СПОСОБ ВОССТАНОВЛЕНИЯ ВИРУЛЕНТНОСТИ ШТАММОВ СИБИРЕЯЗВЕННОГО МИКРОБА Российский патент 1998 года по МПК C12Q1/04 C12N1/20 A61K39/07 C12Q1/04 C12R1/07 

Изобретение относится к медицинской микробиологии, в частности, к способам повышения вирулентности сибиреязвенного микроба.

Известно, что при длительном хранении в лабораторных условиях с частыми пересевами на искусственных питательных средах, сибиреязвенный микроб, как и чумной, снижает свою вирулентность. Штаммы со сниженной вирулентностью часто выделяются из внешней среды. Высоковирулентные штаммы имеют две плазмиды, определяющие вирулентность pXO1 и pXO2, детерминирующие соответственно CO₂-зависимый синтез экзотоксина и капсулы. Происходящие снижения вирулентности связаны с утратой способности той или иной части популяции к нормальному синтезу этих факторов. У одних штаммов, с умеренной вирулентностью, популяция представлена преимущественно клетками, имеющими обе плазмиды, но не продуцирующими токсин, а продуцирующими только капсулу в атмосфере CO₂. У других, слабовирулентных, в популяции преобладают клетки, имеющие обе плазмиды, но не продуцирующие токсин в атмосфере CO₂ и синтезирующие капсулу на воздухе и в атмосфере CO₂. Популяция авирулентных штаммов в большинстве представлена клетками, имеющим только плазмиду pXO1 и продуцирующими токсин в атмосфере CO₂ и не продуцирующими капсулу в любых условиях. Апатогенные в основном состоят из клеток, имеющих только плазмиду pXO1, но не синтезирующих ни капсулу, ни токсин. Такой характер снижения вирулентности и подразделение штаммов обоснованы нами экспериментально.

Для многих экспериментов требуются штаммы с высокой и строго определенной вирулентностью, поэтому на практике часто приходится прибегать к ее повышению.

Известен способ восстановления вирулентности сибиреязвенного микроба, заключающийся в культивировании штаммов в присутствии бактериофага, активного в отношении бескапсульных вариантов с последующим высевом на среду капсулообразования и отбором вирулентных капсульных клонов (1). Недостатком этого способа является невозможность повышать вирулентность штаммов, у которых снижение вирулентности обусловлено нарушением не капсулообразования, а токсинообразования.

Наиболее близким к предлагаемому является способ повышения вирулентности субкультур сибиреязвенного микроба путем последовательного пассирования через организм беспородных белых мышей. По известному способу животных заражают споровой или вегетативной культурой, из органов павших или забитых животных выделяют субкультуру, которой вновь заражают животных (2). Этот способ позволяет повышать вирулентность штаммов с сочетанными нарушениями капсуло- и токсинообразования, но также неэффективен в отношении капсулообразующих штаммов, имеющих нарушения токсинообразования.

Целью предлагаемого изобретения является расширение возможностей способа восстановления вирулентности штаммов сибиреязвенного микроба. Поставленная цель достигается тем, что штаммы вирулентность которых предполагается повысить, подвергают последовательному пассированию через организм белых беспородных мышей, причем для пассирования отбирают штаммы или неклонированные субкультуры штаммов с бескапсульным атоксигенным фенотипом, несущие только плазмиду токсинообразования pXO1, а штаммы с низкой частотой встречаемости бескапсульных клеток (ниже 10^-3 10^-4 КОЕ) обрабатывают новобиоцином в концентрации 1 1,5 мкг/мл.

Отличительными признаками изобретения являются предварительный отбор в популяции штаммов субкультур Cap^-Tox^-/pXO1 и обработка клеток новобиоцином. В сочетании с последующим пассированием через организм белых мышей неклонированных субкультур обработка новобиоцином приводит к результату, противоположному известному эффекту снижения вирулентности в результате действия новобиоцина, а именно к ее повышению. При этом выбранный диапазон концентраций новобиоцина 1-1,5 мкг/мл оказывается необходимым и достаточным для достижения нужного действия, поскольку концентрации ниже 1 мкг/мл не приводят к элиминации плазмиды pXO2, а концентрации выше 1,5 мкг/мл подавляют рост сибиреязвенного микроба.

