НЕЙРОПРОТЕКТОРНОЕ СРЕДСТВО НА ОСНОВЕ БИС{ 2-[(2E)-4-ГИДРОКСИ-4-ОКСОБУТ-2-ЕНОИЛОКСИ]-N,N-ДИЭТИЛЭТАНАМИНИЯ} БУТАНДИОАТА Российский патент 2016 года по МПК A61K31/221 A61K31/194 A61P25/00 

Изобретение относится к медицине и фармации и касается нового нейропротекторного средства бис{2-[(2Е)-4-гидрокси-4-оксобут-2-еноилокси]-N,N-диэтилэтанаминия}бутандиоата (2:1) формулы I:

В медицинской литературе известно описание антиастенического действия диметиламиноэтилового эфира янтарной кислоты [Hakus М., Guillot-Eliot N. Un nouvelle antiasthenique: la tonibral // Gas. Med. Fr. - 1972. Vol. 79. - P. 2353-2356].

Адаптогенное и стресспротективное действие описано для сукцината моно[(2-диметиламино)этилового эфира] янтарной кислоты [Пат. США 4691046, МКИ С07С 69/34. Butanedioic acid mono [(2-dimethylamino)ethyl ester] succinate / M.O. Lozinsky, J.G. Bobkov, A.F. Shivanjuk, J.I. Gevaza, L.N. Markovsky, G.A. Kuznetsova, V.A. Markin, N.N. Kleimenova, A.l. Tentsova, A.N. Motalov, S.B. Seredenm, V.F. Katkov, V.M. Vinogradov, V.I. Kulinsky. - Опубл. 01.09.87. - НКИ 560/196; 560/204. - 8 с.; А.с. СССР 1433957. Сукцинат моно[(2-диметиламино)этилового эфира] янтарной кислоты, обладающий адаптогенным и стресспротективным действием / Лозинский М.О., Бобков Ю.Г., Шиванюк А.П., Геваза Ю.И и др. - Опубл. 30.10.1988 г., Бюл. №40. - 12 с. ].

Активно продолжаются исследования диметиламиноэтанола пироглумата (DMAE p-Glu) в качестве антиамнестического средства [Blin О., Audebert С. et al. Effects of dimethylaminoethanol pyroglutamate (DMAE p-Glu) against memory deficits induced by scopolamine: evidence from preclinical and clinical studies // Psychopharmacology. - 2009. - 207(2). - P. 201-212] и диметиламиноэтанола битартрата в качестве антиоксиданта-скэвенджера [Malanga G., Aguiar M.B. et al. New insights on dimethylaminoethanol (DMAE) features as a free radical scavenger // Drug Metab Lett. - 2012. - 6(1). - P. 54-59].

При анализе химической структуры препаратов с отчетливыми ноотропными и антиастеническими свойствами можно выделить наличие фармакофорной группировки диметиламиноэтанола (предшественника холина), образующего эфирную связь с амино- или оксикислотами. Эти препараты являются одними из наиболее эффективных нейропротекторов, оптимизирующих холинергическую передачу в ЦНС (деанола ацеглумат, холина альфосцерат, цитиколин). Однако наиболее эффективный цитиколин представлен на рынке РФ только оригинальным препаратом иностранного производства, а эффективность холина альфосцерата не всегда является достаточной при поражениях ЦНС. Деанола ацеглумат не имеет парентеральной лекарственной формы и может быть использован только на этапе поддерживающей терапии. Известно, что только цитиколин, обладающий способностью усиливать холинергическую передачу, входит в Европейские рекомендации по лечению инсульта (ESO).

Наиболее близким аналогом по структуре и активности является ониевое соединение цитиколин (5′-O-[гидрокси({гидрокси[2-(триметиламмонио)этокси]фосфорил}окси)фосфорил]цитидин), проявляющий фармакологическую активность, более близкую к заявляемому средству (прототип).

