СПОСОБ ВОССТАНОВЛЕНИЯ АНТАГОНИСТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ЭНДОФИТНОГО ШТАММА Bacillus subtilis 26Д ВНИИСХМ 128 Российский патент 2016 года по МПК C12Q1/04 C12N1/20 C12R1/125 

Основной многих биологических препаратов, в том числе средств защиты растений, являются микроорганизмы с хозяйственно-полезными свойствами. Несмотря на хорошо разработанные методы их культивирования, а также технологии получения различных микробиологических продуктов определенную трудность представляет поддержание на протяжении длительного времени - до нескольких десятков лет - биологической активности бактерий или грибов, являющихся основой таких препаратов.

Современные методы консервации, например криосохранение, являются относительно эффективными при поддержании лабораторных культур микроорганизмов. Однако консервация с полным сохранением популяций, геномов и даже отдельных фенотипических признаков представляет собой проблему, так же как и восстановление необходимой биологической активности после получения жизнеспособных клеток (1).

Известно, что потеря биологической активности может происходить по многим причинам, в том числе из-за пассажей на определенном субстрате (2). Существует несколько способов восстановления свойств микроорганизмов, из которых наиболее известен способ многоступенчатого культивирования на селективной среде. Однако данный способ трудно применить к восстановлению свойства, которое определяется множеством факторов. Так, например, подавление роста фитопатогенных грибов бактериями Bacillus subtilis может происходить благодаря наличию у одного и того же штамма бактерии сразу нескольких полезных свойств - синтеза ферментов хитиназ, глюканаз, протеаз, выделения антибиотиков, продукции сидерофоров и так далее, которые в сумме и составляют высокую антагонистическую активность (3). В этих условиях практически невозможно выделить один селективный фактор среды для отбора колонии с необходимой биологической активностью.

Наличие нескольких свойств, суммирующихся в одном, - антагонизм, относится и к эндофитному штамму бактерий В. subtilis 26Д ВНИИСХМ 128 - основе биофунгицидов Фитоспорин, Фитоспорин-М. Культура в лаборатории поддерживается пересевом на мясо-пептонном агаре (5) или других средах (4), но при этом антагонистическая активность клеток бактерий снижается, что заставляет постоянно вести их селекцию, вплоть до получения из исходной популяции клеток нового штамма, например 1К (6).

В связи с этим возникает задача восстановить антагонистическую активность штамма В. subtilis 26Д ВНИИСХМ 128 без изменения других его свойств.

Аналогом решения данной задачи может быть способ, предложенный в изобретении по патенту РФ №2102484, в котором для восстановления вирулентности бактерии Bacillus anthracis ее пассируют через организм беспородных белых мышей. По известному способу животных заражают споровой или вегетативной культурой, из органов павших или забитых животных выделяют субкультуру, которой вновь заражают животных.

По аналогии с этим способом можно инокулировать растения эндофитным антагонистическим штаммом В. subtilis 26Д ВНИИСХМ 128, а затем выделить из растений реинокулят и оценить изменения его антагонистических и других свойств. Однако до настоящего изобретения такой способ в литературе не был описан ни для одного из эндофитных антагонистических штаммов бактерий, так же как не была известна способность данного штамма восстанавливать антагонистическую активность по отношению к фитопатогенным грибам после реинокуляции.

Поставленная выше задача решается тем, что стерильные микрорастения картофеля, выращенные на среде Мурасиге-Скуга (8), поверхностно инокулируются исходной культурой штамма В. subtilis 26Д ВНИИСХМ 128 с ослабленной антагонистической активностью путем нанесения споровой культуры на листья в асептических условиях. Через 14 дней в асептических условиях микрорастения поверхностно стерилизуются 3%-ным раствором гипохлорита натрия, трижды отмываются от антисептика стерильной дистиллированной водой, разрезаются на сегменты длиной 1-1,5 см, которые затем проводятся над пламенем спиртовки. Затем сегменты выкладываются в чашки Петри на картофельно-глюкозный агар, чашки закрываются и выдерживаются 48 часов. После этого выросшую на агаре культуру бактерий смывают стерильным 0,9% раствором хлорида натрия и культивируют в мясо-пептонном бульоне при температуре 37°C на качалке при перемешивании с частотой 180 об/мин в течение 72 часов. Полученной культурой засевают поверхность картофельно-глюкозного агара и далее проводят тест на антагонистическую активность согласно методике, описанной в работе Нетрусова А.И. с соавторами (9).

