СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГИПЕРИММУННОЙ СЫВОРОТКИ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ И ПРОФИЛАКТИКИ НЕКРОБАКТЕРИОЗА СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ Российский патент 2017 года по МПК A61K39/02 C12N1/20 

Изобретение относится к ветеринарной биотехнологии и микробиологии, в частности к получению сыворотки для профилактики и лечения некробактериоза животных.

Некробактериоз широко распространен во всех странах мира и характеризируется гнойно-некротическим распадом кожи, слизистых оболочек, паренхиматозных органов и конечностей. В процессе переболевания некробактериозом животные теряют 30-40% живой массы тела и до одной тонны молока. Особенно большой экономический ущерб наносит некробактериоз северному оленеводству, где в год заболевает до 50-70 тыс оленей, при этом погибает, как правило, 30-35% животных.

Известен препарат для лечения некробактериоза, содержащий сульфадиметоксин, хинозол, фурацилин, диметилсульфоксид, ацетон, глицерин, твин 40 или 80 и спирт этиловый (патент RU 1524224, опубл. 27.08.1995, А61K 31/00). Однако известный препарат не дает полного лечебного эффекта, имеет узкий спектр действия и сравнительно длительные сроки лечения.

Известен также препарат для профилактики некробактериоза сельскохозяйственных животных, содержащий антибиотик окситетрациклин, активированный иммуностимулятором (патент RU 2112546, опубл. 10.06.98). Однако этот препарат не всегда надежно защищает животных от заболевания.

Наиболее близким аналогом является способ получения гипериммунной сыворотки для лечения и профилактики некробактериоза сельскохозяйственных животных путем гипериммуннизации волов-продуцентов инактивированным формалином антигеном, выделенным из производственного штамма Fusobacterium necrophorum "0-1" ВИЭВ (патент RU 2329828, опубл. 27.07.2008, МПК А61K 39/02).

Однако известная сыворотка недостаточна эффективна и требует двукратного введения.

Задачей изобретения является повышение эффективности целевого продукта.

Технический результат изобретения достигается в способе получения гипериммунной сыворотки для лечения и профилактики некробактериоза сельскохозяйственных животных путем гипериммуннизации волов-продуцентов инактивированным формалином антигеном, выделенным из производственного штамма Fusobacterium necrophorum "0-1" ВИЭВ, тем, что антиген получают культивированием производственного штамма Fusobacterium necrophorum "0-1" ВИЭВ, далее культуральную жидкость подвергают ультрафильтрации с размером пор 13-20 кДа, к ультрафильтрату добавляют 8-10% бактериальной массы штамма Fusobacterium necrophorum "0-1" ВИЭВ до содержания Fusobacterium necrophorum "0-1" ВИЭВ 1,5-2,0 млрд клеток в 1 см³, добавляют натриевую соль сукцината хитозана, взятую в конечной весовой концентрации 0,5-1,5%, проводят инактивацию формалином, взятым в конечной концентрации 0,3-0,4%, в течение 12-14 суток при 37-38°С, затем полученный антиген сорбируют на 10-15% гидроокиси алюминия в гликолевом буфере с рН 8,4-8,6, взятой в конечной концентрации 1,8-2,0%, а гипериммунизацию волов-продуцентов проводят вначале вакциной для профилактики некробактериоза сельскохозяйственных животных в дозе 0,4-0,6 мл/животное, затем через 4-5 недель антигеном, полученным способом, описанным выше, из расчета 1,5-2,0 мл антигена на 100 кг веса тела животного вначале однократно внутрикожно в предлопаточный паховый лимфоузел совместно с масляным адъювантом, взятым в весовом соотношении к антигену как 1:0,8-1,0, затем дважды с интервалом 5-7 дней внутрикожно вводят 0,5-0,6 мл антигена на 100 кг веса тела животного вначале в правый предлопаточный и левый паховый лимфоузлы, затем - в левый предлопаточный и правый паховый лимфоузлы.

Известна вакцина против некробактериоза животных (патент RU 2329828, опубл. 27.07.2008, Бюл. №21, МПК А61K 39/02, А61Р 31/04).

Известен способ получения натриевой соли сукцината хитозана (Патент RU 2144040, МПК С08В 37/08, A61K 31/722, опубликовано 10.01.2000), который может быть использован в ветеринарии, медицине и косметике в качестве пленкообразователя, гидранта или эмульгатора.

