Предпосылки создания изобретения
Потребность в новых противовирусных препаратах для лечения гриппа является значительной и особенно критичной в области медицины. Вирус гриппа, возбудитель гриппа или острой респираторной вирусной инфекции, является причиной от трех до пяти миллионов случаев тяжелых заболеваний ежегодно и приблизительно 500000 случаев смерти во всем мире. Несмотря на то, что большинство людей полностью выздоравливают от гриппа примерно за одну-две недели, у других развиваются опасные для жизни осложнения, такие как пневмония. Таким образом, грипп может быть смертельным, особенно для молодых, старых или хронически больных. Люди со слабой или ослабленной иммунной системой, такие как люди с запущенной ВИЧ-инфекцией или пациенты после трансплантации, чья иммунная система медикаментозно подавлена для предотвращения отторжения трансплантата органа, подвергаются более высокому риску осложнений, связанных с гриппом. Беременные женщины и маленькие дети также подвержены высокому риску осложнений.
Разработка противовирусных препаратов для лечения гриппа остается сложной задачей. Несколько противовирусных агентов против гриппа одобрено для применения в клинике, и эти агенты играют важную роль в модулировании тяжести заболевания и борьбе с пандемиями, пока готовятся вакцины. Однако к наиболее часто используемым ингибиторам появились резистентные к лекарственным средствам штаммы.
Противовирусные агенты против гриппа в основном нацелены на белки, представленные на поверхности частицы вируса гриппа. Оболочка вируса гриппа содержит два иммунодоминантных гликопротеина, гемагглютинин и нейраминидазу, которые играют ключевую роль в вирусной инфекции и распространении. Гемагглютинин влияет на прикрепление вируса к клетке-хозяину посредством взаимодействия с поверхностными сиаловыми кислотами, тем самым инициируя проникновение. Нейраминидаза представляет собой фермент экзогликозидазу, который отщепляет сиаловые кислоты (концевые остатки нейраминовой кислоты) от гликановых структур на поверхности инфицированных клеток-хозяев, высвобождая потомственные вирусы и позволяя вирусу распространяться от клетки-хозяина к неинфицированным окружающим клеткам. Таким образом, ингибирование нейраминидазы служит фармакологической мишенью для противовирусных лекарственных средств. Идентифицированы ингибиторы вирусной нейраминидазы, применяющиеся для уменьшения распространения вируса, включая осельтамивир (Tamiflu™), занамивир (Relenza™) и перамивир (Rapivab™).
Однако грипп у реципиентов трансплантата по-прежнему характеризуется длительным выделением вируса, что увеличивает вероятность развития штаммов, резистентных к лекарственным средствам. Необходимы новые, более эффективные терапии для лечения гриппа.
Краткое описание изобретения
Раскрытие относится к конъюгатам, композициям и способам ингибирования роста вирусов, а также к способам лечения вирусных инфекций. В частности, такие конъюгаты содержат мономеры или димеры фрагмента, который ингибирует нейраминидазу вируса гриппа (например, занамивир, перамивир или их аналоги), конъюгированные с мономерами Fc, доменами Fc, Fc-связывающими пептидами, белками альбуминами или белок альбумин-связывающими пептидами. Ингибитор нейраминидазы (например, занамивир, перамивир или их аналоги) в конъюгатах направленно воздействует на нейраминидазу на поверхности вирусной частицы. Мономеры Fc или домены Fc в конъюгатах связываются с Fcγ-рецепторами (FcγR) (например, FcRn, FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIc, FcγRIIIa и FcγRIIIb) на иммунных клетках, например нейтрофилах, для активации фагоцитоза и эффекторных функций, таких как антителозависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность (ADCC), что приводит к поглощению и разрушению вирусных частиц иммунными клетками и дальнейшему усилению противовирусной активности конъюгатов. Альбумин или альбумин-связывающий пептид может увеличивать период полужизни конъюгата, например, за счет связывания альбумина с рециркулирующим неонатальным Fc-рецептором. Такие композиции являются полезными в способах ингибирования роста вирусов и в способах лечения вирусных инфекций, таких как инфекции, вызываемые вирусом гриппа А, вирусом гриппа В и вирусом гриппа С.
В одном аспекте в раскрытии представлен конъюгат, описываемый формулой (1):
где каждый A1 и каждый А2 независимо выбран из любой из формул (A-I)-(A-XII):
где R1 выбран из -ОН, -NH2, -NHC(=NH)NH2 и -NHC(=NH)NHR6; R2 и R3, каждый, независимо выбраны из -Н, -ОН, -F, -Cl и -Br; R4 выбран из -CO2H -Р(=O)(ОН)2, -SO3H; R5 выбран из -СОСН3, -COCF3, -SO2CH3; X выбран из -О- и -S-; Y выбран из
R6 выбран из 
R7 выбран из Н, (С1-С20)алкила, (С3-С20)циклоалкила, (С3-С20)гетероциклоалкила; (С5-С15)арила и (С2-С15)гетероарила; R8 выбран из (С3-С20)гетероциклоалкила, (С5-С15)арила и (С2-С15)гетероарила; каждый Е содержит мономер Fc-домена (например, мономер Fc-домена, имеющий последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 1-68); L в каждом A1-L-A2 представляет собой линкер, ковалентно присоединенный к атому серы шарнирного цистеина в каждом Е и к каждому из A1 и А2; Т представляет собой целое число от 1 до 20 (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20), и две волнистые линии, соединенные с двумя Е, указывают, что каждый A1-L-A2 ковалентно присоединен (например, посредством ковалентной связи или линкера) к паре атомов серы двух шарнирных цистеинов в двух Е, или его фармацевтически приемлемая соль. Когда Т больше 1 (например, Т равно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20), каждый A1-L-A2 может быть независимо выбран (например, независимо выбран из любой из структур A1-L-A2, описанных в настоящем документе).
Б другом аспекте в раскрытии представлен конъюгат, описываемый формулой (1):
где каждый A1 и каждый А2 независимо выбран из любой из формул (A-I)-(A-V):
где R1 выбран из -ОН, -NH2, -NHC(=NH)NH2 и -NHC(=NH)NHR6; R2 и R3, каждый, независимо выбраны из -Н, -ОН, -F, -Cl и -Br; R4 выбран из -СО2Н, -Р(=O)(ОН)2, -SO3H; R5 выбран из -СОСН3, -COCF3, -SO2CH3; X выбран из -О- и -S-; Y выбран из 
R6 выбран из
R7 выбран из Н, (С1-С20)алкила, (С3-С20)циклоалкила, (С3-С20)гетероциклоалкила; (С5-С15)арила и (С2-С15)гетероарила; R8 выбран из (С3-С20)гетероциклоалкила, (С5-С15)арила и (С2-С15)гетероарила; каждый Е содержит мономер Fc-домена (например, мономер Fc-домена, имеющий последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 1-68); L в каждом A1-L-A2 представляет собой линкер, ковалентно присоединенный к атому серы шарнирного цистеина в каждом Е и к каждому из A1 и А2; Т представляет собой целое число от 1 до 20 (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20), и две волнистые линии, соединенные с двумя Е, указывают на то, что каждый A1-L-A2 ковалентно присоединен (например, посредством ковалентной связи или линкера) к паре атомов серы двух шарнирных цистеинов в двух Е, или его фармацевтически приемлемая соль. Когда Т больше 1 (например, Т равно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20), каждый A1-L-A2 может быть независимо выбран (например, независимо выбран из любой из структур A1-L-A2, описанных в настоящем документе).
В другом аспекте в раскрытии представлен конъюгат, описываемый формулой (1):
где каждый A1 и каждый А2 независимо выбран из любой из формул (А-VI) - (А-IX):
где R1 выбран из -ОН, -NH2, -NHC(=NH)NH2 и -NHC(=NH)NHR6; R2 и R3, каждый, независимо выбраны из -Н, -ОН, -F, -Cl и -Br; R4 выбран из -CO2H -Р(=O)(ОН)2, -SO3H; R5 выбран из -СОСН3, -COCF3, -SO2CH3; X выбран из -О- и -S-; Y выбран из
R6 выбран из
R7 выбран из Н, (С1-С20)алкила, (С3-С20)циклоалкила, (С3-С20)гетероциклоалкила; (С5-С15)арила и (С2-С15 гетероарила; R8 выбран из (С3-С20)гетероциклоалкила, (С5-С15)арила и (С2-С15)гетероарила; каждый Е содержит мономер Fc-домена (например, мономер Fc-домена, имеющий последовательность, представленную с любой из SEQ ID NO: 1-68); L в каждом A1-L-A2 представляет собой линкер, ковалентно присоединенный к атому серы шарнирного цистеина в каждом Е и к каждому из A1 и А2; Т представляет собой целое число от 1 до 20 (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20), и две волнистые линии, соединенные с двумя Е, указывают на то, что каждый A1-L-A2 ковалентно присоединен (например, посредством ковалентной связи или линкера) к паре атомов серы двух шарнирных цистеинов в двух Е, или его фармацевтически приемлемая соль. Когда Т больше 1 (например, Т равно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20), каждый A1-L-A2 может быть независимо выбран (например, независимо выбран из любой из структур A1-L-A2, описанных в настоящем документе).
В другом аспекте изобретение относится к конъюгату, описываемому формулой (2):
где каждый A1 независимо выбран из любой из формул (A-I)-(A-XII):
где R1 выбран из -ОН, -NH2, -NHC(=NH)NH2 и -NHC(=NH)NHR6; R2 и R3, каждый, независимо выбраны из -Н, -ОН, -F, -Cl и -Br; R4 выбран из -CO2H, -Р(=O)(ОН)2, -SO3H; R5 выбран из -СОСН3, -COCF3, -SO2CH3; X выбран из -О- и -S-; Y выбран из
R6 выбран из 
R7 выбран из Н, (С1-С20)алкила, (С3-С20)циклоалкила, (С3-С20)гетероциклоалкила; (С5-С15)арила и (С2-С15)гетероарила; R8 выбран из (С3-С20)гетероциклоалкила, (С5-С15)арила и (С2-С15)гетероарила; каждый Е содержит мономер Fc-домена (например, мономер Fc-домена, имеющий последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 1-68); L в каждом L-A1 представляет собой линкер, ковалентно присоединенный к атому серы шарнирного цистеина в каждом Е и к A1; Т представляет собой целое число от 1 до 20 (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20), и две волнистые линии, соединенные с двумя атомами серы, указывают на то, что каждый L-A1 ковалентно присоединен (например, посредством ковалентной связи или линкера) к паре атомов серы двух шарнирных цистеинов в двух Е, или его фармацевтически приемлемая соль. Когда Т больше 1 (например, Т равно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20), каждый A1 может быть независимо выбран из любой из формул (A-I)-(A-XII).
В другом аспекте изобретение относится к конъюгату, описываемому формулой (2):
где каждый A1 независимо выбран из любой из формул (A-I)-(A-V):
где R1 выбран из -ОН, -NH2, -NHC(=NH)NH2 и -NHC(=NH)NHR6; R2 и R3, каждый, независимо выбраны из -Н, -ОН, -F, -Cl и -Br; R4 выбран из -CO2H, -Р(=O)(ОН)2, -SO3H; R5 выбран из -СОСН3, -COCF3, -SO2CH3; X выбран из -О- и -S-; Y выбран из
R6 выбран из 
R7 выбран из Н, (С1-С20)алкила, (С3-С20)циклоалкила, (С3-С20)гетероциклоалкила; (С5-С15)арила и (С2-С15)гетероарила; R8 выбран из (С3-С20)гетероциклоалкила, (С5-С15)арила и (С2-С15)гетероарила; каждый Е содержит мономер Fc-домена (например, мономер Fc-домена, имеющий последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 1-68); L в каждом L-A1 представляет собой линкер, ковалентно присоединенный к атому серы шарнирного цистеина в каждом Е и к A1; Т представляет собой целое число от 1 до 20 (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20), и две волнистые линии, соединенные с двумя атомами серы, указывают на то, что каждый L-A1 ковалентно присоединен (например, посредством ковалентной связи или линкера) к паре атомов серы двух шарнирных цистеинов в двух Е, или его фармацевтически приемлемая соль. Когда Т больше 1 (например, Т равно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20), каждый A1 может быть независимо выбран из любой из формул (A-I)-(A-V).
В другом аспекте изобретение относится к конъюгату, описываемому формулой (2):
где каждый A1 независимо выбран из любой из формул (A-VI)-(A-IX):
где R1 выбран из -ОН, -NH2, -NHC(=NH)NH2 и -NHC(=NH)NHR6; R2 и R3, каждый, независимо выбраны из -Н, -ОН, -F, -Cl и -Br; R4 выбран из -СО2Н, -Р(=O)(ОН)2, -SO3H; R5 выбран из -СОСН3, -COCF3, -SO2CH3; X выбран из -О- и -S-; Y выбран из
R6 выбран из 
R7 выбран из Н, (С1-С20)алкила, (С3-С20)циклоалкила, (С3-С20)гетероциклоалкила; (С5-С15)арила и (С2-С15)гетероарила; R8 выбран из (С3-С20)гетероциклоалкила, (С5-С15)арила и (С1-С15)гетероарила; каждый Е содержит мономер Fc-домена (например, мономер Fc-домена, имеющий последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 1-68); L в каждом L-A1 представляет собой линкер, ковалентно присоединенный к атому серы шарнирного цистеина в каждом Е и к A1; Т представляет собой целое число от 1 до 20 (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20), и две волнистые линии, соединенные с двумя атомами серы, указывают на то, что каждый L-A1 ковалентно присоединен (например, посредством ковалентной связи или линкера) к паре атомов серы двух шарнирных цистеинов в двух Е, или его фармацевтически приемлемая соль. Когда Т больше 1 (например, Т равно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20), каждый A1 может быть независимо выбран из любой из формул (A-VI)-(A-IX).
В некоторых вариантах осуществления любого из вышеупомянутых вариантов осуществления каждый Е включает мономер Fc-домена, имеющий последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 1-68.
В некоторых вариантах осуществления каждый Е содержит последовательность MVRSDKTHTCPPCPPC*KC*PAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKHHHHHH (SEQ ID NO: 10).
В некоторых вариантах осуществления каждый Е содержит последовательность MVRSDKTHTCPPCPPC*KC*PAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 11).
В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один из пары атомов серы представляет собой атом серы, соответствующий (например, атому серы) шарнирному цистеину последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11, т.е. Cys10, Cys13, Cys16 или Cys18 последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11. В некоторых вариантах осуществления пара атомов серы представляет собой атомы серы, соответствующие (например, атомам серы) Cys10 и Cys13 в SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11, Cys10 и Cys16 в SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11, Cys30 и Cys18 в SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11, Cys13 и Cys36 в SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11, Cys13 и Cys38 в SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11, и/или Cys36 и Cys38 в SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11.
В некоторых вариантах осуществления, когда Т равно 2, пара атомов серы представляет собой (например, атомов серы, соответствующих) Cys10 и Cys13 в SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11, или Cys36 и Cys38 в SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11.
В некоторых вариантах осуществления пара атомов серы включает один атом серы цистеина из каждого Е, т.е. L-A вместе с атомами серы, к которым он присоединен, образует мостик между двумя Fc-доменами (например, двумя Fc-доменами, содержащими последовательность SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11). В некоторых вариантах осуществления пара атомов серы представляет собой атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys10 последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11 из одного Е, и атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys10 последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11 из другого Е. В некоторых вариантах осуществления пара атомов серы представляет собой атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys13 последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11 из одного Е, и атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys13 последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11 из другого Е. В некоторых вариантах осуществления пара атомов серы представляет собой атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys16 последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11 из одного Е, и атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys16 последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11 из другого Е. В некоторых вариантах осуществления пара атомов серы представляет собой атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys18 последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11 из одного Е, и атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys18 последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11 из другого Е.
В некоторых вариантах осуществления, когда Т равно 2, пары атомов серы представляют собой атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys10 последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11 из одного Е, и атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys10 последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11 из другого Е, и атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys13 последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11 из одного Е, и атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys13 последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11 из другого Е. В некоторых вариантах осуществления, когда Т равно 2, пары атомов серы представляют собой атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys10 последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11 из одного Е, и атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys10 последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11 из другого Е, и атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys16 последовательности SEQ ID NO: 10, или SEQ ID NO: 11 из одного Е, и атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys16 последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11 из другого Е. В некоторых вариантах осуществления, когда Т равно 2, пары атомов серы представляют собой атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys10 последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11 из одного Е, и атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys10 последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11 из другого Е, и атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys18 последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11 из одного Е, и атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys18 последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11 из другого Е.
В некоторых вариантах осуществления, когда Т равно 2, пары атомов серы представляют собой атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys13 последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11 из одного Е, и атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys13 последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11 из другого Е, и атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys16 последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11 из одного Е, и атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys16 последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11 из другого Е. В некоторых вариантах осуществления, когда Т равно 2, пары атомов серы представляют собой атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys13 последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11 из одного Е, и атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys13 последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11 из другого Е, и атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys18 последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11 из одного Е, и атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys18 последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11 из другого Е.
В некоторых вариантах осуществления, когда Т равно 2, пары атомов серы представляют собой атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys16 последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11 из одного Е, и атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys16 последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11 из другого Е, и атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys18 последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11 из одного Е, и атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys18 последовательноси SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11 из другого E.
В некоторых вариантах осуществления, когда Т равно 3, пары атомов серы представляют собой атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys10 последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11 из одного Е, и атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys10 последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11 из другого Е; атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys13 последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11 из одного Е, и атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys13 последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11 из другого Е; и атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys16 последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11 из одного Е, и атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys16 последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11 из другого Е. В некоторых вариантах осуществления, когда Т равно 3, пары атомов серы представляют собой атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys10 последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11 из одного Е, и атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys10 последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11 от другого Е; атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys13 последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11 из одного Е, и атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys13 последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11 из другого Е; и атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys18 последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11 из одного Е, и атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys18 последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11 из другого Е. В некоторых вариантах осуществления, когда Т равно 3, пары атомов серы представляют собой атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys10 последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11 из одного Е, и атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys10 последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11 из другого Е; атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys18 последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11 из одного Е, и атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys18 последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11 из другого Е; и атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys16 последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11 из одного Е, и атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys16 последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11 из другого Е. В некоторых вариантах осуществления, когда Т равно 3, пары атомов серы представляют собой атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys13 последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11 из одного Е, и атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys13 последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11 из другого Е; атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys18 последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11 из одного Е, и атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys18 последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11 из другого Е; и атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys16 последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11 из одного Е, и атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys16 последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11 из другого Е.
В некоторых вариантах осуществления, когда Т равно 3, пары атомов серы представляют собой атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys10 последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11 из одного Е, и атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys10 последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11 из другого Е; атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys13 последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11 из одного Е, и атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys13 последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11 из другого Е; атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys16 последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11 из одного Е, и атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys16 последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11 из другого Е; и атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys18 последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11 из одного Е, и атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys18 последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11 из другого Е.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат имеет структуру:
где каждый из a, b, с и d независимо равен 0 или 1, и при этом, когда а, b, с или d равен О, два атома серы образуют дисульфидную связь.
В некоторых вариантах осуществления а равен 1, и b, с и d равны 0. В некоторых вариантах осуществления а и b равны 1, и с и d равны 0. В некоторых вариантах осуществления а и с равны 1, и b и d равны 0. В некоторых вариантах осуществления a и d равны 1, и b и с равны 0. В некоторых вариантах осуществления а, b и с равны 1, и d равен 0. В некоторых вариантах осуществления a, b и d равны 1, и с равен 0. В некоторых вариантах осуществления а, с и d равны 1, и b равен 0. В некоторых вариантах осуществления b и с равны 1, и а и d равны 0. В некоторых вариантах осуществления b и d равны 1, и а и с равны 0. В некоторых вариантах осуществления b, с и d равны 1, и а равен 0. В некоторых вариантах осуществления с и d равны 1, и а и b равны 0. В некоторых вариантах осуществления а, b, с и d равны 1.
В некоторых вариантах осуществления каждый Е содержит последовательность MVRSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 4).
В некоторых вариантах осуществления каждый Е содержит последовательность MVRSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 33).
В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один из пары атомов серы представляет собой атом серы, соответствующий (например, атому серы) шарнирному цистеину последовательности SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 33, т.е. Cys10 и/или Cys13. В некоторых вариантах осуществления пара атомов серы представляет собой атомы серы, соответствующие (например, атомам серы) Cys10 и Cys13 в SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 33.
В некоторых вариантах осуществления пара атомов серы включает один атом серы цистеина из каждого Е, т.е. L-A вместе с атомами серы, к которым он присоединен, образует мостик между двумя Fc-доменами (например, двумя Fc-доменами, содержащими последовательность, представленную в SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 33). В некоторых вариантах осуществления пара атомов серы представляет собой атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys10 последовательности SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 33 из одного Е, и атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys10 последовательности SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 33 из другого Е. В некоторых вариантах осуществления пара атомов серы представляет собой атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys13 последовательности SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 33 из одного Е, и атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys13 последовательности SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 33 из другого Е. В некоторых вариантах осуществления, когда Т равно 2, пары атомов серы представляют собой атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys10 последовательности SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 33 из одного Е, и атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys10 последовательности SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 33 от другого Е, и атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys13 последовательности SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 33 из одного Е, и атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys13 последовательности SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 33 из другого Е.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат имеет структуру:
где каждый из а и b, независимо, равен 0 или 1, и при этом, когда а или b равен 0, два атома серы образуют дисульфидную связь. В некоторых вариантах осуществления а равен 1, и b равен 0. В некоторых вариантах осуществления а равен 0, и b равен 1. В некоторых вариантах осуществления а и b равны 1.
В некоторых вариантах осуществления каждый Е содержит последовательность MVRSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSVGKHHHHHH (SEQ ID NO: 8).
В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один из пары атомов серы представляет собой атом серы, соответствующий (например, атому серы) шарнирному цистеину последовательности SEQ ID NO: 8, т.е. Cys10 и/или Cys13. В некоторых вариантах осуществления пара атомов серы представляет собой атомы серы, соответствующие (например, атомам серы) Cys10 и Cys13 в SEQ ID NO: 8.
В некоторых вариантах осуществления пара атомов серы включает один атом серы цистеина из каждого Е, т.е. L-A вместе с атомами серы, к которым он присоединен, образует мостик между двумя Fc-доменами (например, двумя Fc-доменами, содержащими последовательность, представленную в SEQ ID NO: 8). В некоторых вариантах осуществления пара атомов серы представляет собой атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys10 последовательности SEQ ID NO: 8 из одного Е, и атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys10 последовательности SEQ ID NO: 8 из другого Е. В некоторых вариантах осуществления пара атомов серы представляет собой атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys13 последовательности SEQ ID NO: 8 из одного Е, и атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys143 последовательности SEQ ID NO: 8 из другого Е. В некоторых вариантах осуществления, когда Т равно 2, пары атомов серы представляют собой атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys10 последовательности SEQ ID NO: 8 из одного Е, и атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys10 последовательности SEQ ID NO: 8 из другого Е, и атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys13 последовательности SEQ ID NO: 8 из одного Е, и атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys13 последовательности SEQ ID NO: 8 из другого Е.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат имеет структуру:
где каждый из а и b, независимо, равен 0 или 1, и при этом, когда а или b равен 0, два атома серы образуют дисульфидную связь. В некоторых вариантах осуществления а равен 1, и b равен 0. В некоторых вариантах осуществления а равен 0, и b равен 1. В некоторых вариантах осуществления а и b равны 1.
В другом аспекте изобретение также относится к группе конъюгатов, описанных в любом из предыдущих аспектов, в которых среднее значение Т равно 1-20 (например, среднее значение Т равно 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 5-10, 10-15 или 15-20). В некоторых вариантах осуществления среднее значение Т равно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20.
В другом аспекте изобретение относится к конъюгату, описываемому формулой (3):
где каждый A1 и каждый А2 независимо выбран из любой из формул (A-I)-(A-VII):
где R1 выбран из -ОН, -NH2, -NHC(=NH)NH2 и -NHC(=NH)NHR6; R2 и R3, каждый, независимо выбраны из -Н, -ОН, -F, -Cl и -Br; R4 выбран из -CO2H, -Р(=O)(ОН)2, -SO3H; R5 выбран из -СОСН3, -COCF3, -SO2CH3; X выбран из -О- и -S-; Y выбран из
R6 выбран из 
R7 выбран из Н, (С1-С20)алкила, (С3-С20)циклоалкила, (С3-С20)гетероциклоалкила; (С5-С15)арила и (С2-С15)гетероарила; R8 выбран из (С3-С20)гетероциклоалкила, (С5-С15)арила и (С2-С15)гетероарила; Е содержит мономер Fc-домена или Fc-домен (например, мономер Fc-домена или Fc-домен, при этом каждый мономер Fc-домена имеет, независимо, последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 1-68); L в каждом A1-L-A2 представляет собой линкер, ковалентно присоединенный к атому серы шарнирного цистеина в Е и к каждому из A1 и А2; Т представляет собой целое число от 1 до 20 (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20), и две волнистые линии, соединенные с Е, указывают, что каждый A1-L-A2 ковалентно присоединен (например, посредством ковалентной связи или линкера) к атому серы шарнирного цистеина в Е, или его фармацевтически приемлемая соль. Когда Т больше 1 (например, Т равно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20), каждый A1-L-A2 может быть независимо выбран (например, независимо выбран из любой из структур A1-L-A2, описанных в настоящем документе).
