ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КОРИНЕБАКТЕРИЙ Российский патент 2016 года по МПК C12N1/20 C12R1/15 

Изобретение относится к области ветеринарии и медицины, в частности к изолированию микроорганизмов при бактериологической диагностике инфекционных заболеваний. Как правило, выбор сред или их ингредиентов обусловлен возможностями лаборатории, нередко учитывается доступность, нежели диагностическая ценность, что в конечном итоге сказывается на качестве лабораторных исследований.

В настоящее время в лабораторной практике для культивирования коринебактерий широко применяются питательные среды: нитритный агар по Виноградскому, среда Сотона, кровяной агар, кровяно-теллуритовый агар, среда Клауберг II, среда Бучина и т.д.

Накопленные научные и практические данные по лабораторному выявлению указанных таксонов не позволяют определить универсальную, простую в изготовлении, доступную и эффективную питательную среду для их культивирования, поэтому для повышения результативности приходиться пользоваться несколькими средами [5].

Предложенный нитритный агар по Виноградскому по прописи согласно инструкций [2] с добавлением н-алканов (гексодекан C₁₆H₃₄) в количестве 2% и синтетическая среда Сотона по прописи с добавлением 2%-ной смеси углеводородов (Октан (C₁₈H₁₈), Ундекан (C₁₁H₂₄), Тетрадекан (C₁₄H₃₄), Гексадекан (C₁₆H₃₄)), имеют существенные недостатки. Углеводороды имеют разные температурные параметры кипения, в связи с чем стерилизовать в термостате их приходится по отдельности при разных температурных режимах, что создает определенные трудности при их подготовке. Кроме того, среды отличаются слабыми ростовыми свойствами.

Кровяной агар, состоящий из расплавленного и охлажденного до 45-50°C питательного агара с добавлением 5-10% дефибринированной или цельной свежи взятой крови животного, имеет низкие ингибирующие свойства по отношению к сопутствующей микрофлоре.

Указанные недостатки относятся и к кровяно-теллуритовому агару, отличающееся от кровяного агара наличием 2 мл 2% раствора теллурита калия (K₂T_eO₃).

Среда Клауберг II отличается сложностью в изготовлении и непрактичностью. К 100 мл 3% расплавленного питательного агара добавляют 3 мл 2% раствора теллурита калия, 10 мл глицериновой смеси и 50 мл лаковой крови. Химически чистый глицерин, требуемый для приготовления глицериновой смеси, необходимо стерилизовать при 110°C в течение 30 мин.

Изготовление среды осложняется еще и тем, что нужно предварительно приготовить лаковую кровь из дистиллированной воды и дефибринированной крови животного, что сопряжено с дополнительными расходами и временем. Видимые колонии на данной среде появляются не раньше 48 ч.

К недостаткам сывороточного агара, состоящего из питательной среды с 10-15% лошадиной или бычьей стерильной сывороткой, относятся низкие дифференцирующие свойства на фоне обильного роста сопутствующей микрофлоры.

Наиболее близким к заявляемой среде является сухая хинозольная среда Бучина (производства НПО « Питательные среды) г. Махачкала [4].

Состав:

Панкреатический гидролизат кильки 30,6 г Натрия хлорид 5,0±0,05 г D-глюкоза 15,0 г Водный голубой 0,25 г Натрий углекислый 0,4±0,05 г Агар микробиологический 8,0±1,0 г pH 7,4±0,2   Дистиллированная вода До 1 л 5% стерильной дефибринированой крови человека или животных  

К недостаткам данной среды относятся низкая высеваемость проб из объектов внешней среды (почва, корма, навоз, вода и т.д.), а также проб биоматериала (кровь, молоко, слизь и т.д.). Кроме того, среда содержит 2 вида минеральных солей, что по нашему мнению недостаточно для качественного обеспечения коринебактерий необходимыми микро- и макроэлементами [1].

Целью изобретения является повышение эффективности культивирования коринебактерий в лабораторных условиях на среде с измененным химическим составом.

Поставленная цель достигается тем, что сухая хинозольная среда Бучина, для выделения и дифференциации коринебактерий, содержащая панкреатический гидролизат кильки, натрия хлорид, D-глюкозу, водный голубой, натрий углекислый, агар микробиологический, дистиллированную воду и 5% стерильной дефибринированной крови человека или животных, готовится на основе геотермальной воды в качестве дополнительного источника минеральных солей, которой заменяется 100% дистиллированной воды.