Изобретение осуществляется следующим образом. Готовят взвеси спор штаммов с оптической плотностью, соответствующей OCO ГИСК 10 ЕД. Готовят по прописи агар для иммунологического исследования RYE (3). Взвеси спор штаммов засевают петлей отдельными бляшками на поверхность чашек с RYE, помещают их в микроанаэростат и культивируют при 37^oC в атмосфере, содержащей избыток CO₂, с последующим выдерживанием в холодильнике. После этого просматривают чашки и оценивают штаммы по способности продуцировать капсулу и токсин в зависимости от наличия или отсутствия капсульного вещества на поверхности сформировавшихся макроколоний и ореолов иммунопреципитации вокруг них соответственно. Культуры штаммов, не продуцирующих капсулу и токсин, исследуют на наличие плазмидных ДНК по методу (4). Отбирают штаммы, имеющие плазмиду pXO1, но лишенные плазмиды pXO2, и подвергают их пассированию через организм белых мышей. Для этого приготавливают споровые взвеси с концентрацией около 10⁸ спор в 1 мл и заражают по 3 белых мыши для каждого штамма такими взвесями в объеме 0,2-0,5 млм подкожно. Павших в течение 2 суток или забитых по истечении этого срока белых мышей вскрывают, делают посевы из внутренних органов, места введения и крови на агар Хоттингера. Из выросших культур приготавливают взвеси на физиологическом растворе и вновь исследуют их на способность образовывать капсулу и токсин, как описано выше. Если полученная таким образом культура образует капсулу и токсин, ее отбирают для получения спор и подтверждения вирулентности общепринятым способом. Если культура не образует капсулу и токсин при описанном исследовании, то получив споры, их рассеивают на 10 20 чашек RYE таким образом, чтобы на них формировалось по 20 50 отдельных колоний, культивируют, как описано выше, и отбирают колонию, образующую капсулу и токсин. Если же отбор такой колонии невозможен, споровой взвесью заражают следующую тройку белых мышей аналогично описанному выше. Всю схему повторяют, пока не удастся отобрать колонию с фенотипом Cap⁺Tox⁺.

Споры культур штаммов, продуцирующих капсулу, но не продуцирующих токсин, также рассеивают на чашки с RYE и отбирают колонии Cap^-Tox^-, имеющими только плазмиду pXO1. Если такие колонии не удается отобрать непосредственно, то культуры обрабатывают новобиоцином в соответствии с методом (4), для чего засевают их в колбы с L-бульоном, содержащим новобиоцин в концентрации 1-1,5 мкг/мл, культивируют в течение 3 суток при 37^oC, разводят и рассеивают на RYE. Затем отбирают колонии Cap^-Tox^-/pXO1, которые без предварительного клонирования пассируют через организм белых мышей, как описано выше.

Результаты экспериментальных испытаний изобретения иллюстрируется таблицей и графическими материалами. Таблица 1 отражает результаты сравнительного повышения вирулентности предлагаемым способом и способом-прототипом. На фиг. 1, A схематически изображены колонии штаммов на поверхности плотной среды RYE 81/1,228,140П и 12/16-1 до (1, 2, 3 и 4) и после (5, 6, 7 и 8) воздействия предлагаемым способом, при этом гладкие блестящие колонии 1,6-8, окруженные линиями иммунопреципитации имеют фенотип Cap⁺Tox⁺, гладкие блестящие колонии 2 и 3 фенотип Cap⁺Tox^-, а шероховатая колония 4 Cap^-Tox^-. На фиг. 1, B, схематически изображена электрофореграмма тех же штаммов до и после обработки предлагаемым способом, где линии а соответствуют плазмиде pXO1, b pXO2 и c хромосомной ДНК.

Возможность осуществления изобретения подтверждается следующими примерами.

Пример 1. Готовили споровые взвеси штаммов Bacillus anthracis NN 81/1,228,140П и 12/16-1, определяли их вирулентность для кроликов, заражая по 2 животных дозами 10⁴, 10⁵ и 10⁶ в объеме 0,5 мл. Готовили взвеси спор с оптической плотностью, соответствующей ОСО ГИСК 10 ЕД. Взвеси спор штаммов засевали на поверхность чашек с RYE и культивировали в микроанаэростате, содержащем CO₂, после чего выдерживали в холодильнике, затем просматривали чашки и оценивали штаммы по способности продуцировать капсулу и токсин. Культуру штамма 12/16-1, не продуцирующую капсулу и токсин, исследовали на наличие плазмидных ДНК. Штаммы 228 и 140П, продуцирующие капсулу, но не продуцирующие токсин, рассевали до отдельных колоний на 10 чашек с RYE и после культивирования по приведенной выше схеме отбирали колонии, не продуцирующие капсулу и токсин, несущие плазмиду pXO1. Культуру штамма 228, в популяции которого невозможно было отобрать такие колонии, обрабатывали новобиоцином в концентрации 1 мкг/мл, после чего вновь высевали на чашки RYE и отбирали колонию Cap^-Tox^-/pXO1. Штаммы 81/1, 12/16-1 и субкультуры штаммов 228 и 140П с фено и генотипом Cap^-Tox^-/pXO1 пассировали через организм белых мышей. После одного пассажа субкультур штаммов 228 и 140 П и четырех пассажей штамма 12/16-1 выделенные от животных культуры обладали фено- и генотипом Cap⁺Tox⁺/pXO1pXO2.Вирулентность полученных культур определяли на кроликах. Параллельно 3-х кратное пассирование с целью увеличить вирулентность проводили в соответствии со способом-прототипом. Результаты использования предлагаемого способа и прототипа приведены в таблице 1 и на фиг. 1.