В другом аспекте изобретение относится к конъюгату, описываемому формулой (3):
где каждый A1 и каждый А2 независимо выбран из любой из формул (A-I)-(A-V):
где R1 выбран из -ОН, -NH2, -NHC(=NH)NH2 и -NHC(=NH)NHR6; R2 и R3, каждый, независимо выбраны из -Н, -ОН, -F, -Cl и -Br; R4 выбран из -СО2Н, -Р(=O)(ОН)2, -SO3H; R5 выбран из -СОСН3, -COCF3, -SO2CH3; X выбран из -О- и -S-; Y выбран из
R6 выбран из 
R7 выбран из Н, (С1-С20)алкила, (С3-С20)циклоалкила, (С3-С20)гетероциклоалкила; (С5-С15)арила и (С2-С15)гетероарила; R8 выбран из (С3-С20)гетероциклоалкила, (С5-С15)арила и (С2-С15)гетероарила; Е содержит мономер Fc-домена или Fc-домен (например, мономер Fc-домена или Fc-домен, при этом каждый мономер Fc-домена имеет, независимо, последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 1-68); L в каждом A1-L-A2 представляет собой линкер, ковалентно присоединенный к атому серы шарнирного цистеина в Е и к каждому из A1 и А2; Т представляет собой целое число от 1 до 20 (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20), и две волнистые линии, соединенные с Е, указывают, что каждый A1-L-A2 ковалентно присоединен (например, посредством ковалентной связи или линкера) к атому серы шарнирного цистеина в Е, или его фармацевтически приемлемая соль. Когда Т больше 1 (например, Т равно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20), каждый A1-L-A2 может быть независимо выбран (например, независимо выбран из любой из структур A1-L-A2, описанных в настоящем документе).
В другом аспекте изобретение относится к конъюгату, описываемому формулой (3):
где каждый A1 и каждый А2 независимо выбран из любой из формул (A-VI)-(A-IX):
где R1 выбран из -ОН, -NH2, -NHC(=NH)NH2 и -NHC(=NH)NHR6; R2 и R3, каждый, независимо выбраны из -Н, -ОН, -F, -Cl и -Br; R4 выбран из -СО2Н, -Р(=O)(ОН)2, -SO3H; R5 выбран из -СОСН3, -COCF3, -SO2CH3; X выбран из -О- и -S-; Y выбран из
R6 выбран из 
R7 выбран из Н, (С1-С20)алкила, (С3-С20)циклоалкила, (С3-С20)гетероциклоалкила; (С5-С15)арила и (С2-С15)гетероарила; R8 выбран из (С3-С20)гетероциклоалкила, (С5-С15)арила и (С2-С15)гетероарила; Е содержит мономер Fc-домена или Fc-домен (например, мономер Fc-домена или Fc-домен, при этом каждый мономер Fc-домена имеет, независимо, последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 1-68); L в каждом A1-L-A2 представляет собой линкер, ковалентно присоединенный к атому серы шарнирного цистеина в Е и к каждому из A1 и А2; Т представляет собой целое число от 1 до 20 (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20), и две волнистые линии, соединенные с Е, указывают, что каждый A1-L-A2 ковалентно присоединен (например, посредством ковалентной связи или линкера) к атому серы шарнирного цистеина в Е, или его фармацевтически приемлемая соль. Когда Т больше 1 (например, Т равно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20), каждый A1-L-A2 может быть независимо выбран (например, независимо выбран из любой из структур A1-L-A2, описанных в настоящем документе).
В некоторых вариантах осуществления каждый Е включает мономер Fc-домена, имеющий последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 1-68.
В некоторых вариантах осуществления каждый Е содержит последовательность MVRSDKTHTCPPCPPC*KC*PAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKHHHHHH (SEQ ID NO: 10).
В некоторых вариантах осуществления каждый Е содержит последовательность MVRSDKTHTCPPCPPC*KC*PAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 11).
В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один из пары атомов серы представляет собой атом серы, соответствующий (например, атому серы) шарнирному цистеину последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11, т.е. Cys10, Cys13, Cys16 или Cys18 последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11. В некоторых вариантах осуществления пара атомов серы представляет собой атомы серы, соответствующие (например, атомам серы) Cys10 и Cys13 в SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11, Cys10 и Cys16 в SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11, Cys30 и Cys18 в SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11, Cys13 и Cys36 в SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11, Cys13 и Cys38 в SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11, и/иди Cys36 и Cys38 в SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11.
В некоторых вариантах осуществления, когда Т равно 2, пара атомов серы представляет собой атомы серы, соответствующие (например, атомам серы) Cys10 и Cys13 в SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11, и Cys36 и Cys38 в SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11.
В некоторых вариантах осуществления пара атомов серы включает один атом серы цистеина из каждого Е, т.е. L-A вместе с атомами серы, к которым он присоединен, образует мостик между двумя Fc-доменами (например, двумя Fc-доменами, содержащими последовательность SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11). В некоторых вариантах осуществления пара атомов серы представляет собой атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys10 последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11 из одного Е, и атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys10 последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11 из другого Е. В некоторых вариантах осуществления пара атомов серы представляет собой атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys13 последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11 из одного Е, и атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys13 последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11 из другого Е. В некоторых вариантах осуществления пара атомов серы представляет собой атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys16 последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11 из одного Е, и атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys16 последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11 из другого Е. В некоторых вариантах осуществления пара атомов серы представляет собой атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys18 последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11 из одного Е, и атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys18 последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11 из другого Е.
В некоторых вариантах осуществления, когда Т равно 2, пары атомов серы представляют собой атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys10 последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11 из одного Е, и атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys10 последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11 из другого Е, и атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys13 последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11 из одного Е, и атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys13 последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11 из другого Е. В некоторых вариантах осуществления, когда Т равно 2, пары атомов серы представляют собой атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys10 последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11 из одного Е, и атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys10 последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11 из другого Е, и атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys16 последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11 из одного Е, и атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys16 последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11 из другого Е. В некоторых вариантах осуществления, когда Т равно 2, пары атомов серы представляют собой атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys10 последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11 из одного Е, и атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys10 последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11 из другого Е, и атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys18 последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11 из одного Е, и атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys18 последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11 из другого Е.
В некоторых вариантах осуществления, когда Т равно 2, пары атомов серы представляют собой атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys13 последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11 из одного Е, и атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys13 последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11 из другого Е, и атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys16 последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11 из одного Е, и атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys16 последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11 из другого Е. В некоторых вариантах осуществления, когда Т равно 2, пары атомов серы представляют собой атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys13 последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11 из одного Е, и атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys13 последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11 из другого Е, и атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys18 последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11 из одного Е, и атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys18 последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11 из другого Е.
В некоторых вариантах осуществления, когда Т равно 2, пары атомов серы представляют собой атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys16 последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11 из одного Е, и атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys16 последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11 из другого E, и атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys18 последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11 из одного Е, и атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys18 последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11 из другого Е.
В некоторых вариантах осуществления, когда Т равно 3, пары атомов серы представляют собой атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys10 последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11 из одного Е, и атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys10 последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11 из другого Е; атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys13 последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11 из одного Е, и атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys13 последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11 из другого Е; и атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys16 последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11 из одного Е, и атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys16 последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11 из другого Е. В некоторых вариантах осуществления, когда Т равно 3, пары атомов серы представляют собой атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys10 последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11 из одного Е, и атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys10 последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11 из другого Е; атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys13 последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11 из одного Е, и атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys13 последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11 из другого Е; и атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys18 последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11 из одного Е, и атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys18 последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11 из другого Е. В некоторых вариантах осуществления, когда Т равно 3, пары атомов серы представляют собой атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys10 последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11 из одного Е, и атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys10 последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11 из другого Е; атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys18 последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11 из одного Е, и атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys18 последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11 из другого Е; и атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys16 последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11 из одного Е, и атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys16 последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11 из другого Е. В некоторых вариантах осуществления, когда Т равно 3, пары атомов серы представляют собой атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys13 последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11 из одного Е, и атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys13 последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11 из другого Е; атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys18 последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11 из одного Е, и атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys18 последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11 из другого Е; и атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys16 последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11 из одного Е, и атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys16 последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11 из другого Е.
В некоторых вариантах осуществления, когда Т равно 3, пары атомов серы представляют собой атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys10 последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11 из одного Е, и атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys10 последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11 из другого Е; атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys13 последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11 из одного Е, и атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys13 последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11 из другого Е; атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys16 последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11 из одного Е, и атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys16 последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11 из другого Е; и атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys18 последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11 из одного Е, и атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys18 последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11 из другого Е.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат имеет структуру:
где каждый из a, b, с и d независимо равен 0 или 1, и при этом, когда а, b, с или d равен 0, два атома серы образуют дисульфидную связь.
В некоторых вариантах осуществления а равен 1, и b, с и d равны 0. В некоторых вариантах осуществления а и b равны 1, и с и d равны 0. В некоторых вариантах осуществления а и с равны 1, и b и d равны 0. В некоторых вариантах осуществления a и d равны 1, и b и с равны 0. В некоторых вариантах осуществления а, b и с равны 1, и d равен 0. В некоторых вариантах осуществления a, b и d равны 1, и с равен 0. В некоторых вариантах осуществления а, с и d равны 1, и b равен 0. В некоторых вариантах осуществления b и с равны 1, и а и d равны 0. В некоторых вариантах осуществления b и d равны 1, и а и с равны 0. В некоторых вариантах осуществления b, с и d равны 1, и а равен 0. В некоторых вариантах осуществления с и d равны 1, и а и b равны 0. В некоторых вариантах осуществления а, b, с и d равны 1.
В некоторых вариантах осуществления каждый Е содержит последовательность MVRSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 4).
В некоторых вариантах осуществления каждый Е содержит последовательность MVRSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 33).
В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один из пары атомов серы представляет собой атом серы, соответствующий (например, атому серы) шарнирному цистеину последовательности SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 33, т.е. Cys10 и/или Cys13. В некоторых вариантах осуществления пара атомов серы представляет собой атомы серы, соответствующие (например, атомам серы) Cys10 и Cys13 в SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 33.
В некоторых вариантах осуществления пара атомов серы включает один атом серы цистеина из каждого Е, т.е. L-A вместе с атомами серы, к которым он присоединен, образует мостик между двумя Fc-доменами (например, двумя Fc-доменами, содержащими последовательность, представленную в SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 33). В некоторых вариантах осуществления пара атомов серы представляет собой атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys10 последовательности SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 33 из одного Е, и атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys10 последовательности SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 33 из другого Е. В некоторых вариантах осуществления пара атомов серы представляет собой атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys13 последовательности SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 33 из одного Е, и атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys13 последовательности SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 33 из другого Е. В некоторых вариантах осуществления, когда Т равно 2, пары атомов серы представляют собой атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys10 последовательности SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 33 из одного Е, и атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys10 последовательности SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 33 из другого Е, и атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys13 последовательности SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 33 из одного Е, и атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys13 последовательности SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 33 из другого Е.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат имеет структуру:
где каждый из а и b, независимо, равен 0 или 1, и при этом, когда а или b равен 0, два атома серы образуют дисульфидную связь. В некоторых вариантах осуществления а равен 1, и b равен 0. В некоторых вариантах осуществления a равен 0, и b равен 1. В некоторых вариантах осуществления a и b равные 1.
В некоторых вариантах осуществления каждый Е содержит последовательность MVRSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSVGKHHHHHH (SEQ ID NO: 8)
В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один из пары атомов серы представляет собой атом серы, соответствующий (например, атому серы) шарнирному цистеину последовательности SEQ ID NO: 8, т.е. Cys10 и/или Cys13. В некоторых вариантах осуществления пара атомов серы представляет собой атомы серы, соответствующие (например, атомам серы) Cys10 и Cys13 в SEQ ID NO: 8.
В некоторых вариантах осуществления пара атомов серы включает один атом серы цистеина из каждого Е, т.е. L-A вместе с атомами серы, к которым он присоединен, образует мостик между двумя Fc-доменами (например, двумя Fc-доменами, содержащими последовательность, представленную в SEQ ID NO: 8). В некоторых вариантах осуществления пара атомов серы представляет собой атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys10 последовательности SEQ ID NO: 8 из одного Е, и атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys10 последовательности SEQ ID NO: 8 из другого Е. В некоторых вариантах осуществления пара атомов серы представляет собой атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys13 последовательности SEQ ID NO: 8 из одного Е, и атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys13 последовательности SEQ ID NO: 8 из другого Е. В некоторых вариантах осуществления, когда Т равно 2, пары атомов серы представляют собой атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys10 последовательности SEQ ID NO: 8 из одного Е, и атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys10 последовательности SEQ ID NO: 8 из другого Е, и атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys13 последовательности SEQ ID NO: 8 из одного Е, и атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys13 последовательности SEQ ID NO: 8 из другого Е.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат имеет структуру:
где каждый из а и b, независимо, равен 0 или 1, и при этом, когда а или b равен 0, два атома серы образуют дисульфидную связь. В некоторых вариантах осуществления а равен 1, и b равен 0. В некоторых вариантах осуществления а равен 0, и b равен 1. В некоторых вариантах осуществления а и b равны 1.
В другом аспекте изобретение относится к конъюгату, описываемому формулой (4):
где каждый A1 независимо выбран из любой из формул (A-I)-(A-XII):
где R1 выбран из -ОН, -NH2, -NHC(=NH)NH2 и -NHC(=NH)NHR6; R2 и R3, каждый, независимо выбраны из -Н, -ОН, -F, -Cl и -Br; R4 выбран из -CO2H, -Р(=O)(ОН)2, -SO3H; R5 выбран из -СОСН3, -COCF3, -SO2CH3; X выбран из -О- и -S-; Y выбран из
R6 выбран из 
R7 выбран из Н, (С1-С20)алкила, (С3-С20)циклоалкила, (С3-С20)гетероциклоалкила; (С5-С15)арила и (С2-С15)гетероарила; R8 выбран из (С3-С20)гетероциклоалкила, (С5-С15)арила и (С2-С15)гетероарила; Е содержит мономер Fc-домена или Fc-домен (например, мономер Fc-домена или Fc-домен, при этом каждый мономер Fc-домена имеет, независимо, последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 1-68); L в каждом L-A1 представляет собой линкер, ковалентно присоединенный к атому серы шарнирного цистеина в Е и к A1; Т представляет собой целое число от 1 до 20 (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20), и две волнистые линии, соединенные с Е, указывают, что каждый L-A1 ковалентно присоединен (например, посредством ковалентной связи или линкера) к атому серы шарнирного цистеина в Е, или его фармацевтически приемлемая соль. Когда Т больше 1 (например, Т равно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20), каждый A1 может быть независимо выбран из любой из формул (A-I)-(A-XII).
В другом аспекте изобретение относится к конъюгату, описываемому формулой (4):
где каждый A1 независимо выбран из любой из формул (A-I)-(A-V):
где R1 выбран из -ОН, -NH2, -NHC(=NH)NH2 и -NHC(=NH)NHR6; R2 и R3, каждый, независимо выбраны из -Н, -ОН, -F, -Cl и -Br; R4 выбран из -СО2Н, -Р(=O)(ОН)2, -SO3H; R5 выбран из -СОСН3, -COCF3, -SO2CH3; X выбран из -О- и -S-; Y выбран из
R6 выбран из 
R7 выбран из Н, (С1-С20)алкила, (С3-С20)циклоалкила, (С3-С20)гетероциклоалкила; (С5-С15)арила и (С2-С15)гетероарила; R8 выбран из (С3-С20)гетероциклоалкила, (С5-С15)арила и (С2-С15)гетероарила; Е содержит мономер Fc-домена или Fc-домен (например, мономер Fc-домена или Fc-домен, при этом каждый мономер Fc-домена имеет, независимо, последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 1-68); L в каждом L-A1 представляет собой линкер, ковалентно присоединенный к атому серы шарнирного цистеина в Е и к A1; Т представляет собой целое число от 1 до 20 (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20), и волнистая линия, соединенная с Е, указывает, что каждый L-A1 ковалентно присоединен (например, посредством ковалентной связи или линкера) к атому серы шарнирного цистеина в Е, или его фармацевтически приемлемая соль. Когда Т больше 1 (например, Т равно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20), каждый A1 может быть независимо выбран из любой из формул (A-I)-(A-V). В другом аспекте изобретение относится к конъюгату, описываемому формулой (4):
где каждый A1 независимо выбран из любой из формул (A-VI)-(A-IX):
где R1 выбран из -ОН, -NH2, -NHC(=NH)NH2 и -NHC(=NH)NHR6; R2 и R3, каждый, независимо выбраны из -Н, -ОН, -F, -Cl и -Br; R4 выбран из -CO2H, -Р(=O)(ОН)2, -SO3H; R5 выбран из -СОСН3, -COCF3, -SO2CH3; X выбран из -О- и -S-; Y выбран из
R6 выбран из 
R7 выбран из Н, (С1-С20)алкила, (С3-С20)циклоалкила, (С3-С20)гетероциклоалкила; (С5-С15)арила и (С2-С15)гетероарила; R8 выбран из (С3-С20)гетероциклоалкила, (С5-С15)арила и (С2-С15)гетероарила; Е содержит мономер Fc-домена или Fc-домен (например, мономер Fc-домена или Fc-домен, при этом каждый мономер Fc-домена имеет, независимо, последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 1-68); L в каждом L-A1 представляет собой линкер, ковалентно присоединенный к атому серы шарнирного цистеина в Е и к A1; Т представляет собой целое число от 1 до 20 (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20), и волнистая линия, соединенная с Е, указывает, что каждый L-A1 ковалентно присоединен (например, посредством ковалентной связи или линкера) к атому серы шарнирного цистеина в Е, или его фармацевтически приемлемая соль. Когда Т больше 1 (например, Т равно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20), каждый A1 может быть независимо выбран из любой из формул (A-VI)-(A-IX).
В некоторых вариантах осуществления каждый Е включает мономер Fc-домена, имеющий последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 1-68.
В некоторых вариантах осуществления каждый Е содержит последовательность MVRSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 4).
В некоторых вариантах осуществления каждый Е содержит последовательность MVRSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 33).
В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один из атомов серы представляет собой атом серы, соответствующий (например, атому серы) шарнирному цистеину последовательности SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 33, т.е. Cys10 и/или Cys13. В некоторых вариантах осуществления атомы серы представляют собой атом серы, соответствующий (например, атому серы) Cys10 в SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 33. В некоторых вариантах осуществления атом серы соответствует (например, атому серы) Cys10 в SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 33.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат имеет структуру:
где каждый из а и b, независимо, равен 0 или 1, и при этом, когда а или b равен 0, атомы серы представляют собой тиол. В некоторых вариантах осуществления а равен 1, и b равен 0. В некоторых вариантах осуществления а равен 0, и b равен 1. В некоторых вариантах осуществления а и b равны 1.
В другом аспекте изобретение относится к группе конъюгатов, в которой среднее значение Т равно 1-20 (например, среднее значение Т равно 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 5-10, 10-15 или 15-20). В некоторых вариантах осуществления среднее значение Т равно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20.
В другом аспекте изобретение относится к конъюгату, описываемому формулой (3):
где каждый A1 и каждый А2 независимо выбран из любой из формул (A-I)-(A-XII):
где R1 выбран из -ОН, -NH2, -NHC(=NH)NH2 и -NHC(=NH)NHR6; R2 и R3, каждый, независимо выбраны из -Н, -ОН, -F, -Cl и -Br; R4 выбран из -CO2H, -Р(=O)(ОН)2, -SO3H; R5 выбран из -СОСН3, -COCF3, -SO2CH3; X выбран из -О- и -S-; Y выбран из
R6 выбран из 
R7 выбран из Н, (С1-С20)алкила, (С3-С20)циклоалкила, (С3-С20)гетероциклоалкила; (С5-С15)арила и (С2-С15)гетероарила; R8 выбран из (С3-С20)гетероциклоалкила, (С5-С15)арила и (С2-С15)гетероарила; Е содержит мономер Fc-домена или Fc-домен (например, мономер Fc-домена или Fc-домен, при этом каждый мономер Fc-домена имеет, независимо, последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 1-68); L в каждом A1-L-A2 представляет собой линкер, ковалентно присоединенный к атому азота экспонированного на поверхности лизина в Е и к каждому из A1 и А2; Т представляет собой целое число от 1 до 20 (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20), и волнистая линия, соединенная с Е, указывает, что каждый A1-L-A2 ковалентно присоединен (например, посредством ковалентной связи или линкера) к атому азота экспонированного на поверхности лизина в Е, или его фармацевтически приемлемая соль. Когда Т больше 1 (например, Т равно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20), каждый A1-L-A2 может быть независимо выбран (например, независимо выбран из любой из структур A1-L-A2, описанных в настоящем документе).
В другом аспекте изобретение относится к конъюгату, описываемому формулой (3):
где каждый A1 и каждый А2 независимо выбран из любой из формул (A-I)-(A-V):
где R1 выбран из -ОН, -NH2, -NHC(=NH)NH2 и -NHC(=NH)NHR6; R2 и R3, каждый, независимо выбраны из -Н, -ОН, -F, -Cl и -Br; R4 выбран из -CO2H, -Р(=O)(ОН)2, -SO3H; R5 выбран из -СОСН3, -COCF3, -SO2CH3; X выбран из -О- и -S-; Y выбран из
R6 выбран из 
R7 выбран из Н, (С1-С20)алкила, (С3-С20)циклоалкила, (С3-С20)гетероциклоалкила; (С5-С15)арила и (С2-С15)гетероарила; R8 выбран из (С3-С20)гетероциклоалкила, (С5-С15)арила и (С2-С15)гетероарила; Е содержит мономер Fc-домена или Fc-домен (например, мономер Fc-домена или Fc-домен, при этом каждый мономер Fc-домена имеет, независимо, последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 1-68); L в каждом A1-L-A2 представляет собой линкер, ковалентно присоединенный к атому азота экспонированного на поверхности лизина в Е и к каждому из A1 и А2; Т представляет собой целое число от 1 до 20 (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20), и волнистая линия, соединенная с Е, указывает, что каждый A1-L-A2 ковалентно присоединен (например, посредством ковалентной связи или линкера) к атому азота экспонированного на поверхности лизина в Е, или его фармацевтически приемлемая соль. Когда Т больше 1 (например, Т равно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20), каждый A1-L-A2 может быть независимо выбран (например, независимо выбран из любой из структур A1-L-A2, описанных в настоящем документе).
В другом аспекте изобретение относится к конъюгату, описываемому формулой (3):
где каждый A1 и каждый А2 независимо выбран из любой из формул (A-VI)-(A-IX):
где R1 выбран из -ОН, -NH2, -NHC(=NH)NH2 и -NHC(=NH)NHR6; R2 и R3, каждый, независимо выбраны из -Н, -ОН, -F, -Cl и -Br; R4 выбран из -CO2H, -Р(=O)(ОН)2, -SO3H; R5 выбран из -СОСН3, -COCF3, -SO2CH3; X выбран из -О- и -S-; Y выбран из
R6 выбран из 
R7 выбран из Н, (С1-С20)алкила, (С3-С20)циклоалкила, (С3-С20)гетероциклоалкила; (С5-С15)арила и (С2-С15)гетероарила; R8 выбран из (С3-С20)гетероциклоалкила, (С5-С15)арила и (С2-С15)гетероарила; Е содержит мономер Fc-домена или Fc-домен (например, мономер Fc-домена или Fc-домен, при этом каждый мономер Fc-домена имеет, независимо, последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 1-68); L в каждом A1-L-A2 представляет собой линкер, ковалентно присоединенный к атому азота экспонированного на поверхности лизина в Е и к каждому из A1 и А2; Т представляет собой целое число от 1 до 20 (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20), и волнистая линия, соединенная с Е, указывает, что каждый A1-L-A2 ковалентно присоединен (например, посредством ковалентной связи или линкера) к атому азота экспонированного на поверхности лизина в Е, или его фармацевтически приемлемая соль. Когда Т больше 1 (например, Т равно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20), каждый A1-L-A2 может быть независимо выбран (например, независимо выбран из любой из структур A1-L-A2, описанных в настоящем документе).
В другом аспекте изобретение относится к конъюгату, описываемому формулой (4):
где каждый A1 независимо выбран из любой из формул (A-I)-(A-XII):
где R1 выбран из -ОН, -NH2, -NHC(=NH)NH2 и -NHC(=NH)NHR6; R2 и R3, каждый, независимо выбраны из -Н, -ОН, -F, -Cl и -Br; R4 выбран из -CO2H, -Р(=O)(ОН)2, -SO3H; R5 выбран из -СОСН3, -COCF3, -SO2CH3; X выбран из -О- и -S-; Y выбран из
R6 выбран из 
R7 выбран из Н, (С1-С20)алкила, (С3-С20)циклоалкила, (С3-С20)гетероциклоалкила; (С5-С15)арила и (С2-С15)гетероарила; R8 выбран из (С3-С20)гетероциклоалкила, (С5-С15)арила и (С2-С15)гетероарила; Е содержит мономер Fc-домена или Fc-домен (например, мономер Fc-домена или Fc-домен, при этом каждый мономер Fc-домена имеет, независимо, последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 1-68); L в каждом L-A1 представляет собой линкер, ковалентно присоединенный к атому азота экспонированного на поверхности лизина в Е и к A1 и А2; Т представляет собой целое число от 1 до 20 (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20), и волнистая линия, соединенная с Е, указывает, что каждый L-A1 ковалентно присоединен (например, посредством ковалентной связи или линкера) к атому азота экспонированного на поверхности лизина в Е, или его фармацевтически приемлемая соль. Когда Т больше 1 (например, Т равно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20), каждый А может быть независимо выбран из любой из формул (A-I)-(A-XII).
