СПОСОБ ОЦЕНКИ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ БАКТЕРИОФАГОВ Российский патент 2007 года по МПК C12Q1/70 C12N5/00 C12Q1/02 

Изобретение относится к области медицины, медицинской токсикологии, микробиологии, биологии при испытании различных бактериофагов (например, лечебных), а именно к оценке специфической активности лечебных бактериофагов.

Сущность способа сводится к тому, что в стандартных условиях монослоя культуры клеток эмбриона человека проводится совместное культивирование тест-штамма микроорганизма с соответствующим лечебным бактериофагом или комбинированным (поливалентным) бактериофагом, в состав которого входит соответствующий используемой тест-культуре микроорганизма фаг.

В настоящее время бактериофаги широко используются для идентификации выделенных микроорганизмов, а также в качестве лечебного средства. Быстрый ответ необходим в клинике для постановки раннего диагноза и применения рациональной терапии, тем более что препараты лечебного бактериофага применяют только после определения чувствительности выделенной от больного культуры к фагу.

Препараты бактериофага представляют собой различные лекарственные формы (сухой таблетированный, жидкий очищенный концентрат, линимент), активные в отношении наиболее часто встречающихся видов стафилококка, протея, стрептококка, кишечной и синегнойной палочки. В качестве примера поливалентного бактериофага использовали официнальный препарат пиобактериофага комбинированного очищенного концентрированного в форме жидкого очищенного концентрата.

Тесты по определению чувствительности микроорганизмов к специфическому бактериофагу используются для решения ряда задач.

Известна высокая специфичность литического действия фагов в пределах родов и семейств, поэтому пробу на лизис используют, когда возникает сомнение в родовой принадлежности штамма для ускорения идентификации микроба. Исследование можно провести, пользуясь обычными методами выращивания фагов на плотной и жидкой среде или упрощенным методом, который позволяет получить ориентировочные данные о способности изучаемого штамма лизироваться примененным фагом. Для выполнения этой пробы в две пробирки с бульоном засевают культуру определяемых микробов, в одну из них добавляют фаг от 1 до 10 капель в зависимости от литической силы фага. Обе пробирки ставят в термостат на 18-20 часов, после чего по густоте роста (мутности) учитывают полное или частичное воздействие фага на бактерии по сравнению с ростом в контрольной пробирке.

Также, например, воздействием фага пользуются для определения фаговарианта некоторых микробов - сальмонелл, тифа, паратифа, стафилококков, псевдомонад, протея - при внутриродовой идентификации, что очень важно для эпидемиологической практики. При эпидемиологических обследованиях может оказаться полезным определение фаговаров. Определение фаговаров стафилококков проводят при помощи фагов, разведенных до тест-разведения, обозначенного на этикетке. В чашке Петри на поверхность 1,2% агара, приготовленного на переваре Хоттингера с добавлением свежей мясной воды и 0,4% глюкозы (pH 7,6, перед разливкой в чашки в агар добавляют на 100 мл 0,2 мл стерильного 10% раствора CaCl₂) и подсушенного в течение 30-40 мин в термостате, наливают 1-2 мл 4-часовой бульонной культуры, равномерно распределяют по поверхности агара, дают жидкости испариться. По предварительно нанесенной на дно сетке капают фаги, по одному в каждый квадрат. Дно засеянной чашки расчерчивают на 22 квадрата по числу фагов. Рекомендуется всегда соблюдать один и тот же порядок распределения фагов. Оставляют на 3 часа при 37°С и далее до 18-20 часов при комнатной температуре. Фаголизис прочитывают в падающем свете на темном фоне при помощи лупы. В зависимости от чувствительности культуры к фагу наблюдается разная степень лизиса - от полного (сливного) до единичных стерильных пятен. Результаты оцениваются плюсами: 4+ при сливной лизисе, 3+ при сливном лизисе с вторичным ростом, 2+ при наличии более чем 50 негативных колоний. Менее выраженный лизис не считают положительньм результатом. Если данная культура не лизируется фагом в тест-разведении, то опыт повторяют, пользуясь фагами, в 100 раз более концентрированными. При этом возможны ингибиторные реакции, трудно отличимые от вторичного роста, который может наблюдаться и в случае полного лизиса при наличии резистентных к фагу особей в культуре /1/.

