ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ ДИФТЕРИЙНОГО МИКРОБА Российский патент 1995 года по МПК C12N1/20 

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано при лабораторной диагностике возбудителя дифтерии.

Известны питательные среды для выделения дифтерийного микроба из инфицированного материала, содержащие в своем составе гидролизаты белкового сырья (килька, кровь убойных животных), в качестве стимуляторов роста дрожжевой экстракт, L-цистеин солянокислый, глицериновую смесь и стерильную кровь, а для ингибирования роста посторонней микрофлоры теллурит калия [1]
Наиболее близким к предлагаемой среде является кровяной теллуритовый агар [2] Основным недостатком этой среды является использование в ее составе стерильной дефибринированной или гемолизированной крови, что исключает возможность стерилизации среды, а получаемая плотная питательная среда непрозрачна. Сложный состав кровяного теллуритового агара приводит к многоэтапности приготовления питательной среды: приготовлению раствора питательного агара, расплавлению и охлаждению агара, добавлению раствора теллурита калия и стерильному внесению гемолизированной крови.

Существенным недостатком этой среды как диагностического препарата является малое количество образующихся колоний: при засеве 100 микробных клеток вырастает не более 5 колоний.

Цель изобретения обеспечение возможности стерилизации и повышение ростовых свойств питательной среды для выделения дифтерийного микроба.

Цель достигается тем, что предлагается питательная среда, содержащая панкреатический гидролизат рыбной муки, ферментативный гидролизат черного альбумина, хлористый натрий, теллурит калия и агар, при следующем соотношении компонентов, г/л: Панкреатический гидролизат рыбной муки 20-25 Ферментативный гидролизат черного альбумина 8-12 Хлористый натрий 4-6 Агар 10-15 Теллурит калия (2%-ный раст- вор) 5-20 мл
Отличием предлагаемой среды является использование панкреатического гидролизата рыбной муки и ферментативного гидролизата черного альбумина, причем их соотношение в среде находится в пределах от 3:1 до 2:1 соответственно.

Питательную среду готовят следующим образом.

П р и м е р 1. Для приготовления предлагаемой сухой питательной среды смешивают 20 г панкреатического гидролизата рыбной муки (ТУ оп. 64-15-120-90), 8 г ферментативного гидролизата черного альбумина (ТУ оп. 64-15-114-89), 4 г хлористого натрия и 10 г агара в смесителе барабанного типа. Полученный сухой препарат расфасовывают в ламинированные пакеты или стеклянные банки с завинчивающейся крышкой. Сухая среда может храниться в течение 2 лет (срок наблюдений). Для приготовления плотной питательной среды содержимое пакета или банки (42 г) растворяют в 1 л дистиллированной воды, тщательно размешивают, доводят до кипения и кипятят 1-2 мин при перемешивании и стерилизуют при 1 атм (121^оС) 20 мин. После охлаждения до 45-60^оС добавляют 20 мл 2% -ного процентного раствора теллурита калия и разливают в чашке Петри. Односуточную культуру дифтерии выращивают на сывороточно-агаровой среде, смывают физиологическим раствором, готовят 1 млрд клеток в 1 мл взвеси и путем 10-кратных разведений готовят необходимую посевную дозу. Для контроля сред используют два последних разведения (6 и 7), что соответствует 500 и 100 микробным клеткам в 0,1 мл.

В таблице приведены экспериментальные данные по ростовым свойствам питательных сред при культивировании трех штаммов Corynebacterium dipheriaemitis 143, Corynebacterium diphteriae gravis 3689 и Corynebacterium xerosis 1911. Рост стафилококка (St. aureus Biomico 209p) отсутствует.

П р и м е р 2. Для приготовления сухой питательной среды смешивают 25 г панкреатического гидролизата рыбной муки, 12 г ферментативного гидролизата черного альбумина, 6 г хлористого натрия и 15 г агара. Далее аналогично примеру 1. Ростовые свойства среды представлены в табл.1. Теллурита калия (2% -ный раствор) добавляют 5 мл.

П р и м е р 3. Для приготовления плотной питательной среды берут навеску сухого питательного агара СПА (питательную основу среды прототипа) в количестве 40 г, добавляют навеску 10 г ферментативного гидролизата черного альбумина, заливают 1 л дистиллированной воды. Далее аналогично примеру 2. Ростовые свойства представлены в таблице.

Анализ результатов биологической проверки питательных сред показывает (таблица), что по количеству и размеру вырастающих колоний C. mitis, C. gravis, C. xerosis предлагаемая среда превосходит известные.

Так, при выращивании этих штаммов из 10^-6 и 10^-7 разведений число колоний на предлагаемой среде в 1,5-2,0 раза больше, чем на известных питательных средах.

Диаметр образующихся колоний через 48 ч культивирования на предлагаемой среде на 0,5-1,0 мм больше, чем на известных. Морфология выросших колоний типичная, черного цвета с приподнятым центром.

Увеличения размера и количества колоний на предлагаемой среде удается достичь за счет оптимального соотношения двух компонентов ферментативного гидролизата черного альбумина и панкреатического гидролизата рыбной муки. Такого эффекта не удается получить при использовании в качестве белковой основы панкреатического гидролизата каспийской кильки (пример 3). Ростовые свойства последней остаются на уровне кровяного теллуритового агара.

Большая скорость роста дифтерийных микробов на предлагаемой среде проявляется и при меньших временах культивирования. Через 19 ч культивирования на предлагаемой среде визуально наблюдаются колонии дифтерийного микроба, тогда как на прототипе за это время рост возбудителя дифтерии можно наблюдать с помощью бинокуляра.

Предлагаемая питательная среда прозрачна в отличие от непрозрачного кровяного теллуритового агара, что также значительно облегчает обнаружение дифтерийного микроба на поверхности агара.

За счет теллурита калия (1,5-2,0 мл на 100 мл среды) на всех вариантах сред рост посторонней микрофлоры (St. aureus, E. coli, Pr. vulgaris) подавлен.

Смыв из носоглотки через 20-24 ч культивирования на предлагаемых средах дает более пышный рост дифтероидов по сравнению с известными средами.

Использование: медицинская микробиология, лабораторная диагностика возбудителя дифтерии. Сущность изобретения: питательная среда содержит следующие компоненты, г/л панкреатический гидролизат рыбной муки 20 25; ферментативный гидролизат черного альбумина 8 12; хлористый натрий 4 6; агар 10 15; теллурит калия (2%-ный раствор) 5 20 мл. В отличие от кровяного теллуритового агара среда прозрачна, что значительно облегчает обнаружение дифтерийного микроба на поверхности агара. По ростовым свойствам предлагаемая среда превосходит известные. 1табл.

ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ ДИФТЕРИЙНОГО МИКРОБА, содержащая питательную основу, хлористый натрий, агар, теллурит калия и воду, отличающаяся тем, что в качестве основы она содержит панкреатический гидролизат рыбной муки и дополнительно ферментативный гидролизат черного альбумина при следующем соотношении компонентов:
Панкреатический гидролизат рыбной муки, г 20 25
Ферментативный гидролизат черного альбумина, г 8 12
Хлористый натрий, г 4 6
Агар, г 10 15
Теллурит калия (2%-ный раствор), мм 5 20
Вода, л До 1