В другом аспекте изобретение относится к конъюгату, описываемому формулой (4):
где каждый A1 независимо выбран из любой из формул (A-I)-(A-V):
где R1 выбран из -ОН, -NH2, -NHC(=NH)NH2 и -NHC(=NH)NHR6; R2 и R3, каждый, независимо выбраны из -Н, -ОН, -F, -Cl и -Br; R4 выбран из -CO2H, -Р(=O)(ОН)2, -SO3H; R5 выбран из -СОСН3, -COCF3, -SO2CH3; X выбран из -О- и -S-; Y выбран из
R6 выбран из 
R7 выбран из Н, (С1-С20)алкила, (С3-С20)циклоалкила, (С3-С20)гетероциклоалкила; (С5-С15)арила и (С2-С15)гетероарила; R8 выбран из (С3-С20)гетероциклоалкила, (С5-С15)арила и (С2-С15)гетероарила; Е содержит мономер Fc-домена или Fc-домен (например, мономер Fc-домена или Fc-домен, при этом каждый мономер Fc-домена имеет, независимо, последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 1-68); L в каждом L-A1 представляет собой линкер, ковалентно присоединенный к атому азота экспонированного на поверхности лизина в Е и к A1; Т представляет собой целое число от 1 до 20 (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20), и волнистая линия, соединенная с Е, указывает, что каждый L-A1 ковалентно присоединен (например, посредством ковалентной связи или линкера) к атому азота экспонированного на поверхности лизина в Е, или его фармацевтически приемлемая соль. Когда Т больше 1 (например, Т равно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20), каждый A1 может быть независимо выбран из любой из формул (A-I)-(A-V).
В другом аспекте изобретение относится к конъюгату, описываемому формулой (4):
где каждый A1 независимо выбран из любой из формул (A-VI)-(A-IX):
где R1 выбран из -ОН, -Nth, -NHC(=NH)NH2 и -NHC(=NH)NHR6; R2 и R3, каждый, независимо выбраны из -Н, -ОН, -F, -С1 и -Br; R4 выбран из -СО2Н -Р(=O)(ОН)2, -SO3H; R5 выбран из -СОСН3, -COCF3, -SO2CH3; X выбран из -О- и -S-; Y выбран из 
R7 выбран из Н, (С1-С20)алкила, (С3-С20)циклоалкила, (С3-С20)гетероциклоалкила; (C5-С1)арила и (С2-С15)гетероарила; R8 выбран из (С3-С20)гетероциклоалкила, (С5-С15)арила и (С2-С15)гетероарила; Е содержит мономер Fc-домена или Fc-домен (например, мономер Fc-домена или Fc-домен, при этом каждый мономер Fc-домена имеет, независимо, последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 1-68); L в каждом L-A1 представляет собой линкер, ковалентно присоединенный к атому азота экспонированного на поверхности лизина в Е и к А; Т представляет собой целое число от 1 до 20 (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20), и волнистая линия, соединенная с Е, указывает, что каждый L-A1 ковалентно присоединен (например, посредством ковалентной связи или линкера) к атому азота экспонированного на поверхности лизина в Е, или его фармацевтически приемлемая соль. Когда Т больше 1 (например, Т равно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20), каждый A1 может быть независимо выбран из любой из формул (A-VI)-(A-IX).
В другом аспекте изобретение относится к конъюгату, описываемому формулой (5):
где каждый Int независимо выбран из любого из промежуточных соединений, представленных в таблице 1; Е содержит мономер Fc-домена или Fc-домен (например, мономер Fc-домена или Fc-домен, при этом каждый мономер Fc-домена имеет, независимо, последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 1-68); L в каждом L-Int представляет собой линкер, ковалентно присоединенный к атому азота экспонированного на поверхности лизина в Е и к Int; Т представляет собой целое число от 1 до 20 (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20), волнистая линия, соединенная с Е, указывает на то, что каждый L-Int ковалентно присоединен (например, посредством ковалентной связи или линкера) к атому азота экспонированного на поверхности лизина или атому серы экспонированного на поверхности цистеина в Е, или его фармацевтически приемлемая соль. Когда Т больше 1 (например, Т равно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20), каждый Int может быть независимо выбран из любого из промежуточных соединений, представленных в таблице 1.
Промежуточные соединения в таблице 1 могут быть конъюгированы с Fc-доменом или мономером Fc-домена (например, посредством линкера) с помощью любых подходящих способов, известных специалистам в данной области, включая любой из способов, описанных или проиллюстрированных в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления конъюгат (например, конъюгат, описываемый формулой (5)) содержит Е, где Е представляет собой мономер Fc-домена или Fc-домен (например, мономер Fc-домена или Fc-домен, при этом каждый мономер Fc-домена имеет, независимо, последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 1-68). В предпочтительных вариантах осуществления один или несколько атомов азота одного или нескольких экспонированных на поверхности остатков лизина Е, или один или несколько атомов серы одного или нескольких экспонированных на поверхности цистеинов в Е, ковалентно конъюгированы с линкером (например, линкером PEG2-PEG20). Линкер, конъюгированный с Е, может быть функционализирован таким образом, что он может взаимодействовать с образованием ковалентной связи с любым из Int, описанных в настоящем документе (например, Int из таблицы 1). В предпочтительных вариантах осуществления Е конъюгирован с линкером, функционализированным азидо группой, и Int (например, Int из таблицы 1) функционализировано алкиновой группой. При конъюгировании (например, с помощью клик-химии) линкер-азидо Е и линкер-алкин Int образуется конъюгат по изобретению, например конъюгат, описываемый формулой (5). В еще других вариантах осуществления Е конъюгирован с линкером, функционализированным алкиновой группой, и Int (например, Int из таблицы 1) функционализировано азидогруппой. При конъюгировании (например, путем клик-химии) линкер-алкин Е и линкер-азидо Int образуется конъюгат по изобретению, например, конъюгат, описываемый формулой (5).
В некоторых вариантах осуществления каждый Е включает мономер Fc-домена, имеющий последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 1-68. В некоторых вариантах осуществления Е включает последовательность
В некоторых вариантах осуществления каждый Е включает последовательность
В некоторых вариантах осуществления Е включает последовательность
В некоторых вариантах осуществления каждый Е содержит последовательность
В некоторых вариантах осуществления предыдущих трех аспектов атом азота представляет собой азот экспонированного на поверхности лизина, например, атом азота, соответствующий (например, атому азота) Lys35, Lys63, Lys77, Lys79, Lys106, Lysl23, Lysl29, Lysl81, Lys203, Lys228 или Lys236 последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11. В некоторых вариантах осуществления атом азота представляет собой атом азота, соответствующий (например, атому азота) Lys65, Lys79, Lys108, Lys230 и/или Lys238 последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат имеет структуру:
где каждый из a, b, с, d и e, независимо, равен 0 или 1, и при этом, когда а, b, с, d или е равен 0, два атома азота представляют собой NH2. В некоторых вариантах осуществления а равен 1, и b, с, d и е равны 0. В некоторых вариантах осуществления b равен 1, и а, с, d и е равны 0. В некоторых вариантах осуществления с равен 1, и a, b, d и е равны 0. В некоторых вариантах осуществления d равен 1, и а, b, с и е равны 0. В некоторых вариантах осуществления е равен 1, и а, b, с и d равны 0. В некоторых вариантах осуществления а и b равны 1, и с, d и е равны 0. В некоторых вариантах осуществления а и с равны 1, и b, d и е равны 0. В некоторых вариантах осуществления a и d равны 1, и b, сие равны 0. В некоторых вариантах осуществления а и е равны 1, и b, с и d равны 0. В некоторых вариантах осуществления b и с равны 1, и a, d и е равны 0. В некоторых вариантах осуществления b и d равны 1, и а, с и е равны 0. В некоторых вариантах осуществления b и е равны 1, и а, с и d равны 0. В некоторых вариантах осуществления e и d равны 1, и a, b и е равны 0. В некоторых вариантах осуществления c и e равны 1, и a, b и d равны 0. В некоторых вариантах осуществления d и е равны 1, и a, b и с равны 0. В некоторых вариантах осуществления a, b и с равны 1, и d и е равны 0. В некоторых вариантах осуществления a, b и d равны 1, и с и е равны 0. В некоторых вариантах осуществления a, b и е равны 1, и с и d равны 0. В некоторых вариантах осуществления а, с и d равны 1, и b и е равны 0. В некоторых вариантах осуществления а, с и е равны 1, и b и d равны 0. В некоторых вариантах осуществления a, d и е равны 1, и b и с равны 0. В некоторых вариантах осуществления b, с и d равны 1, и а и е равны 0. В некоторых вариантах осуществления b, d и е равны 1, и а и с равны 0. В некоторых вариантах осуществления с, d и е равны 1, и а и b равны 0.
В другом аспекте изобретение относится к группе конъюгатов, описанных в любом из предыдущих аспектов, где среднее значение Т равно 1-20 (например, среднее значение Т равно 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 5-10, 10-15 или 15-20). В некоторых вариантах осуществления среднее значение Т равно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20.
В некоторых вариантах осуществления конъюгатов, описанных в настоящем документе, конъюгат образует гомодимер, включающий Fc-домен.
В некоторых вариантах осуществления конъюгатов, описанных в настоящем документе, Е гомодимеризуется с другим Е с образованием Fc-домена.
В другом аспекте изобретение относится к конъюгату, описываемому формулой (3):
где каждый A1 и каждый А2 независимо выбран из любой из формул (A-I)-(A-XII):
где R1 выбран из -ОН, -NH2, -NHC(=NH)NH2 и -NHC(=NH)NHR6; R2 и R3, каждый, независимо выбраны из -Н, -ОН, -F, -С1 и -Br; R4 выбран из -CO2H -Р(=O)(ОН)2, -SO3H; R5 выбран из -СОСН3, -COCF3, -SO2CH3; X выбран из -О- и -S-; Y выбран из
R7 выбран из Н, (С1-С20)алкила, (С3-С20)циклоалкила, (С3-С20)гетероциклоалкила; (C5-C15)арила и (С2-С15)гетероарила; R8 выбран из (С3-С20)гетероциклоалкила, (С5-С15)арила и (С2-С15)гетероарила; Е содержит белок альбумин (например, белок альбумин, имеющий последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 69-71), белок альбумин-связывающий пептид или Fc-связывающий пептид; L в каждом A1-L-A2 представляет собой линкер, ковалентно присоединенный к атому серы экспонированного на поверхности цистеина или атому азота экспонированного на поверхности лизина в Е и к каждому из A1 и А2; Т представляет собой целое число от 1 до 20 (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20), и волнистая линия, соединенная с Е, указывает, что каждый A1-L-A2 независимо ковалентно присоединен (например, посредством связи или линкера) к атому серы подвергнутого воздействию растворителя цистеина или атому азота подвергнутого воздействию растворителя лизина в Е, или его фармацевтически приемлемая соль. Когда Т больше 1 (например, Т равно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20), каждый A1-L-A2 может быть независимо выбран (например, независимо выбран из любой из структур A1-L-A2, описанных в настоящем документе).
В другом аспекте изобретение относится к конъюгату, описываемому формулой (5):
где каждый A1 и каждый А2 независимо выбран из любой из формул (A-I)-(A-V):
где R1 выбран из -ОН, -NH2, -NHC(=NH)NH2 и -NHC(=NH)NHR6; R2 и R3, каждый, независимо выбраны из -Н, -ОН, -F, -С1 и -Br; R4 выбран из -CO2H, -Р(=O)(ОН)2, -SO3H; R5 выбран из -СОСН3, -COCF3, -SO2CH3; X выбран из -О- и -S-; Y выбран из
R7 выбран из Н, (C1-С20)алкила, (С3-С20)циклоалкила, (С3-С20)гетероциклоалкила; (С5-С15)арила и (С2-С15)гетероарила; R8 выбран из (С3-С20)гетероциклоалкила, (С5-С15)арила и (С2-С15)гетероарила; Е содержит белок альбумин (например, белок альбумин, имеющий последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 69-71), белок альбумин-связывающий пептид или Fc-связывающий пептид; L в каждом A1-L-A2 представляет собой линкер, независимо ковалентно присоединенный к атому серы экспонированного на поверхности цистеина или атому азота экспонированного на поверхности лизина в Е и к каждому из A1 и А2; Т представляет собой целое число от 1 до 20 (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20), и волнистая линия, соединенная с Е, указывает, что каждый A1-L-A2 независимо ковалентно присоединен (например, посредством связи или линкера) к атому серы подвергнутого воздействию растворителя цистеина или атому азота подвергнутого воздействию растворителя лизина в Е, или его фармацевтически приемлемая соль. Когда Т больше 1 (например, Т равно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20), каждый A1-L-A2 может быть независимо выбран (например, независимо выбран из любой из структур A1-L-A2, описанных в настоящем документе).
В другом аспекте изобретение относится к конъюгату, описываемому формулой (3):
где каждый A1 и каждый А2 независимо выбран из любой из формул (A-VI)-(A-IX):
где R1 выбран из -ОН, -NH2, -NHC(=NH)NH2 и -NHC(=NH)NHR6; R2 и R3, каждый, независимо выбраны из -Н, -ОН, -F, -С1 и -Br; R4 выбран из -CO2H -Р(=O)(ОН)2, -SO3H; R5 выбран из -СОСН3, -COCF3, -SO2CH3; X выбран из -О- и -S-; Y выбран из
R7 выбран из Н, (С1-С20)алкила, (С3-С20)циклоалкила, (С3-С20)гетероциклоалкила; (С5-С15)арила и (С2-С15)гетероарила; R8 выбран из (С3-С20)гетероциклоалкила, (С5-С15)арила и (С2-С15)гетероарила; Е содержит белок альбумин (например, белок альбумин, имеющий последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 69-71), белок альбумин-связывающий пептид или Fc-связывающий пептид; L в каждом A1-L-A2 представляет собой линкер, независимо ковалентно присоединенный к атому серы экспонированного на поверхности цистеина или атому азота экспонированного на поверхности лизина в Е и к каждому из A1 и А2; Т представляет собой целое число от 1 до 20 (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20), и волнистая линия, соединенная с Е, указывает, что каждый A1-L-A2 независимо ковалентно присоединен (например, посредством связи или линкера) к атому серы подвергнутого воздействию растворителя цистеина или атому азота подвергнутого воздействию растворителя лизина в Е, или его фармацевтически приемлемая соль. Когда Т больше 1 (например, Т равно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20), каждый A1-L-A2 может быть независимо выбран (например, независимо выбран из любой из структур A1-L-A2, описанных в настоящем документе).
В другом аспекте изобретение относится к конъюгату, описываемому формулой (4):
где каждый A1 и каждый А2 независимо выбран из любой из формул (A-I)-(A-XII):
где R1 выбран из -ОН, -NH2, -NHC(=NH)NH2 и -NHC(=NH)NHR6; R2 и R3, каждый, независимо выбраны из -Н, -ОН, -F, -С1 и -Br; R4 выбран из -CO2H -Р(=O)(ОН)2, -SO3H; R5 выбран из -СОСН3, -COCF3, -SO2CH3; X выбран из -О- и -S-; Y выбран из
R7 выбран из Н, (С1-С20)алкила, (С3-С20)циклоалкила, (С3-С20)гетероциклоалкила; (С5-С15)арила и (С2-С15)гетероарила; R8 выбран из (С3-С20)гетероциклоалкила, (С5-С15)арила и (С2-С15)гетероарила; Е содержит белок альбумин (например, белок альбумин, имеющий последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 69-71), белок альбумин-связывающий пептид или Fc-связывающий пептид; L в каждом L-A1 представляет собой линкер, независимо ковалентно присоединенный к атому серы экспонированного на поверхности цистеина или атому азота экспонированного на поверхности лизина в Е и к A1; Т представляет собой целое число от 1 до 20 (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20), и волнистая линия, соединенная с Е, указывает, что каждый L-A1 независимо ковалентно присоединен (например, посредством связи или линкера) к атому серы подвергнутого воздействию растворителя цистеина или атому азота подвергнутого воздействию растворителя лизина в Е, или его фармацевтически приемлемая соль. Когда Т больше 1 (например, Т равно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20), каждый А может быть независимо выбран из любой из формул (A-I)-(A-XII).
В другом аспекте изобретение относится к конъюгату, описываемому формулой (4):
где каждый A1 независимо выбран из любой из формул (A-I)-(A-V):
где R1 выбран из -ОН, -NH2, -NHC(=NH)NH2 и -NHC(=NH)NHR6; R2 и R3, каждый, независимо выбраны из -Н, -ОН, -F, -С1 и -Br; R4 выбран из -СО2Н -Р(=O)(ОН)2, -SO3H; R5 выбран из -СОСН3, -COCF3, -SO2CH3; X выбран из -О- и -S-; Y выбран из
R7 выбран из Н, (C1-С20)алкила, (С3-С20)циклоалкила, (С3-С20)гетероциклоалкила; (С5-С15)арила и (С2-С15)гетероарила; R8 выбран из (С3-С20)гетероциклоалкила, (С5-С15)арила и (С2-С15)гетероарила; Е содержит белок альбумин (например, белок альбумин, имеющий последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 69-71), белок альбумин-связывающий пептид или Fc-связывающий пептид; L в каждом L-A1 представляет собой линкер, независимо ковалентно присоединенный к атому серы экспонированного на поверхности цистеина или атому азота экспонированного на поверхности лизина в Е и к A1; Т представляет собой целое число от 1 до 20 (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20), и волнистая линия, соединенная с Е, указывает, что каждый L-A1 независимо ковалентно присоединен (например, посредством связи или линкера) к атому серы подвергнутого воздействию растворителя цистеина или атому азота подвергнутого воздействию растворителя лизина в Е, или его фармацевтически приемлемая соль. Когда Т больше 1 (например, Т равно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20), каждый A1 может быть независимо выбран из любой из формул (A-I)-(A-V).
В другом аспекте изобретение относится к конъюгату, описываемому формулой (4):
где каждый A1 независимо выбран из любой из формул (A-VI)-(A-IX):
где R1 выбран из -ОН, -NH2, -NHC(=NH)NH2 и -NHC(=NH)NHR6; R2 и R3, каждый, независимо выбраны из -Н, -ОН, -F, -С1 и -Br; R4 выбран из -CO2H -Р(=O)(ОН)2, -SO3H; R5 выбран из -СОСН3, -COCF3, -SO2CH3; X выбран из -О- и -S-; Y выбран из
R7 выбран из Н, (С1-С20)алкила, (С3-С20)циклоалкила, (С3-С20)гетероциклоалкила; (С5-С15)арила и (С2-С15)гетероарила; R8 выбран из (С3-С20)гетероциклоалкила, (С5-С15)арила и (С2-С15)гетероарила; Е содержит белок альбумин (например, белок альбумин, имеющий последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 69-71), белок альбумин-связывающий пептид или Fc-связывающий пептид; L в каждом L-A1 представляет собой линкер, независимо ковалентно присоединенный к атому серы экспонированного на поверхности цистеина или атому азота экспонированного на поверхности лизина в Е и к A1; Т представляет собой целое число от 1 до 20 (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20), и волнистая линия, соединенная с Е, указывает, что каждый L-A1 независимо ковалентно присоединен (например, посредством связи или линкера) к атому серы подвергнутого воздействию растворителя цистеина или атому азота подвергнутого воздействию растворителя лизина в Е, или его фармацевтически приемлемая соль. Когда Т больше 1 (например, Т равно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20), каждый A1 может быть независимо выбран из любой из формул (A-VI)-(A-IX).
В другом аспекте изобретение относится к конъюгату, описываемому формулой (5):
где каждый Int независимо выбран из любого из промежуточных соединений из таблицы 1; Е содержит белок альбумин (например, белок альбумин, имеющий последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 69-71), белок альбумин-связывающий пептид или Fc-связывающий пептид; L в каждом L-Int представляет собой линкер, независимо ковалентно присоединенный к атому серы экспонированного на поверхности цистеина или атому азота экспонированного на поверхности лизина в Е и к Int; Т представляет собой целое число от 1 до 20 (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20); и волнистая линия, соединенная с Е, указывает, что каждый L-Int независимо ковалентно присоединен к атому серы подвергнутого воздействию растворителя цистеина или атому азота подвергнутого воздействию растворителя лизина в Е, или его фармацевтически приемлемой соли. Когда Т больше 1 (например, Т равно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20), каждый Int может быть независимо выбран из любого из промежуточных соединений из таблицы 1.
Промежуточные соединения из таблицы 1 могут быть конъюгированы с белком альбумином, белок альбумин-связывающим пептидом, или Fc-связывающим пептидом (например, посредством линкера), с помощью любых подходящих способов, известных специалистам в данной области, включая любой из способов, описанных или приведенных в качестве примера в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления конъюгат (например, конъюгат, описанный формулой (5)) содержит Е, где Е представляет собой белок альбумин (например, белок альбумин, имеющий последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 69-71), белок альбумин связывающий пептид или Fc-связывающий пептид. В предпочтительных вариантах осуществления один или несколько атомов азота одного или нескольких экспонированных на поверхности остатков лизина Е, или один или нескольких атомов серы одного или нескольких экспонированных на поверхности цистеинов в Е, ковалентно конъюгированы с линкером (например, линкером PEG2-PEG20). Линкер, конъюгированный с Е, может быть функционализирован таким образом, что он может реагировать с образованием ковалентной связи с любым из Int, описанных в настоящем документе (например, Int из таблицы 1). В предпочтительных вариантах осуществления Е конъюгирован с линкером, функционализированным азидогруппой, и Int (например, Int из таблицы 1) функционализирован алкиновой группой. Конъюгирование (например, с помощью клик-химии) линкер-азидо Е и линкер-алкин Int приводит к образованию конъюгата по изобретению, например, конъюгата, описываемого формулой (5). В еще других вариантах осуществления Е конъюгирован с линкером, функционализированным алкиновой группой, и Int (например, Int из таблицы 1) функционализирован азидогруппой. Конъюгирование (например, с помощью клик-химии) линкер-алкин Е и линкер-азидо Int приводит к образованию конъюгата по изобретению, например конъюгата, описываемого формулой (5).
В некоторых вариантах осуществления каждый Е включает белок альбумин, имеющий последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 69-71.
В некоторых вариантах осуществления Т равно 1, и L-A ковалентно присоединен к атому серы, соответствующему Cys34 последовательности SEQ ID NO: 69.
В другом аспекте изобретение относится к группе конъюгатов, описанных в любом из предыдущих аспектов, где среднее значение Т равно 1-20 (например, среднее значение Т равно 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 5-10, 10-15 или 15-20). В некоторых вариантах осуществления среднее значение Т равно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20.
В другом аспекте изобретение относится к конъюгату, включающему (i) первый фрагмент, A1; (ii) второй фрагмент, А2; (iii) мономер Fc-домена или Fc-домен; и (iv) линкер, ковалентно присоединенный к A1 и А2, и к мономеру Fc-домена или Fc-домену; где каждый A1 и каждый А2 независимо выбран из любой из формул (A-I)-(A-XII):
где R1 выбран из -ОН, -NH2, -NHC(=NH)NH2 и -NHC(=NH)NHR6; R2 и R3, каждый, независимо выбраны из -Н, -ОН, -F, -С1 и -Br; R4 выбран из -СО2Н, -Р(=O)(ОН)2, -SO3H; R5 выбран из -СОСН3, -COCF3, -SO2CH3; X выбран из -О- и -S-; Y выбран из
R7 выбран из Н, (С1-С20)алкила, (С3-С20)циклоалкила, (С3-С20)гетероциклоалкила; (С5-С15)арила и (С2-С15)гетероарила; R8 выбран из (С3-С20)гетероциклоалкила, (С5-С15)арила и (С2-С15)гетероарила, или его фармацевтически приемлемой соли.
В другом аспекте изобретение относится к конъюгату, включающему (i) первый фрагмент, A1; (ii) второй фрагмент, А2; (iii) мономер Fc-домена или Fc-домен; и (iv) линкер, ковалентно присоединенный к A1 и А2, и к мономеру Fc-домена или Fc-домену; где каждый A1 и каждый А2 независимо выбран из любой из формул (A-I)-(A-V):
где R1 выбран из -ОН, -NH2, -NHC(=NH)NH2 и -NHC(=NH)NHR6; R2 и R3, каждый, независимо выбраны из -Н, -ОН, -F, -С1 и -Br; R4 выбран из -CO2H -Р(=O)(ОН)2, -SO3H; R5 выбран из -СОСН3, -COCF3, -SO2CH3; X выбран из -О- и -S-; Y выбран из
R7 выбран из Н, (C1-С20)алкила, (С3-С20)циклоалкила, (С3-С20)гетероциклоалкила; (С5-С15)арила и (С2-С15)гетероарила; R8 выбран из (С3-С20)гетероциклоалкила, (С5-С15)арила и (С2-С15)гетероарила, или его фармацевтически приемлемой соли.
В другом аспекте изобретение относится к конъюгату, включающему (i) первый фрагмент, A1; (ii) второй фрагмент, А2; (iii) мономер Fc-домена или Fc-домен; и (iv) линкер, ковалентно присоединенный к A1i и А2, и к мономеру Fc-домена или Fc-домену; где каждый A1 и каждый А2 независимо выбран из любой из формул (А-VI)-(A-IX):
где R1 выбран из -ОН, -NH2, -NHC(=NH)NH2 и -NHC(=NH)NHR6; R2 и R3, каждый, независимо выбраны из -Н, -ОН, -F, -С1 и -Br; R4 выбран из -CO2H -Р(=O)(ОН)2, -SO3H; R5 выбран из -СОСН3, -COCF3, -SO2CH3; X выбран из -О- и -S-; Y выбран из
R7 выбран из Н, (С1-С20)алкила, (С3-С20о)циклоалкила, (С3-С20)гетероциклоалкила; (С5-С15)арила и (С2-С15)гетероарила; R8 выбран из (С3-С20)гетероциклоалкила, (С5-С15)арила и (С2-С15)гетероарила, или его фармацевтически приемлемой соли.
В другом аспекте изобретение относится к конъюгату, включающему (i) первый фрагмент, Int; (ii) мономер Fc-домена или Fc-домен; и (iv) линкер, ковалентно присоединенный к Int и к мономеру Fc-домена или Fc-домену; где каждый Int независимо выбран из любого из промежуточных соединений из таблицы 1.
