Штамм бактерий Bacillus subtilis с комплексной биологической активностью Российский патент 2020 года по МПК C12N1/21 A01N63/00 

Основой наиболее эффективных биопестицидов, широко применяемых в России для борьбы с насекомыми-вредителями, являются бактерии Bacillus thuringiensis (Bt), способные при споруляции формировать кристаллические инсектициды белковой природы [1]. Выбор Bt, как основы инсектицидных препаратов, обусловлен, с одной стороны, существованием множества подвидов бактерии - продуцентов токсинов для борьбы с представителями различных отрядов насекомых. С другой стороны, споровая форма микроорганизма и продукция кристаллического токсина позволяют производить длительно хранящиеся сухие препараты.

Способность Bt продуцировать белковые инсектициды широко применяется для генетической модификации растений, устойчивых к вредителям - колорадскому жуку, хлопковой совки, кукурузному мотыльку и другим [2-4]. В конце 1990-х - начале 2000 годов гены Bt, кодирующие синтез инсектотоксинов, стали внедрять в геном других видов бактерий. Например, таким способом из штамма Pseudomonas fluorescens Р469, активного против ряда фитопатогенных микроорганизмов, был получен рекомбинантный штамм IPM-44 с целью создания препаратов для комплексной защиты растений от болезней и вредных насекомых [1].

Перспективной для поиска новых способов борьбы с насекомыми с помощью энтомопатогенных и инсектицидных бактерий является идея постоянного присутствия таких микроорганизмов внутри растений, что позволяет такое природное свойство, как эндофитность. Известен патент [5], в котором авторы предлагают использование бактерий видов Bacillus,

, Brevibacillus, Paenibacillus, диких, мутантных или генетически модифицированных форм, проявляющих инсектицидные свойства, и выделенные, в том числе, из внутренних тканей растений хлопчатника [6]. Вместе с тем представляет интерес создание препаратов на основе эндофитов не только с инсектицидной активностью, но и фунгицидной, стимулирующей рост растений, антистрессовой и другими.

Известен штамм B.subtilis 26Д (деп.ВНИИСХМ 128), который является эндофитом, антагонистом фитопатогенных грибов, стимулирует рост растений, мобилизует фосфаты [7, 8], повышает устойчивость растений к тяжелым металлам [9] и является не патогенным для человека и животных.

В патентной литературе известны изобретения, описывающие использование штамма B.subtilis 26Д для защиты растений [10-15]. Известен патент на изобретение РФ [16], в котором описан инсектицидный препарат, включающий штамм B.subtilis 26Д, но это свойство препарата обусловлено включением в состав биопестицида двух инсектицидных бактерий В. thuringiensis ssp. thuringiensis (ВКПМ В-5689) и В. thuringiensis ssp. kurstaki (ВКПМ В-6066), так как по данным паспорта, научно-технической литературы, ярко выраженной, существенной инсектицидной активности штамм B.subtilis 26Д (деп. ВНИИСХМ 128) не проявляет.

Недостатком многофункционального препарата [16] является необходимость использования всех трех микроорганизмов одновременно, тогда как использование лишь одного штамма могло бы существенно (в данном примере, в три раза) сократить материальные, энергетические и другие ресурсы для производства препарата.

Таким образом, необходимо решение задачи получения на основе только одного штамма B.subtilis 26Д бактериального препарата с антагонистической, рост стимулирующей, фосфат-мобилизующей и высокой инсектицидной активностями.

Предварительная оценка в лабораторных условиях выявила, что обработка растений бактериями B.subtilis 26Д увеличивает смертность насекомых, но, как было установлено, это происходит вследствие изменения под влиянием бактерии микробиоценоза в кишечнике насекомых [17], тогда как прямого инсектотоксичного действия данный штамм не проявляет.

Поставленная задача придания прямой высокой инсектицидной активности решается тем, что создан штамм Bacillus subtilis 26ДСryСhS с антагонистической активностью по отношению фитопатогенным грибам и существенной инсектицидной активностью против различных видов вредных насекомых. Штамм В. subtilis 26ДСryСhS депонирован в Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения ОСХН РАН (ВКСМ) под номером RCAM04928. Штамм В. subtilis 26ДСryСhS создан методом рекомбинантной трансформации природного штамма В. subtilis 26Д модифицированной плазмидой pDG1662, содержащей целевой ген Cry 1Ia (идентификационный номер в GenBank Х62821.1).