Аналогов, содержащих бис{2-[(2Е)-4-гидрокси-4-оксобут-2-еноилокси]-N-N-диэтилэтанаминия}бутандиоат (2:1), не выявлено, токсичность и биологическая активность этой новой субстанции не были изучены, что не позволяло говорить о возможности создания лекарственного средства на ее основе.

Входящий в состав препарата диэтиламиноэтанол (DEAE), подобно диметиламиноэтанолу, является прекурсором холина, лимитирующего субстрата при синтезе ацетилхолина - одного из ведущих нейротрансмиттеров, вовлеченных в процесс обучения и запоминания. Субстратно DEAE обеспечивает синтез ацетилхолина и фосфатидилхолина нейрональных мембран. Стимулирует холинергическую нейротрансмиссию, улучшает пластичность нейрональных мембран. Обладает антиоксидантным действием. В результате повышается концентрация внимания, запоминание и способность к воспроизведению полученной информации, оптимизируются познавательные и поведенческие реакции, устраняет эмоциональную неустойчивость, происходит регресс неврологической симптоматики.

Авторы предположили, что по аналогии с известными антигипоксантами и антиоксидантами соль такого соединения с интермедиатами цикла Кребса может оказывать более выраженное действие, чем исходное основание или же чистый субстрат цикла трикарбоновых кислот за счет поддержания при гипоксии энергопродукции путем сохранения активности сукцинатоксидазного звена цикла трикарбоновых кислот (ЦТК). Это FAD-зависимое звено цикла Кребса, позднее угнетающееся при гипоксии по сравнению с NAD-зависимыми оксидазами, может определенное время поддерживать энергопродукцию в клетке при условии наличия в митохондриях субстрата окисления в данном звене - бутандиовой (янтарной) кислоты. Кроме того, в последние годы установлено, что бутандиовая кислота реализует свои эффекты как лиганд специфических рецепторов (SUCNR1, GPR91), расположенных на цитоплазматической мембране клеток и сопряженных с G-белками (Gi/Go и Gq). Для поддержания работы ЦТК бутандиовая кислота может быть введена извне, либо ее синтез может осуществляться из транс-бутендиовой кислоты, при обращении терминальных реакций ЦТК в условиях выраженной гипоксии ЦНС. В свою очередь транс-бутендиовая кислота, также входящая в состав молекулы, является лигандом НСА2 рецептора, реализующим свои эффекты через ряд внутриклеточных процессов, включая стабилизацию уровня Nrf2 (erythroidderived2)-like 2 и активацию №12-зависимых путей, регулирующих ответ на метаболический и оксидативный стресс и обеспечивающих развитие нейропротективного действия.

Задачей предлагаемого изобретения является расширение арсенала нейропротекторных (антиастенических, ноотропных и актопротекторных) средств, поиск нового на основе энергодающих кислот цикла Кребса и производного диэтиламиноэтанола средства с одновременной направленностью действия на холинореактивные процессы в мозге и энергопродуцирующие системы нейронов и периферических тканей (преимущественно мышечной), имеющего низкую токсичность, для применения в восстановительной неврологии и оказывающего более выраженную нейропротекторную активность, чем у наиболее близкого аналога цитиколина (прототипа).

Указанная задача достигается созданием нейропротекторного средства, разработанного на основе бис{2-[(2Е)-4-гидрокси-4-оксобут-2-еноилокси]-N,N-диэтилэтанаминия} бутандиоата.

Изобретение иллюстрируется примерами синтеза и исследования фармакологических свойств, описание сопровождается шестью таблицами и одним графиком (фиг.).