С помощью вышеописанного способа оценки фаговаров определяется чувствительность выделенных микроорганизмов к лечебным бактериофагам.

Указанные способы являются аналогами предлагаемому изобретению. Ближайшим аналогом (прототипом) предлагаемого способа является метод определения фаговаров стафилококков на плотной среде.

Изложенные способы определения чувствительности микроорганизмов к специфическому бактериофагу длительны, сложны и трудоемки. Результаты тестирования могут быть получены только через 21-24 часа.

Техническим результатом изобретения является повышение скорости выявления чувствительности тест-штамма микроорганизма к специфическому бактериофагу и оценка эффективности лечебного бактериофага за счет приближения условий оценки к условиям макроорганизма.

Результат изобретения достигается за счет того, что в стандартных условиях монослоя культуры клеток эмбриона человека проводят совместное культивирование в течение 2 часов тест-штамма микроорганизма с соответствующим лечебным бактериофагом или комбинированным (поливалентным) бактериофагом, в состав которого входит соответствующий используемой тест-культуре микроорганизма фаг, а результат оценивают по степени снижения адгезии тест-штамма микроорганизма по сравнению с контролем.

Способ осуществляется следующим образом.

Из пробирок Лейтона на покровное стекло с монослоем кожно-мышечных (ФКЭЧ) или легочных фибробластов (ФЛЭЧ) эмбриона человека, полученным по /2/, сливают ростовую среду и добавляют 1,8 мл препарата бактериофага и 0,2 мл суточной культуры тест-штамма в дозе 10⁹ КОЕ/мл, получая конечную концентрацию тест-штамма 10⁸ КОЕ/мл. Пробирки инкубируют 2 часа при 37°С, затем клетки монослоя отмывают от неприкрепившихся бактерий многократной сменой среды Игла, фиксируют 96° этиловым спиртом, окрашивают по Романовскому-Гимза и исследуют микроскопически, определяя степень инфицированности монослоя сравнительно с контролем. В контрольной пробирке проводят совместное инкубирование 1,8 мл поддерживающей среды Игла с 0,2 мл суточной культуры тест-штамма в конечной дозе 10⁸ КОЕ/мл. Интенсивность процесса адгезии оценивают по следующим показателям: 1) индекс адгезии (ИА) выражают средним числом бактериальных клеток на одной эукариотической клетке; 2) процент пораженных клеток монослоя (ПК%); 3) обсемененность 100 клеток монослоя - микробную нагрузку (МН) - определяют по формуле МН=ИА×ПК%. Процент адгезии микроба определяют по показателю микробной нагрузки относительно контроля, принимаемого за 100%.

Пример 1. Определение бактериолитической активности препарата пиобактериофага (пиофага) в отношении тест-штаммов S.aureus 209, E.coli 1257, Ps.aeruginosa 15442 на культуре клеток (КК) ФКЭЧ. Среда для культивирования тест-культур микроорганизмов - мясо-пептонный бульон, для культивирования фибробластов - питательная среда Игла.

В пробирку Лейтона на покровное стекло с монослоем ФКЭЧ помещали 1,8 мл пиофага и 0,2 мл суточной тест-культуры соответствующего микроорганизма в дозе 10⁹ КОЕ/мл для получения конечной концентрации тест-штаммов 10⁸ КОЕ/мл (опытный инокулят). В качестве контрольного инокулята использовали смесь 1,8 мл питательной среды Игла с 0,2 мл суточной тест-культуры соответствующего микроорганизма в той же дозе, помещенную в пробирку Лейтона на покровное стекло с монослоем ФКЭЧ. Пробирки инкубировали 2 часа при 37°С, затем клетки монослоя отмывали от неприкрепившихся микроорганизмов многократной сменой среды Игла, фиксировали 96° этиловым спиртом, окрашивали по Романовскому-Гимза и исследовали под микроскопом, определяя степень инфицированности монослоя и процент адгезии микроба по сравнению с соответствующим контролем без пиофага по показателю микробной нагрузки (таблица 1).