Пример 2. Проводили повышение вирулентности по предлагаемому способу, как описано в примере 1, за исключением того, что штаммы рассеивали на 20 чашек, а концентрация новобиоцина составляла 1,5 мкг/мл. Полученные результаты не отличались от описанных в примере 1.

Как видно из таблицы 1, штамм 81/1, исходно имеющий высокую вирулентность, не изменил ее в результате обработки как предлагаемым способом, так и способом прототипом. При этом его фено- и генотип также остались без изменений (фиг. 1). Штамм 228, не продуцирующий токсин, отличался от высоковирулентного штамма 81/1 большим средним временем гибели животных (5 дней в сравнении с 3), после обработки по предлагаемому способу стал высоковирулентным штаммом с фенотипом Cap⁺Tox⁺ и среднем временем гибели 2,5 дня. Обработка способом-прототипом не приводила к увеличению его вирулентности. Авирулентный для кроликов штамм 140 П после обработки предлагаемым способом стал высоковирулентным штаммом с нормальным фенотипом, его DCL для кроликов уменьшилась более чем на два порядка, обработка же способом-прототипом не привела к изменению вирулентности. Бескапсульный атоксигенный штамм 12/16-1 обрабатывался методически одинаков как по способу-прототипу, так и предлагаемым способом и после 4-го пассажа стал высоковирулентным штаммом с обычным фено- и генотипом.

Таким образом, предлагаемый способ, в отличие от существующих, позволяет повысить вирулентность всех штаммов, у которых она снижена, включая капсульные атоксигенные штаммы. Этот способ является также тестом для определения эпидемической значимости штаммов, так как позволяет выявить их потенциальную вирулентность и способность реверсировать к высоковирулентному типу.

Источники информации.

1. Thorne C.B. Biochemical properties of virulent and avirulent straines of Bacillus anthracis//Ann.N.Y.Acad.Sci.-1960.-Vol.88. N.6.-P.1024-1033.

2. Meynell G.G. Reversting and non-reversting rough variante of Bacillus anthracis//J.Gen.Microbiol.-1965.-V.39.-P.423-427.

3. Ivins B.E. Welkos S.L. Cloning and expression of Bacillus anthracis protective antigen gene in Bacillus subtilis//Infect.and Immun. 1986. - Vol. 54. N.2. P.537-542.

4. Green B. D. Battisti L. Koehler T.M. Thorne C/B/ and Ivins B.E. Demonstating of a capsule plasmid in Bacillus anthracis// Infect. and Immun. -1985.-Vol.49.-N.2.-P.291-297.

Использование: медицинская микробиология, в повышение вирулентности сибиреязвенного микроба, селекции штаммов с заданными свойствами. Сущность изобретения заключается в том, что в популяциях штаммов со сниженной вирулентностью отбирают субкультуру, имеющую фенотип Cap-Tox- и генотип pXO1 и массируют ее через организм белых беспородных мышей. Способ позволяет повысить вирулентность всех штаммов, включая потенциально опасные, и поэтому может быть использован также в качестве теста на реверсию к высокой вирулентности для оценки эпидемической значимости природных изоляторов. 1 ил., 1 табл.

Способ восстановления вирулентности штаммов сибиреязвенного микроба, включающий их последовательное пассирование через организм белых беспородных мышей, отличающийся тем, что для пассирования отбирают штаммы или неклонированные субкультуры штаммов с бескапсульным атоксигенным фенотипом, несущие только плазмиду токсинообразования pX01, а штаммы с низкой частотой встречаемости бескапсульных клеток обрабатывают новобиоцином в концентрации 1 1,5 мкг/мл.