Сопоставительный анализ с прототипом позволяет сделать вывод, что заявляемый состав среды отличается от известного заменой дистиллированной воды геотермальной и расширением солевого состава за счет большего содержания микро- и макроэлементов в геотермальной воде. Таким образом, заявляемое техническое решение соответствует критерию «новизна».

Расширенный лабораторный анализ геотермальной воды (фотометрия, потенциометрия, атомно-абсорбционная спектрометрия, комплексометрия и тд.) показал качественное и количественное отличие данной воды от дистиллированной по микро- и макроэлементам. Суммарное значение анионов составляло - 1,6771 г/л (NH₄, Na, К, Mg, Са, Sr, Fe, Mn, Zn, Cu, Ni), катионов - 3,4732 г/л (Cl, Br, I, SO₄, HCO₃, HPO₄, NO₃). Кроме того, в геотермальной воде содержится нейтральные и кислые битумы (2,5 мг/л), гумусовые вещества (7,1 мг/л) как источник углеводородов. Для углеводородокисляющих микроорганизмов, к которым относятся и коринебактерий, источник углеводородов улучшает ростовые свойства предлагаемой среды и благоприятно влияет на размножение коринебактерий [3].

При экспериментальной проверке были испытаны среды, наиболее часто используемые для культивирования коринебактерий.

Предлагаемую среду готовили следующим образом: 60 г сухой хинозольной среды Бучина (Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследвоания. - М.: Медицина, 1982, с.68 :панкреатический гидролизат кильки - 30,6 г, натрия хлорид 5± 0,05 г, D-глюкоза - 15,0 г, водный голубой - 0,25 г, натрий углекислый - 0,4±0,05 г, агар микробиологический - 8,0±1,0 г (рН 7,4±0,2) (2)) растворяют в геотермальной воде, добавляют общий объем до 1 л, размешивают, доводят до кипения, кипятят в течение 2 мин до полного растворения агара и образования крупнопузырчатой быстро оседающей пены. После охлаждения до 50°C добавляют к объему 5% стерильной дефибринированной крови человека или животного. Тщательно размешивают, не допуская образование пены, разливают в чашки Петри. После застывания среду слегка подсушивают в термостате при температуре (37±1)°C в течение 40-60 мин. Цвет готовой среды темно-синий. Хранят среду в холодильнике, используют в течение 3-4 суток. Рост культуры наблюдают через 24-48 ч. На месте роста культуры среда окрашивается в фиолетовый цвет, а колонии в синий.

Остальные среды готовили по прописи авторов [2].

Оценку сред проводили посевом тест-штаммов и свежевыделенных культур коринебактерий. В качестве музейного штамма использовали Corynebacterium xerosis N1911, Corynebacterium ulcerans N675, а нативным материалом служили лабораторные штаммы, выделенные из объектов внешней среды (почва, корма, навоз и кровь крупного рогатого скота).

Культуру каждого штамма высевали в 5 чашках Петри (колбы) каждой среды. Для соблюдения равнозначности опыта материал высевали равными дозами (500 клеток в 0,1 мл). При учете результатов провели сравнительный анализ эффективности сред изучаемых образцов с предлагаемым по скорости и интенсивности роста, по величине колоний и ингибирующим к сопутствующей микрофлоре свойствам. Результаты учитывали через 24 и 48 ч. Опыты повторялись двукратно. Результаты лабораторных исследований приведены в таблице.

