удовлетворительный.

Пример 8

Пациент А., 55 лет. Находится в отделении хирургии с диагнозом «Нагноение раны». При проведении хирургического вмешательства осуществили забор раневого отделяемого с последующим микробиологическим исследованием. Было проведено исследование литической активности выделенного клинического штамма микроорганизма по предлагаемому способу. При этом определяли литическую активность бактериофага «Бактериофаг клебсиелл поливалентный очищенный», в отношении клинического штамма микроорганизма Klebsiella pneumonia, выделенного из раны по предлагаемому способу.

Результаты исследования. ОП1=1,353; ОП2=0,275. ЛА=ОП1:ОП2=5.

Культура слабо чувствительна к бактериофагу, не рекомендовано использовать как противомикробный препарат.

Пример 9

Пациент А., 55 лет. Находится в отделении хирургии с диагнозом «Нагноение мягких тканей». При проведении хирургического вмешательства осуществили забор раневого отделяемого с последующим микробиологическим исследованием. Было проведено исследование литической активности выделенного клинического штамма микроорганизма по предлагаемому способу. При этом определяли литическую активность бактериофага «Бактериофаг клебсиелл поливалентный очищенный», в отношении клинического штамма микроорганизма Klebsiella pneumonia, выделенного из раны.

Результаты исследования. ОП1=0,675; ОП2=0,075. ЛА=ОП1:ОП2=9.

Заключение, оценивают бактериофаг как слаболитический, культура слабо чувствительна к бактериофагу, не рекомендовано использовать как противомикробный препарат.

Пример 10

Пациент А., 55 лет. Находится в отделении хирургии с диагнозом «Холецистит». При проведении хирургического вмешательства осуществили забор крови с последующим микробиологическим исследованием. Было проведено исследование литической активности выделенного клинического штамма микроорганизма по предлагаемому способу. При этом определяли литическую активность бактериофага «Бактериофаг клебсиелл поливалентный очищенный», в отношении клинического штамма микроорганизма Klebsiella pneumonia, выделенного из крови.

Результаты исследования. ОП1=0,545; ОП2=0,730. ЛА=ОП1:ОП2=0,746.

Заключение. Культура не чувствительна к бактериофагу, т.е. литическая активность отсутствует. «Бактериофаг клебсиелл поливалентный очищенный» не рекомендовано использовать как противомикробный препарат.

Контроль для всех вышеприведенных исследований: показатель ОП первого исследования 1,255, второго 2,140, культура жизнеспособна.

По предлагаемому способу было проведено исследование 57 проб клинического материала от 57 пациентов, при этом исследовали 94 штамма микроорганизмов. Для подтверждения эффективности предлагаемого способа, была выделена контрольная группа из 30 пациентов, которым также провели исследование методом «Стерильного пятна». Полученные результаты приведены в таблице.

Заключение. Проведенное сравнение двух методов подтвердило 100% соответствие результатов по оценки литической активности 30 клинических штаммов микроорганизмов в отношении соответствующих бактериофагов.

Использование в практическом здравоохранении предлагаемого способа позволит в кратчайшие сроки провести подбор бактериофага и начать лечение пациента с учетом полученных результатов, что обеспечит повышение его эффективности, особенно при лечении пациентов с гнойно-септическими заболеваниями, а для пациентов с непереносимостью антибактериальных препаратов скорректировать дальнейшую тактику проведения лечебных мероприятий.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ количественной оценки литической активности бактериофагов, включающий приготовление бактериальной суспензии суточной культуры микроорганизма в мясо-пептонном бульоне в концентрации 10⁵ КОЕ/мл, соединение полученной смеси со специфическим бактериофагом в соотношении как 2:1, оценку литической активности бактериофагов осуществляют по значению оптической плотности, при этом оптическую плотность фиксируют в начале исследования и через 6 ч и при определении соотношения этих показателей в пределах более или равно 10 оценивают бактериофаг как литический, при определении значения соотношения этих показателей в пределах от 5 до менее 10 оценивают бактериофаг как слаболитический, при значении менее 5 определяют отсутствие литической активности. Изобретение обеспечивает расширение арсенала способов определения литической активности бактериофагов. 1 табл., 10 пр.

Способ количественной оценки литической активности бактериофагов, включающий приготовление бактериальной суспензии суточной культуры микроорганизма, соединение с мясо-пептонным бульоном и специфическим бактериофагом, оценку литической активности бактериофагов осуществляют по значению оптической плотности, отличающийся тем, что микроорганизм в мясо-пептонном бульоне берут в концентрации 10⁵ КОЕ/мл, а соотношение этой смеси со специфическим бактериофагом выбирают как 2:1, при этом оптическую плотность фиксируют в начале исследования и через 6 ч и при определении соотношения этих показателей в пределах более или равно 10 оценивают бактериофаг как литический, при определении значения соотношения этих показателей в пределах от 5 до менее 10 оценивают бактериофаг как слаболитический, при значении менее 5 определяют отсутствие литической активности.