В патентной и научно-технической литературе не известны технические решения, содержащие режимы способа получения гипериммунной сыворотки для лечения и профилактики некробактериоза сельскохозяйственных животных, аналогичные заявляемому, т.е. предложение соответствует критерию «новизны».

Все режимы способа осуществимы в промышленных условиях, направлены на решение реальной технической задачи, т.е. предложение «промышленно применимо».

Впервые предложен способ получения гипериммунной сыворотки для лечения и профилактики некробактериоза сельскохозяйственных животных, где некробактериозный антиген получают культивированием производственного штамма Fusobacterium necrophorum "0-1" ВИЭВ, далее культуральную жидкость подвергают ультрафильтрации, к ультрафильтрату добавляют бактериальную массу штамма Fusobacterium necrophorum "0-1" ВИЭВ и натриевую соль сукцината хитозана, проводят инактивацию формалином, затем полученный антиген сорбируют на гидроокиси алюминия при определенных условиях, т.е. предложение соответствует критериям «новизна» и «изобретательский уровень».

Изобретение иллюстрируется на следующих примерах.

Пример 1. Сыворотку получают путем гипериммунизации животных антигеном возбудителя некробактериоза.

Для получения некробактериозного антигена берут производственный штамм Fusobacterium necrophorum "0-1" ВИЭВ, культивируют, отделяют бакмассу от культуральной жидкости центрифугированием, из культуральной жидкости выделяют экзотоксин ультрафильтрацией на полых волокнах с размером пор 13-20 кДа, к ультрафильтрату добавляют 10% бактериальной массы штамма Fusobacterium necrophorum "0-1" ВИЭВ до содержания Fusobacterium necrophorum "0-1" ВИЭВ 2,0 млрд клеток в 1 см³, добавляют натриевую соль сукцината хитозана, взятую в конечной весовой концентрации 1,5%, проводят инактивацию формалином, взятым в конечной концентрации 0,4%, в течение 14 суток при 38°С, затем полученный антиген сорбируют на 15% гидроокиси алюминия в гликолевом буфере с рН 8,6, взятой в конечной концентрации 2,0%, а гипериммунизацию волов-продуцентов проводят вначале вакциной для профилактики некробактериоза сельскохозяйственных животных в дозе 0,6 мл/животное, затем через 5 недель антигеном, полученным способом, описанным выше, из расчета 2,0 мл антигена на 100 кг веса тела животного вначале однократно внутрикожно в предлопаточный паховый лимфоузел совместно с масляным адъювантом, взятым в весовом соотношении к антигену как 1:0,8, затем дважды с интервалом 7 дней внутрикожно вводят 0,6 мл антигена на 100 кг веса тела животного вначале в правый предлопаточный и левый паховый лимфоузлы, затем - в левый предлопаточный и правый паховый лимфоузлы.

После этого проводят контроль бактериологический, физико-химический и активности сыворотки. Сыворотка содержит антитела к F. necrophorum в титре не ниже 1:128 (в РА). За период наблюдения в течение 10 дней все животные оставались здоровыми. На месте введения изменений нет.

Пример 2. Сыворотку получают путем гипериммунизации животных антигеном возбудителя некробактериоза.

Для получения некробактериозного антигена берут производственный штамм Fusobacterium necrophorum "0-1" ВИЭВ, культивируют, отделяют бакмассу от культуральной жидкости центрифугированием, из культуральной жидкости выделяют экзотоксин ультрафильтрацией на полых волокнах с размером пор 13-20 кДа, к ультрафильтрату добавляют 8% бактериальной массы штамма Fusobacterium necrophorum "0-1" ВИЭВ до содержания Fusobacterium necrophorum "0-1" ВИЭВ 1,5 млрд клеток в 1 см³, добавляют натриевую соль сукцината хитозана, взятую в конечной весовой концентрации 0,5%, проводят инактивацию формалином, взятым в конечной концентрации 0,3%, в течение 12 суток при 37°С, затем полученный антиген сорбируют на 10% гидроокиси алюминия в гликолевом буфере с рН 8,4, взятой в конечной концентрации 1,8%, а гипериммунизацию волов-продуцентов проводят вначале вакциной для профилактики некробактериоза сельскохозяйственных животных в дозе 0,4 мл/животное, затем через 4 недель антигеном, полученным способом, описанным выше, из расчета 1,5 мл антигена на 100 кг веса тела животного вначале однократно внутрикожно в предлопаточный паховый лимфоузел совместно с масляным адъювантом, взятым в весовом соотношении к антигену как 1:1, затем дважды с интервалом 5 дней внутрикожно вводят 0,5 мл антигена на 100 кг веса тела животного вначале в правый предлопаточный и левый паховый лимфоузлы, затем - в левый предлопаточный и правый паховый лимфоузлы.