В результате добиваются усиления антагонистическй активности штамма по отношению к различным видам фитопатогенных грибов (таблица) по сравнению с исходной культурой клеток. При этом все другие культурально-морфологические и биохимические свойства, характерные для штамма В. subtilis 26Д ВНИИСХМ 128, не меняются. Способ позволяет отказаться от повторной многократной инокуляции растений по сравнению с аналогом, описанным выше, а также от трудоемкого отбора отдельных колоний в исходной популяции клеток с непредсказуемым результатом, способным привести к существенному изменению других свойств штамма, как это описано в источнике 6.

Сравнительная антагонистическая активность реинокулята штамма Bacillus subtilis 26Д ВНИИСХМ 128

Источники информации

1. Методы длительного хранения коллекционных культур микроорганизмов и тенденции развития / В.Д. Похиленко, А.М. Баранов, К.В. Детушев // Известия высших учебных заведений. Поволжский регион. Медицинские науки. 2009. №4 (12). С. 99-121.

2. Цветкова Н.Б. Влияние факторов среды на биологические свойства Listeria monocytogenes, контаминирующей пищевые продукты. Автореф. дисс. д-ра биол. наук. Владивосток, 2011. 38 с.

3. Фитоспорин - надежная защита сельскохозяйственных культур. «Нивы Зауралья». 2015. №2.

4. Байгузина Ф.А., Штроман Г.А. Способ получения препарата фитоспорин. Патент РФ №2128914. Опубл. 20.04.1999.

5. Хайруллин P.M., Недорезков В.Д., Мубинов И.Г., Захарова Р.Ш. Повышение устойчивости пшеницы к абиотическим стрессам эндофитным штаммом Bacilus subtilis // Вестник Оренбургского государственного университета. 2007. №2. С. 129-134.

6. Биологизация земледелия - основа устойчивости сельскохозяйственного производства. Государственное казенное учреждение «Ставропольский сельскохозяйственный информационно-консультационный центр», http: //www.stav-ikc.ru/, 06.10.2014 г.

7. Еременко Е.И., Цыганкова О.И., Солодовников Б.В. Способ восстановления вирулентности штаммов сибиреязвенного микроба. Патент РФ №2102484. Опубл. 20.01.1998.

8. Нетрусов А.И., Егорова М.А., Захарчук Л.М., Колотилова Н.Н. и др. Практикум по микробиологии: учебное пособие для студентов высших учебных заведений (ред. Нетрусов А.И.). М.: Академия, 2005. 608 с.

9. Калинин Ф.Л., Сариацкая В.В., Полищук В.Е. Методы культуры тканей в физиологии и биохимии растений. Киев: Наук. думка, 1980. 488 с.

Изобретение относится к биотехнологии. Способ предусматривает выращивание стерильных микрорастений картофеля на среде Мурасиге-Скуга. Выращенные микрорастения картофеля в асептических условиях поверхностно инокулируют Bacillus subtilis 26Д ВНИИХМ 128 с пониженной антагонистической активностью путем нанесения споровой культуры на листья. Через 14 дней в асептических условиях из поверхностно стерилизованных фрагментов стеблей картофеля выделяют культуру клеток. При этом антагонистическая активность выделенной культуры выше, чем у исходной популяции клеток. Изобретение позволяет упростить способ восстановления антагонистической активности, а также повысить антагонистическую активность штамма по отношению к фитопатогенным грибам. 1 табл.

Способ восстановления антагонистической активности эндофитного штамма Bacillus subtilis 26Д ВНИИСХМ 128, отличающийся тем, что в асептических условиях стерильные микрорастения картофеля поверхностно инокулируют спорами исходного штамма, культивируют растения 14 дней и затем выделяют из поверхностно стерилизованных внутренних тканей культуру клеток бактерий, которая обладает повышенной антагонистической активностью по сравнению с исходной без изменения других культурально-морфологических и биохимических свойств, характерных для данного штамма.