ВАКЦИНА ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ НЕКРОБАКТЕРИОЗА ЖИВОТНЫХ И СПОСОБ ЕЁ ПОЛУЧЕНИЯ Российский патент 2016 года по МПК A61K39/114 

Изобретение относится к области ветеринарии и биотехнологии и касается получения вакцины для профилактики некробактериоза животных.

Известен способ изготовления вакцины против некробактериоза животных, включающий выращивание штамма возбудителя некробактериоза, инактивацию выросшей культуры, разделение ее на биомассу и культуральную жидкость, ресуспендирование отделенной биомассы, экстракцию антигена, содержащего эндотоксин, многократным замораживанием и оттаиванием полученной суспензии, центрифугированием и отделением антигена из супернатанта, параллельное извлечение экзотоксина из культуральной жидкости, инактивацию полученных экзотоксина и эндотоксина, их объединение с последующим добавлением адъюванта на основе минерального масла и ланолина и получением целевого продукта, причем из штаммов выращивают производственный штамм Bacteroides necrophorum (ВИЭВ), отделенную биомассу ресуспендируют в физиологическом растворе до концентрации 100-120 млрд кл. /мл, выделяют эндотоксин с концентрацией белка 2,5-3,0 мг/мл, а извлечение экзотоксина осуществляют ультрафильтрацией на полых волокнах с размером пор 1,3-1,7 КДа до содержания белка в экзотоксине 5,5-6,0 мг/мл, смешивают экзотоксин и эндотоксин в равных объемных соотношениях (Патент RU 2109519, А61К 39/02, Опубликовано 27.04.1998, Бюл. №21).

Однако известная вакцина недостаточно иммуногенна, так как требует двукратного введения и обеспечивает иммунитет только против некробактериоза в течение 3,5-4 мес. Кроме того, при получении вакцины осуществляют предварительный подбор местных штаммов для каждого конкретного хозяйства, что невозможно при промышленном производстве.

Известен также способ изготовления вакцины, который включает культивирование штамма B.necrophorum «0-1» ВИЭВ на питательной среде, инактивирование формалином, отделение биомассы от культуральной жидкости центрифугированием, отделение центрифугата и концентрирование экзотоксина ультрафильтрацией до содержания белка 5,5-6,0 мг/мл (по Лоури). Получают экзотоксин B.necrophorum с молекулярной массой 18000-20000 Д. Добавляют к нему раствор формалина до конечной концентрации 0,4%. Инактивируют в течение 15 суток и смешивают инактивированный формалином экзотоксин с масляным адъювантом при следующем содержании компонентов (в мас. %): инактивированный формалином экзотоксин B.necrophorum - 60,0-67,0, масляный адювант - 33,0-40,0. Затем гомогенизируют полученную суспензию и расфасовывают готовую вакцину. Вакцину животным вводят внутрикожно одно-, двукратно в дозе 0,2-0,4 мл. Изобретение позволяет упростить способ изготовления высокоэффективной вакцины, получить вакцину с низкой реактогенностью, а также снизить прививочную дозу вакцины и повысить удобство ее введения (Патент RU 2329828, А61К 39/02, опубл. 27.07. 2008, бюл. №21).

Однако известная вакцина не обеспечивает создание достаточного иммунитета против некробактериоза.

Задачей изобретения является повышение качества целевого продукта за счет увеличения сроков иммунитета животных и снижения реактогенности вакцины против некробактериоза.

Технический результат изобретения достигается в вакцине против некробактериоза, содержащей инактивированный формалином лейкоцидин-экзотоксин, полученный из производственного штамма Fusobacterium necrophorum "0-1" ВИЭВ, тем, что инактивированный формалином лейкоцидин-экзотоксин, полученный из производственного штамма Fusobacterium necrophorum "0-1" ВИЭВ, представляет собой высокоочищенный белок с молекулярной массой 18-20 кДа с содержанием 1,5-2,0 млрд клеток Fusobacterium necrophorum "0-1" ВИЭВ в 1 см³, адсорбированный на гидроокиси алюминия, и дополнительно содержит сапонин, глицерин и натриевую соль сукцината хитозана при следующем соотношении компонентов, мас. %:

Известен способ получения натриевой соли сукцината хитозана (Патент RU 2144040, МПК С08В 37/08, А61К 31/722, Опубликовано 10.01.2000), который может быть использован в ветеринарии, медицине и косметике в качестве пленкообразователя, гидранта или эмульгатора.

