Среда для выделения и культивирования микобактерий Российский патент 2018 года по МПК C12N1/20 C12R1/32 

Изобретение относится к области ветеринарии и медицины, в частности к изолированию микобактерий при бактериологической диагностике туберкулеза.

В настоящее время в лабораторной практике для культивирования микобактерий широко применяют простые или глицеринсодержащие и элективные - белковые и безбелковые (синтетические) питательные среды. К числу первых относят глицериновый картофель, глицериновый мясо-пептонный бульон и агар. К элективным белковым (Петраньяни, Гельберга, Левенштейна-Иенсена, Финн-2 и др.), синтетическим (безбелковым) - среда Сотона, Моделя и др. [3, 5].

Анализ данных по культивированию микобактерий не позволяет определить среду, состоящую из менее сложных субстратов, необходимых для развития и обеспечения оптимальных условий жизнедеятельности исследуемых бактерий. Существующие среды имеют многочисленные недостатки качественного характера, в частности низкая чувствительность и малая скорость роста, что в конечном итоге сказывается в качестве диагностики, идентификации и определении лекарственной чувствительности выделенных культур [2, 4].

Наиболее близкой к заявляемой среде по простоте изготовления и доступности является синтетическая среда Сотона

Для приготовления 4,32 г порошка размешивают в 1000 мл дистиллированной воды, содержащей 20 мл глицерина. Кипятят для полного растворения частиц. Стерилизуют автоклавированием при 1,1 атм (121°С) в течение 15 мин [3].

Данная среда, являясь стандартной, содержит соли типа цитрата аммонийного железа и сульфата магния, которые необходимы для роста микобактерий в качестве источника неорганических ионов и азота, аспарагин добавляют для стимуляции роста микобактериальной клетки. Среда не содержит посторонних примесей, имеет значительное преимущество перед средами с органическими компонентами. Используют для определения колониеобразующих единиц (КОЕ) микобактерий, для получения микробной массы, при создании аллергенов, а также для культивирования ряда микробов с целью изучения протекающих в них процессов метаболизма, ассимиляции питательных веществ, для выяснения механизмов биосинтеза токсинов, антибиотиков, ферментов, для исследования действия антибиотиков, витаминов, незаменимых аминокислот на развитие бактерий.

К недостаткам упомянутой среды является то, что она не может заменить среды, химический состав которой точно не определен, каковыми являются белковые или пептонные питательные среды. Этими средами пользуются при культивировании микобактерий, особенно при выделении их из организма животных, что объяснятся недостаточной изученностью метаболизма и питательных потребностей микобактерий [1].

Целью изобретения является повышения эффективности питательной среды для выделения и культивирования микобактерий за счет изменения состава среды.

Поставленная цель достигается тем, что среда Сотона содержит дополнительно в качестве загустителя, а также источника минеральных солей и полисахаридов агар-агар в количестве 2%, а в качестве источника углеводорода (фактора роста) геотермальную воду.

Техническая задача решается тем, что 4,32 г порошка, состоящего из: железа аммонийного цитрата - 0,0167, L-аспарагина - 1,330, лимонной кислоты - 0,660, магния сульфата - 0,166, калия гидрофосфата - 0,287, натрия дигидрофосфата - 0,633, натрия хлорида - 0,400, твин - 80-0,833, размешали в 1000 мл геотермальной воды, добавили 20 г агар-агара, кипятили на огне до полного растворения агара, постоянно перемешивая во избежание прогорания. По окончании кипячения восстановили объем среды добавлением геотермальной воды. Реакцию определяли при температуре 80°С. После установления реакции агар прокипятили, дали отстоять в теплом месте, после чего профильтровали в горячем состоянии через ватно-марлевый фильтр. Разлили в посуду, стерилизовали автоклавированием при 1,1 атм. (121°С) в течение 20 мин.

Сопоставительный анализ с прототипом позволяет сделать вывод, что заявляемый состав среды отличается от известной введением новых компонентов, а именно агар-агара и геотермальной воды. Таким образом, заявляемое техническое решение соответствует критерию «новизна».

Анализ известной синтетической среды Сотона показывает, что данная жидкая форма среды используется для культивирования тест-микробов, при микробиологических методах определения аминокислот и витаминов, а также для определения значении тех или иных веществ в питании микобактерий и не может быть использована при выделении микобактерий из организма животных, питательные потребности которых не известны. Добавление агар-агара обогащает среду продуктами растительного происхождения, в частности полисахаридами (агаропектин, агароза и другие), которые и придают ему свойства желе, пировиноградной и глюкуроновой кислотой, минеральными веществами, в том числе, кальцием и йодом, железом, разнообразными витаминами. Микроэлементы и витамины, входящие в состав агар-агара, не только полезны, но и необходимы для размножения микобактерий.

