СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ НЕКРОБАКТЕРИОЗА ЖИВОТНЫХ Российский патент 1998 года по МПК A61K39/02 A61K39/114 

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии и биотехнологии и касается получения вакцины для лечения и профилактики некробактериоза животных.

Однако известный способ нетехнологичен: очень трудоемка и длительна операция по извлечению комплексных водорастворимых антигенов, а также операция по диализу антигенов против дистиллированной и водопроводной воды.

Наиболее близким аналогом является способ получения вакцины против некробактериоза рогатого скота, включающий выделение из местного очага эпизоотической культуры возбудителя некробактериоза, ее выращивание, инактивацию, отделение биомассы от культуральной жидкости центрифугированием, извлечение антигена из биомассы путем последовательного трехкратного замораживания-оттаивания клеток и их гомогенизации с последующим центрифугированием и выделением из супернатанта протективного антигена, представляющего собой цитоплазматическую фракцию, содержащую эндотоксин, и параллельно выделение экзотоксина осаждением его желатином, объединение полученных антигенов в соотношении 1 : 3, повторное добавление инактиватора формалина и соединение с масляно-ланолиновым адъювантом в соотношении 1 : 1.

Известный способ получения вакцины предусматривает предварительный подбор местных штаммов для каждого конкретного хозяйства, что невозможно при промышленном производстве. Кроме того, нетехнологичны стадии разделения бактериальной суспензии и концентрирования экзотоксина.

Задачей изобретения является разработка промышленной технологии производства инактивированной эмульгированной вакцины против некробактериоза, обладающей высокой иммуногенной активностью.

Технический результат изобретения заключается в упрощении технологии производства вакцины, сокращении времени и энерго- и трудозатрат и получении высокоиммуногенной вакцины, обеспечивающей формирование длительного и напряженного иммунитета против некробактериоза.

Сущность изобретения заключается в следующем.

Для изготовления вакцины используют штамм Bacteroides necrophorum (ВИЭВ), селекционированный по признаку максимальной иммуногенной и антигенной активности, культивируют, отделяют биомассу от культуральной жидкости центрифугированием, экзотоксин из культуральной жидкости выделяют ультрафильтрацией на полых волокнах с размером пор 1,3 - 1,7 КДа и концентрируют до содержания белка (по Лоури) 5,5 - 6,0 мг/мл, а отделенную биомассу ресуспендируют в физиологическом р-ре до концентрации 100 - 120 млрд. кл/мл, из полученной суспензии извлекают эндотоксин многократным замораживанием и оттаиванием до полного разрушения бактериальных клеток, отделяют его от клеточного дейтрита центрифугированием, устанавливают концентрацию белка (по Лоури) на уровне 2,5 - 3,0 мг/мл, затем смешивают полученные эндотоксин и экзотоксин в равных объемных соотношениях и добавляют адъювант - на основе минерального масла и ланолина.

Использование производственного штамма Bacteroides necrophorum (ВИЭВ), характеризующегося высокой антигенной активностью и широтой иммуногенной спектра, позволяет получать вакцину, эффективную в различных хозяйствах. Кроме того, выделение и концентрирование экзотоксина ультрафильтрацией упрощает технологию изготовления вакцины и улучшает ее качественные характеристики (снижение реактоганности, повышение иммуногенности). Все компоненты (эндотоксин, экзотоксин, инактиватор, адъювант) соединяют в вакцине в определенных соотношениях, также обеспечивающих получение высокоэффективного препарата.

Производственный штамм Bacteroides necrophorum (ВИЭВ) (условное обозначение B. necrophorum "0-1") выделен из копыта больного оленя и селекционирован по антигенной и иммуногенной активности, хранится в коллекции Всероссийского научно-исследовательского института экспериментальной ветеринарии им. Я. Р. Коваленко и в коллекции Всероссийского государственного научно-исследовательского института контроля. Стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов.

Производственный штамм B. necrophorum (ВИЭВ) является безвредным для человека и относится к четвертой группе патогенных микроорганизмов, характеризуется следующими свойствами.

Морфологические свойства. Граммотрицательные одиночные палочки размером 0,5 - 1,5 мкм (ширина) и 1,5 - 3,0 мкм (длина) или длинные зернисто-окрашенные нити длиной 30 - 400 мкм. У части нитей могут быть шаровидные или колбовидные вздутия. Спор и капсул не образуют.

Культуральные свойства. На среде Китт-Тароцци при культивировании в термостате при 37 ± 0,5^oC через 24 - 48 ч появляется помутнение, на кусочках печени образуется хлопковидный осадок, незначительное газообразование. В аэробных условиях на мясо-пептонном бульоне и мясо-пептонном агаре роста нет.

Ферментативная активность. Не ферментирует углеводы и многоатомные спирты, не разжижает желатин, не свертывает молоко, образует индол и сероводород.

Вирулентные свойства. Вирулентен для лабораторных животных - кроликов и белых мышей.

Лиофилизированный штамм освежают один раз в год пассажами через лабораторных животных (кроликов).

Пример 1. Штамм B. necrophorum (ВИЭВ) культивируют на среде Китт-Тароцци в бутылях в течение 2-х сут. при 37^oC, затем пересеивают в флаконы с той же средой. Выращенную матровую расплодку засевают в биореактор с предварительно простерилизованной питательной средой на основе перевара Хоттингера. Выращивание проводят 30 - 36 ч. при 37^oC. В процессе культивирования через засеянную среду периодически пропускают очищенный азот.