В другом аспекте изобретение относится к конъюгату, включающему (i) первый фрагмент, A1; (ii) второй фрагмент, А2; (iii) белок альбумин, белок альбумин-связывающий пептид или Fc-связывающий пептид; и (iv) линкер, ковалентно присоединенный к A1 и А2, и к белку альбумину, белок альбумин-связывающему пептиду или Fc-связывающему пептиду; где каждый A1 и каждый А2 независимо выбран из любой из формул (A-I)-(A-XII):
где R1 выбран из -ОН, -NH2, -NHC(=NH)NH2 и -NHC(=NH)NHR6; R2 и R3, каждый, независимо выбраны из -Н, -ОН, -F, -С1 и -Br; R4 выбран из -CO2H -Р(=O)(ОН)2, -SO3H; R5 выбран из -СОСН3, -COCF3, -SO2CH3; X выбран из -О- и -S-; Y выбран из
R7 выбран из Н, (С1-С20)алкила, (С3-С20)циклоалкила, (С3-С20)гетероциклоалкила; (С5-С15)арила и (С2-С15)гетероарила; R8 выбран из (С3-С20)гетероциклоалкила, (С5-С15)арила и (С2-С15)гетероарила, или его фармацевтически приемлемой соли.
В другом аспекте изобретение относится к конъюгату, включающему (i) первый фрагмент, A1; (ii) второй фрагмент, А2; (iii) белок альбумин, белок альбумин-связывающий пептид или Fc-связывающий пептид; и (iv) линкер, ковалентно присоединенный к A1 и А2, и к белку альбумину, белок альбумин-связывающему пептиду или Fc-связывающему пептиду; где каждый A1 и каждый А2 независимо выбран из любой из формул (A-I)-(A-V):
где R1 выбран из -ОН, -NH2, -NHC(=NH)NH2 и -NHC(=NH)NHR6; R2 и R3, каждый, независимо выбраны из -Н, -ОН, -F, -С1 и -Br; R4 выбран из -CO2H -Р(=O)(ОН)2, -SO3H; R5 выбран из -СОСН3, -COCF3, -SO2CH3; X выбран из -О- и -S-; Y выбран из
R7 выбран из Н, (С1-С20)алкила, (С3-С20)циклоалкила, (С3-С20)гетероциклоалкила; (С5-С15)арила и (С2-С15)гетероарила; R8 выбран из (С3-С20)гетероциклоалкила, (С5-С15)арила и (С2-С15)гетероарила, или его фармацевтически приемлемой соли.
В другом аспекте изобретение относится к конъюгату, включающему (i) первый фрагмент, A1; (ii) второй фрагмент, А2; (iii) белок альбумин, белок альбумин-связывающий пептид или Fc-связывающий пептид; и (iv) линкер, ковалентно присоединенный к A1 и А2, и к белку альбумину, белок альбумин-связывающему пептиду или Fc-связывающему пептиду; где каждый A1 и каждый А2 независимо выбран из любой из формул (A-VI)-(A-IX):
где R1 выбран из -ОН, -NH2, -NHC(=NH)NH2 и -NHC(=NH)NHR6; R2 и R3, каждый, независимо выбраны из -Н, -ОН, -F, -С1 и -Br; R4 выбран из -CO2H, -Р(=O)(ОН)2, -SO3H; R5 выбран из -СОСН3, -COCF3, -SO2CH3; X выбран из -О- и -S-; Y выбран из
R7 выбран из Н, (С1-С20)алкила, (С3-С20)циклоалкила, (С3-С20)гетероциклоалкила; (С5-С15)арила и (С2-С15)гетероарила; R8 выбран из (С3-С20)гетероциклоалкила, (С5-С15)арила и (С2-С15)гетероарила, или его фармацевтически приемлемой соли.
В другом аспекте изобретение относится к конъюгату, описываемому формулой (D-I):
где каждый A1 и каждый А2 независимо выбран из любой из формул (A-I)-(A-XII):
где R1 выбран из -ОН, -NH2, -NHC(=NH)NH2 и -NHC(=NH)NHR6; R2 и R3, каждый, независимо выбраны из -Н, -ОН, -F, -С1 и -Br; R4 выбран из -СО2Н, -Р(=O)(ОН)2, -SO3H; R5 выбран из -СОСН3, -COCF3, -SO2CH3; X выбран из -О- и -S-; Y выбран из
R7 выбран из H, (С1-С20)алкила, (С3-С20)циклоалкила, (С3-С20)гетероциклоалкила; (С5-С15)арила и (С2-С15)гетероарила; R8 выбран из (С3-С20)гетероциклоалкила, (С5-С15)арила и (С2-С15)гетероарила; каждый Е содержит мономер Fc-домена (например, мономер Fc-домена, имеющий последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 1-68), белок альбумин (например, белок альбумин, имеющий последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 69-71), белок альбумин-связывающий пептид или Fc-связывающий пептид; п равно 1 или 2; Т представляет собой целое число от 1 до 20 (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20), и L представляет собой линкер, ковалентно присоединенный к каждому из Е, A1 и А2, или его фармацевтически приемлемой соли. Когда Т больше 1 (например, Т равно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20), каждый A1-L-A2 может быть независимо выбран (например, независимо выбран из любой из структур A1-L-A2, описанных в настоящем документе).
В другом аспекте изобретение относится к конъюгату, описываемому формулой (D-I):
где каждый A1 и каждый А2 независимо выбран из любой из формул (A-I)-(A-V):
где R1 выбран из -ОН, -NH2, -NHC(=NH)NH2 и -NHC(=NH)NHR6; R2 и R3, каждый, независимо выбраны из -Н, -ОН, -F, -С1 и -Br; R4 выбран из -CO2H -Р(=O)(ОН)2, -SO3H; R5 выбран из -СОСН3, -COCF3, -SO2CH3; X выбран из -О- и -S-; Y выбран из
R7 выбран из Н, (С1-С20)алкила, (С3-С20)циклоалкила, (С3-С20)гетероциклоалкила; (С5-С15)арила и (С2-С15)гетероарила; R8 выбран из (С3-С20)гетероциклоалкила, (С5-С15)арила и (С2-С15)гетероарила; каждый Е содержит мономер Fc-домена (например, мономер Fc-домена, имеющий последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 1-68), белок альбумин (например, белок альбумин, имеющий последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 69-71), белок альбумин-связывающий пептид или Fc-связывающий пептид; п равно 1 или 2; Т представляет собой целое число от 1 до 20 (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20); и L представляет собой линкер, ковалентно присоединенный к каждому из Е, A1 и А2, или его фармацевтически приемлемой соли. Когда Т больше 1 (например, Т равно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20), каждый A1-L-A2 может быть независимо выбран (например, независимо выбран из любой из структур A1-L-A2, описанных в настоящем документе).
В другом аспекте изобретение относится к конъюгату, описываемому формулой (D-I):
где каждый A1 и каждый А2 независимо выбран из любой из формул (А-VI) - (А-IX):
где R1 выбран из -ОН, -NH2, -NHC(=NH)NH2 и -NHC(=NH)NHR6; R2 и R3, каждый, независимо выбраны из -Н, -ОН, -F, -С1 и -Br; R4 выбран из -СО2Н, -Р(=O)(ОН)2, -SO3H; R5 выбран из -СОСНз, -COCF3, -SO2CH3; X выбран из -О- и -S-; Y выбран из
R7 выбран из Н, (С1-С20)алкила, (С3-С20)циклоалкила, (С3-С20)гетероциклоалкила; (С5-С15)арила и (С2-С15)гетероарила; R8 выбран из (С3-С20)гетероциклоалкила, (С5-С15)арила и (С2-С15)гетероарила; каждый Е содержит мономер Fc-домена (например, мономер Fc-домена, имеющий последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 1-68), белок альбумин (например, белок альбумин, имеющий последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 69-71), белок альбумин-связывающий пептид или Fc-связывающий пептид; n равно 1 или 2; Т представляет собой целое число от 1 до 20 (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20); и L представляет собой линкер, ковалентно присоединенный к каждому из Е, A и А2, или его фармацевтически приемлемой соли. Когда Т больше 1 (например, Т равно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20), каждый A1-L-A2 может быть независимо выбран (например, независимо выбран из любой из структур A1-L-A2, описанных в настоящем документе).
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (D-II): (Е)n
или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (D-II- 1):
или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (D-II-2);
или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (D-II-3):
где L' представляет собой остаток от L, a y1 и у2, каждый, независимо представляют собой целое число, равное 1-20 (например, y1 и у2, каждый, независимо равны 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20), или его фармацевтически приемлемая соль. В некоторых вариантах осуществления L' представляет собой атом азота.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат имеет структуру, выбранную из
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (D-II-4):
или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (D-II-5):
где L' представляет собой остаток от L, a y1 и у2, каждый, независимо представляют собой целое число, равное 1-20 (например, y1 и у2, каждый, независимо равны 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20), или его фармацевтически приемлемая соль. В некоторых вариантах осуществления L' представляет собой атом азота.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат имеет структуру, выбранную из:
или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат имеет структуру, выбранную из:
или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (D-II-6):
где R7 выбран из Н, (С1-С20)алкила, (С3-С20)циклоалкила, (С3-С20)гетероциклоалкила; (С5-С15)арила и (С2-С15)гетероарила; или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (D-II-7):
или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (D-II-8):
где L' представляет собой остаток от L, a y1 и у2, каждый, независимо представляют собой целое число, равное 1-20 (например, y1 и у2, каждый, независимо равны 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20), или его фармацевтически приемлемая соль. В некоторых вариантах осуществления L' представляет собой атом азота.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат имеет структуру
или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат имеет структуру
или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат имеет структуру:
или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (D-II-9):
или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (D-II-10):
где L' представляет собой остаток от L, a y1 и у2, каждый, независимо представляют собой целое число, равное 1-20 (например, y1 и у2, каждый, независимо равны 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20), или его фармацевтически приемлемая соль. В некоторых вариантах осуществления L' представляет собой атом азота.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат имеет структуру:
или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат имеет структуру:
или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (D-III):
или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (D-III-1):
или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (D-III-2):
или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (D-III-3):
где L' представляет собой остаток от L, a y1 и у2, каждый, независимо представляют собой целое число, равное 1-20 (например, y1 и у2, каждый, независимо равны 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20), или его фармацевтически приемлемая соль. В некоторых вариантах осуществления L' представляет собой атом азота.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (D-III-4):
или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (D-III-5):
где L' представляет собой остаток от L, a y1 и у2, каждый, независимо представляют собой целое число, равное 1-20 (например, y1 и у2, каждый, независимо равны 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20), или его фармацевтически приемлемая соль. В некоторых вариантах осуществления L' представляет собой атом азота
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (D-III-6):
или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (D-III-7):
где L' представляет собой остаток от L, a y1 и у2, каждый, независимо представляют собой целое число, равное 1-20 (например, y1 и у2, каждый, независимо равны 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20), или его фармацевтически приемлемая соль. В некоторых вариантах осуществления L' представляет собой атом азота.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (D-III-8):
или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (D-III-9):
где L' представляет собой остаток от L, a y1 и у2, каждый, независимо представляют собой целое число, равное 1-20 (например, y1 и у2, каждый, независимо равны 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20), или его фармацевтически приемлемая соль. В некоторых вариантах осуществления L' представляет собой атом азота.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (D-IV):
или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (D-IV-1):
или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (D-IV-2):
где L' представляет собой остаток от L, a y1 и у2, каждый, независимо представляют собой целое число, равное 1-20 (например, y1 и у2, каждый, независимо равны 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20), или его фармацевтически приемлемая соль. В некоторых вариантах осуществления L' представляет собой атом азота.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (D-V):
или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (D-V-1):
или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (D-V-2):
или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (D-V-3):
где L' представляет собой остаток от L, a y1 и у2, каждый, независимо представляют собой целое число, равное 1-20 (например, y1 и у2, каждый, независимо равны 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20), или его фармацевтически приемлемая соль. В некоторых вариантах осуществления L' представляет собой атом азота. В некоторых вариантах осуществления каждый y1 и у2 равен 1, каждый y1 и у2 равен 2, или каждый y1 и у2 равен 3.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (D-V-4):
или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (D-V-5):
где L' представляет собой остаток от L, и каждый y1 и у2 независимо представляет собой целое число, равное 1-20 (например, каждый y1 и у2 независимо равен 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20), или его фармацевтически приемлемая соль. В некоторых вариантах осуществления L' представляет собой атом азота. В некоторых вариантах осуществления каждый y1 и у2 равен 1, каждый y1 и у2 равен 2, или каждый y1 и у2 равен 3.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (D-V-6):
или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (D-V-7):
или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (D-V-8):
где L' представляет собой остаток от L, и каждый y1 и у2 независимо представляет собой целое число, равное 1-20 (например, каждый y1 и y2 независимо равен 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20), или его фармацевтически приемлемая соль. В некоторых вариантах осуществления L' представляет собой атом азота. В некоторых вариантах осуществления каждый y1 и у2 равен 1, каждый y1 и у2 равен 2, или каждый y1 и у2 равен 3.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (D-V-9):
или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (D-V-10):
где L' представляет собой остаток от L, и каждый y1 и у2 независимо представляет собой целое число, равное 1-20 (например, каждый y1 и у2 независимо равен 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20), или его фармацевтически приемлемая соль. В некоторых вариантах осуществления L' представляет собой атом азота. В некоторых вариантах осуществления каждый y1 и у2 равен 1; каждый y1 и у2 равен 2, или каждый y1 и у2 равен 3.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (D-VI):
или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (D-VI-1):
или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (D-VI-2):
или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (D-VI-3):
где L' представляет собой остаток от L, и каждый y1 и у2 независимо представляет собой целое число, равное 1-20 (например, каждый y1 и у2 независимо равен 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20), или его фармацевтически приемлемая соль. В некоторых вариантах осуществления L' представляет собой атом азота. В некоторых вариантах осуществления каждый y1 и у2 равен 1, каждый y1 и у2 равен 2, или каждый y1 и у2 равен 3.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (D-VI-4):
или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (D-VI-5):
где L' представляет собой остаток от L, и каждый y1 и у2 независимо представляет собой целое число, равное 1-20 (например, каждый y1 и у2 независимо равен 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20), или его фармацевтически приемлемая соль. В некоторых вариантах осуществления L' представляет собой атом азота. В некоторых вариантах осуществления каждый y1 и у2 равен 1, каждый y1 и у2 равен 2, или каждый y1 и у2 равен 3.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (D-VI-6):
или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (D-VI-7):
где L' представляет собой остаток от L, и каждый y1 и у2 независимо представляет собой целое число, равное 1-20 (например, каждый y1 и у2 независимо равен 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20), или его фармацевтически приемлемая соль. В некоторых вариантах осуществления L' представляет собой атом азота. В некоторых вариантах осуществления каждый y1 и у2 равен 1, каждый y1 и у2 равен 2, или каждый y1 и у2 равен 3.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (D-VI-8):
или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (D-VI-9):
где L' представляет собой остаток от L, и каждый y1 и у2 независимо представляет собой целое число, равное 1-20 (например, каждый y1 и у2 независимо равен 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20), или его фармацевтически приемлемая соль. В некоторых вариантах осуществления L' представляет собой атом азота. В некоторых вариантах осуществления каждый y1 и у2 равен 1, каждый y1 и у2 равен 2, или каждый y1 и у2 равен 3.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (D-VII):
или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов, описанных в настоящем документе, r1 представляет собой ОН. В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов, описанных в настоящем документе, R1 представляет собой NH2. В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов, описанных в настоящем документе, R1 представляет собой -NHC(=NH)NH2.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (D-VIII):
или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (D-VIII-1):
или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (D-VIII-2):
или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (D-VIII-3):
где L' представляет собой остаток от L, и каждый y1 и у2 независимо представляет собой целое число, равное 1-20 (например, каждый y1 и у2 независимо равен 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20), или его фармацевтически приемлемая соль. В некоторых вариантах осуществления L' представляет собой атом азота.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат имеет структуру, выбранную из
или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (D-VIII-4):
или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (D-VIII-5):
где L' представляет собой остаток от L, и каждый y1 и у2 независимо представляет собой целое число, равное 1-20 (например, каждый y1 и у2 независимо равен 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20), или его фармацевтически приемлемая соль. В некоторых вариантах осуществления L' представляет собой атом азота.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат имеет структуру; выбранную из:
или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается структурой
или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (D-VIII-6):
или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (D-VIII-7):
где L' представляет собой остаток от L, и каждый y1 и у2 независимо представляет собой целое число, равное 1-20 (например, каждый y1 и у2 независимо равен 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20), или его фармацевтически приемлемая соль. В некоторых вариантах осуществления L' представляет собой атом азота.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (D-VIII-8):
или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (D-VIII-9):
где L' представляет собой остаток от L, и каждый y1 и у2 независимо представляет собой целое число, равное 1-20 (например, каждый y1 и у2 независимо равен 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20), или его фармацевтически приемлемая соль. В некоторых вариантах осуществления L' представляет собой атом азота.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (D-VIII-10):
или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (D-VIII-II):
где L' представляет собой остаток от L, и каждый y1 и у2 независимо представляет собой целое число, равное 1 до 20 (например, каждый y1 и у2 независимо равен 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20), или его фармацевтически приемлемая соль. В некоторых вариантах осуществления L' представляет собой атом азота.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (D-IX):
или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (D-IX-I):
или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (D-IX-2):
или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (D-IX-3):
или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (D-IX-4):
или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (D-IX-5):
или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (D-IX-6):
или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (D-X):
или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (D-X-1):
или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (D-X-2):
или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (D-X-3):
или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов, описанных в настоящем документе, L или L' включает один или несколько из необязательно замещенного (С1-С20)алкилена, необязательно замещенного (С1-С20)гетероалкилена, необязательно замещенного (С2-С20)алкенилена, необязательно замещенного (С2-С20)гетероалкенилена, необязательно замещенного (С2-С20)алкинилена, необязательно замещенного (С2-С20)гетероалкинилена, необязательно замещенного (С3-С20)никлоалкилена, необязательно замещенного (С3-С20)гетероциклоалкилена, необязательно замещенного (С4-С20)никлоалкенилена, необязательно замещенного (C4-С20)гетероциклоалкенилена, необязательно замещенного (С8-С20)циклоалкинилена, необязательно замещенного (С8-С20)гетероциклоалкинилена, необязательно замещенного (С5-С15)арилена, необязательно замещенного (С2-С15)гетероарилена, О, S, NRi, Р, карбонила, тиокарбонила, сульфонила, фосфата, фосфорила или имино, где Ri представляет собой Н, необязательно замещенный (С1-С20)алкил, необязательно замещенный (С1-С20)гетероалкил, необязательно замещенный (С2-С20)алкенил, необязательно замещенный (С2-С20)гетероалкенил, необязательно замещенный (С2-С20)алкинил, необязательно замещенный (С2-С20)гетероалкинил, необязательно замещенный (С3-С20)циклоалкил, необязательно замещенный (С3-С20)гетероциклоалкил, необязательно замещенный (С4-С20)циклоалкенил, необязательно замещенный (С4-С20)гетероциклоалкенил, необязательно замещенный (С8-С20)циклоалкинил, необязательно замещенный (С8-С20)гетероциклоалкинил, необязательно замещенный (С5-С15)арил или необязательно замещенный (С2-С15)гетероарил.
В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов, описанных в настоящем документе, основная цепь L или L' состоит из одного или нескольких из необязательно замещенного (С1-С20)алкилена, необязательно замещенного (C1-С20)гетероалкилена, необязательно замещенного (С2-С20)алкенилена, необязательно замещенного (С2-С20)гетероалкенилена, необязательно замещенного (С2-С20)алкинилена, необязательно замещенного (С2-С20)гетероалкинилена, необязательно замещенного (С3-С20)пиклоалкилена, необязательно замещенного (С3-С20)гетероциклоалкилена, необязательно замещенного (С4-С20)пиклоалкенилена, необязательно замещенного (С4-С20)гетероциклоалкенилена, необязательно замещенного (С8-С20)пиклоалкинилена, необязательно замещенного (C8-С20)гетероциклоалкинилена, необязательно замещенного (С5-С15)арилена, необязательно замещенного (С2-С15)гетероарилена, О, S, NRi, Р, карбонила, тиокарбонила, сульфонила, фосфата, фосфорила или имино, где Ri представляет собой Н, необязательно замещенный (С1-С20)алкил, необязательно замещенный (C1-С20)гетероалкил, необязательно замещенный (С2-С20)алкенил, необязательно замещенный (С2-С20)гетероалкенил, необязательно замещенный (С2-С20)алкинил, необязательно замещенный (С2-С20)гетероалкинил; необязательно замещенный (С3-С20)циклоалкил, необязательно замещенный (С3-С20)гетероциклоалкил, необязательно замещенный (С4-С20)циклоалкенил, необязательно замещенный (С4-С20)гетероциклоалкенил, необязательно замещенный (С8-С20)циклоалкинил, необязательно замещенный (С8-С20)гетероциклоалкинил, необязательно замещенный (С5-С15)арил или необязательно замещенный (С2-С15)гетероарил.
В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов, описанных в настоящем документе, L или L' является оксозамещенным. В некоторых вариантах осуществления основная цепь L или L' содержит не более 250 атомов. В некоторых вариантах осуществления L или L' способны образовывать амидную, карбаматную, сульфонильную или мочевинную связь. В некоторых вариантах осуществления L или L' представляет собой связь. В некоторых вариантах осуществления L или L' представляет собой атом.
В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов, описанных в настоящем документе, каждый L описывается формулой (D-L-I):
где LA описывается формулой GA1-(ZA1)g1-(YA1)h1-(ZA2)i1-(YA2)j1-(ZA3)k1-(YA3)l1-(ZA4)m1-(YA4)n1-(ZA5)o1-GA2; LB описывается формулой GB1-(ZB1)g2-(YB1)h2-(ZB2)i2-(YB2)j2-(ZB3)k2-(YB3)l2-(ZB4)m2-(YB4)n2-(ZB5)o2-GB2; LC описывается формулой GC1-(ZC1)g3-(YC1)h3-(ZC2)i3-(YC2)j3-(ZC3)k3-(YC3)l3-(YC4)m3-(YC4)n3-(ZC5)o3-GC2; GA1 представляет собой связь, присоединенную к Q; GA2 представляет собой связь, присоединенную к А1; GB1 представляет собой связь, присоединенную к Q); GB2 представляет собой связь, присоединенную к А2; GC1 представляет собой связь, присоединенную к Q; GC2 представляет собой связь, присоединенную к E, или функциональную группу, способную реагировать с функциональной группой, конъюгированной с Е (например, малеимид и цистеин, амин и активированная карбоновая кислота, тиол и малеимид, активированные сульфоновая кислота и амин, изоцианат и амин, азид и алкин, а также алкен и тетразин); каждый из ZA1, ZA2, ZA3, ZA4, ZA5, ZB1, ZB2, ZB3, ZB4, ZB5, ZCl, ZC2, ZC3, ZC4 и ZC5 представляет собой, независимо, необязательно замещенный (С1-С20)алкилен, необязательно замещенный (С1-С20)гетероалкилен, необязательно замещенный (С2-С20)алкенилен, необязательно замещенный (С2-С20)гетероалкенилен, необязательно замещенный (С2-С20)алкинилен, необязательно замещенный (С2-С20)гетероалкинилен, необязательно замещенный (С3-С20)циклоалкинилен, необязательно замещенный (С3-С20)гетероциклоалкилен, необязательно замещенный (С4-С20)циклоалкенилен, необязательно замещенный (С4-С20)гетероциклоалкенилен, необязательно замещенный (С8-С20)циклоалкинилен, необязательно замещенный (С8-С20)гетероциклоалкинилен, необязательно замещенный (С5-С15)арилен или необязательно замещенный (С2-С15)гетероарилен; каждый из YA1, YA2, YA3, YA4, YB1, YB2, YB3, YB4, YC1, YC2, YC3 и YC4 представляет собой, независимо, O, S, NRi, P, карбонил, тиокарбонил, сульфонил, фосфат, фосфорил или имино; Ri представляет собой Н, необязательно замещенный (С1-С20)алкил, необязательно замещенный (С1-С20)гетероалкил, необязательно замещенный (С2-С20)алкенил, необязательно замещенный (С2-С20)гетероалкенил, необязательно замещенный (С2-С20)алкинил, необязательно замещенный (С2-С20)гетероалкинил, необязательно замещенный (С3-С20)циклоалкинил, необязательно замещенный (С3-С20)гетероциклоалкил, необязательно замещенный (С4-С20)циклоалкенил, необязательно замещенный (С4-С20)гетероциклоалкенил, необязательно замещенный (С8-С20)циклоалкинил, необязательно замещенный (C8-С20)гетероциклоалкинил, необязательно замещенный (С5-С15)арил или необязательно замещенный (С2-С15)гетероарил; каждый из g1, h1, i1, j1, k1, l1, m1, n1, o1, g2, h2, i2, j2, k2, l2, m2, n2, o2, g3, h3, i3, j3, k3, l3, m3, n3 и о3 равен, независимо, 0 или 1; Q представляет собой атом азота, необязательно замещенный (С1-С20)алкилен, необязательно замещенный (С1-С20)гетероалкилен, необязательно замещенный (С2-С20)алкенилен, необязательно замещенный (С2-С20)гетероалкенилен, необязательно замещенный (С2-С20)алкинилен, необязательно замещенный (С2-С20)гетероалкинилен, необязательно замещенный (С3-С20)циклоалкилен, необязательно замещенный (С3-С20)гетероциклоалкилен, необязательно замещенный (С4-С20)пиклоалкенилен, необязательно замещенный (С4-С20)гетероциклоалкенилен, необязательно замещенный (С8-С20)пиклоалкинилен, необязательно замещенный (С8-С20)гетероциклоалкинилен, необязательно замещенный (С5-С15)арилен или необязательно замещенный (С2-С15)гетероарилен.