Расширенный лабораторный анализ геотермальной воды, взятой в качестве разбавителя ингредиентов среды (фотометрия, потенциометрия, атомно-абсорбционная спектрометрия, комплексометрия и т.д.), показал качественное и количественное отличие данной воды от дистиллированной по микро- и макроэлементам. Суммарное значение составляло: анионов - 1,6771 г/л (NH₄, Na, K, Mg, Са, Sr, Fe, Mn, Zn, Cu, Ni), катионов - 3,4732 г/л (Cl, Br, I, SO₄, HCO₃, HPO₄, NO₃). Кроме того, в геотермальной воде содержится нейтральные и кислые битумы (2,5 мг/л), гумусовые вещества (7,1 мг/л) как источник углеводородов. Для углеводородокисляющих микроорганизмов, к которым относятся микобактерии, такой источник является стимулом повышения ростовых свойств предлагаемой среды.

Таким образом, данный состав компонентов придает среде новые свойства, что позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого решения критерию «существенные отличия».

Для экспериментальной проверки заявляемого состава среды провели сравнительное испытание со средами Гельберга, Левенштейна-Иенсена и Финн-2. Готовые среды засевали видами культуры: М. tuberculosis, М. БЦЖ, М. bovis, М. avium. Оценку сред проводили посевом тест-штаммов и свежевыделенных культур микобактерий, нативным материалом служили лабораторные штаммы, выделенные из объектов внешней среды (почва, корма, навоз и кровь крупного рогатого скота). Культуру каждого штамма высевали в 10 пробирках. Для соблюдения равнозначности опыта материал высевали равными дозами (200 клеток в 0,1 мл). При учете результатов провели сравнительный анализ эффективности сред изучаемого образца с предлагаемым по скорости и интенсивности роста и по величине колоний. Опыты повторялись трехкратно.

Характеристика роста микобактерий на различных средах

Примечание: ++++ - Сплошной рост. Колонии не поддаются подсчету

+++ - Обильный рост (от до 20 колоний)

++ - Умеренный рост (от 5 до 11колоний)

+ - Скудный рост (от 1 до 5 колоний)

Как видно из таблицы, на предлагаемой среде все виды опытных культур растут значительно быстрее, чем на средах-аналогах. Рост отличался не только числом, но и характером и размером колонии.

Для сравнительного изучения эффективности изучаемых образцов сред при выделении микобактерий из биоматериала от больных туберкулезом коров были отобраны 22 пробы (лимфатические узлы). Посев производили из расчета 1 проба на 3 пробирки опытной среды.

Результаты исследования проб биоматериала от больных туберкулезом животных.

Результаты проведенных исследовании показали, скорость роста и частота индикации микобактерий на предлагаемой среде была значительно выше, чем на сравниваемых.

Таким образом, предлагаемая среда показала значительное превосходство по скорости и интенсивности роста микобактерий, высокую индикационную способность в сравнении с аналогами, что позволит ускорить сроки лабораторной диагностики туберкулеза, а также идентификацию культур микобактерий.

Литература

1. Баратов М.О. Сравнительное изучение наиболее часто используемых питательных сред для выделения коринебактерий [Текст] / М.О. Баратов, М.М. Ахмедов, О.П. Сакидибиров //Мат Всеросс. научно-практ конф. «Повыш. продук. с/х животных и птицы на основе инновац. достижений» - Новочеркасск. - 2009. - С. 20-22.

2. Баратов М.О. Питательная среда для культивирования коринебактерий [Текст] / М.О. Баратов, М.М. Ахмедов //Патент №2592372, Государственный реестр изобретений Российской Федерации - 29 июня 2016.

3. Меджидов М.М. Сухие микробиологические питательные среды [Текст] / М.М. Меджидов и др. // - Каталог - Махачкала, 1998, 78 с.

4. Нуратинов Р.А. Питательная среда для выращивания микобактерий [Текст] / Р.А. Нуратинов // Патент на изобретение №2121000 от 27 октября 1998.

5. Самилло Г.К. Пути повышения высываемости и ускорения роста микобактерий туберкулеза на модифицированной среде Финн-2 [Текст] / Г.К. Самилло, Е.Н. Ромашова// Проблемы туберкулеза. - 1988. - №12. - с. 62-63.

Изобретение относится к биотехнологии. Питательная среда для выделения и культивирования микобактерий содержит железа аммонийного цитрат, L-аспарагин, лимонную кислоту, магния сульфат, калия гидрофосфат, натрия хлорид, твин-80, агар-агар и геотермальную воду при заданном соотношении компонентов. Изобретение позволяет повысить выход биомассы микобактерий и сократить сроки диагностики туберкулеза. 2 табл.

Питательная среда для выделения и культивирования микобактерий, содержащая железа аммонийного цитрат, L-аспарагин, лимонную кислоту, магния сульфат, калия гидрофосфат, натрия дигидрофосфат, натрия хлорид, твин-80, отличающаяся тем, что дополнительно содержит агар-агар и геотермальную воду с количественным составом компонентов:

Железа аммонийного цитрат, г 0,0167 L-Аспарагин, г 1,330 Лимонная кислота, г 0,660 Магния сульфат, г 0,166 Калия гидрофосфат, г 0,287 Натрия дигидрофосфат, г 0,633 Натрия хлорид, г 0,400 Твин-80, г 0,833 Агар-агар, г 20 Геотермальная вода, мл 1000 Значение pH при 25°С 7,2±0,2