Пример 1. Получение бис{2-[(2Е)-4-гидрокси-4-оксобут-2-еноилокси]-N,N-диэтилэтанаминия}бутандиоата (I)

В круглодонную колбу емкостью 500 мл, снабженную обратным холодильником, термометром и механической мешалкой, загружают 100 мл сухого дихлорэтана (х.ч., ТУ 2631-085-44493179-02), в котором растворяют 98 г (1 моль) малеинового ангидрида (ч., ГОСТ 11153-75). Затем при перемешивании прибавляют 117 г (1 моль) осушенного и перегнанного 2-диэтиламиноэтанола (ч., МРТУ 6-09-1311-64). Реакционную массу нагревают до 50-55°С и выдерживают 1 час. Далее прибавляют 59 г (0,5 моль) мелкорастертой янтарной кислоты (х.ч., ГОСТ 6341-75) и выдерживают при 50-55 °С 1-2 часа до полного растворения. Затем под вакуумом из реакционной смеси отгоняют дихлорэтан. В кубовом остатке находится целевой продукт, представляющий собой бесцветную или желтоватую вязкую некристаллизующуюся жидкость. Выход 270 г (98,5%).

Состав синтезированного соединения подтвержден элементным анализом. Брутто-формула: C₂₄H₄₀N₂O₁₂. Найдено, %: С - 52,73, Н - 6,98, N - 5,09, О - 35,21. Вычислено, %: С - 52,55, Н - 7,35, N - 5,11, О - 35,00.

Строение синтезированного вещества было доказано методами 1Н- и 13С- ЯМР-спектроскопией.

Пример 2. Определение острой токсичности

Острую токсичность синтезированного соединения определяли на нелинейных белых мышах самцах массой тела 18-20 г. Животных распределяли на равные по численности и массе тела группы по 10 животных в каждой. Суспензии соединения в воде, стабилизированные твином-80, вводили однократно внутрибрюшинно в интервале доз 50 мг/кг - 3000 мг/кг. Выживаемость животных определяли, наблюдая через 24 часа и через 48 часов от момента введения исследуемого соединения. Наблюдение за животными осуществляли в течение 72 часов. Регистрировали развитие основных симптомов и время гибели животных.

Расчет среднесмертельной дозы (LD50) проводили с помощью экспресс-метода В.Б. Прозоровского [Прозоровский В.Б., Прозоровская М.П., Демченко В.И. // Фармакология и токсикология. 1978. №4. С. 497-502] и пробит-анализа по методу Миллера-Тейнтера [Беленький М.Л. Элементы количественной оценки фармакологического эффекта. 2-е изд., доп. и перераб. Л.: Медгиз, 1963]. Соединение отличает высокая безопасность - величину полулетальной дозы (LD50) при пероральном введении мышам обоего пола установить не удалось, она превышает 2000 мг/кг, что позволяет отнести тестируемое соединение к группе мало- или умеренно токсичных веществ по различным классификациям (Hodge и Sterner:Toxicity classes. In: Canadian center for occupational Health and safety, 2005; Березовская И.В.: Химико-фармацевтический журнал, 2003; Гигиена и токсикология пестицидов и клиника отравлений, 1968).

Пример 3. Определение актопротекторной активности Заявляемого средства

Для оценки физической работоспособности мелких лабораторных животных (мыши) в работе использовался стандартный для фармакологических исследований метод предельного плавания с нагрузкой. Для его проведения лабораторным животным в области крестца к шкуре прикрепляется груз, составляющий 7,5% от массы тела животного и соответствующий среднему уровню интенсивности аэробно-анаэробной нагрузки.

Кроме величины груза на время предельного плавания животных существенно влияет температура воды. Для оценки физической работоспособности без учета специфического влияния температурного фактора используется вода термонейтрального диапазона - комнатной температуры (18-22°С). В нашем исследовании использовался именно этот вариант теста - с водой термонейтрального диапазона (18-22°С).

Вода в бассейн для плавания животных заливалась не менее чем за 4 часа до исследования тонкой струйкой по стенке для избежания дополнительной газации при заполнении. За период отстоя из воды происходило высвобождение растворенного в ней воздуха, что исключало впоследствии его сорбцию на мехе животного и влияние на плавучесть. Температуру воды определяли термометром за 30 минут до начала исследования и при необходимости доводили до среднего значения нужного температурного диапазона.