В некоторых вариантах осуществления LC может иметь две точки присоединения к Fc-домену, Fc-связывающему пептиду, белку альбумину или белок альбумин-связывающему пептиду (например, два GC2). В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов, описанных в настоящем документе, L включает линкер полиэтиленгликоль (PEG). Линкер PEG представляет собой линкер, имеющий структуру с повторяющимися звеньями (-CH2CH2O-)n, где n представляет целое число от 2 до 100. Линкер полиэтиленгликоль может ковалентно присоединяться к ингибитору нейраминидазы и Е (например, в конъюгате любой из формул (MI)-(MX)). Линкер полиэтиленгликоль может ковалентно присоединяться к первому ингибитору нейраминидазы и второму ингибитору нейраминидазы (например, в конъюгате любой из формул (D-I)-(D-X)). Линкер полиэтиленгликоль может ковалентно присоединяться к димеру ингибитора нейраминидазы и Е (например, в конъюгате любой из формул (D-I)-(D-X)). Линкер полиэтиленгликоль может быть выбран из любого из PEG2-PEG100 (например, PEG2, РЕС3, PEG4, PEG5, PEG5-PEG10, PEG10-PEG20, PEG20-PEG10, РЕС30-PEG40, PEG50-PEG60, PEG60-PEG70, PEG70-PEG80, PEG80-PEG90, PEG90-PEG100). В некоторых вариантах осуществления LC включает линкер PEG, где LC ковалентно присоединен к каждому из Q и Е.
В некоторых вариантах осуществления L представляет собой:
где каждый z1 и z2, независимо, представляют собой целое число от 1 до 20; и R9 выбран из Н; (С1-С20)алкила, (С3-С20)циклоалкила; (С3-С20)гетероциклоалкила; (C5-С15)арила и (С2-С15)гетероарила.
В некоторых вариантах осуществления L представляет собой
где R* представляет собой связь или включает один или несколько из необязательно замещенного (C1-С20)алкилена, необязательно замещенного (С1-С20)гетероалкилена, необязательно замещенного (С2-С20)алкенилена, необязательно замещенного (С2-С20)гетероалкенилена, необязательно замещенного (С2-С20)алкинилена, необязательно замещенного (С2-С20)гетероалкинилена, необязательно замещенного (С3-С20)циклоалкилена, необязательно замещенного (С3-С20)гетероциклоалкилена, необязательно замещенного (С4-С20)циклоалкенилена, необязательно замещенного (С4-С20)гетероциклоалкенилена, необязательно замещенного (С8-С20)циклоалкинилена, необязательно замещенного (С8-С20)гетероциклоалкилена, необязательно замещенного (С5-С15)арилена, необязательно замещенного (С2-С15)гетероарилена, О, S, NRi, Р, карбонила, тиокарбонила, сульфонила, фосфата и имино, и где Ri представляет собой Н, необязательно замещенный (С1-С20)алкил, необязательно замещенный (C1-С20)гетероалкил, необязательно замещенный (С2-С20)алкенил, необязательно замещенный (С2-С20)гетероалкенил, необязательно замещенный (С2-С20)алкинил, необязательно замещенный (С2-С20)гетероалкинил, необязательно замещенный (С3-С20)циклоалкил, необязательно замещенный (С3-С20)гетероциклоалкил, необязательно замещенный (С4-С20)циклоалкенил, необязательно замещенный (С4-С20)гетероциклоалкенил, необязательно замещенный (С8-С20)циклоалкинил, необязательно замещенный (С8-С20)гетероциклоалкинил, необязательно замещенный (С5-С15)арил или необязательно замещенный (С2-С15)гетероарил.
В некоторых вариантах осуществления Y представляет собой: 
(-NH(C=O)O-) и L представляет собой: 
В некоторых вариантах осуществления Y представляет собой: 
(-NH(C=O)O-) и L представляет собой: 
В некоторых вариантах осуществления Y представляет собой: 
(-NH(C=O)O) и L представляет собой: 
В некоторых вариантах осуществления Y представляет собой: 
(-О-) и L представляет собой: 
В другом аспекте изобретение относится к конъюгату, описываемому формулой (M-I):
где каждый А1 независимо выбран из любой из формул (A-I)-(A-XII):
где R1 выбран из -ОН, -NH2, -NHC(=NH)NH2 и -NHC(=NH)NHR6; R2 и R3, каждый, независимо выбраны из -Н, -ОН, -F, -Cl и -Br; R4 выбран из -CO2H -Р(=O)(ОН)2, -SO3H; R5 выбран из -СОСН3, -COCF3, -SO2CH3; X выбран из -О- и -S-; Y выбран из
R6 выбран из 
R7 выбран из Н, (С1-С20)алкила, (С3-С20)циклоалкила, (С3-С20)гетероциклоалкила; (С5-С15)арила и (С2-С15)гетероарила; R8 выбран из (С3-С20)гетероциклоалкила, (С5-С15)арила и (С2-С15)гетероарила; каждый Е содержит мономер Fc-домена (например, мономер Fc-домена, имеющий последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 1-68), белок альбумин (например, белок альбумин, имеющий последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 69-71), белок альбумин-связывающий пептид или Fc-связывающий пептид; n равно 1 или 2; Т представляет собой целое число от 1 до 20 (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20); и L представляет собой линкер, ковалентно присоединенный к каждому из Е и A1, или его фармацевтически приемлемой соли. Когда Т больше 1 (например, Т равно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20), каждый A1 может быть независимо выбран из любой из формул (A-I)-(A-XII).
В другом аспекте изобретение относится к конъюгату, описываемому формулой (M-I):
где каждый A1 независимо выбран из любой из формул (A-I)-(A-V):
где R1 выбран из -ОН, -NH2, -NHC(=NH)NH2 и -NHC(=NH)NHR6; R2 и R3, каждый, независимо выбраны из -Н, -ОН, -F, -Cl и -Br; R4 выбран из -CO2H -Р(=O)(ОН)2, -SO3H; R5 выбран из -СОСН3, -COCF3, -SO2CH3; X выбран из -О- и -S-; Y выбран из
R6 выбран из 
R7 выбран из Н, (С1-С20)алкила, (С3-С20)циклоалкила, (С3-С20)гетероциклоалкила; (С5-С15)арила и (С2-С15)гетероарила; R8 выбран из (С3-С20)гетероциклоалкила, (С5-С15)арила и (С2-С15)гетероарила; каждый Е содержит мономер Fc-домена (например, мономер Fc-домена, имеющий последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 1-68), белок альбумин (например, белок альбумин, имеющий последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 69-71), белок альбумин-связывающий пептид или Fc-связывающий пептид; n равно 1 или 2; Т представляет собой целое число от 1 до 20 (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20); и L представляет собой линкер, ковалентно присоединенный к каждому из Е и A1, или его фармацевтически приемлемой соли. Когда Т больше 1 (например, Т равно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20), каждый A1 может быть независимо выбран из любой из формул (A-I)-(A-V). В другом аспекте изобретение относится к конъюгату, описываемому формулой (M-I):
где каждый A1 независимо выбран из любой из формул (A-VI)-(A-IX):
где R1 выбран из -ОН, -NH2, -NHC(=NH)NH2 и -NHC(=NH)NHR6; R2 и R3, каждый, независимо выбраны из -Н, -ОН, -F, -Cl и -Br; R4 выбран из -СО2Н, -Р(=O)(ОН)2, -SO3H; R5 выбран из -СОСН3, -COCF3, -SO2CH3; X выбран из -О- и -S-; Y выбран из
R6 выбран из 
R7 выбран из Н, (С1-С20)алкила, (С3-С20)циклоалкила, (С3-С20)гетероциклоалкила; (С5-С15)арила и (С2-С15)гетероарила; R8 выбран из (С3-С20)гетероциклоалкила, (С5-С15)арила и (С2-С15)гетероарила; каждый Е содержит мономер Fc-домена (например, мономер Fc-домена, имеющий последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 1-68), белок альбумин (например, белок альбумин, имеющий последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 69-71), белок альбумин-связывающий пептид или Fc-связывающий пептид; n равно 1 или 2; Т представляет собой целое число от 1 до 20 (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20); и L представляет собой линкер, ковалентно присоединенный к каждому из Е и A1, или его фармацевтически приемлемой соли. Когда Т больше 1 (например, Т равно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20), каждый A1 может быть независимо выбран из любой из формул (A-VI)-(A-IX).
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (М-II):
или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (М-II-1):
или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (М-II-2):
или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (М-II-3):
где L' представляет собой остаток L, и y1 представляет собой целое число, равное 1-20 (например, y1 равен 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20), или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (М-II-4):
или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (М-II-5):
где L' представляет собой остаток L, и y1 представляет собой целое число, равное 1-20 (например, y1 равен 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20), или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат имеет структуру
или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (М-II-6):
где R7 выбран из Н, (C1-С20)алкила, (С3-С20)циклоалкила, (С3-С20)гетероциклоалкила; (С5-С15)арила и (С2-С15)гетероарила; или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (М-II-7):
или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (М-II-8):
где L' представляет собой остаток L, и y1 представляет собой целое число, равное 1-20 (например, y1 равен 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20), или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат имеет структуру
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (М-II-9):
или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (М-II-10):
где L' представляет собой остаток L, и y1 представляет собой целое число, равное 1-20 (например, y1 равен 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20), или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат имеет структуру:
или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (М-III):
или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (М-III-1):
или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (М-III-2):
или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (М-III-3):
где L' представляет собой остаток L, и y1 представляет собой целое число, равное 1-20 (например, y1 равен 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20), или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (М-III-4):
или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (М-III-5):
где L' представляет собой остаток L, и y1 представляет собой целое число, равное 1-20 (например, y1 равен 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20), или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (М-III-6):
или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (М-III-7):
где L' представляет собой остаток L, и y1 представляет собой целое число, равное 1-20 (например, y1 равен 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20), или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (М-III-8):
или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (М-III-9):
где L' представляет собой остаток L, и y1 представляет собой целое число, равное 1-20 (например, y1 равен 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20), или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (М-IV):
или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (M-IV-1):
или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (M-IV-2):
где L' представляет собой остаток L, и y1 представляет собой целое число, равное 1-20 (например, y1 равен 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20), или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (M-V):
или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (M-V-1):
или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (M-V-2):
или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (M-V-3):
где L' представляет собой остаток L, и y1 представляет собой целое число, равное 1-20 (например, y1 равен 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20), или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (M-V-4):
или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (M-V-5):
где L' представляет собой остаток L, и y1 представляет собой целое число, равное 1-20 (например, y1 равен 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20), или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (M-V-6):
или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (M-V-7):
или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (M-V-8):
где L' представляет собой остаток L, и y1 представляет собой целое число, равное 1-20 (например, y1 равен 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20), или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (M-V-9):
или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (M-V-10):
где L' представляет собой остаток L, и y1 представляет собой целое число, равное 1-20 (например, y1 равен 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20), или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (М-VI):
или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (М-VI-1):
или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (М-VI-2):
или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (М-VI-3):
где L' представляет собой остаток L, и y1 представляет собой целое число, равное 1-20 (например, y1 равен 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20), или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (М-VI-4):
или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (М-VI-5):
где L' представляет собой остаток L, и y1 представляет собой целое число, равное 1-20 (например, y1 равен 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20), или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (М-VI-6):
или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (М-VI-7):
где L' представляет собой остаток L, и y1 представляет собой целое число, равное 1-20 (например, y1 равен 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20), или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (М-VI-8):
или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (М-VI-9):
где L' представляет собой остаток L, и y1 представляет собой целое число, равное 1-20 (например, y1 равен 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20), или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (М-VII):
или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов, описанных в настоящем документе, R1 представляет собой ОН. В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов, описанных в настоящем документе, R1 представляет собой NH2. В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов, описанных в настоящем документе, R1 представляет собой -NHC(=NH)NH2.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (М-VIII):
или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (М-VIII-1):
или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (М-VIII-2):
или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (М-VIII-3):
где L' представляет собой остаток L, и y1 представляет собой целое число, равное 1-20 (например, y1 равен 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20), или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (М-VIII-4):
или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (М-VIII-5):
где L' представляет собой остаток L, и y1 представляет собой целое число, равное 1-20, или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат имеет структуру
или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (М-VIII-6):
или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (М-VIII-7):
где L' представляет собой остаток L, и y1 представляет собой целое число, равное 1-20 (например, y1 равен 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20), или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (М-VIII-8):
или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (М-VIII-9):
где L представляет собой остаток L, и y1 представляет собой целое число, равное 1-20 (например, y1 равен 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20), или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (М-VIII-10):
или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (М-VIII-11):
где L' представляет собой остаток L, и y1 представляет собой целое число, равное 1-20 (например, y1 равен 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20), или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (М-IX):
или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (M-IX-1):
или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (M-IX-2):
или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (M-IX-3):
или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (M-IX-4):
или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (M-IX-5):
или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (M-IX-6):
или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (М-Х):
или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (М-Х-1):
или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (М-Х-2):
или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат описывается формулой (М-Х-3):
или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов, описанных в настоящем документе, L или L' содержит один или несколько из необязательно замещенного (С1-С20)алкилена, необязательно замещенного (С1-С20)гетероалкилена, необязательно замещенного (С2-С20)алкенилена, необязательно замещенного (С2-С20)гетероалкенилена, необязательно замещенного (С2-С20)алкинилена, необязательно замещенного (С2-С20)гетероалкинилена, необязательно замещенного (С3-С20)циклоалкилена, необязательно замещенного (С3-С20)гетероциклоалкилена, необязательно замещенного (С4-С20)циклоалкенилена, необязательно замещенного (С4-С20)гетероциклоалкенилена, необязательно замещенного (С8-С20)циклоалкинилена, необязательно замещенного (С8-С20)гетероциклоалкинилена, необязательно замещенного (С5-С15)арилена, необязательно замещенного (С2-С15 гетероарилена, О, S, NRi, Р, карбонила, тиокарбонила, сульфонила, фосфата, фосфорила или имино, где Ri представляет собой Н, необязательно замещенный (С1-С20)алкил, необязательно замещенный (С1-С20)гетероалкил, необязательно замещенный (С2-С20)алкенил, необязательно замещенный (С2-С20)гетероалкенил, необязательно замещенный (С2-С20)алкинил, необязательно замещенный (С2-С20)гетероалкинил, необязательно замещенный (С3-С20)циклоалкил, необязательно замещенный (С3-С20)гетероциклоалкил, необязательно замещенный (С4-С20)циклоалкенил, необязательно замещенный (С4-С20)гетероциклоалкенил, необязательно замещенный (С8-С20)циклоалкинил, необязательно замещенный (С8-С20)гетероциклоалкинил, необязательно замещенный (С5-С15)арил или необязательно замещенный (С2-С15)гетероарил.
В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов, описанных в настоящем документе, основная цепь L или L' состоит из одного или нескольких из необязательно замещенного (С1-С20)алкилена, необязательно замещенного (C1-С20)гетероалкилена, необязательно замещенного (С2-С20)алкенилена, необязательно замещенного (С2-С20)гетероалкенилена, необязательно замещенного (С2-С20)алкинилена, необязательно замещенного (С2-С20)гетероалкинилена, необязательно замещенного (С3-С20)циклоалкилена, необязательно замещенного (С3-С20)гетероциклоалкилена, необязательно замещенного (С4-С20)циклоалкенилена, необязательно замещенного (С4-С20)гетероциклоалкенилена, необязательно замещенного (С8-С20)циклоалкинилена, необязательно замещенного (C8-С20)гетероциклоалкинилена, необязательно замещенного (С5-С15)арилена, необязательно замещенного (С2-С15)гетероарилена, О, S, NRi, Р, карбонила, тиокарбонила, сульфонила, фосфата, фосфорила или имино, где Ri представляет собой Н, необязательно замещенный (С1-С20)алкил, необязательно замещенный (C1-С20)гетероалкил, необязательно замещенный (С2-С20)алкенил, необязательно замещенный (С2-С20)гетероалкенил, необязательно замещенный (С2-С20)алкинил, необязательно замещенный (С2-С20)гетероалкинил, необязательно замещенный (С3-С20)циклоалкил, необязательно замещенный (С3-С20)гетероциклоалкил, необязательно замещенный (С4-С20)циклоалкенил, необязательно замещенный (С4-С20)гетероциклоалкенил, необязательно замещенный (С8-С20)циклоалкинил, необязательно замещенный (С8-С20)гетероциклоалкинил, необязательно замещенный (С5-С15)арил или необязательно замещенный (С2-С15)гетероарил.
В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов, описанных в настоящем документе, L или L' является оксозамещенным. В некоторых вариантах осуществления основная цепь L или L' содержит не более 250 атомов. В некоторых вариантах осуществления L или L' способны образовывать амидную, карбаматную, сульфонильную или мочевинную связь. В некоторых вариантах осуществления L или L' представляет собой связь. В некоторых вариантах осуществления L или L' представляет собой атом.
В некоторых вариантах осуществления каждый L описывается формулой (M-L-1):
J1-(Q1)g-(T1)h-(Q2)i-(T2)j-(Q3)k-(T3)l-(Q4)m-(T4)n-(Q5)o-J2
где: J1 представляет собой связь, присоединенную к A1; J2 представляет собой связь, присоединенную к Е, или функциональную группу, способную реагировать с функциональной группой, конъюгированной с Е (например, малеимид и цистеин, амин и активированная карбоновая кислота, тиол и малеимид, активированная сульфоновая кислота и амин, изоцианат и амин, азид и алкин, а также алкен и тетразин); каждый из Q1, Q2, Q3, Q4 и Q5 независимо представляет собой необязательно замещенный (C1-С20)алкилен, необязательно замещенный (С1-С20)гетероалкилен, необязательно замещенный (С2-С20)алкенилен, необязательно замещенный (С2-С20)гетероалкенилен, необязательно замещенный (С2-С20)алкинилен, необязательно замещенный (С2-С20)гетероалкинилен, необязательно замещенный (С3-С20)циклоалкинилен, необязательно замещенный (С3-С20)гетероциклоалкилен, необязательно замещенный (С4-С20)циклоалкенилен, необязательно замещенный (С4-С20)гетероциклоалкенилен, необязательно замещенный (С8-С20)циклоалкинилен, необязательно замещенный (C8-С20)гетероциклоалкинилен, необязательно замещенный (С5-С15)арилен или необязательно замещенный (С2-С15)гетероарилен; каждый из Т1, Т2, Т3, Т4 независимо представляет собой О, S, NRi, Р, карбонил, тиокарбонил, сульфонил, фосфат, фосфорил или имино; Ri представляет собой Н, необязательно замещенный (С1-С20)алкил, необязательно замещенный (С1-С20)гетероалкил, необязательно замещенный (С2-С20)алкенил, необязательно замещенный (С2-С20)гетероалкенил, необязательно замещенный (С2-С20)алкинил, необязательно замещенный (С2-С20)гетероалкинил, необязательно замещенный (С3-С20)циклоалкил, необязательно замещенный (С3-С20)гетероциклоалкил, необязательно замещенный (С4-С20)циклоалкенил, необязательно замещенный (С4-С20)гетероциклоалкенил, необязательно замещенный (С8-С20)циклоалкинил, необязательно замещенный (С8-С20)гетероциклоалкинил, необязательно замещенный (С5-С15)арил или необязательно замещенный (С2-С15)гетероарил; и каждый из g, h, i, j, k, l, m, n и о независимо равен 0 или 1; или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления J2 может иметь две точки присоединения к домену Fc, Fc-связывающему пептиду, белку альбумину или белок альбумин-связывающему пептиду (например, два J2).
В некоторых вариантах осуществления L представляет собой:
где d представляет собой целое число от 1 до 20 (например, d равно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20).
В некоторых вариантах осуществления L представляет собой:
где каждый из d и е независимо представляет собой целое число от 1 до 26; или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов, описанных в настоящем документе, L включает линкер полиэтиленгликоль (PEG). Линкер PEG представляет собой линкер, имеющий структуру с повторяющимися звеньями (-СН2СН2О-)n, где n является целым числом от 2 до 100. Линкер полиэтиленгликоль может ковалентно присоединяться к ингибитору нейраминидазы и Е (например, в конъюгате любой из формул (MI)-(MX)). Линкер полиэтиленгликоль может ковалентно присоединяться к первому ингибитору нейраминидазы и второму ингибитору нейраминидазы (например, в конъюгате любой из формул (D-I)-(D-X)). Линкер полиэтиленгликоль может ковалентно присоединяться к димеру ингибитора нейраминидазы и Е (например, в конъюгате любой из формул (D-I)-(D-X)). Линкер полиэтиленгликоль может быть выбран из любого из PEG2-PEG100 (например, PEG2, PEG3, PEG4, PEG5, PEG5-PEG10, PEG10-PEG20, PEG20-PEG30, PEG30-PEG40, PEG50-PEG60, PEG60-PEG70, PEG70-PEG80, PEG80-PEG90, PEG90-PEG100). В некоторых вариантах осуществления Lc включает линкер PEG, где LC ковалентно присоединен к каждому из Q и E.
В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов, описанных в настоящем документе, R1 представляет собой -NHC(=NH)NH2. В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов, описанных в настоящем документе, R2 представляет собой -F. В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов, описанных в настоящем документе, R3 представляет собой -F. В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов, описанных в настоящем документе, R4 представляет собой -СО2Н. В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов, описанных в настоящем документе, R5 представляет собой -СОСН3.
В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов, описанных в настоящем документе, L ковалентно присоединен к атому азота экспонированного на поверхности лизина в Е или L ковалентно присоединен к атому серы экспонированного на поверхности цистеина в Е.
В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов, описанных в настоящем документе, Е представляет собой мономер Fc-домена. В некоторых вариантах осуществления n равно 2, и каждый Е димеризуется с образованием Fc-домена.
В некоторых вариантах осуществления n равно 2, каждый Е представляет собой мономер Fc-домена, каждый Е димеризуется с образованием Fc-домена, и конъюгат описывается формулой (D-I-1):
где J представляет собой Fc-домен; и Т представляет собой целое число от 1 до 20 (например, Т равно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20), или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления n равно 2, каждый Е представляет собой мономер Fc-домена, каждый Е димеризуется с образованием Fc-домена, и конъюгат описывается формулой (M-I-1):
где J представляет собой Fc-домен; и Т представляет собой целое число от 1 до 20 (например, Т равно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20), или его фармацевтически приемлемая соль
В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов, описанных в настоящем документе, Е имеет последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 1-68.
В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов, описанных в настоящем документе, Е представляет собой белок альбумин, белок альбумин-связывающий пептид или Fc-связывающий пептид. В некоторых вариантах осуществления, где Е представляет собой белок альбумин, белок альбумин-связывающий пептид или Fc-связывающий пептид, n равно 1.
В некоторых вариантах осуществления n равно 1, Е представляет собой белок альбумин, белок альбумин-связывающий пептид или Fc-связывающий пептид, и конъюгат описывается формулой (D-I-2):
где Е представляет собой белок альбумин, белок альбумин-связывающий пептид или Fc-связывающий пептид; и Т представляет собой целое число от 1 до 20, или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления n равно 1, Е представляет собой белок альбумин, белок альбумин-связывающий пептид или Fc-связывающий пептид, и конъюгат описывается формулой (M-I-2):
где Е представляет собой белок альбумин, белок альбумин-связывающий пептид или Fc-связывающий пептид; и Т представляет собой целое число от 1 до 20, или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов, описанных в настоящем документе, Е представляет собой белок альбумин, имеющий последовательность любой из SEQ ID NO: 69-71.
В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов, описанных в настоящем документе, Т равно 1, 2, 3, 4 или 5.
В другом аспекте изобретение обеспечивает группу конъюгатов, имеющих структуру любого из конъюгатов, описанных в настоящем документе (например, группу конъюгатов, имеющих любую из формул (1)-(5), (D-I)-(D-X), (D'-I), (M-I)-(M-X) или (M'-I)), где среднее значение Т равно 1-20 (например, среднее значение Т равно 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 5-10, 10-15 или 15-20). В некоторых вариантах осуществления среднее значение Т равно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20.
В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов, описанных в настоящем документе, Когда Т больше 1 (например, Т равно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20), каждый A1-L-A2 может быть независимо выбран (например, независимо выбран из любой из структур A1-L-A2, описанных в настоящем документе). В некоторых вариантах осуществления Е может быть конъюгирован с 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более различными фрагментами A1-L-A2. В некоторых вариантах осуществления Е конъюгирован с первым фрагментом A1-L-A2 и вторым фрагментом A1-L-A2. В некоторых вариантах осуществления A1 и А2 первого фрагмента A1-L-A2 независимо выбраны из любой из формул (A-III)-(A-V):
и A1 и А2 второго фрагмента A1-L-A2 независимо выбраны из любой из формул (A-I), (А-II), (А-VI), (A-VII), (А-VIII) и (A-IX):
В некоторых вариантах осуществления каждый из первых фрагментов A1-L-A2 специфически конъюгирован с остатком лизина Е (например, атом азота экспонированного на поверхности остатка лизина Е), и каждый из вторых фрагментов A1-L-A2 специфически конъюгирован с остатком цистеина Е (например, атом серы экспонированного на поверхности остатка цистеина Е). В некоторых вариантах осуществления каждый из первых фрагментов A1-L-A2 специфически конъюгирован с остатком цистеина Е (например, атом серы экспонированного на поверхности остатка цистеина Е), и каждый из вторых фрагментов A1-L-A2 специфически конъюгирован с остатком лизина Е (например, атом азота экспонированного на поверхности остатка лизина в Е).
В некоторых вариантах осуществления количество первых фрагментов A1-L-A2, конъюгированных с Е, представляет собой целое число от 1 до 10 (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10). В некоторых вариантах осуществления количество вторых фрагментов A1-L-A2, конъюгированных с Е, представляет собой целое число от 1 до 10 (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10).
В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов, описанных в настоящем документе, когда Т больше 1 (например, Т равно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20), каждый A1-L может быть независимо выбран (например, независимо выбран из любой из структур A1-L, описанных в настоящем документе). В некоторых вариантах осуществления Е может быть конъюгирован с 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более различными фрагментами A1-L. В некоторых вариантах осуществления Е конъюгирован с первым фрагментом A1-L и вторым фрагментом A1-L. В некоторых вариантах осуществления A1 из первого фрагмента A1-L выбран из любой из формул (A-III)-(A-V):
и A1 второй группы A1-L выбран из любой из формул (A-I), (А-II), (А-VI), (А-VII), (А-VIII) или (A-IX):
В некоторых вариантах осуществления каждый из первых фрагментов A1-L специфически конъюгирован с остатком лизина Е (например, атомом азота экспонированного на поверхности остатка лизина Е), и каждый из вторых фрагментов A1-L специфически конъюгирован с остатком цистеина Е (например, атом серы экспонированного на поверхности остатка цистеина Е). В некоторых вариантах осуществления каждый из первых фрагментов A1-L специфически конъюгирован с остатком цистеина Е (например, атом серы экспонированного на поверхности остатка цистеина Е), и каждый из вторых фрагментов A1-L специфически конъюгирован с остатком лизина Е (например, атом азота экспонированного на поверхности остатка лизина Е).