После этого проводят контроль бактериологический, физико-химический и активности сыворотки. Сыворотка содержит антитела к F. necrophorum в титре не ниже 1:128 (в РА). За период наблюдения в течение 10 дней все животные оставались здоровыми. На месте введения изменений нет.

Пример 3. Полученную по примерам 1-2 сыворотку применяют для клинического испытания в хозяйстве.

В опыт берут 150 оленей с первой стадией заболевания, которая характеризовалась покраснением и отеком области межкопытной щели, венчика и сгибательной поверхности пута, серозным выделением у отдельных животных, которое высыхало, образуя на коже корку. Температура тела повышалась до 40° и выше. Животные были угнетены, у них прекращалась жвачка, резко снижались удои. Эта группа была поделена на три группы по 50 животных. 1-я группа (опытная) подвергалась лечению гипериммунной сывороткой, полученной по примеру 1, 2-я группа (опытная) подвергалась лечению гипериммунной сывороткой, полученной по примеру 2, 3-я группа получила лечение гипериммунной сывороткой, полученной по известному техническому решению (прототипу).

Перед применением гипериммунных сывороток производят расчистку и обрезку копыт, туалет раневой поверхности, удаляют омертвевшие ткани. Всем животным, получающих лечение, на раневую поверхность накладывают ватно-марлевый тампон, пропитанный гипериммунной сывороткой, и фиксируют его поддерживающей повязкой. Одновременно с наложением повязки каждому животному в круп вводят по 150 мл гипериммунной сыворотки.

За подопытными животными установлено клиническое наблюдение с двукратным измерением температуры. Через 4-6 суток повязки с конечностей снимают и проводят осмотр раневой поверхности.

У животных первой и второй группы раны очистились от клеточного дейтрита, на отдельных участках появились очаги грануляционной ткани. У животных третьей группы была обнаружена грануляционная ткань, заполняющая всю раневую поверхность. В результате лечебных мероприятий в первой и второй группах были излечены 49 и 47 животных, соответственно. Эффективность лечения составляет 98 и 94%. В третьей группе были излечены только 32 животных. Эффективность лечения составляет 64%. У животных 3-й группы болезнь прогрессировала.

Пример 4. Полученную по примерам 1-2 сыворотку применяют для клинического испытания в хозяйстве.

В опыт берут 150 оленей со второй стадией заболевания, при которой патологический процесс увеличен, очаг с мягких тканей переходил на надкостницу, иногда возникал оссифицирующий периостит и остеоартрит копытного сустава. У животных установлена выраженная хромота, пораженная конечность горяча на ощупь и резко болезненна, в местах поражения возникала характерная язва с изрытыми краями. Эта группа была поделена на три группы по 50 животных. 1-я группа (опытная) подвергалась лечению гипериммунной сывороткой, полученной по примеру 1, 2-я группа (опытная) подвергалась лечению гипериммунной сывороткой, полученной по примеру 2, 3-я группа получила лечение гипериммунной сывороткой, полученной по известному техническому решению (прототипу).

Перед применением гипериммунных сывороток производят расчистку и обрезку копыт, туалет раневой поверхности, удаляют омертвевшие ткани. Всем животным, получающих лечение, на раневую поверхность накладывают ватно-марлевый тампон, пропитанный гипериммунной сывороткой, и фиксируют его поддерживающей повязкой. Одновременно с наложением повязки каждому животному в круп вводят по 150 мл гипериммунной сыворотки.

За подопытными животными установлено клиническое наблюдение с двукратным измерением температуры. Через 14-16 суток повязки с конечностей снимают и проводят осмотр раневой поверхности.

У животных первой и второй группы раны очистились от клеточного дейтрита, на отдельных участках появились очаги грануляционной ткани. У животных третьей группы была обнаружена грануляционная ткань, заполняющая всю раневую поверхность. В результате лечебных мероприятий в первой и второй группах были излечены 48 и 46 животных. Эффективность лечения составляет 96 и 92%, соответственно. В третьей группе были излечены только 20 животных. Эффективность лечения составляет 40%. У животных 3-й группы болезнь прогрессировала.