Среды Показатель прорастания колоний в (++++) Величина колоний в мм через 48 ч 24 ч 48 ч Тест-штаммы Нативный материал Тест-штаммы Нативный материал 1. Нитритный агар - - + + 1,6-1,9 2. Среда Сотона - - + + 2,1-2,3 3. Клауберг II - + + ++ 1,0-2,4 4. Кровяной агар +++ ++++ ++++ ++++ 1,5-2,5 5. Кровяной-теллуритовый агар +++ +++ ++++ ++++ 2,2-3,4 6. Сывороточный агар +++ +++ ++++ ++++ 2,1-3,0 7. Среда Бунина + ++ ++ +++ 2,5-3,3 8. Предлагаемая среда +++ ++ +++ +++ 2,7-3,5 Примечание: ++++ - Сплошной рост. Колоний не поддаются подсчету +++ - Обильный рост (от 20 до 46 колоний) ++ - Умеренный рост (от 12 до 23 колоний) + - Скудный рост(от 2 до 6 колоний)

Рост колоний на среде Бучина формировался на первые сутки от 2 до 6 колоний с тест-штаммами и умеренным ростом с нативным материалом от 12 до 23 колоний. На вторые сутки количество колоний в чашках с наливным материалом увеличилось от 20 до 46 колоний.

По ростовым свойствам кровяной и кровяно-теллуритовые агары не уступают среде Бучина, но рост колоний формировался на фоне низких ингибирующих свойств по отношению к сопутствующей микрофлоре.

Низкими дифференцирующими свойствами обладает и сывороточный агар, где обнаружили обильный рост сопутствующей микрофлоры на вторые сутки.

Эффективность Нитритного агара и среды Сотона была самой низкой. Слегка заметное однородное помутнение обнаружили на средах через 48 ч.

Предлагаемая среда показала высокие дифференцирующие и ингибирующие свойства. Колонии появились на 1 сутки в количестве от 20 до 46 в чашках с тест штаммами и до 23 колонии с нативным материалом. На 2 сутки картина практически не изменилась, что является показателем высокой ингибирующей активности. Рост отличался не только числом, но и характером и размером колоний.

Таким образом, проведенные исследования показали, что среда, приготовленная на основе геотермальной воды, приводит к ускоренному росту коринебактерий на фоне высокой активности ингибирующей постороннюю микрофлору свойств, что в конечном итоге показывает значительную эффективность. Кроме того, на изготовление среды не требуется ощутимых материальных затрат, так как геотермальная вода в условиях Дагестана доступна для любой бактериологической лаборатории.

Список литературы

1. Баратов М.О., Ахмедов М.М, Сакидибиров О.П. Сравнительное изучение наиболее часто используемых сред для выделения коринебактерий. // Мат. Всероссийской научно-практической конференций «Повышение продуктивности с/х. животных и птицы на основе инновационных достижений)). - Новочеркасск, 2009 г.

2. Биргер М.О., Ведьмина Е.А, Влодавец В.В. и др. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования. // М.: Медицина, 1982, с. 68.

3. Высоцкий В.В., Мазурова И.К., Шмелева Е.А Сравнительное электронно-микроскопическое изучение 8 представителей рода Corynebacterium, выращенных на твердой питательной среде в стационарной фазе развития. //Микробиология. 1976, №7. С. 121-125.

4. Меджидов М.М. и др. Сухие микробиологические питательные среды. // Каталог. Махачкала-1998 г.

5. Шапелева Р.Г., Андреева З.М, Сокольникова Г.П. и др. Сравнительное изучение питательных сред для выделения коринебактерий. //Журнал микробиология, 1989. №5. С. 62-64.

Изобретение относится к биотехнологии. Питательная среда для культивирования коринебактерий содержит панкреатический гидролизат кильки, натрия хлорид, D-глюкозу, водный голубой, натрий углекислый, агар микробиологический, геотермальную воду и стерильную дефибринированную кровь человека или животных при заданном соотношении компонентов. Изобретение позволяет сократить сроки культивирования коринебактерий и повысить чистоту их выделения. табл.

Питательная среда для культивирования коринебактерий, содержащая панкреатический гидролизат кильки, натрия хлорид, D-глюкозу, водный голубой, натрий углекислый, агар микробиологический, воду и 5% стерильной дефибринированной крови человека или животных, отличающаяся тем, что в качестве воды и дополнительного источника минеральных солей содержит геотермальную воду в следующих количествах, г/л:
Панкреатический гидролизат кильки 30,6 Натрия хлорид 5,0±0,05 Д-глюкоза 15,0 Водный голубой 0,25 Натрий углекислый 0,4±0,05 Агар микробиологический 8,0±1,0 _PH 7,4±0,2   Геотермальная вода до 1 л 5% стерильной дефибринированной крови человека или животных