Исследование проводили в стандартных условиях (утренние часы, обычный уровень освещения). Животные накануне исследования на ночь оставлялись без корма при свободном доступе к воде.

Лабораторным животным после взвешивания зондом перорально вводили расчетную дозу раствора исследуемого препарата. За 15-20 минут до начала тестирования работоспособности (для сглаживания возможной стресс-реакции) к животному фиксировали подобранный груз.

При начале исследования животное без резких движений погружали в воду бассейна, секундомер включали при первых плавательных движениях животного. Критерием прекращения плавания (остановка секундомера) являлось погружение животного на дно бассейна без плавательных движений более чем на 1 минуту, а также появление пузырьков вытесняемого из легких воздуха.

Исследования выполнялись на 100 белых беспородных мышах самцах массой 17-25 г. Животных содержали в условиях вивария на стандартном рационе. Заявляемое средство изучали в дозах 10, 25, 50 и 75 мг/кг, референсный препарат диметиламиноэтанол + ацетилглутамат (Нооклерин) вводили в дозе 25, 50 и 75 мг/кг массы тела животного. Препараты вводили перорально однократно за 1 час до начала эксперимента. Животные контрольной группы получали воду очищенную в эквиобъемных количествах. Результаты исследований представлены в табл. 1.

Установлено, что заявляемое средство (доза 75 мг/кг) достоверно (р<0,0001) увеличивало физическую работоспособность мышей на 52% по сравнению с животными контрольной группы и превосходил эффект DMAE + ацетилглутамата (доза 50 мг/кг).

Пример 4. Влияние Заявляемого средства на поведение лабораторных животных.

Психофизиологический статус животных изучали в двух тестах «открытое поле» и приподнятый крестообразный лабиринт (ПКЛ).

4.1. Влияние Заявляемого средства на поведение лабораторных животных в тесте «Открытое поле».

Мышей поочередно помещали на площадку 50×50 см, приподнятой над полом на высоту 40 см. В эксперименте за 3 мин наблюдения регистрировали суммарное время остановок, время ухода с центра арены, число пересеченных и обследованных квадратов, подъемов на задние лапки, заглядываний за край, заглядываний в отверстия ("норки"), а также груминг, количество дефекаций и уринаций. По истечении этого времени, не снимая мышь с арены, проверяли ее реакцию на хлопок и на захват рукой (хэндлинг).

Путем обработки полученных результатов определяли ориентировочную (ОА) и поисковую активности (ПА), эмоциональную лабильность (Эл), агрессивность (АГ) и двигательную активность (ДА). Влияние препаратов на эмоциональную лабильность мышей самцов и выраженность психоседативного эффекта определяли по результатам теста "открытое поле". Психоседативный эффект оценивали в условных единицах как сумму баллов в ответ на звуковой (хлопок) и тактильный (захват рукой) раздражители. Эмоциональную лабильность также оценивали в условных единицах как сумму баллов при подсчете числа уринаций и дефекаций животных в течение 3 мин пребывания их на площадке.

Исследования выполнены на 100 белых беспородных мышах самцах массой тела 17-25 г. Животных содержали в условиях вивария на стандартном рационе. Заявляемое средство изучали в дозах 10, 25, 50 и 75 мг/кг массы тела животного. Препарат вводили перорально однократно за 1 час до начала эксперимента. Животные контрольной группы получали воду очищенную в эквиобъемных количествах. Результаты исследований представлены в табл. 2.

Введение Заявляемого средства в диапазоне доз от 10 мг/кг до 75 мг/кг приводило к увеличению ОА, ДА на 19-31% и 4-42% соответственно, снижению ПА на 18-35% у мышей по сравнению с группой контрольных животных. В группах мышей самцов Заявляемое средство в дозах 10 и 75 мг/кг наблюдали увеличение Ar на 50 и 38% соответственно, а в дозах 25 и 50 мг/кг - уменьшение этого показателя на 50 и 75% соответственно.

