Питательная среда для культивирования коринебактерий дифтерии Советский патент 1984 года по МПК C12N1/20 

Изобретение относится к медицине преимущественно медицинской микробиологии, и мохсет быть использовано при получении биомассы коринебактерий дифтерии, их типировании, идент фикации. Известна среда для культивирования коринебактерий дифтерии с целью их дифференциации от дифтероидов f Однако при высеве на данную пита тельную среду 100 микробных тел уда ется получить лишь 12-15 колоний. Известна среда для культивирования коринебактерий, которую готовят из отвара .говяжьего мяса с добавлением натрия хлористого 2 . Однако ВЫХОД биомассы при культи вировании на ней коринебактерий диф терии низкий, что требует добавлени к ней сыворотки крови животных или дефибринированной крови. Кроме того элективность данной питательной сре ды низкая. I. Цель изобретения - улучшение . ростовых свойств и повышение электив ности. Цель достигается тем, что питательная среда для культивирования коринебактерий дифтерии, содержащая питательную основу, факторы роста, хлористый натрий, агар-агар и воду, в качестве питательной основы содержит сухой ферментативный гидролизат крови животных, в качестве факторов роста - сухой экстракт кормовых дрожжей и дистеин хлористый, дополнительно содержит активированный уголь при следующем соотношении компонентов , мае.%: Сухой ферментативный гидролизат крови 1,4-1/6 животных Сухой экстракт кормовых-дрожжей 0,25-0,50 Цистеин хлористый OJOOl-0,002 Хлористый натрий 0,35-0,40 Активированный 0,3-0,5 уголь 1,8-2,5 Агар-агар Дистиллирован н ая Остальное вода Новая питательная среда используется без добавления нативных белковых продуктов (сыворотки, крови). Ферментативный гидролизат крови животных является стандартньви препаратом, содержащим: 13,0-14,0% общего азота,, 9,0-10,0% аминного азота, 8,0-9,0% хлоридов и 16 свободных аминокислот (триптофан, гистидин, аргинин, треонин, серин, пролин, глицин, аланин, валин, MeTHoViHH, изолейцин, лейцин, тиро-. ЗИН, фенилаланин, аспарагиновую и глутаминовую кислоты, Новая питательная среда приготавливается следующим образом. Сухой гидролизат крови животных, сухой экстракт кормовых дрожжей и хлористый натрий растворяют последовательно в дистиллированной воде при нагревании до 80С, затем добавляют необходимое количество агара и доводят до кипения. Кипятят до полного растворения агара. Устанавливают ,8-7,9 10%-нь1М раствором едкого натра, кипятят 5 мин, затем добавляют цистеин хлористый и активированный уголь. Питательную среду наливают в стерильные флаконы и стерилизуют при 110-112°с в тече-, ние 30 мин. Пример использования новой питательной среды. Оценку ростовых свойств питательной среды проводят путем посева серийных разведений взвеси :;уточной культуры коринебактерий дифтерии.Результаты учитывают через 24 ч. Критерием оценки изучаемых сред считают наличие роста при посевной дозе, равной 100 и 50 микробных клеток, а также размер и характер выросших колоний. Для посева используют штаммы коринебактерий дифтерии с различными биологиг ческими свойствами (токсигенные и нетоксигённые, по биох12иическим свойствам тип Гравис и тип Митис) . Контролем служит среда Мартена. Для определения выхода микробной массы 1 ил взвеси суточной культуры коринебактерий дифтерии, содержащий 1 млрд, микробных тел, засевают на матрацы с испытуемой к контрольной средой. Капля равномерно распределяется по поверхности среды при помо- щи стеклянных бус. Матрацы помещают . в термостат при 37с на 24 ч. Затем культуру смьшают физиологическим раствором и определяют густоту взвеси по оптическому стандарту. В табл. 1 приведены испытанные варианты новой питательной среды. Ростовые свойства вариантов ере-Г ды, включающих представленные в таблице сочетания, определяют путем посева серийных разведений 6 итгиимов коринебактерий дифтерии. результатов производят через 24 ч. При этом учитьлвают процент колоний, выросших при посеве 50 и 100 клеток, и характер колоний. Наличие роста отмечено на вариантах: 2, 3, 5, 8, 9, 10. На вариантах 2, 3, 8, 9 число выросших колоний составило 70-80%, на варинатах 5 и 10 - 60%. Рост на варианте 9, содержащем 6,0 г/л активированного угля, пышный, но слизистый, мало характерный для коринебактерий дифтерии. На вариантах 6

и 7, содержащих цистеин в количествах ниже 0,01 г/л и выше 0,02 г/л, рост очень скудный и составляет менее 30% по отношению к посевной дозе. При увеличении хлористого натрия до 6,0 г/л число выросших колоний снижается до 30,0-35,0%. К таким же результатам приводит уменьшение активированного угля до 2,0г/л.