Для достижения безопасности применения получаемого штамма в производстве и в сельском хозяйстве из плазмиды pDG1662 при помощи рестриктаз EcoR1 и Sph1 был удален ген устойчивости к хлорамфениколу и получен штамм В. subtilis 26ДСryСhS с интегрированным геном cry1Ia. Анализ эндофитности заявляемого штамма выявил, что она была присуща вновь созданной бактерии и сравнима с материнским штаммом (таблица). Обработка семян пшеницы бактериями штамма 26ДСryСhS стимулировала рост проростков; сохранилась также фосфатмобилизирующая активность клеток (таблица).

Новым свойством для модифицированного потомства бактерии В. subtilis 26ДСryСhS является высокая инсектицидная активность, существенно (примерно, в 2 раза) превышающая таковую по сравнению с исходным штаммом В. subtilis 26Д, сопоставимая, для сравнения, по значению с инсектицидными свойствами В. thuringiensis В-5351 по смертности тлей, и превышающая значения у штамма В. thuringiensis В-5351 по смертности личинок колорадского жука в тесте с предварительной обработкой целых растений препаратами (26% и 62%, соответственно, таблица).

Антагонистическая активность in vitro против фитопатогена Ph. infestans, вызывающего фитофтороз картофеля, была на 20% больше, площадь поражения листьев пшеницы фитопатогеном S. nodorum была на 30% меньше, чем у исходного штамма В. subtilis 26Д.

Хорошо известно, что фунгицидные и фунгистатические свойства многих штаммов бактерий В. subtilis проявляются благодаря микробному синтезу антибиотиков группы сурфактинов. Проведенные нами дополнительные исследования свойств бактерий, указанных в таблице, выявили, что вновь созданный штамм продуцировал сурфактина на 20% больше, чем бактерии В. subtilis 26Д, чем можно объяснить более высокую антагонистическую активность клеток В. subtilis 26ДСryСhS по отношению к Ph. infestans и защитную при заражении растений фитопатогеном S. nodorum.

Успех придания штамму В. subtilis 26ДСryСhS существенных инсектицидных свойств при одновременном увеличении ростстимулирующей и антагонистической активностей, а также продукции антибиотика сурфактина по сравнению с исходным штаммом В. subtilis 26Д не был явным, так как ожидалось увеличение только инсектицидной активности. По данным научно-технической и патентной литературы модифицированный штамм раннее не был известен, что, в совокупности, соответствует принципу новизны изобретения.

Литература

1. Добрица А.П., Корецкая Н.Г., Гайтан В.И. Разработка биопестицидов против колорадского жука // Рос.хим. ж. (Ж. Рос.хим. об-ва им. Д.И. Менделеева). 2001. T. XLV. №5-6.

2. Ellis D.M., Negrotto D.V., Shi L., Shotkoski F.A., Thomas C.R. COT102 insecticidal cotton. US 2006/0130175 Al. Pub. date: Jun. 15, 2006.

3. Sticklen M.B., Cheng J. et al. Lepidopteran insect resistant transgenic potato plants. US 6100456 A. Pub. date: Aug. 08, 2000.

4. Lundquist R.C., Walters D.A. Insect resistant fertile transgenic corn plants. US 6331665 B1. Pub. date: Dec. 18, 2001.

5. De pontes Rose Gomes Monnerat Solon, Soares Carlos Marcelo Silveira, Berry Colin. Composition based on Bacillus spp.and correlate genera and their use in pest control. WO 2008/025108 Al. Pub. Date: March. 06, 2008.

6. Viviane M. Melatti, Lilian B. praca, Erica S. martins et al. Selection of Bacillus thuringiensis Strains Toxic Against Cotton Aphid, Aphis gossypii (Hemiptera:Aphididae) // BioAssay. 2010. V. 5. N2.