4.2. Влияние Заявляемого средства на поведение лабораторных животных в тесте «Приподнятый крестообразный лабиринт».

Исследования выполнены на установке «Приподнятый крестообразный лабиринт (ПКЛ)» для мышей (НПК Открытая Наука, Россия). Данный лабиринт состоит из 4 рукавов, длина рукавов 30 см, ширина рукавов 5 см, высота стенок закрытых рукавов 15 см, высота борта открытых рукавов 0,25 см Лабиринт был приподнят над полом на высоту 38 см.

Лабораторных животных поочередно сажали на центральную площадку, затем наблюдали за активностью мыши в течение 5 минут, регистрируя число заходов в открытые и закрытые рукава, время пребывания в них, грумминг, ориентировочную активность (число стоек + число свешиваний с открытого рукава + выглядываний) и эмоциональную активность (количество дефекаций + количество уринаций). Исследования выполнены на 100 белых беспородных мышах самцах массой тела 17-25 г. Животных содержали в условиях вивария на стандартном рационе. Заявляемое средство изучали в дозах 10, 25, 50 и 75 мг/кг массы тела животного. Препарат вводили перорально однократно за 1 час до начала эксперимента. Животные контрольной группы получали воду очищенную в эквивалентных количествах. Результаты исследований представлены в табл. 3.

В группах мышей, получавших Заявляемое средство в дозах 10, 25 и 50 мг/кг наблюдали, увеличение времени нахождения в открытых рукавах на 23, 18 и 17% соответственно, количества заходов в открытые рукава на 75, 110 и 75% соответственно, ОА на 28,39 и 7% соответственно по сравнению с группой контрольных животных. Наблюдали снижение Эл и время нахождения на центральной площадке во всем диапазоне доз. Заявляемое средство (доза 75 мг/кг) вызывало снижение времени нахождения в открытых рукавах и количества заходов в открытые рукава на 32 и 10% соответственно и повышение ОА на 21%.

Однократное пероральное введение Заявляемого средства снижает тревожность лабораторных животных и увеличивает их двигательную активность.

Пример 5. Оценка антигипоксической активности Заявляемого средства

Антигипоксическую активность препаратов изучали на моделях гипоксии: острой гемической, гистотоксической гипоксии и острой гипоксической гипоксии. Исследования выполнены на 280 белых беспородных мышах самцах массой тела 18-22 г. Животных содержали в условиях вивария на стандартном рационе. Заявляемое средство изучали в дозах 10, 25, 50 и 75 мг/кг. Референсными препаратами были выбраны триметазидин (Медарум 20) в дозе 6,7 мг/кг и цитиколин (Цераксон, Феррер Интернасьональ С.А., Испания) в дозе 100 мг/кг. Заявляемое средство, триметазидин и цитиколин вводили однократно, перорально за 1 час до начала эксперимента. Животным контрольной группы вводили воду очищенную, в эквиобъемных количествах. Результаты исследований представлены в табл. 4-6 и рис. 1.

5.1. Модель гемической гипоксии

Для создания гемической гипоксии животным вводили внутрибрюшинно натрия нитрит (300 мг/кг). Учитывали продолжительность жизни мышей в минутах, а также выживаемость в течение 20 минут. Результаты исследований представлены в табл. 4. В ходе проведенных исследований было установлено, что на модели гемической гипоксии антигипоксический эффект Заявляемого средства в дозе 75 мг/кг способствовал увеличению продолжительности жизни и выживаемости мышей на 77 и 63% соответственно по сравнению с группой контрольных животных. По эффективности Заявляемое средство в дозе 75 мг/кг сопоставимо с триметазидином (доза 6,7 мг/кг).