В некоторых вариантах осуществления количество первых фрагментов A1-L, конъюгированных с Е, представляет собой целое число от 1 до 10 (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10). В некоторых вариантах осуществления количество вторых фрагментов A1-L, конъюгированных с Е, представляет собой целое число от 1 до 10 (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10).
В другом аспекте изобретение относится к конъюгату, описываемому формулой (D'-I):
где каждый A1 независимо выбран из любой из формул (A-III)-(A-V):
где каждый А2 независимо выбран из любой из формул (A-I), (А-II), (А-VI), (А-VII), (А-VIII) и (А-IX):
где R1 выбран из -ОН, -NH2, -NHC(=NH)NH2 и -NHC(=NH)NHR6; R2 и R3, каждый, независимо выбраны из -Н, -ОН, -F, -Cl и -Br; R4 выбран из -CO2H, -Р(=O)(ОН)2, -SO3H; R5 выбран из -СОСН3, -COCF3, -SO2CH3; X выбран из -О- и -S-; Y выбран из
R6 выбран из 
R7 выбран из Н, (C1-С20)алкила, (С3-С20)циклоалкила, (С3-С20)гетероциклоалкила; (С5-С15)арила и (С2-С15)гетероарила; R8 выбран из (С3-С20)гетероциклоалкила, (С5-С15)арила и (С2-С15)гетероарила; каждый Е содержит мономер Fc-домена (например, мономер Fc-домена, имеющий последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 1-68), белок альбумин (например, белок альбумин, имеющий последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 69-71), белок альбумин-связывающий пептид или Fc-связывающий пептид; n равно 1 или 2; Т представляет собой целое число от 1 до 20 (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20); и L1 представляет собой линкер, ковалентно конъюгированный с Е и каждым A1, T1 представляет собой целое число от 1 до 10 (например, T1 равно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10); L2 представляет собой линкер, ковалентно конъюгированный с Е и каждым А2; Т2 представляет собой целое число от 1 до 10 (например, Т2 равно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10), или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления каждый A1-L-A1 специфически конъюгирован с остатком лизина Е (например, атом азота экспонированного на поверхности остатка лизина Е), и каждый A2-L-A2 специфически конъюгирован с остатком цистеина Е (например, атом серы экспонированного на поверхности остатка цистеина Е). В некоторых вариантах осуществления каждый фрагмент A1-L-A1 специфически конъюгирован с остатком цистеина Е (например, атом серы экспонированного на поверхности остатка цистеина Е), и каждый фрагмент A2-L-A2 специфически конъюгирован с остатком лизина Е (например, атом азота экспонированного на поверхности остатка лизина Е).
В другом аспекте изобретение относится к конъюгату, описываемому формулой (М'-I):
где каждый A1 независимо выбран из любого (M-IX) формул (A-III)-(A-V):
где каждый А2 независимо выбран из любой из формул (A-I), (А-II), (А-VI), (А-VII), (А-VIII) и (А-IX):
где R1 выбран из -ОН, -NH2, -NHC(=NH)NH2 и -NHC(=NH)NHR6; R2 и R3, каждый, независимо выбраны из -Н, -ОН, -F, -Cl и -Br; R4 выбран из -СО2Н, -Р(=O)(ОН)2, -SO3H; R5 выбран из -СОСН3, -COCF3, -SO2CH3; X выбран из -О- и -S-; Y выбран из
R6 выбран из 
R7 выбран из Н, (С1-C20)алкила, (C3-C20)циклоалкила, (C3-C20)гетероциклоалкила; (С5-C15)арила и (С2-C15)гетероарила; R8 выбран из (C3-C20)гетероциклоалкила, (С5-C15)арила и (С2-C15)гетероарила; каждый Е содержит мономер Fc-домена (например, мономер Fc-домена, имеющий последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 1-68), белок альбумин (например, белок альбумин, имеющий последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 69-71), белок альбумин-связывающий пептид или Fc-связывающий пептид; n равно 1 или 2; T1 представляет собой целое число от 1 до 20 (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20); и L1 представляет собой линкер, ковалентно конъюгированный с Е и Ai, T1 представляет собой целое число от 1 до 10 (например, T1 равно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10); L2 представляет собой линкер, ковалентно конъюгированный с Е и А2; Т2 представляет собой целое число от 1 до 10 (например, Т2 равно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10), или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления каждый A1-L специфически конъюгирован с остатком лизина Е (например, атом азота экспонированного на поверхности остатка лизина Е), и каждый A2-L специфически конъюгирован с остатком цистеина Е (например, атом серы экспонированного на поверхности остатка цистеина Е). В некоторых вариантах осуществления каждый фрагмент A1-L специфически конъюгирован с остатком цистеина Е (например, атом серы экспонированного на поверхности остатка цистеина Е), и каждый фрагмент A2-L специфически конъюгирован с остатком лизина Е (например, атом азота экспонированного на поверхности остатка лизина Е).
В еще одном аспекте изобретение обеспечивает фармацевтическую композицию, содержащую любой из конъюгатов, описанных в настоящем документе (например, конъюгат любой из формул (1)-(5), (D-I)-(D-X), (D'-I), (M-I)-(M-X) или (М'-I)), или его фармацевтически приемлемую соль и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.
В еще одном аспекте изобретение обеспечивает способ лечения субъекта, имеющего вирусную инфекцию или предположительно имеющего вирусную инфекцию, при этом способ включает введение субъекту эффективного количества любого из конъюгатов или композиций, описанных в настоящем документе (например, конъюгата любой из формул (1)-(5), (D-I)-(D-X), (D'-I), (M-I)-(M-X) или (M'-I)).
В еще одном аспекте изобретение обеспечивает способ профилактического лечения вирусной инфекции у субъекта, нуждающегося в этом, причем способ включает введение субъекту эффективного количества любого из конъюгатов или композиций, описанных в настоящем документе (например, конъюгата любой из формул (1)-(5), (D-I)-(D-X), (D'-I), (M-I)-(M-X) или (M'-I)).
В некоторых вариантах осуществления вирусная инфекция вызвана вирусом гриппа или вирусом парагриппа. В некоторых вариантах осуществления вирусная инфекция представляет собой вирус гриппа А, В или С, или вирус парагриппа.
В некоторых вариантах осуществления у субъекта ослаблен иммунитет.
В некоторых вариантах осуществления у субъекта диагностирован гуморальный иммунодефицит, Т-клеточная недостаточность, нейтропения, аспления или недостаточность комплемента.
В некоторых вариантах осуществления субъект получает лечение или собирается получить лечение с помощью иммуносупрессивной терапии.
В некоторых вариантах осуществления у субъекта диагностировано заболевание, вызывающее иммуносупрессию. В некоторых вариантах осуществления заболевание представляет собой рак или синдром приобретенного иммунодефицита. В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой лейкоз, лимфому или множественную миелому.
В некоторых вариантах осуществления субъект перенес или собирается перенести трансплантацию гемопоэтических стволовых клеток.
В некоторых вариантах осуществления субъект перенес или собирается перенести трансплантацию органа.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат композиции вводят внутримышечно, внутривенно, внутрикожно, внутриартериально, внутрибрюшинно, внутриочагово, внутричерепно, внутрисуставно, интрапростатически, внутриплеврально, интратрахеально, интраназально, интравитреально, интравагинально, интраректально, местно, интратуморально, периотонеально, подкожно, субконъюктивально, интравезикулярно, мукозально, интраперикардиально, внутрипупочно, интраокулярно, перорально, локально, путем ингаляции, путем инъекции или путем инфузии.
В некоторых вариантах осуществления субъект получает лечение вторым терапевтическим агентом. В некоторых вариантах осуществления второй терапевтический агент представляет собой противовирусный агент. В некоторых вариантах осуществления противовирусный агент выбран из осельтамивира, занамивира, перамивира, ланинамивира, амантадина или римантадина. В некоторых вариантах осуществления второй терапевтический агент представляет собой вирусную вакцину. В некоторых вариантах осуществления вирусная вакцина вызывает у субъекта иммунный ответ против вируса гриппа А, В или С, или вируса парагриппа.
В некоторых вариантах осуществления Fc-домен-содержащая композиция может быть заменена на Fc-домен, и содержащая мономер Fc-домена композиция может быть заменена на мономер Fc-домена в любой из формул (1)-(5), (D-I)-(D-X), (D'-I), (M-I)-(M-X) или (M'-I) (например, любой из формул (1), (2), (3), (4), (5), (D-I), (D-II), (D-II-1), (D-II-2), (D-II-3), (D-II-4), (D-II-5), (D-II-6), (D-II-7), (D-II-8), (D-II-9), (D-II-10), (D-III), (D-III-1), (D-III-2), (D-III-3), (D-III-4), (D-III-5), (D-III-6), (D-III-7), (D-III-8), (D-III-9), (D-IV), (D-IV-1), (D-IV-2), (D-V), (D-V-l), (D-V-2), (D-V-3), (D-V-4), (D-V-5), (D-V-6), (D-V-7), (D-V-8), (D-V-9), (D-V-10), (D-VI), (D-VI-1), (D-VI-2), (D-VI-3), (D-VI-4), (D-VI-5), (D-VI-6), (D-VI-7), (D-VI-8), (D-VI-9), (D-VII), (D-VIII), (D-VIII-1), (D-VIII-2), (D-VIII-3), (D-VIII-4), (D-VIII-5), (D-VIII-6), (D-VIII-7), (D-VIII-8), (D-VIII-9), (D-VIII-10), (D-VIII-11), (D-IX), (D-IX-1), (D-IX-2), (D-IX-3), (D-IX-4), (D-IX-5), (D-IX-6), (D-X), (D-X-l), (D-X-2), (D-X-3), (D'-I), (M-I), (М-II), (M-II-1), (M-II-2), (M-II-3), (M-II-4), (M-II-5), (M-II-6), (M-II-7), (M-II-8), (M-II-9), (M-II-10), (M-III), (M-III-1), (M-III-2), (M-III-3), (M-III-4), (M-III-5), (M-III-6), (M-III-7), (M-III-8), (M-III-9), (M-IV), (M-IV-1), (M-IV-2), (M-V), (M-V-1), (M-V-2), (M-V-3), (M-V-4), (M-V-5), (M-V-6), (M-V-7), (M-V-8), (M-V-9), (M-V-10), (M-VI), (M-VI-1), (M-VI-2), (M-VI-3), (M-VI-4), (M-VI-5), (M-VI-6), (M-VI-7), (M-VI-8), (M-VI-9), (M-VII), (M-VIII), (M-VIII-1), (M-VIII-2), (M-VIII-3), (M-VIII-4), (M-VIII-5), (M-VIII-6), (M-VIII-7), (M-VIII-8), (M-VIII-9), (M-VIII-10), (M-VIII-11), (M-IX), (M-IX-1), (M-IX-2), (М-IX-3), (M-IX-4), (M-IX-5), (M-IX-6), (M-X), (M-X-1), (M-X-2), (M-X-3) или (M'-I)). В любой из формул, описанных в настоящем документе (например, любой из формул (1)-(5), (D-I)-(D-X), (D'-I), (M-I)-(М-Х) или (M'-I)), когда n равно 1, Е представляет собой композицию, содержащую мономер Fc-домена. В любой из описанных в настоящем документе формул (например, любой из формул (1)-(5), (D-I)-(D-X), (D'-I), (M-I)-(M-X) или (M'-I)), когда n равно 2, Е представляет собой Fc-домен-содержащую композицию.
В некоторых вариантах осуществления Fc-домен-содержащая композиция представляет собой антитело или фрагмент антитела. Антитело может включать любую форму иммуноглобулина, антитело с тяжелыми цепями, антитело с легкими цепями, антитело на основе LRR или другой белковый каркас со антителоподобными свойствами, а также любой другой иммунологический связывающий фрагмент, известный в данной области, включая фрагменты антитела (например, Fab, Fab', Fab'2, F(ab')2, Fd, Fv, Feb, scFv или SMIP). Структуры субъединиц и трехмерные конфигурации различных классов антител известны в данной области. Фрагмент антитела может включать связывающий фрагмент, который включает часть, полученную из антитела или имеющую значительную гомологию с антителом, такую как антиген-определяющая область антитела. Типичные фрагменты антител включают Fab, Fab', Fab'2, F(ab')2, Fd, Fv, Feb, scFv и SMIP.
В конкретных вариантах осуществления антитело или фрагмент антитела представляет собой антитело или фрагмент антитела человека, мыши, верблюда (например, ламы, альпаки или верблюда), козы, овцы, кролика, курицы, морской свинки, хомяка, лошади или крысы. В конкретных вариантах осуществления антитело представляет собой IgG, IgA, IgD, IgE, IgM или интратело. В некоторых вариантах осуществления фрагмент антитела включает scFv, sdAb, dAb, Fab, Fab', Fab'2, F(ab')2, Fd, Fv, Feb или SMIP.
В некоторых вариантах осуществления Fc-домен-содержащая композиция (например, антитело или фрагмент антитела) наделяет специфичностью связывания с одной или нескольким мишеням (например, антигеном).
В некоторых вариантах осуществления одна или несколько мишеней (например, антиген), связанные Fc-домен-содержащей композицией (например, антителом или фрагментом антитела), представляют собой вирусный (например, гриппозный) белок, такой как нейраминидаза или гемагглютинин. В некоторых вариантах осуществления антитело или фрагмент антитела распознает поверхностный антиген вируса. В некоторых вариантах осуществления антитело или фрагмент антитела нацелено на гемагглютинин. Нацеленные на гемагглютинин антитела включают моноклональные антитела, такие как CR6261, CR8020, MEDI8852, МНАА4549А и VIS410. В некоторых вариантах осуществления антитело или фрагмент антитела представляет собой широко нейтрализующее антитело или фрагмент антитела, нацеленное на гемагглютинин гриппа (например, антитело или фрагмент антитела, описанное в Wu et al., J. Mol. Biol. 429: 2694 2709 (2017)). В некоторых вариантах осуществления антитело или фрагмент антитела нацелено на вирусный матричный белок (например, матричный белок 2). TCN032 представляет собой моноклональное антитело, нацеленное на матричный белок 2.
В некоторых вариантах осуществления Fc-домен-содержащая композиция (например, антитело или фрагмент антитела), включает одно или несколько однодоменных антител (sdAb). В некоторых вариантах осуществления Fc-домен-содержащая композиция представляет собой антитело или фрагмент антитела, включающее sdAb с реактивностью к гриппу А, такое как sdAb, которое связывается с гемагглютинином вируса гриппа А (например, SD36 или SD38, описанным в работе Laursen et al. Science. 362:598-602 (2018)). В некоторых вариантах осуществления Fc-домен-содержащая композиция представляет собой антитело или фрагмент антитела, включающее sdAb с реактивностью против вируса гриппа В, такое как sdAb, которое связывается с гемагглютинином вируса гриппа В (например, SD83 или SD84, как описано в работе Laursen et al. Science. 362:598-602 (2018)).
В некоторых вариантах осуществления Fc-домен-содержащая композиция представляет собой мультидоменное антитело (MDAb) или фрагмент мультидоменного антитела, включающее 2 или более (например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 или более) sdAb. В некоторых вариантах осуществления MDAb или его фрагмент включает один или несколько sdAB, которые связываются с гемагглютинином вируса гриппа А, и один или несколько sdAb, которые связываются с гемагглютинином вируса гриппа В. В некоторых вариантах осуществления MDAb представляет собой JNJ-7445 (также известный как MD3606), которое описано в работе Laursen et al. Science. 362:598-602 (2018). Вкратце, JNJ-7445 представляет собой MDAb, которое включает два sdAb, которые связываются с гемагглютинином вируса гриппа A (SD36 и SD38), и два sdAb, которые связываются с гемагглютинином вируса гриппа В (SD83 и SD84), которые связаны с Fc-доменом (IgG1). SdAb получали путем иммунизации лам вакциной против гриппа и рекомбинантным гемагглютинином Н7 и Н2.
В еще одном аспекте изобретение включает конъюгат, описанный любой из формул (1)-(5), (D-I)-(D-X), (D'-I), (M-I)-(M-X) или (M'-I) (например, любой из формул (1), (2), (3), (4), (5), (D-I), (D-II), (D-II-1), (D-II-2), (D-II-3), (D-II-4), (D-II-5), (D-11-6), (D-II-7), (D-II-8), (D-II-9), (D-II-10), (D-III), (D-III-1), (D-III-2), (D-III-3), (D-III-4), (D-III-5), (D-III-6), (D-III-7), (D-III-8), (D-III-9), (D-IV), (D-IV-1), (D-IV-2), (D-V), (D-V-1), (D-V-2), (D-V-3), (D-V-4), (D-V-5), (D-V-6), (D-V-7), (D-V-8), (D-V-9), (D-V-10), (D-VI), (D-VI-1), (D-VI-2), (D-VI-3), (D-VI-4), (D-VI-5), (D-VI-6), (D-VI-7), (D-VI-8), (D-VI-9), (D-VII), (D-VIII), (D-VIII-1), (D-VIII-2), (D-VIII-3), (D-VIII-4), (D-VIII-5), (D-VIII-6), (D-VIII-7), (D-VIII-8), (D-VIII-9), (D-VIII-10), (D-VIII-11), (D-IX), (D-IX-1), (D-IX-2), (D-IX-3), (D-IX-4), (D-IX-5), (D-IX-6), (D-X), (D-X-1), (D-X-2), (D-X-3), (D'-I), (M-I), (М-II), (М-II-1), (М-II-2), (М-II-3), (М-II-4), (М-II-5), (М-II-6), (М-II-7), (М-II-8), (М-II-9), (М-II-10), (М-III), (М-III-1), (М-III-2), (М-III-3), (М-III-4), (М-III-5), (М-III-6), (М-III-7), (М-III-8), (М-III-9), (M-IV), (M-IV-1), (M-IV-2), (M-V), (M-V-1), (M-V-2), (M-V-3), (M-V-4), (M-V-5), (M-V-6), (M-V-7), (M-V-8), (M-V-9), (M-V-10), (М-VI), (M-VI-1), (М-VI-2), (M-VI-3), (M-VI-4), (M-VI-5), (M-VI-6), (M-VI-7), (M-VI-8), (M-VI-9), (M-VII), (М-VIII), (М-VIII-1), (M-VIII-2), (M-VIII-3), (M-VIII-4), (M-VIII-5), (M-VIII-6), (М-VIII-7), (M-VIII-8), (M-VIII-9), (М-VIII-10), (М-VIII-11), (М-IX), (M-IX-1), (M-IX-2), (M-IX-3), (М-IX-4), (M-IX-5), (М-IX-6), (М-Х), (М-Х-1), (М-Х-2), (М-Х-3) или (М'-I)), где Е представляет собой антитело или фрагмент антитела. В предпочтительных вариантах осуществления, где Е представляет собой антитело или фрагмент антитела, n равно 1. В некоторых вариантах осуществления антитело или фрагмент антитела включает любое антитело или фрагмент антитела, описанное в настоящем документе, такое как моноклональное антитело, которое связывается с вирусным гемагглютинином (например, CR6261, CR8020, MEDI8852, МНАА4549А или VIS410); широко нейтрализующее антитело или фрагмент антитела, нацеленное на вирусный гемагглютинин (например, антитела или фрагменты антител, описанные в Wu et al., J. Mol. Biol. 429:2694-2709 (2017)); sdAb, нацеленное на вирусный гемагглютинин (например, SD36, SD38, SD83 или SD84); или MDAb или его фрагмент, нацеленное на вирусный гемаглютинин (например, JNJ-7445).
В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов, описанных в настоящем документе, Е (например, каждый Е) включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления Е включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 1.
В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов, описанных в настоящем документе, Е (например, каждый Е) включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах осуществления Е включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2.
В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов, описанных в настоящем документе, Е (например, каждый Е) включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3. В некоторых вариантах осуществления Е включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 3.
В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов, описанных в настоящем документе, Е (например, каждый Е) включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах осуществления Е включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 4.
В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов, описанных в настоящем документе, Е (например, каждый Е) включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 5. В некоторых вариантах осуществления Е включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 5.
В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов, описанных в настоящем документе, Е (например, каждый Е) включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 6. В некоторых вариантах осуществления Е включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 6.
В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов, описанных в настоящем документе, Е (например, каждый Е) включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 7. В некоторых вариантах осуществления Е включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 7.
В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов, описанных в настоящем документе, Е (например, каждый Е) включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 8. В некоторых вариантах осуществления Е включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 8.
В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов, описанных в настоящем документе, Е (например, каждый Е) включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 9. В некоторых вариантах осуществления Е включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 9.
В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов, описанных в настоящем документе, Е (например, каждый Е) включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 10. В некоторых вариантах осуществления Е включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 10.
В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов, описанных в настоящем документе, Е (например, каждый Е) включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 11. В некоторых вариантах осуществления Е включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 11.
В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов, описанных в настоящем документе, Е (например, каждый Е) включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 12. В некоторых вариантах осуществления Е включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 12.
В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов, описанных в настоящем документе, Е (например, каждый Е) включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 13. В некоторых вариантах осуществления Е включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 13.
В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов, описанных в настоящем документе, Е (например, каждый Е) включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 14. В некоторых вариантах осуществления Е включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 14.
В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов, описанных в настоящем документе, Е (например, каждый Е) включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 15. В некоторых вариантах осуществления Е включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 15.
В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов, описанных в настоящем документе, Е (например, каждый Е) включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 16. В некоторых вариантах осуществления Е включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 16.
В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов, описанных в настоящем документе, Е (например, каждый Е) включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 17. В некоторых вариантах осуществления Е включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 17.
В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов, описанных в настоящем документе, Е (например, каждый Е) включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 18. В некоторых вариантах осуществления Е включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 18.
В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов, описанных в настоящем документе, Е (например, каждый Е) включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 19. В некоторых вариантах осуществления Е включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 19.
В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов, описанных в настоящем документе, Е (например, каждый Е) включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 20. В некоторых вариантах осуществления Е включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 20.
В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов, описанных в настоящем документе, Е (например, каждый Е) включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 21. В некоторых вариантах осуществления Е включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 21.
В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов, описанных в настоящем документе, Е (например, каждый Е) включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 22. В некоторых вариантах осуществления Е включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 22.
В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов, описанных в настоящем документе, Е (например, каждый Е) включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 23. В некоторых вариантах осуществления Е включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 23.
В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов, описанных в настоящем документе, Е (например, каждый Е) включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 24. В некоторых вариантах осуществления Е включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 24.
В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов, описанных в настоящем документе, Е (например, каждый Е) включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 25. В некоторых вариантах осуществления Е включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 25.
В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов, описанных в настоящем документе, Е (например, каждый Е) включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 26. В некоторых вариантах осуществления Е включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 26.
В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов, описанных в настоящем документе, Е (например, каждый Е) включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 27. В некоторых вариантах осуществления Е включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 27.
В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов, описанных в настоящем документе, Е (например, каждый Е) включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 28. В некоторых вариантах осуществления Е включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 28.
В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов, описанных в настоящем документе, Е (например, каждый Е) включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 29. В некоторых вариантах осуществления Е включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 29.
В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов, описанных в настоящем документе, Е (например, каждый Е) включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 30. В некоторых вариантах осуществления Е включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 30.
В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов, описанных в настоящем документе, Е (например, каждый Е) включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 31. В некоторых вариантах осуществления Е включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 31.
В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов, описанных в настоящем документе, Е (например, каждый Е) включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 32. В некоторых вариантах осуществления Е включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 32.
В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов, описанных в настоящем документе, Е (например, каждый Е) включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 33. В некоторых вариантах осуществления Е включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 33.
В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов, описанных в настоящем документе, Е (например, каждый Е) включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 34. В некоторых вариантах осуществления Е включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 34.
В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов, описанных в настоящем документе, Е (например, каждый Е) включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 35. В некоторых вариантах осуществления Е включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 35.
В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов, описанных в настоящем документе, Е (например, каждый Е) включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 36. В некоторых вариантах осуществления Е включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 36.
В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов, описанных в настоящем документе, Е (например, каждый Е) включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 37. В некоторых вариантах осуществления Е включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 37.
В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов, описанных в настоящем документе, Е (например, каждый Е) включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 38. В некоторых вариантах осуществления Е включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 38.
В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов, описанных в настоящем документе, Е (например, каждый Е) включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 39. В некоторых вариантах осуществления Е включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 39.
В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов, описанных в настоящем документе, Е (например, каждый Е) включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 40. В некоторых вариантах осуществления Е включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 40.
В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов, описанных в настоящем документе, Е (например, каждый Е) включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 41. В некоторых вариантах осуществления Е включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 41.
В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов, описанных в настоящем документе, Е (например, каждый Е) включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 42. В некоторых вариантах осуществления Е включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 42.
В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов, описанных в настоящем документе, Е (например, каждый Е) включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 43. В некоторых вариантах осуществления Е включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 43.
В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов, описанных в настоящем документе, Е (например, каждый Е) включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 44. В некоторых вариантах осуществления Е включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 44.
В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов, описанных в настоящем документе, Е (например, каждый Е) включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 45. В некоторых вариантах осуществления Е включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 45.
В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов, описанных в настоящем документе, Е (например, каждый Е) включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 46. В некоторых вариантах осуществления Е включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 46.
В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов, описанных в настоящем документе, Е (например, каждый Е) включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 47. В некоторых вариантах осуществления Е включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 47.