Оптшлальными количественными соотношениями компонентов среды являются следующие: гидролизат крови - 15,0 г/л; натрий.хлористый 4,0 г/л; цистеин - 0,01 г/л; активированный уголь - 3,0. г/л (вариант 2). Сочетание этих компонентов в. данных количественных соотношениях обеспечило получение максимального выхода биомассы при культивировании всех испытанных штаммов коринебактерий дифтерии. Выход биомассы на этом варианте среды составляет 7,5-8,0 млрд. микробных тел с 1 мл среды. При испытании вариантов 3 и 8 выход микробной массы колеблется в зависимости от посеянных штаммов в пределах 6-8 млрд. микробных тел с 1 мл среды.

В табл. 2 приводятся данные опытов, позволивших установить предельномаксимальные, оптимальные и предельно минимальные дозы 4-х компонентов питательной среды (хлористого натрия, гидролизата крови, цистеина и активированного угля). Опыты проводили с 18 штаммаг-ш коринебактерий дифтерии с различными биологическими свойствами.

Высокий уровень биомассы новая питательная среда обеспечивает лиш при определенном соотношении входящих в нее компонентов.

Выход микробной массы с 1 мл новой среды в 3 раза превьппает выход микробной массы со среды Мартена. Свойства среды Мартена приближаются к свойствам новой среды только после добавления к среде Ш1ртена 1 сыворотки крупного рогатого скотта.

Результаты излучения влияния содерлсания активированного угля в питательной среде на ее ростовые своП-. ства и выход микробной массы в сравнении со свойствами среды Мартена представлены в табл. 3.

Как видно из таблицы, питательная 5 среда с оптимальным количественнымсоотношением компонентов приобретает новые качественные свойства толькй при добавлении оптимальной дозы активированного угля. Добавление 0 активированного угля в той же дозе к среде Мартена не дает эффекта.

Метод серологической идентифика-. . дни коринебактерий дифтерии используется с целью определения видовой

5 и типовой принадлежности выделенной культуры для дифференциации дифтерийных микробов от других представителей рода коринебактерий. Метод вклрэчает 2 этапа: I - агглютинация

0 на стекле для определения родовой принадлежности; iI - линейная агглютилация в пробирках с типовыми сьшоротками. Для реакции аггльзтинации на стекле используют суточную

5 кулы/ру, полученную со среды культивирования. На этом этапе культуры, полученные со среды Мартена, плохо гомогенизирующиеся, часто дают хлопья и дальше не изучаются., Взвесь, полученная с новой питательной среды/ гомогенна и хорошо типируется. Результаты типирования представлены в табл. 4. Приведенные в таблице данные свидетельствуют об улучшенных свойст5 tsax новой среды, проявляемых при серологической идентификации и серотипировании коринебактерий дифтерии. Культура, полученная с новой среды, хорошо гомогенизируется и это оп0 ределяет четкие результаты в реакции агглютинации, тогда как взвесь культуры, полученной со среды Мартена, почти в 40% случаев содержит хлопья, имитирующие спонтанную агглютинацию

5 в контроле. .

Таким образом, новая питательная среда обладает улучшенными ростовыми свойствами, обеспечивает повышение выхода биомассы коринебактерий

дифтерии и обладает повьЙ1енной элек|ТИВНОСТЬП.

Таблица. 1

ПИТАТЕЛЬНАЯ CPEJB. ДЛЯ .КУЛЬТИВИРОтНИЯ КОРИНЕБАКТЕРИЙ. ДИФТЕРИИ, содержащая питательную ocHOiVf факторы роста, хлористый натрий,агар-агар и воду, о т л и - чающаяся тем, что, с целью улучшения ростовых свойств и повышения элективности, в качестве питательной основы она содержит сухой ферментативный гидролизат крови животных, .в качестве факторов роста сухой экстракт кормовых дроиокей и цистеин хлористый, дополнительно содержит активированный уголь при следующем соотношении компонентов, . мае.%: Сухбй ферментативный гидролизат крови 1,4-1,6 животных Сухой экстракт 0,25-0,50 кормовых дрожжей 0,001-0,002 Цистеин хлористый 0,35-0,40 Хлористый натрий Активированный 0,3-0,5 уголь 1,8-2,5 Агар-агар Дистиллированная Остальное. вода О СП hi :л

Гидролизат крови 14,0 15,0 16,0. 15,0 Натрий хлористый 5,0 4,0 4,0 6,0 Цистеин хлористый 0,01 0,01 0,02 0,01 Активиро-. ванный уголь 2,0 3,0 3,0 3,0

Таблица 2 14,0 15,0 15,0 15,0 15,0 15,0 3,5 3,5 4,0 4,0 4,0 3,5 0,01 0,03 0,005 0,01 0,01 0,01 4,0 4,0 4,05,0 6,0 3,0

.Продолжение табл. 2

питательная (оптимальный вариант) без угля

Питательная (опти

Таблица 3

2,5-3,0

33,OJ5,4 0,2-0,3

Т а б. Л и Ц а 4