Как видно из данных таблицы, процент адгезии тест-штаммов достоверно снизился относительно контроля соответственно: для стафилококка - на 92,5%, для кишечной палочки - на 96,2%, для синегнойной палочки - на 92,1%. Снижение адгезивной активности тест-культур происходит за счет бактериолитического эффекта пиофага. Это подтверждается результатами проведенного дополнительного теста.

Производили высев инокулятов из пробирок Лейтона на чашки Петри с МПА до начала инкубации и после 2 часов термостатирования при 37°С. Результаты высева инокулятов из соответствующих контрольных и опытных пробирок показаны в таблице 2.

Данные, представленные в таблице 2, свидетельствуют об отсутствии жизнеспособных клеток микроорганизмов как в контрольной, так и в опытной пробирках после 2 часов инкубации. Отсутствие роста микрофлоры на плотной питательной среде в контроле связано со 100% адгезией тест-штаммов к культуре клеток фибробластов в пробирках Лейтона. В то же время отсутствие роста тест-культур на МПА после 2 часов инкубации в опыте свидетельствует о гибели тест-штаммов за счет бактериолитического действия пиофага в связи с отсутствием адгезированных клеток микроорганизмов к культуре клеток фибробластов в пробирках Лейтона.

Литература

1. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследований. // Под ред. М.О.Биргера. - 3-е изд., перераб. и доп. - М.: Медицина, 1982. - с.118, 254.

2. К.Б.Грабовская, А.А.Тотолян Журн. Микробиол. - 1977. - №2. - с.32-36.

Таблица 1.Адгезивная активность тест-микроорганизмов в присутствии пиофага Тест-микроорганизмТест-объектS.aureusE.coliPs.aeruginosa ИА%ПКМН% адгезии от контроляИА%ПКМН% адгезии от контроляИА%ПКМН% адгезии от контроляконтроль:            КК + микроб620120100730210100835280100опыт:            КК + микроб + пиофаг1997,51883,8211227,9

Таблица 2.Обсемененность тест-штаммами микроорганизмов в контроле и в опытеВысев на чашки Петри с МПАРост микрофлоры в КОЕ/мл S.aureusE.coliPs.aeruginosa контрольопытконтрольопытконтрольопытДо начала инкубации6·10⁸4·10⁸2·10⁸3·10⁸4·10⁸5·10⁸Через 2 часа инкубации при 37°С000000

Изобретение относится к области медицины, медицинской токсикологии, микробиологии, биологии. Сущность способа сводится к тому, что в стандартных условиях монослоя культуры клеток эмбриона человека проводят совместное культивирование в течение 2 часов тест-штамма микроорганизма с соответствующим лечебным бактериофагом или комбинированным (поливалентным) бактериофагом, в состав которого входит соответствующий используемой тест-культуре микроорганизма фаг. Специфическую активность бактериофага оценивают по степени снижения адгезии тест-штамма микроорганизма к клеткам монослоя по сравнению с контролем (монослой клеток и тест-штамм без бактериофага). Использование способа позволяет повысить скорость определения и проводить оценку эффективности лечебного бактериофага за счет приближения условий оценки к условиям макроорганизма. 2 табл.

Способ оценки специфической активности бактериофагов, отличающийся тем, что в стандартных условиях монослоя культуры клеток эмбриона человека проводят совместное культивирование в течение 2 ч тест-штамма микроорганизма с соответствующим лечебным бактериофагом или комбинированным (поливалентным) бактериофагом, в состав которого входит соответствующий используемой тест-культуре микроорганизма фаг, а результат оценивают по степени снижения адгезии тест-штамма микроорганизма по сравнению с контролем.