В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов, описанных в настоящем документе, Е (например, каждый Е) включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 48. В некоторых вариантах осуществления Е включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 48.
В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов, описанных в настоящем документе, Е (например, каждый Е) включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 49. В некоторых вариантах осуществления Е включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 49.
В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов, описанных в настоящем документе, Е (например, каждый Е) включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 50. В некоторых вариантах осуществления Е включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 51.
В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов, описанных в настоящем документе, Е (например, каждый Е) включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 52. В некоторых вариантах осуществления Е включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 52.
В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов, описанных в настоящем документе, Е (например, каждый Е) включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 53. В некоторых вариантах осуществления Е включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 53.
В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов, описанных в настоящем документе, Е (например, каждый Е) включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 54. В некоторых вариантах осуществления Е включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 54.
В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов, описанных в настоящем документе, Е (например, каждый Е) включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 55. В некоторых вариантах осуществления Е включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 55.
В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов, описанных в настоящем документе, Е (например, каждый Е) включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 56. В некоторых вариантах осуществления Е включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 56.
В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов, описанных в настоящем документе, Е (например, каждый Е) включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 57. В некоторых вариантах осуществления Е включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 57.
В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов, описанных в настоящем документе, Е (например, каждый Е) включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 58. В некоторых вариантах осуществления Е включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 58.
В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов, описанных в настоящем документе, Е (например, каждый Е) включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 59. В некоторых вариантах осуществления Е включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 59.
В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов, описанных в настоящем документе, Е (например, каждый Е) включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 60. В некоторых вариантах осуществления Е включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 60.
В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов, описанных в настоящем документе, Е (например, каждый Е) включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 61. В некоторых вариантах осуществления Е включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 61.
В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов, описанных в настоящем документе, Е (например, каждый Е) включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 62. В некоторых вариантах осуществления Е включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 62.
В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов, описанных в настоящем документе, Е (например, каждый Е) включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 63. В некоторых вариантах осуществления Е включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 63.
В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов, описанных в настоящем документе, Е (например, каждый Е) включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 64. В некоторых вариантах осуществления Е включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 64.
В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов, описанных в настоящем документе, Е (например, каждый Е) включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 65. В некоторых вариантах осуществления Е включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 65.
В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов, описанных в настоящем документе, Е (например, каждый Е) включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 66. В некоторых вариантах осуществления Е включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 66.
В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов, описанных в настоящем документе, Е (например, каждый Е) включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 67. В некоторых вариантах осуществления Е включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 67.
В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов, описанных в настоящем документе, Е (например, каждый Е) включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 68. В некоторых вариантах осуществления Е включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 68.
В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов, описанных в настоящем документе, Е (например, каждый Е) включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 69. В некоторых вариантах осуществления Е включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 69.
В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов, описанных в настоящем документе, Е (например, каждый Е) включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 70. В некоторых вариантах осуществления Е включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 70.
В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов, описанных в настоящем документе, Е (например, каждый Е) включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 71. В некоторых вариантах осуществления Е включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 71.
В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов, описанных в настоящем документе, где Е включает мономер Fc-домена, указанный мономер Fc-домена (например, мономер Fc-домена, имеющий последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 1-68) включает тройную мутацию, соответствующую M252Y/S254T/T256E (YTE). Как используется в настоящем документе, следует понимать, что аминокислота, «соответствующая» конкретному аминокислотному остатку (например, конкретной SEQ ID NO.), включает любой аминокислотный остаток, который будет пониматься специалистом в данной области как совпадающий при выравнивании с конкретным остатком (например, конкретной последовательностью). Например, любая из SEQ ID NO: 1-68 может быть мутирована для включения мутации YTE.
В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов, описанных в настоящем документе, где Е включает мономер Fc-домена, мономер Fc-домена (например, мономер Fc-домена, имеющий последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 1-68) включает двойной мутант, соответствующий M428L/N434S (LS). Как используется в настоящем документе, следует понимать, что аминокислота, «соответствующая» конкретному аминокислотному остатку (например, конкретной SEQ ID NO.), включает любой аминокислотный остаток, который будет пониматься специалистом в данной области как совпадающий при выравнивании с конкретным остатком (например, конкретной последовательностью). Например, любая из SEQ ID NO: 1-68 может быть мутирована для включения мутации LS.
В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов, описанных в настоящем документе, где Е включает мономер Fc-домена, мономер Fc-домена (например, мономер Fc-домена, имеющий последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 1-68) включает мутант, соответствующий N434H. Как используется в настоящем документе, следует понимать, что аминокислота, «соответствующая» конкретному аминокислотному остатку (например, конкретной SEQ ID NO.), включает любой аминокислотный остаток, который будет пониматься специалистом в данной области как совпадающий при выравнивании с конкретным остатком (например, конкретной последовательностью). Например, любая из SEQ ID NO: 1-68 может быть мутирована для включения мутации N434H.
В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов, описанных в настоящем документе, где Е включает мономер Fc-домена, указанный мономер Fc-домена (например, мономер Fc-домена, имеющий последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 1-68) включает мутант, соответствующий C220S. Как используется в настоящем документе, следует понимать, что аминокислота, «соответствующая» конкретному аминокислотному остатку (например, конкретной SEQ ID NO.), включает любой аминокислотный остаток, который будет пониматься специалистом в данной области как совпадающий при выравнивании с конкретным остатком (например, конкретной последовательностью). Например, любая из SEQ ID NO: 1-68 может быть мутирована для включения мутации C220S.
В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов, описанных в настоящем документе, где Е включает мономер Fc-домена, указанный мономер Fc-домена (например, мономер Fc-домена, имеющий последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 1-68) является фрагментом мономера Fc-домена (например, фрагментом из по меньшей мере 25 (например, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 или более), по меньшей мере 50 (например, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75 или более), по меньшей мере 75 (например, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 или более) последовательных аминокислот в длину из SEQ ID NO: 1-68.
В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов, описанных в настоящем документе (например, конъюгат любой из формул (1)-(5), (D-I)-(D-X), (D'-I), (M-I)-(M-X) или (M'-I)), один или несколько атомов азота одного или нескольких экспонированных на поверхности остатков лизина в Е, или один или несколько атомов серы одного или нескольких экспонированных на поверхности остатков цистеина в Е ковалентно конъюгированы с линкером (например, линкер PEG2-PEG20). Линкер, конъюгированный с Е, может быть функционализирован таким образом, что он может реагировать с образованием ковалентной связи с L любого A1-L или любого A2-L-A1, описанного в настоящем документе. В предпочтительных вариантах осуществления Е конъюгирован с линкером, функционализированным азидогруппой, и L в A1-L или любом A2-L-A1 функционализирован алкиновой группой. Конъюгирование (например, с помощью «клик»-химии) линкер-азидо в Е и линкер-алкин в A1-L или A2-L-A1 приводит к образованию конъюгата по изобретению, например конъюгата, описываемого любой из формул (1)-(5), (D-I)-(D-X), (D'-I), (M-I)-(M-X) или (M'-I). В еще других вариантах осуществления Е конъюгирован с линкером, функционализированным алкиновой группой, и L любого A1-L или любого A2-L-A1 функционализирован азидогруппой. Конъюгирование (например, с помощью «клик»-химии) линкер-алкин в Е и линкер-азидо в A1-L или A2-L-A1 приводит к образованию конъюгата по изобретению, например конъюгата, описываемого формулой (1)-(5), (D-I)-(D-X), (D'-I), (M-I)-(M-X) или (M'-I).
В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов, описанных в настоящем документе, волнистая линия в любой из формул (1)-(5), (D-I)-(D-X), (D'-I), (M-I)-(M-X) или (M'-I) может представлять ковалентную связь между Е и L в A1-L или A2-L-A1.
В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов, описанных в настоящем документе, волнистая линия в любой из формул (1)-(5), (D-I)-(D-X), (D'-I), (M-I)-(M-X) или (M'-I) может обозначать, что одна или несколько боковых цепей аминокислот в Е (например, один или несколько атомов азота одного или нескольких экспонированных на поверхности остатков лизина в Е, или один или несколько атомов серы одного или нескольких экспонированных на поверхности цистеинов в Е) были конъюгированы с линкером (например, линкером PEG2-PEG20), при этом линкер функционализирован реакционноспособным фрагментом, так что реакционноспособный фрагмент образует ковалентную связь с L в любом A1-L или любом A2-L-A1, описанном в настоящем документе (например, с помощью реакции «клик»-химии между линкером, функционализированным азидо, и линкером, функционализированным алкином, как описано выше). В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов, описанных в настоящем документе, A1 и/или А2 имеют структуру, описанную (A-I):
В предпочтительных вариантах осуществления, где A1 и/или А2 имеют структуру, описываемую (A-I): R1 представляет собой -NHC(=NH)NH2, R4 представляет собой -СО2Н, R5 представляет собой -СОСН3 и/или X представляет собой -О-. В предпочтительных вариантах осуществления A1 и/или А2 имеют структуру занамивира, описываемую следующим образом:
В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов, описанных в настоящем документе, A1 и/или А2 имеют структуру, описываемую (А-II):
В предпочтительных вариантах осуществления, где A1 и/или А2 имеют структуру, описываемую (А-II): R1 представляет собой -NFC(=NF)NH2, R2 представляет собой Н или F, R3 представляет собой Н или F, R4 представляет собой -СО2Н, R5 представляет собой -СОСН3 и/или X представляет собой -О-. В предпочтительных вариантах осуществления A1 и/или А2 имеют структуру, описываемую следующим образом:
В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов, описанных в настоящем документе, A1 и/или А2 имеют структуру, описываемую (А-III):
В предпочтительных вариантах осуществления, где A1 и/или А2 имеют структуру, описываемую (А-III): R1 представляет собой -NHC(=NH)NH2, R4 представляет собой -СО2Н и/или R5 представляет собой -СОСН3. В предпочтительных вариантах осуществления A1 и/или А2 имеют структуру перамивира, описываемую следующим образом:
В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов, описанных в настоящем документе, A1 и/или А2 имеют структуру, описываемую (A-IV):
В предпочтительных вариантах осуществления, где A1 и/или А2 имеют структуру, описываемую (A-IV): R1 представляет собой -NHC(=NH)NH2, R4 представляет собой -СО2Н и/или R5 представляет собой -СОСН3. В предпочтительных вариантах осуществления A1 и/или А2 имеют структуру, описываемую следующим образом:
В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов, описанных в настоящем документе, A1 и/или А2 имеют структуру, описываемую (A-V):
В предпочтительных вариантах осуществления, где A1 и/или А2 имеют структуру, описываемую (A-V): R1 представляет собой -NHC(=NH)NH2, R4 представляет собой -СО2Н и/или R5 представляет собой -СОСН3. В предпочтительных вариантах осуществления A1 и/или А2 имеют структуру, описываемую следующим образом:
В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов, описанных в настоящем документе, A1 и/или А2 имеют структуру, описываемую (А-VI):
В предпочтительных вариантах осуществления, где A1 и/или А2 имеют структуру, описываемую (A-VI): R1 представляет собой -NHC(=NH)NH2, R4 представляет собой -СО2Н, R5 представляет собой -СОСН3 и/или X представляет собой -О-. В предпочтительных вариантах осуществления A1 и/или А2 имеют структуру занамивира, описываемую:
В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов, описанных в настоящем документе, A1 и/или А2 имеют структуру, описываемую (А-VII):
В предпочтительных вариантах осуществления, где A1 и/или А2 имеют структуру, описываемую (A-VII): R1 представляет собой -NHC(=NH)NH2, R2 представляет собой Н или F, R3 представляет собой Н или F, R4 представляет собой -СО2Н, R5 представляет собой -СОСН3 и/или X представляет собой -О-. В предпочтительных вариантах осуществления A1 и/или А2 имеют структуру, описываемую:
В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов, описанных в настоящем документе, A1 и/или А2 имеют структуру, описываемую (А-VIII):
В предпочтительных вариантах осуществления, где A1 и/или А2 имеют структуру, описываемую (А-VIII): R1 представляет собой -NHC(=NH)NH2, R5 представляет собой -СОСН3 и/или X представляет собой -О-. В предпочтительных вариантах осуществления A1 и/или А2 имеют структуру, описываемую:
В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов, описанных в настоящем документе, A1 и/или А2 имеют структуру, описываемую (A-IX):
В предпочтительных вариантах осуществления, где A1 и/или А2 имеют структуру, описываемую (A-IX): R1 представляет собой -NHC(=NH)NH2, R2 представляет собой Н или F, R3 представляет собой Н или F, R5 представляет собой -СОСН3 и/или X представляет собой -О-. В предпочтительных вариантах осуществления A1 и/или А2 имеют структуру, описываемую:
В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов, описанных в настоящем документе, A1 и/или А2 имеют структуру, описываемую (А-Х):
В предпочтительных вариантах осуществления, где A1 и/или А2 имеют структуру, описываемую (А-Х): R1 представляет собой -NHC(=NH)NH2, R3 представляет собой Н, R5 представляет собой -СОСН3 и/или X представляет собой -О-. В предпочтительных вариантах осуществления A1 и/или А2 имеют структуру сульфозанамивира, описываемую:
В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов, описанных в настоящем документе, A1 и/или А2 имеют структуру, описываемую (A-XI):
В предпочтительных вариантах осуществления, где A1 и/или А2 имеют структуру, описываемую (A-XI): R4 представляет собой -СО2Н и/или R5 представляет собой -СОСН3. В предпочтительных вариантах осуществления алкен представляет собой (Е), (Z) или рацемическую смесь (E)/(Z). В предпочтительных вариантах осуществления A1 и/или А2 имеют структуру А-315675 (Abbott), описываемую:
В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов, описанных в настоящем документе, A1 и/или А2 имеют структуру, описываемую (А-XIII):
В предпочтительных вариантах осуществления, где A1 и/или А2 имеют структуру, описываемую (А-XIII): R4 представляет собой -СО2Н. В предпочтительных вариантах осуществления A1 и/или А2 имеют структуру А-315675 (Abbott), описываемую:
В некоторых вариантах осуществления конъюгат представляет собой конъюгат 1 или любой его региоизомер, и отношение лекарственного средства к антителу (DAR) (например, Т) составляет от 0,5 до 10,0, например, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8,0, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9 или 10,0. В некоторых вариантах осуществления DAR составляет от 0,5 до 2,0, от 2,0 до 4,0, от 4,0 до 6,0, от 6,0 до 8,0 или от 8,0 до 10,0.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат представляет собой конъюгат 2 или любой его региоизомер, и DAR (например, Т) составляет от 0,5 до 10,0, например, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8,0, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9 или 10,0. В некоторых вариантах осуществления DAR составляет от 0,5 до 2,0, от 2,0 до 4,0, от 4,0 до 6,0, от 6,0 до 8,0 или от 8,0 до 10,0.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат представляет собой конъюгат 3 или любой его региоизомер, и DAR (например, Т) составляет от 0,5 до 10,0, например, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8,0, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9 или 10,0. В некоторых вариантах осуществления DAR составляет от 0,5 до 2,0, от 2,0 до 4,0, от 4,0 до 6,0, от 6,0 до 8,0 или от 8,0 до 10,0.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат представляет собой конъюгат 4 или любой его региоизомер, и DAR (например, Т) составляет от 0,5 до 10,0, например, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8,0, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9 или 10,0. В некоторых вариантах осуществления DAR составляет от 0,5 до 2,0, от 2,0 до 4,0, от 4,0 до 6,0, от 6,0 до 8,0 или от 8,0 до 10,0.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат представляет собой конъюгат 5 или любой его региоизомер, и DAR (например, Т) составляет от 0,5 до 10,0, например, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8,0, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9 или 10,0. В некоторых вариантах осуществления DAR составляет от 0,5 до 2,0, от 2,0 до 4,0, от 4,0 до 6,0, от 6,0 до 8,0 или от 8,0 до 10,0.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат представляет собой конъюгат 6 или любой его региоизомер, и DAR (например, Т) составляет от 0,5 до 10,0, например, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8,0, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9 или 10,0. В некоторых вариантах осуществления DAR составляет от 0,5 до 2,0, от 2,0 до 4,0, от 4,0 до 6,0, от 6,0 до 8,0 или от 8,0 до 10,0.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат представляет собой конъюгат 7 или любой его региоизомер, и DAR (например, Т) составляет от 0,5 до 10,0, например, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8,0, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9 или 10,0. В некоторых вариантах осуществления DAR составляет от 0,5 до 2,0, от 2,0 до 4,0, от 4,0 до 6,0, от 6,0 до 8,0 или от 8,0 до 10,0.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат представляет собой конъюгат 8 или любой его региоизомер, и DAR (например, Т) составляет от 0,5 до 10,0, например, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8,0, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9 или 10,0. В некоторых вариантах осуществления DAR составляет от 0,5 до 2,0, от 2,0 до 4,0, от 4,0 до 6,0, от 6,0 до 8,0 или от 8,0 до 10,0.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат представляет собой конъюгат 9 или любой его региоизомер, и DAR (например, Т) составляет от 0,5 до 10,0, например, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8,0, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9 или 10,0. В некоторых вариантах осуществления DAR составляет от 0,5 до 2,0, от 2,0 до 4,0, от 4,0 до 6,0, от 6,0 до 8,0 или от 8,0 до 10,0.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат представляет собой конъюгат 10 или любой его региоизомер, и DAR (например, Т) составляет от 0,5 до 10,0, например, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8,0, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9 или 10,0. В некоторых вариантах осуществления DAR составляет от 0,5 до 2,0, от 2,0 до 4,0, от 4,0 до 6,0, от 6,0 до 8,0 или от 8,0 до 10,0.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат представляет собой конъюгат 2 или любой его региоизомер, и DAR (например, Т) составляет от 0,5 до 10,0, например, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8,0, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,263, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9 или 10,0. В некоторых вариантах осуществления DAR составляет от 0,5 до 264,0, от 2,0 до 4,0, от 4,0 до 6,0, от 6,0 до 8,0 или от 8,0 до 10,0.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат представляет собой конъюгат 12 или любой его региоизомер, и DAR (например, Т) составляет от 0,5 до 10,0, например, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8,0, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9 или 10,0. В некоторых вариантах осуществления DAR составляет от 0,5 до 2,0, от 2,0 до 4,0, от 4,0 до 6,0, от 6,0 до 8,0 или от 8,0 до 10,0.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат представляет собой конъюгат 13 или любой его региоизомер, и DAR (например, Т) составляет от 0,5 до 10,0, например, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8,0, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9 или 10,0. В некоторых вариантах осуществления DAR составляет от 0,5 до 2,0, от 2,0 до 4,0, от 4,0 до 6,0, от 6,0 до 8,0 или от 8,0 до 10,0.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат представляет собой конъюгат 14 или любой его региоизомер, и DAR (например, Т) составляет от 0,5 до 10,0, например, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8,0, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9 или 10,0. В некоторых вариантах осуществления DAR составляет от 0,5 до 2,0, от 2,0 до 4,0, от 4,0 до 6,0, от 6,0 до 8,0 или от 8,0 до 10,0.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат представляет собой конъюгат 15 или любой его региоизомер, и DAR (например, Т) составляет от 0,5 до 10,0, например, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8,0, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,265, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9 или 10,0. В некоторых вариантах осуществления DAR составляет от 0,5 до 2,0, от 2,0 до 4,0, от 4,0 до 6,0, от 6,0 до 8,0 или от 8,0 до 10,0.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат представляет собой конъюгат 16 или любой его региоизомер, и DAR (например, Т) составляет от 0,5 до 10,0, например, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8,0, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9 или 10,0. В некоторых вариантах осуществления DAR составляет от 0,5 до 2,0, от 2,0 до 4,0, от 4,0 до 6,0, от 6,0 до 8,0 или от 8,0 до 10,0.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат представляет собой конъюгат 17 или любой его региоизомер, и DAR (например, Т) составляет от 0,5 до 10,0, например, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8,0, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9 или 10,0. В некоторых вариантах осуществления DAR составляет от 0,5 до 2,0, от 2,0 до 4,0, от 4,0 до 6,0, от 6,0 до 8,0 или от 8,0 до 10,0.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат представляет собой конъюгат 18 или любой его региоизомер, и DAR (например, Т) составляет от 0,5 до 10,0, например, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4.6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8,0, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9 или 10,0. В некоторых вариантах осуществления DAR составляет от 0,5 до 2,0, от 2,0 до 4,0, от 4,0 до 6,0, от 6,0 до 8,0 или от 8,0 до 10,0.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат представляет собой конъюгат 19 или любой его региоизомер, и DAR (например, Т) составляет от 0,5 до 10,0, например, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,266, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,266, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 266, 266,1, 4,2, 266,3, 266,266, 266,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8,0, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9 или 10,0. В некоторых вариантах осуществления DAR составляет от 0,5 до 2,0, от 2,0 до 4,0, от 4,0 до 6,0, от 6,0 до 8,0 или от 8,0 до 10,0.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат представляет собой конъюгат 20 или любой его региоизомер, и DAR (например, Т) составляет от 0,5 до 10,0, например, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8,0, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9 или 10,0. В некоторых вариантах осуществления DAR составляет от 0,5 до 2,0, от 2,0 до 4,0, от 4,0 до 6,0, от 6,0 до 8,0 или от 8,0 до 10,0.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат представляет собой конъюгат 21 или любой его региоизомер, и DAR (например, Т) составляет от 0,5 до 10,0, например, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8,0, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9 или 10,0. В некоторых вариантах осуществления DAR составляет от 0,5 до 2,0, от 2,0 до 4,0, от 4,0 до 6,0, от 6,0 до 8,0 или от 8,0 до 10,0.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат представляет собой конъюгат 22 или любой его региоизомер, и DAR (например, Т) составляет от 0,5 до 10,0, например, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8,0, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9 или 10,0. В некоторых вариантах осуществления DAR составляет от 0,5 до 2,0, от 2,0 до 4,0, от 4,0 до 6,0, от 6,0 до 8,0 или от 8,0 до 10,0.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат представляет собой конъюгат 23 или любой его региоизомер, и DAR (например, Т) составляет от 0,5 до 10,0, например, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8,0, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9 или 10,0. В некоторых вариантах осуществления DAR составляет от 0,5 до 2,0, от 2,0 до 4,0, от 4,0 до 6,0, от 6,0 до 8,0 или от 8,0 до 10,0.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат представляет собой конъюгат 24 или любой его региоизомер, и DAR (например, Т) составляет от 0,5 до 10,0, например, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4.6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8,0, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9 или 10,0. В некоторых вариантах осуществления DAR составляет от 0,5 до 2,0, от 2,0 до 4,0, от 4,0 до 6,0, от 6,0 до 8,0 или от 8,0 до 10,0.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат представляет собой конъюгат 25 или любой его региоизомер, и DAR (например, Т) составляет от 0,5 до 10,0, например, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8,0, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9 или 10,0. В некоторых вариантах осуществления DAR составляет от 0,5 до 2,0, от 2,0 до 4,0, от 4,0 до 6,0, от 6,0 до 8,0 или от 8,0 до 10,0.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат представляет собой конъюгат 26 или любой его региоизомер, и DAR (например, Т) составляет от 0,5 до 10,0, например, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4.6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8,0, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,267, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9 или 10,0. В некоторых вариантах осуществления DAR составляет от 0,5 до 2,0, от 2,0 до 4,0, от 4,0 до 268,0, от 6,0 до 8,0 или от 8,0 до 10,0.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат представляет собой конъюгат 27 или любой его региоизомер, и DAR (например, Т) составляет от 0,5 до 10,0, например, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8,0, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9 или 10,0. В некоторых вариантах осуществления DAR составляет от 0,5 до 2,0, от 2,0 до 4,0, от 4,0 до 6,0, от 6,0 до 8,0 или от 8,0 до 10,0.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат представляет собой конъюгат 28 или любой его региоизомер, и DAR (например, Т) составляет от 0,5 до 10,0, например, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8,0, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9 или 10,0. В некоторых вариантах осуществления DAR составляет от 0,5 до 2,0, от 2,0 до 4,0, от 4,0 до 6,0, от 6,0 до 8,0 или от 8,0 до 10,0.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат представляет собой конъюгат 29 или любой его региоизомер, и DAR (например, Т) составляет от 0,5 до 10,0, например, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8,0, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9 или 10,0. В некоторых вариантах осуществления DAR составляет от 0,5 до 2,0, от 2,0 до 4,0, от 4,0 до 6,0, от 6,0 до 8,0 или от 8,0 до 10,0.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат представляет собой конъюгат 30 или любой его региоизомер, и DAR (например, Т) составляет от 0,5 до 10,0, например, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,269, 6,8, 6,9, 269,0, 7,1, 7,2, 7,3, 269,4, 269,5, 269,6, 269,7, 7,8,0, 269,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,269, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9 или 10,0. В некоторых вариантах осуществления DAR составляет от 0,5 до 2,0, от 2,0 до 4,0, от 4,0 до 6,0, от 6,0 до 8,0 или от 8,0 до 10,0.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат представляет собой конъюгат 31 или любой его региоизомер, и DAR (например, Т) составляет от 0,5 до 10,0, например, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8,0, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9 или 10,0. В некоторых вариантах осуществления DAR составляет от 0,5 до 2,0, от 2,0 до 4,0, от 4,0 до 6,0, от 6,0 до 8,0 или от 8,0 до 10,0.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат представляет собой конъюгат 32 или любой его региоизомер, и DAR (например, Т) составляет от 0,5 до 10,0, например, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8,0, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9 или 10,0. В некоторых вариантах осуществления DAR составляет от 0,5 до 2,0, от 2,0 до 4,0, от 4,0 до 6,0, от 6,0 до 8,0 или от 8,0 до 10,0.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат представляет собой конъюгат 33 или любой его региоизомер, и DAR (например, Т) составляет от 0,5 до 10,0, например, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8,0, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9 или 10,0. В некоторых вариантах осуществления DAR составляет от 0,5 до 2,0, от 2,0 до 4,0, от 4,0 до 6,0, от 6,0 до 8,0 или от 8,0 до 10,0.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат представляет собой конъюгат 34 или любой его региоизомер, и DAR (например, Т) составляет от 0,5 до 10,0, например, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,270, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8,0, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9 или 10,0. В некоторых вариантах осуществления DAR составляет от 0,5 до 2,0, от 2,0 до 4,0, от 4,0 до 6,0, от 6,0 до 8,0 или от 8,0 до 10,0.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат представляет собой конъюгат 35 или любой его региоизомер, и DAR (например, Т) составляет от 0,5 до 10,0, например, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8,0, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9 или 10,0. В некоторых вариантах осуществления DAR составляет от 0,5 до 2,0, от 2,0 до 4,0, от 4,0 до 6,0, от 6,0 до 8,0 или от 8,0 до 10,0.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат представляет собой конъюгат 35 или любой его региоизомер, и DAR (например, Т) составляет от 0,5 до 10,0, например, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8,0, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9 или 10,0. В некоторых вариантах осуществления DAR составляет от 0,5 до 2,0, от 2,0 до 4,0, от 4,0 до 6,0, от 6,0 до 8,0 или от 8,0 до 10,0.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат представляет собой конъюгат 36 или любой его региоизомер, и DAR (например, Т) составляет от 0,5 до 10,0, например, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8,0, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9 или 10,0. В некоторых вариантах осуществления DAR составляет от 0,5 до 2,0, от 2,0 до 4,0, от 4,0 до 6,0, от 6,0 до 8,0 или от 8,0 до 10,0.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат представляет собой конъюгат 37 или любой его региоизомер, и DAR (например, Т) составляет от 0,5 до 10,0, например, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4.6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8,0, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9 или 10,0. В некоторых вариантах осуществления DAR составляет от 0,5 до 2,0, от 2,0 до 4,0, от 4,0 до 6,0, от 6,0 до 8,0 или от 8,0 до 10,0.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат представляет собой конъюгат 38 или любой его региоизомер, и DAR (например, Т) составляет от 0,5 до 10,0, например, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8,0, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9 или 10,0. В некоторых вариантах осуществления DAR составляет от 0,5 до 2,0, от 2,0 до 4,0, от 4,0 до 6,0, от 6,0 до 8,0 или от 8,0 до 10,0.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат представляет собой конъюгат 39 или любой его региоизомер, и DAR (например, Т) составляет от 0,5 до 10,0, например, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8,0, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9 или 10,0. В некоторых вариантах осуществления DAR составляет от 0,5 до 2,0, от 2,0 до 4,0, от 4,0 до 6,0, от 6,0 до 8,0 или от 8,0 до 10,0.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат представляет собой конъюгат 40 или любой его региоизомер, и DAR (например, Т) составляет от 0,5 до 10,0, например, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8,0, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,271, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9 или 10,0. В некоторых вариантах осуществления DAR составляет от 0,5 до 2,0, от 2,0 до 4,0, от 4,0 до 6,0, от 6,0 до 8,0 или от 8,0 до 272,0.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат представляет собой конъюгат 41 или любой его региоизомер, и DAR (например, Т) составляет от 0,5 до 10,0, например, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8,0, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9 или 10,0. В некоторых вариантах осуществления DAR составляет от 0,5 до 2,0, от 2,0 до 4,0, от 4,0 до 6,0, от 6,0 до 8,0 или от 8,0 до 10,0.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат представляет собой конъюгат 42 или любой его региоизомер, и DAR (например, Т) составляет от 0,5 до 10,0, например, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8,0, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9 или 10,0. В некоторых вариантах осуществления DAR составляет от 0,5 до 2,0, от 2,0 до 4,0, от 4,0 до 6,0, от 6,0 до 8,0 или от 8,0 до 10,0.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат представляет собой конъюгат 43 или любой его региоизомер, и DAR (например, Т) составляет от 0,5 до 10,0, например, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8,0, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9 или 10,0. В некоторых вариантах осуществления DAR составляет от 0,5 до 2,0, от 2,0 до 4,0, от 4,0 до 6,0, от 6,0 до 8,0 или от 8,0 до 10,0.