Таким образом, гипериммунная сыворотка против некробактериоза позволяет на 28-58% повысить эффективность лечения некробактериоза и может быть использована как специфическое лечебное средство с терапевтической и профилактической целью в неблагополучных по некробактериозу животноводческих и оленеводческих хозяйствах. Сыворотка может применяться сочетанно с вакцинацией животных, особенно в начальной стадии болезни.

Изобретение относится к области биотехнологии и предназначено для получения сыворотки для профилактики и лечения некробактериоза животных. Способ включает гипериммуннизацию волов-продуцентов инактивированным формалином антигеном, выделенным из производственного штамма Fusobacterium necrophorum "0-1" ВИЭВ. Антиген получают культивированием производственного штамма Fusobacterium necrophorum "0-1" ВИЭВ. Далее культуральную жидкость подвергают ультрафильтрации с размером пор 13-20 кДа, к ультрафильтрату добавляют 8-10% бактериальной массы штамма Fusobacterium necrophorum "0-1" ВИЭВ до содержания Fusobacterium necrophorum "0-1" ВИЭВ 1,5-2,0 млрд клеток в 1 см³, добавляют натриевую соль сукцината хитозана, взятой в конечной весовой концентрации 0,5-1,5%. Проводят инактивацию формалином, взятом в конечной концентрации 0,3-0,4% в течение 12-14 суток при 37-38°С. Затем полученный антиген сорбируют на 10-15% гидроокиси алюминия в гликолевом буфере с рН 8,4-8,6, взятой в конечной концентрации 1,8-2,0%. Гипериммунизацию волов-продуцентов проводят вначале вакциной для профилактики некробактериоза сельскохозяйственных животных в дозе 0,4-0,6 мл/животное, затем через 4-5 недель антигеном, полученным способом, описанным выше, из расчета 1,5-2,0 мл антигена на 100 кг веса тела животного вначале однократно внутрикожно в предлопаточный паховый лимфоузел, совместно с масляным адъювантом, взятым в весовом соотношении к антигену как 1:0,8-1,0. Затем дважды с интервалом 5-7 дней внутрикожно вводят 0,5-0,6 мл антигена на 100 кг веса тела животного вначале в правый предлопаточный и левый паховый лимфоузлы, затем - в левый предлопаточный и правый паховый лимфоузлы. Способ позволяет получать высококачественную эффективную сыворотку для профилактики и лечения некробактериоза животных. 4 пр.

Способ получения гипериммунной сыворотки для лечения и профилактики некробактериоза сельскохозяйственных животных путем гипериммуннизации волов-продуцентов инактивированным формалином антигеном, выделенным из производственного штамма Fusobacterium necrophorum "0-1" ВИЭВ, отличающийся тем, что антиген получают культивированием производственного штамма Fusobacterium necrophorum "0-1" ВИЭВ, далее культуральную жидкость подвергают ультрафильтрации с размером пор 13-20 кДа, к ультрафильтрату добавляют 8-10% бактериальной массы штамма Fusobacterium necrophorum "0-1" ВИЭВ до содержания Fusobacterium necrophorum "0-1" ВИЭВ 1,5-2,0 млрд клеток в 1 см³, добавляют натриевую соль сукцината хитозана, взятую в конечной весовой концентрации 0,5-1,5%, проводят инактивацию формалином, взятым в конечной концентрации 0,3-0,4%, в течение 12-14 суток при 37-38°С, затем полученный антиген сорбируют на 10-15% гидроокиси алюминия в гликолевом буфере с рН 8,4-8,6, взятой в конечной концентрации 1,8-2,0%, а гипериммунизацию волов-продуцентов проводят вначале вакциной для профилактики некробактериоза сельскохозяйственных животных в дозе 0,4-0,6 мл/животное, затем через 4-5 недель - антигеном, полученным способом, описанным выше, из расчета 1,5-2,0 мл антигена на 100 кг веса тела животного вначале однократно внутрикожно в предлопаточный паховый лимфоузел совместно с масляным адъювантом, взятым в весовом соотношении к антигену как 1:0,8-1,0, затем дважды с интервалом 5-7 дней внутрикожно вводят 0,5-0,6 мл антигена на 100 кг веса тела животного вначале в правый предлопаточный и левый паховый лимфоузлы, затем - в левый предлопаточный и правый паховый лимфоузлы.