7. Егоршина А.А., Хайруллин P.M., Лукьянцев М.А., Курамшина З.М., Смирнова Ю.В. Фосфат-мобилизующая активность эндофитных штаммов Bacillus subtilis и их влияние на степень микоризации корней пшеницы // Научный журнал Сибирского федерального университета. 2011. №1. С. 172-182.

8. Бурханова Г.Ф., Веселова СВ., Сорокань А.В., Благова Д.К., Нужная Т.В., Максимов И.В. Бактерии рода Bacillus в регуляции устойчивости пшеницы к Septoria nodorum Berk. // Прикладная биохимия и микробиология. 2017. Т. 53. №3. С. 308-315.

9. Курамшина З.М., Смирнова Ю.В., Хайруллин P.M. Повышение толерантности Triticum aestivum к кадмий-стрессу с помощью эндофитных штаммов Bacillus subtilis II Физиология растений. 2016. Т. 63. №5. С. 679-687.

10. Смирнов В.В., Сорокулова И.Б., Бережницкая Т.Г., Ваньянц Г.М., Менликиев М.Я., Недорезков В.Д., Минеев М.И., Вахитов В.А., Байгузина Ф.А. Биопрепарат Фитоспорин для защиты растений от болезней. Патент РФ №2099947.Опубл. 27.12.1997.

11. Байгузина Ф.А., Штроман Г.А. Способ получения препарата Фитоспорин. Патент РФ №2128914. Опубл. 20.04.1999.

12. Байгузина Ф.А., Штроман Г.А., Алсынбаев М.М. Способ получения препарата Фитоспорин. Патент РФ №2128915. Опубл. 20.04.1999.

13. Байгузина Ф.А., Штроман Г.А. Способ получения препарата Фитоспорин. Патент РФ №2129004. Опубл. 20.04.1999.

14. Байгузина Ф.А., Штроман Г.А., Менликеев М.Я., Алсынбаев М.М. Биопрепарат Фитоспорин жидкий для защиты растений от болезней Патент РФ №2129375. Опубл. 27.04.1999.

15. Максимов И.В., Хайруллин P.M., Сорокань А.В. Способ восстановления антагонистической активности эндофитного штамма Bacillus subtilis 26Д ВНИИСХМ 128. Патент РФ №2595431. Опубл. 27.08.2016. Бюл. №24.

16. Хайруллин Р.М.,Максимов И.В., Благова Д.К., Сорокань А.В., Веселова С.В., Уразбахтина Н.А., Иргалина Р.Ш., Вахитова Р.К. Микробиологический состав для увеличения урожайности сельскохозяйственных культур и их защиты от вредителей и болезней. Патент РФ №2654569. Опубл. 21.05.2018. Бюл. №15.

17. Sorokan A.V., Ben'kovskaya G.V., Maksimov I.V. The influence of potato endophytes on Leptinotarsa decemlineata endosymbionts promotes mortality of the pest // J. of Invertebrate Pathology. 2016. V. 136. 65-67.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к области создания препаратов, инсектицидного действия. Предложен штамм бактерий Bacillus subtilis 26ДCryChS (RCAM04928), полученный из природного штамма В. subtilis 26Д путем рекомбинантной трансформации плазмидой pDG1662, содержащей целевой ген cry1Ia (идентификационный номер в GenBank Х62821.1), кодирующий синтез инсектотоксичного белка Cry1Ia. Полученный рекомбинантный штамм В. subtilis 26ДСryChS сохранил изученные существующие у исходного штамма В. subtilis 26Д хозяйственно-полезные свойства, приобрел высокую инсектицидную активность, а также более высокие ростстимулирующую и антагонистическую активности. Штамм бактерий может применяться в растениеводстве как основа однокомпонентного микробиологического препарата с комплексной биологической активностью, стимулирующей рост растений, мобилизирующей фосфаты, инсектицидной и антагонистической. 1 табл.

Штамм бактерий Bacillus subtilis 26ДCryChS, депонированный в Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии» Отделения сельскохозяйственных наук Российской академии наук под регистрационным номером RCAM04928, с комплексной биологической активностью.