5.2. Модель острой гистотоксической гипоксии

Острую гистотоксическую гипоксию моделировали, вводя животным внутрибрюшинно 0,4% водный раствор натрия нитропруссида (20 мг/кг). Регистрировали продолжительность жизни животных и выживаемость после введения ингибитора тканевого дыхания в течение 20 минут. Результаты исследований представлены в табл. 5. На модели острой гистотоксической гипоксии было выявлено, что введение Заявляемого средства в дозе 75 мг/кг способствовало увеличению продолжительности жизни и выживаемости мышей на 42 и 38% соответственно по сравнению с группой контрольных животных. По эффективности заявляемое средство в первой и второй моделях в дозах 50 и 75 мг/кг сопоставимо с эффектом триметазидина (доза 6,7 мг/кг).

5.3. Острую гипоксическую гипоксию моделировали с помощью гипоксикатора «Био-Нова-204» (НТО Био-Нова, Россия) с объемом камеры 60 л. Концентрацию О₂ внутри камеры контролировали датчиками ПКГ-4-К-Т (ЗАО ЭКСИС, Россия). Препараты животным вводили однократно перорально перед помещением в гипоксикамеру. Критерием прекращения проведения методики являлся процент кислорода во вдыхаемом воздухе на момент гибели животного. Результаты исследований представлены в табл. 6 и рис. 1. В ходе проведенных исследований было установлено, что по сравнению с контролем и референсным препаратом гибель животных на фоне Заявляемого средства происходила при содержании 3,64±0,05% кислорода во вдыхаемом воздухе против 4,23±1,13% на фоне цитиколина и 4,21±0,19% в контроле. Изучена зависимость «доза-эффект» антигипоксической активности Заявляемого средства в диапазоне доз от 10 мг/кг до 800 мг/кг. В группах животных, которым вводили Заявляемое средство (дозы 10 мг/кг, 75 мг/кг, 300 мг/кг, 600 мг/кг и 800 мг/кг), наблюдали увеличение продолжительности жизни мышей при содержании кислорода во вдыхаемом воздухе в диапазоне от 3,64% (75 мг/кг) до 3,73% (10 мг/кг и 600 мг/кг). Однако статистически значимые результаты (р<0,005) были получены для Заявляемого средства (доза 75 мг/кг и 300 мг/кг) по сравнению с группой контрольных животных.

Таким образом, заявляемое средство является малотоксичным, проявляет большую нейропротекторную активность, чем прототип, и сравним по эффективности с используемыми на практике взятыми отдельно ноотропными, актопротекторными, противогипоксическими препаратами.

Заявляемое средство - бис{2-[(2Е)-4-гидрокси-4-оксобут-2-еноилокси]-N,N-диэтилэтанаминия}бутандиоат может быть использовано в качестве активного компонента нейропротекторного средства.

Изобретение относится к медицине и фармации и касается нового нейропротекторного средства на основе бис{2-[(2E)-4-гидрокси-4-оксобут-2-еноилокси]-N,N-диэтилэтанаминия} бутандиоата (I). Показано нейропротекторное действие соединения в качестве активного вещества, входящего в состав лекарственного средства на модели гипоксии, оно обладает антиастеническим, ноотропным и актопротекторным действием. Соединение является малотоксичным, сравнимо по эффективности с используемыми на практике взятыми отдельно ноотропными, актопротекторными, противогипоксическими препаратами. Указанные свойства позволяют предполагать, что бис{2-[(2E)-4-гидрокси-4-оксобут-2-еноилокси]-N,N-диэтилэтанаминия} бутандиоат может быть использован в медицине. 1 ил., 6 табл., 5 пр.

Нейропротекторное средство, включающее бис{2-[(2E)-4-гидрокси-4-оксобут-2-еноилокси]-N,N-диэтилэтанаминия} бутандиоат в качестве активного вещества.