Технический результат изобретения достигается также в способе получения вакцины против некробактериоза путем культивирования штамма Fusobacterium necrophorum "0-1" ВИЭВ, инактивирования его формалином, отделения бактериальной массы от культуральной жидкости центрифугированием, выделения из культуральной жидкости экзотоксина-лейкоцидина, его очистки и концентрирование ультрафильтрацией на полых волокнах и адсорбцией на гидроокиси алюминия в гликолевом буфере, причем перед адсорбцией на гидроокиси алюминия к экзотоксину добавляют 1-10% инактивированной бактериальной массы штамма Fusobacterium necrophorum "0-1" ВИЭВ с содержанием 1,5-2,0 млрд клеток Fusobacterium necrophorum "0-1" ВИЭВ в 1 см³, после чего последовательно добавляют сапонин, а глицерин добавляют сразу после добавления сапонина.

В патентной и научно-технической литературе неизвестны технические решения, аналогичные заявляемому, т.е. предложение соответствует критерию изобретения «новизна».

Нами впервые показано, что сочетанное использование вышеуказанных компонентов позволяет изготовить новую вакцину против некробактериоза животных, следовательно, изобретение соответствует критерию «изобретательский уровень».

Предлагаемая вакцина против некробактериоза создает длительный иммунитет у привитых животных, при этом по иммуногенности она превосходит известную вакцину против некробактериоза. Вакцина безвредна и авирулентна для лабораторных и сельскохозяйственных животных, т.е. предложение «промышленно применимо».

Вакцину против некробактериоза готовят следующим образом.

Пример 1. Для получения некробактериозного антигена - лейкоцидина-экзотоксина берут производственный штамм Fusobacterium necrophorum "0¬1" ВИЭВ, культивируют, инактивируют формалином в конечной концентрации 0,4%, отделяют бакмассу от культуральной жидкости центрифугированием, из культуральной жидкости выделяют экзотоксин, подвергают его высокой очистке ультрафильтрацией на полых волокнах с размером пор 13-17 к Да и концентрируют до содержания белка (по Лоури) 5,5 мг% с молекулярной массой 18-20 кДа. Далее к полученному антигену - лейкоцидин-эндотоксин добавляют 1% инактивированной бактериальной массы штамма Fusobacterium necrophorum "0-1" ВИЭВ до содержания Fusobacterium necrophorum "0-1" ВИЭВ 1,5 млрд клеток в 1 см³, затем сорбируют на 12% гидроокисью алюминия в гликолевом буфере с рН 8,4, взятой в конечной концентрации 1,0%. После сорбции антигена на гидрате окиси алюминия проверяют нейтрализацию остаточного количества формалина. К полученной реакционной среде последовательно добавляют натриевую соль сукцината хитозана, сапонин и глицерин, взятых в конечной концентрации 1,0%, 0,25% и 20,0% соответственно, получая состав 1 при следующем соотношении компонентов, мас. %:

Вакцину эмульгируют в гомогенизаторе при 3500 об/мин в течение 15 мин.

Полученная вакцина представляет собой однородную эмульсию белого цвета.

Пример 2. Для получения некробактериозного антигена - лейкоцидина-экзотоксина берут производственный штамм Fusobacterium necrophorum "0¬1" ВИЭВ, культивируют, инактивируют формалином в конечной концентрации 0,4%, отделяют бакмассу от культуральной жидкости центрифугированием, из культуральной жидкости выделяют экзотоксин, подвергают его высокой очистке ультрафильтрацией на полых волокнах с размером пор 13-17 к Да и концентрируют до содержания белка (по Лоури) 7,0 мг% с молекулярной массой 18-20 кДа. Далее к полученному антигену - лейкоцидин-эндотоксин добавляют 10% инактивированной бактериальной массы штамма Fusobacterium necrophorum "0-1" ВИЭВ до содержания Fusobacterium necrophorum "0-1" ВИЭВ 2,0 млрд клеток в 1 см, затем сорбируют на 15% гидроокисью алюминия в гликолевом буфере с рН 8,6, взятой в конечной концентрации 2,0%. После сорбции антигена на гидрате окиси алюминия проверяют нейтрализацию остаточного количества формалина. К полученной реакционной среде последовательно добавляют натриевую соль сукцината хитозана, сапонин и глицерин, взятых в конечной концентрации 5,0%, 0,75% и 30,0% соответственно, получая состав 2 при следующем соотношении компонентов, мас. %:

Вакцину эмульгируют в гомогенизаторе при 5000 об/мин в течение 20 мин.

Полученная вакцина представляет собой однородную эмульсию белого цвета.

Полученные по примерам 1-2 составы 1-2 применяют для профилактических и вынужденных прививок клинически здоровых животных однократно. Молодняк, не достигший 3-месячного возраста, прививать ассоциированной вакциной не разрешается. Вакцину вводят внутрикожно с помощью безыгольного инъектора в бесшерстный участок тела свиньям по 0,4 см³ и северным оленям по 0,2 см³.

Таблица 1

Сравнительная характеристика показателей иммуногенности известной и предлагаемой вакцин против некробактериоза через 2 года после вакцинации оленей в республике Саха (Якутия)

Кроме того, реактогенность в группе контрольных животных, получавших вакцину, полученную по прототипу, составила 6,5±2,1 см², в то время как в опытных группах она была равна 0.

Кроме того, реактогенность в группе контрольных животных, получавших вакцину, полученную по прототипу, составила 5,2±1,3 см², в то время как в опытных группах она была равна 0.

Таким образом, вакцина против некробактериоза является высокоэффективным препаратом, способным более длительно защитить животных от некробактериоза (более двух лет) и снизить реактогенность с 3,9-8,6 см до 0 см.

Изобретение относится к области биотехнологии и микробиологии. Описана вакцина против некробактериоза, содержащая инактивированный формалином лейкоцидин - экзотоксин, адсорбированный на гидроокиси алюминия, и дополнительно сапонин, глицерин и натриевую соль сукцината хитозана при определенном соотношении компонентов. Также описан способ получения такой вакцины. Изобретение может быть использовано в ветеринарии для профилактики некробактериоза животных. 2 н.п. ф-лы, 2 табл., 2 пр.

1. Вакцина против некробактериоза, содержащая инактивированный формалином лейкоцидин-экзотоксин, полученный из производственного штамма Fusobacterium necrophorum "0-1" ВИЭВ, отличается тем, что инактивированный формалином лейкоцидин-экзотоксин, полученный из производственного штамма Fusobacterium necrophorum "0-1" ВИЭВ, представляет собой высокоочищенный белок с молекулярной массой 18-20 кДа с содержанием 1,5-2,0 млрд клеток Fusobacterium necrophorum "0-1" ВИЭВ в 1 см³, адсорбированный на гидроокиси алюминия, и дополнительно содержит сапонин, глицерин и натриевую соль сукцината хитозана при следующем соотношении компонентов, мас.%:

2. Способ получения вакцины против некробактериоза путем культивирования штамма Fusobacterium necrophorum "0-1" ВИЭВ, инактивирования его формалином, отделения бактериальной массы от культуральной жидкости центрифугированием, выделением из культуральной жидкости экзотоксина - лейкоцидина, его очистки и концентрирование ультрафильтрацией на полых волокнах и адсорбцией на гидроокиси алюминия в гликолевом буфере и добавления инактивированной бактериальной массы штамма Fusobacterium necrophorum "0-1" ВИЭВ, отличающийся тем, что к экзотоксину-лейкоцидину добавляют инактивированную бактериальную массу штамма Fusobacterium necrophorum "0-1" ВИЭВ с содержанием 1,5-2,0 млрд. клеток Fusobacterium necrophorum "0-1" ВИЭВ в 1 см³, после чего последовательно добавляют натриевую соль сукцината хитозана и сапонин, а глицерин добавляют сразу после добавления сапонина.