По окончании выращивания культуру проверяют на чистоту роста и оптическую концентрацию. Инактивируют формалином в конечной концентрации 0,4%.

Инактивированную выросшую культуру разделяют на биомассу и культуральную жидкость центрифугированием.

Из культуральной жидкости (центрифугат) выделяют и концентрируют экзотоксин на ультрафильтрационной установке с полыми волокнами, имеющими размер пор 1,5 КДа, до содержания белка 6,0 мг/мл. Контроль концентрирования экзотоксина проводят по методу Лоури. Затем в экзотоксин вводят формалин с конечной концентрацией 0,4% и выдерживают при 42^oC в течение 15 сут.

Для получения эндотоксина отделенную биомассу ресуспендируют в физиологическом растворе до концентрации 100 млрд. кл/мл и разрушают многократно чередующимися операциями замораживания и оттаивания по методу Грассе, до полного разрушения бактериальных клеток.

Отделение эндотоксина от клеточного дейтрита проводят центрифугированием с последующим контролем наличия эндотоксина по методу Лоури. Концентрация белка в эндотоксине составляет 2,5 - 3,0 мг/мл. Полученный эндотоксин инактивируют формалином.

Инактивированные эндотоксин и экзотоксин смешивают в равных объемных соотношениях и соединяют с адъювантом на основе минерального масла и ланолина. Полученную смесь гомогенизируют на коллоидной мельнице и готовую вакцину расфасовывают.

Пример 2. Полученную по примеру 1 вакцину против некробактериоза, используют в неблагополучном по некробактериозу хозяйстве для профилактики и лечения крупного рогатого скота.

Вакцину вводят подкожно двукратно, сначала в дозе 2 мл, затем в дозе 3 мл. Всего было вакцинировано около 2000 животных.

Вакцинация больного и условно здорового скота инактивированной эмульсин-вакциной позволила ликвидировать некробактерии в хозяйстве.

В результате проведенной проверки установлено, что вакцина обладает как профилактическими, так и лечебными свойствами, и предохраняет 86 - 89% животных от заболевания.

Комплексное применение вакцины совместно с гипериммунной сывороткой способствует полной ликвидации болезни в течение 1 - 1,5 лет.

Пример 3. Полученную инактивированную эмульгированную вакцину против некробактериоза применяют для вакцинации северных оленей. При этом иммунизировано 2095 голов оленей. Из них дали осложнения всего 299 в виде припухлостей, заболели легкой формой некробактериоза 23 гол. оленей. Падежа среди вакцинированного поголовья нет.

Эффективность от вакцинации составляет 97,1%.

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии и биотехнологии и касается получения вакцины для профилактики и лечения некробактериоза рогатого скота. Для изготовления вакцины используют производственный штамм Bacteroides necrophorum (ВИЭВ), селекционированный по признаку максимальной иммуногенной и антигенной активности. Выращивают его, инактивируют и отделяют биомассу от культуральной жидкости центрифугированием. Из культуральной жидкости ультрафильтрацией на полых волокнах с размером пор 1,3 - 1,7 КДа выделяют экзотоксин с содержанием белка 5,5 - 6,0 мг/мл и инактивируют формалином. Отделенную биомассу ресуспендируют в физиологическом растворе до концентрации 10 - 120 млрд. кл/мл и из полученной суспензии экстрагируют эндотоксин многократным замораживанием и оттаиванием. Далее отделяют эндотоксин от клеточного дейтрита центрифугированием и устанавливают концентрацию белка на уровне 2,5 - 3,0 мг/мл. Смешивают полученные эндотоксин и экзотоксин в равных объемных соотношениях и добавляют адьювант на основе минерального масла и ланолина. Технический результат изобретения заключается в упрощении технологии производства вакцины, сокращении времени и энерго- и трудозатрат и получении высокоиммуногенной вакцины, обеспечивающей формирование длительного и напряженного иммунитета против некробактериоза.

Способ изготовления вакцины против некробактериоза животных, включающий выращивание штамма возбудителя некробактериоза, инактивацию выросшей культуры, разделение ее на биомассу и культуральную жидкость, ресуспендирование отделенной биомассы, экстракцию антигена, содержащего эндотоксин, многократным замораживанием и оттаиванием полученной суспензии, центрифугированием и отделением антигена из супернатанта, параллельное извлечение экзотоксина из культуральной жидкости, инактивацию полученных экзотоксина и эндотоксина, их объединение с последующим добавлением адъюванта на основе минерального масла и ланолина и получением целевого продукта, отличающийся тем, что из штаммов выращивают производственный штамм Bacteroides necrophorum (ВИЭВ), отделенную биомассу ресуспендируют в физиологическом растворе до концентрации 100 - 120 млрд кл. /мл, выделяют эндотоксин с концентрацией белка 2,5 - 3,0 мг/мл, а извлечение экзотоксина осуществляют ультрафильтрацией на полых волокнах с размером пор 1,3 - 1,7 КДа до содержания белка в экзотоксине 5,5 - 6,0 мг/мл, смешивают экзотоксин и эндотоксин в равных объемных соотношениях.