Определения
Для того, чтобы помочь пониманию этого изобретения, ниже приводятся определения ряда терминов. Термины, определения которым приведены в настоящем документе, имеют значения, обычно понятные специалистам в областях, относящихся к настоящему изобретению. Термины в единственном числе не предназначены для обозначения лишь объекта в единственном числе, а включают общий класс, конкретный пример которого может быть использован для иллюстрации. Терминология в настоящем документе используется для описания конкретных вариантов осуществления изобретения, но их использование не ограничивает объем изобретения, за исключением случаев, указанных в формуле изобретения.
Термин «ингибитор нейраминидазы» или «ингибитор вирусной нейраминидазы» в контексте настоящего описания относится к соединениям, которые снижают активность фермента нейраминидазы вируса гриппа (например, из вируса гриппа А, В или С). Ингибитор нейраминидазы может быть идентифицирован с помощью способов, известных специалистам в данной области, например, путем уменьшения репликации вируса в анализе нейтрализации бляшкообразования вируса гриппа, например, при концентрациях менее 20 мкМ (например, менее 10 мкМ, 5 мкМ, 2 мкМ, 1 мкМ, 500 нМ или 100 нМ). Ингибиторы вирусной нейраминидазы, известные специалистам в данной области, включают занамивир, сульфозанамивир, перамивир и А-315675 (Abbott) (см., например, Hadhazi et al. A sulfozanamivir analogue has potent anti-influenza virus activity. ChemMedChem Comm. 13:785-789 (2018) and In vitro characterization of A-315675, a highly potent inhibitor of A and В strain of influenze virus neuraminidases and influenza virus replication. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 46(4): 1014-1021 (2002)). Ингибиторы вирусной нейраминидазы по изобретению включают занамивир, сульфозанамивир, перамавир, А-315675 и их аналоги, такие как ингибиторы вирусной нейраминидазы формул (A-I)-(A-XII):
где R1 выбран из -ОН, -NH2, -NHC(=NH)NH2 и -NHC(=NH)NHR6; каждый R2 и R3 независимо выбран из -Н, -ОН, -F, -Cl и -Br; R4 выбран из -CO2H -Р(=O)(ОН)2, -SO3H; R5 выбран из -СОСН3, -COCF3, -SO2CH3; X выбран из -О- и -S-; Y выбран из
R6 выбран из 
R7 выбран из Н, (С1-C20)алкила, (C3-C20)циклоалкила, (C3-C20)гетероциклоалкила; (С5-C15)арила и (С2-С15)гетероарила; R8 выбран из (C3-C20)гетероциклоалкила, (С5-C15)арила и (С2-C15)гетероарила. Используемый в настоящем документе термин «ингибирует активность нейраминидазы» относится к значению IC50, которое равно 1000 нМ или менее, например, как измерено в соответствии с анализом ингибирования нейраминидазы в примере 2 настоящего документа. В частности, значение IC50 представляет собой концентрацию ингибитора нейраминидазы вируса гриппа, которая требуется для 50% ингибирования in vitro. В некоторых аспектах значение IC50, равное 100 нМ или менее или 10 нМ или менее, в соответствии с анализом ингибирования нейраминидазы указывает на соединение, ингибирующее активность нейраминидазы.
Под «вирусной инфекцией» подразумевается патогенный рост вируса (например, вируса гриппа) в организме-хозяине (например, у субъекта-человека). Вирусной инфекцией может быть любая ситуация, в которой присутствие вирусной популяции(й) наносит вред организму хозяина. Таким образом, субъект «страдает» вирусной инфекцией, когда чрезмерное количество вирусной популяции присутствует в теле субъекта или на нем, или когда присутствие вирусной популяции(й) повреждает клетки или другую ткань субъекта.
Используемый в настоящем документе термин «мономер Fc-домена» относится к полипептидной цепи, которая включает по меньшей мере шарнирный домен, а также второй и третий константные домены антитела (CH2 и CH3) или их функциональные фрагменты (например, фрагменты, которые способны (i) димеризоваться с другим мономером Fc-домена с образованием Fc-домена, и (ii) связываться с Fc-рецептором. Мономер Fc-домена может представлять собой любой изотип антитела иммуноглобулина, включая IgG, IgE, IgM, IgA или IgD (например, IgG). Кроме того, мономер Fc-домена может представлять собой подтип IgG (например, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3 или IgG4) (например, IgG1). Мономер Fc-домена не включает какую-либо часть иммуноглобулина, которая способна действовать в качестве антиген-распознающей области, например, вариабельный домен или определяющую комплементарность область (CDR). Мономеры Fc-домена в конъюгатах, как описано в настоящем документе, могут содержать одно или несколько изменений по сравнению с последовательностью мономера домена Fc дикого типа (например, 1-10, 1-8, 1-6, 1-4 аминокислотных замен, добавлений или делеций), которые изменяют взаимодействие между Fc-доменом и Fc-рецептором. Примеры подходящих изменений известны в данной области. В некоторых вариантах осуществления мономер Fc-домена человека (например, тяжелая цепь IgG, такая как IgG1) содержит область, которая проходит от любого из Asn208, Glu216, Asp221, Lys222 или Cys226 до карбоксильного конца тяжелой цепи в Lys447. С-концевой Lys447 Fc-области может присутствовать или отсутствовать, не влияя на структуру или стабильность Fc-области. Если в настоящем документе не указано иное, нумерация аминокислотных остатков в IgG или мономере Fc-домена соответствует системе нумерации ЕС для антител, также называемой индексом EU Kabat, как описано, например, в Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991.
Используемый в настоящем документе термин «Fc-домен» относится к димеру из двух мономеров Fc-домена, который способен связывать Fc-рецептор. В Fc-домене дикого типа два мономера Fc-домена димеризуются за счет взаимодействия между двумя константными доменами CH3 антитела, в некоторых вариантах осуществления одна или несколько дисульфидных связей образуются между шарнирными доменами двух димеризующихся мономеров Fc-домена.
Термин «ковалентно присоединенный» относится к двум частям конъюгата, которые связаны друг с другом ковалентной связью, образованной между двумя атомами в двух частях конъюгата.
Используемый в настоящем документе термин «Fc-связывающий пептид» относится к полипептиду, имеющему аминокислотную последовательность из 5-50 (например, 5-40, 5-30, 5-20, 5-15, 5-10, 10-50, 10-30 или 10-20) аминокислотных остатков, который обладает аффинностью в отношении и функциями для связывания с Fc-доменом, таким как любой Fc-домен, описанный в настоящем документе. Fc-связывающий пептид может иметь различное происхождение, например, синтетическое, человеческое, мышиное или крысиное. Fc-связывающие пептиды по изобретению включают Fc-связывающие пептиды, которые были сконструированы таким образом, чтобы включать один или несколько (например, два, три, четыре или пять) доступных растворителю остатков цистеина или лизина, которые могут обеспечивать сайт для конъюгации с соединением по изобретению (например, конъюгации с мономером или димером ингибитора нейраминидазы, в том числе посредством линкера). Наиболее предпочтительно Fc-связывающий пептид будет содержать единственный доступный растворителю цистеин или лизин, обеспечивая, таким образом, сайт-специфическую конъюгацию соединения по изобретению. Fc-связывающие пептиды могут включать только встречающиеся в природе аминокислотные остатки или могут включать один или несколько не встречающихся в природе аминокислотных остатков. В случае включения, не встречающийся в природе аминокислотный остаток (например, боковая цепь не встречающегося в природе аминокислотного остатка) может быть использована в качестве точки присоединения для соединения по изобретению (например, мономера или димера ингибитора нейраминидазы, в том числе посредством линкера). Fc-связывающие пептиды по изобретению могут быть линейными или циклическими. Fc-связывающие пептиды по изобретению включают любые Fc-связывающие пептиды, известные специалисту в данной области.
Используемый в настоящем документе термин «белок альбумин» относится к полипептиду, содержащему аминокислотную последовательность, соответствующую встречающемуся в природе белку альбумину (например, сывороточному альбумину человека) или его варианту, такому как сконструированный вариант встречающегося в природе белка альбумина. Варианты белков альбуминов включают полиморфизмы, фрагменты, такие как домены и субдомены, и слитые белки (например, белок альбумин, имеющий С-концевое или N-концевое слияние, такое как полипептидный линкер). Предпочтительно белок альбумина имеет аминокислотную последовательность сывороточного альбумина человека (HSA) или ее вариант или фрагмент, наиболее предпочтительно ее функциональный вариант или фрагмент.Белки альбумины по изобретению включают белки, имеющие по меньшей мере 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности с любой из SEQ ID NO: 69-71. Белки альбумины по изобретению включают белки альбумины, которые были сконструированы таким образом, чтобы включать один или несколько (например, два, три, четыре или пять) доступных растворителю остатков цистеина или лизина, которые могут обеспечивать сайт для конъюгации с соединением по изобретению (например, конъюгации с мономером или димером ингибитора нейраминидазы, в том числе посредством линкера). Наиболее предпочтительно, чтобы белок альбумин содержал единственный доступный растворителю цистеин или лизин, обеспечивая таким образом возможность сайт-специфической конъюгации соединения по изобретению. Белки альбумины могут включать только встречающиеся в природе аминокислотные остатки или могут включать один или несколько не встречающихся в природе аминокислотных остатков. В случае включения, не встречающийся в природе аминокислотный остаток (например, боковая цепь не встречающегося в природе аминокислотного остатка) может быть использована в качестве точки присоединения для соединения по изобретению (например, мономера или димера ингибитора нейраминидазы, в том числе посредством линкера).
Используемый в настоящем документе термин «белок альбумин-связывающий пептид» относится к полипептиду, имеющему аминокислотную последовательность из 5-50 (например, 5-40, 5-30, 5-20, 5-15, 5-10, 10-50, 10-30 или 10-20) аминокислотных остатков, которые обладают аффинностью в отношении и функциями для связывания белка альбумина, такого как любой из белков альбуминов, описанных в настоящем документе. Предпочтительно белок альбумин-связывающий пептид связывается с встречающимся в природе сывороточным альбумином, наиболее предпочтительно с человеческим сывороточным альбумином. Белок альбумин-связывающий пептид может иметь различное происхождение, например, синтетическое, человеческое, мышиное или крысиное. Белок альбумин-связывающие пептиды по изобретению включают белок альбумин-связывающие пептиды, которые были сконструированы таким образом, чтобы включать один или несколько (например, два, три, четыре или пять) доступных растворителю остатков цистеина или лизина, которые могут обеспечивать сайт для конъюгации с соединением по изобретению (например, конъюгации с мономером или димером ингибитора нейраминидазы, в том числе посредством линкера). Наиболее предпочтительно белок альбумин-связывающий пептид будет содержать единственный доступный растворителю цистеин или лизин, обеспечивая таким образом возможность сайт-специфической конъюгации соединения по изобретению. Белок альбумин-связывающие пептиды могут включать только встречающиеся в природе аминокислотные остатки, или могут включать один или несколько не встречающихся в природе аминокислотных остатков. В случае включения, не встречающийся в природе аминокислотный остаток (например, боковая цепь не встречающегося в природе аминокислотного остатка) может быть использована в качестве точки присоединения для соединения по изобретению (например, мономера или димера ингибитора нейраминидазы, в том числе посредством линкера). Белок альбумин-связывающие пептиды по изобретению могут быть линейными или циклическими. Белок альбумин-связывающий пептид по изобретению включает любые белок альбумин-связывающие пептиды, известные специалисту в данной области, примеры которых представлены в настоящем документе. Дополнительные иллюстративные белок альбумин-связывающие пептиды представлены в заявке на патент США №2005/0287153, которая полностью включена в настоящий документ посредством ссылки.
В контексте настоящего описания «экспонированная на поверхности аминокислота» или «подвергнутая воздействию растворителя аминокислота», такая как экспонированный на поверхности цистеин или экспонированный на поверхности лизин, относится к аминокислоте, которая доступна для растворителя, окружающего белок. Экспонированная на поверхности аминокислота может представлять собой встречающийся в природе или сконструированный вариант (например, замену или вставку) белка. В некоторых вариантах осуществления экспонированная на поверхности аминокислота представляет собой аминокислоту, которая при замене существенно не изменяет трехмерную структуру белка.
Термины «линкер», «L» и «L'» в контексте настоящего описания относятся к ковалентной связи или соединению между двумя или более компонентами в конъюгате (например, между двумя ингибиторами нейраминидазы в описанном в настоящем документе конъюгате, между ингибитором нейраминидазы и Fc-доменом или белком альбумином в описанном в настоящем документе конъюгате, и между димером из двух ингибиторов нейраминидазы и Fc-доменом или белком альбумином в описанном в настоящем документе конъюгате). В некоторых вариантах осуществления описанный в настоящем документе конъюгат может содержать линкер, который имеет трехвалентную структуру (например, трехвалентный линкер). Трехвалентный линкер имеет три ответвления, где каждое ответвление ковалентно связано с компонентом конъюгата (например, первое ответвление конъюгировано с первым ингибитором нейраминидазы, второе ответвление конъюгировано со вторым ингибитором нейраминидазы, и третье ответвление конъюгировано с Fc-доменом или белком альбумином).
Молекулы, которые могут быть использованы в качестве линкеров, включают по меньшей мере две функциональные группы, которые могут быть одинаковыми или разными, например, две группы карбоновой кислоты, две аминогруппы, две группы сульфоновой кислоты, группу карбоновой кислоты и малеимидную группу, группу карбоновой кислоты и алкиновую группу, группу карбоновой кислоты и аминогруппу, группу карбоновой кислоты и группу сульфоновой кислоты, аминогруппу и малеимидную группу, аминогруппу и алкиновую группу, или аминогруппу и группу сульфоновой кислоты. Первая функциональная группа может образовывать ковалентную связь с первым компонентом в конъюгате, а вторая функциональная группа может образовывать ковалентную связь со вторым компонентом в конъюгате. В некоторых вариантах осуществления трехвалентного линкера два плеча линкера могут содержать две дикарбоновые кислоты, где первая карбоновая кислота может образовывать ковалентную связь с первым ингибитором нейраминидазы в конъюгате, и вторая карбоновая кислота может образовывать ковалентную связь с вторым ингибитором нейраминидазы в конъюгате, и третье плечо линкера может обеспечивать ковалентную связь с Fc-доменом или белком альбумином в конъюгате. Примеры дикарбоновых кислот описаны далее в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления молекула, содержащая одну или несколько малеимидных групп, может быть использована в качестве линкера, в котором малеимидная группа может образовывать углерод-серную связь с цистеином в компоненте (например, Fc-домен или белок альбумин) в конъюгате. В некоторых вариантах осуществления молекула, содержащая одну или несколько алкиновых групп, может быть использована в качестве линкера, в котором алкиновая группа может образовывать 1,2,3-триазольную связь с азидом в компоненте (например, Fc-домен или белок альбумин) в конъюгате. В некоторых вариантах осуществления молекула, содержащая одну или несколько азидных групп, может быть использована в качестве линкера, в котором азидная группа может образовывать 1,2,3-триазольную связь с алкином в компоненте (например, Fc-домен или белок альбумин) в конъюгате. В некоторых вариантах осуществления молекула, содержащая одну или несколько бис-сульфоновых групп, может быть использована в качестве линкера, в котором бис-сульфоновая группа может образовывать связь с аминогруппой в компоненте (например, Fc-домен или белок альбумин) в конъюгат. В некоторых вариантах осуществления молекула, содержащая одну или несколько групп сульфоновой кислоты, может быть использована в качестве линкера, в котором группа сульфоновой кислоты может образовывать сульфонамидную связь с компонентом в конъюгате. В некоторых вариантах осуществления молекула, содержащая одну или несколько изоцианатных групп, может быть использована в качестве линкера, в котором изоцианатная группа может образовывать связь мочевины с компонентом в конъюгате. В некоторых вариантах осуществления молекула, содержащая одну или несколько галогеналкильных групп, может быть использована в качестве линкера, в котором галогеналкильная группа может образовывать ковалентную связь, например, связи C-N и С-О, с компонентом в конъюгате.
В некоторых вариантах осуществления линкер обеспечивает пространство, жесткость и/или гибкость между двумя или более компонентами. В некоторых вариантах осуществления линкер может представлять собой связь, например, ковалентную связь. Термин «связь» относится к химической связи, например, амидной связи, дисульфидной связи, связи С-О, связи C-N, связи N-N, связи C-S или любой связи, созданной в результате химической реакции, например, химической конъюгации. В некоторых вариантах осуществления линкер включает не более 250 атомов. В некоторых вариантах осуществления линкер включает не более 250 неводородных атомов. В некоторых вариантах осуществления основная цепь линкера включает не более 250 атомов. «Основная цепь» линкера относится к атомам в линкере, которые вместе образуют кратчайший путь от одной части конъюгата к другой части конъюгата (например, кратчайший путь, связывающий первый ингибитор нейраминидазы и второй ингибитор нейраминидазы). Атомы в основной цепи линкера непосредственно участвуют в связывании одной части конъюгата с другой частью конъюгата (например, в связывании первого ингибитора нейраминидазы и второго ингибитора нейраминидазы). Например, атомы водорода, присоединенные к атомам углерода в основной цепи линкера, не рассматриваются как непосредственно участвующие в связывании одной части конъюгата с другой частью конъюгата.
В некоторых вариантах осуществления линкер может содержать синтетическую группу, полученную, например, из синтетического полимера (например, полимера полиэтиленгликоля (PEG)). В некоторых вариантах осуществления линкер может содержать один или несколько аминокислотных остатков, таких как D- или L-аминокислотные остатки. В некоторых вариантах осуществления линкер может представлять собой остаток аминокислотной последовательности (например, последовательность из 1-25 аминокислот, 1-10 аминокислот, 1-9 аминокислот, 1-8 аминокислот, 1-7 аминокислот, 1-6 аминокислот, 1-5 аминокислот, 1-4 аминокислот, 1-3 аминокислот, 1-2 аминокислот или 1 аминокислоты). В некоторых вариантах осуществления линкер может содержать один или несколько, например, 1-100, 1-50, 1-25, 1-10, 1-5 или 1-3, из необязательно замещенного алкилена, необязательно замещенного гетероалкилена (например, звено PEG), необязательно замещенного алкенилена, необязательно замещенного гетероалкенилена, необязательно замещенного алкинилена, необязательно замещенного гетероалкинилена, необязательно замещенного циклоалкилена, необязательно замещенного гетероциклоалкилена, необязательно замещенного циклоалкенилена, необязательно замещенного гетероциклоалкенилена, необязательно замещенного циклоалкинилена, необязательно замещенного гетероциклоалкинилена, необязательно замещенного арилена, необязательно замещенного гетероарилена (например, пиридин), О, S, NRi (Ri представляет собой Н, необязательно замещенный алкил, необязательно замещенный гетероалкил, необязательно замещенный алкенил, необязательно замещенный гетероалкенил, необязательно замещенный алкинил, необязательно замещенный гетероалкинил, необязательно замещенный циклоалкил, необязательно замещенный гетероциклоалкил, необязательно замещенный циклоалкенил, необязательно замещенный гетер оцикло алкенил, необязательно замещенный циклоалкинил, необязательно замещенный гетероциклоалкинил, необязательно замещенный арил или необязательно замещенный гетероарил), Р, карбонил, тиокарбонил, сульфонил, фосфат, фосфорил или имино. Например, линкер может содержать один или несколько из необязательно замещенного (С1-C20)алкилена, необязательно замещенного (C1-C20)гетероалкилена (например, звено PEG), необязательно замещенного (С2-C20)алкенилена (например, С2-алкенилена), необязательно замещенного (С2-C20)гетероалкенилена, необязательно замещенного (С2-C20)алкинилена, необязательно замещенного (С2-C20)гетероалкинилена, необязательно замещенного (C3-C20)циклоалкилена (например, циклопропилен, циклобутилен), необязательно замещенного (C3-C20)гетероциклоалкилена, необязательно замещенного (С4-C20)циклоалкенилена, необязательно замещенного (С4-С20) гетероциклоалкенилена, необязательно замещенного (С8-C20)циклоалкинилена, необязательно замещенного (C8-C20)гетероциклоалкинилена, необязательно замещенного (С5-C15)арилена (например, С6-арилен), необязательно замещенного (С2-C15)гетероарилена (например, имидазол, пиридин), О, S, NRi (Ri представляет собой Н, необязательно замещенный (C1-C20)алкил, необязательно замещенный (С1-C20)гетероалкил, необязательно замещенный (С2-C20)алкенил, необязательно замещенный (С2-C20)гетероалкенил, необязательно замещенный (С2-C20)алкинил, необязательно замещенный (С2-C20)гетероалкинил, необязательно замещенный (C3-C20)циклоалкил, необязательно замещенный (C3-C20)гетероциклоалкил, необязательно замещенный (С4-C20)циклоалкенил, необязательно замещенный (С4-C20)гетероциклоалкенил, необязательно замещенный (С8-C20)циклоалкинил, необязательно замещенный (С8-C20)гетероциклоалкинил, необязательно замещенный (С5-C15)арил или необязательно замещенный (С2-С15)гетероарил), Р, карбонил, тиокарбонил, сульфонил, фосфат, фосфорил или имино.
Используемые в настоящем документе термины «алкил», «алкенил» и «алкинил» включают одновалентные заместители с прямой и разветвленной цепью, а также их комбинации, содержащие только С и Н в незамещенном виде. Когда алкильная группа включает по меньшей мере одну двойную связь углерод-углерод или тройную связь углерод-углерод, алкильная группа может называться, соответственно, «алкенильной» или «алкинильной» группой. Моновалентность алкильной, алкенильной или алкинильной группы не включает необязательные заместители в алкильной, алкенильной или алкинильной группе. Например, если алкильная, алкенильная или алкинильная группа присоединена к соединению, моновалентность алкильной, алкенильной или алкинильной группы относится к ее присоединению к соединению и не включает никаких дополнительных заместителей, которые могут присутствовать в алкильной, алкенильной или алкинильной группе. В некоторых вариантах осуществления алкильная или гетероалкильная группа может содержать, например, 1-20. 1-18, 1-16, 1-14, 1-12, 1-10, 1-8, 1-6, 1-4 или 1-2 атома углерода (например, С1-С20, С1-C18, С1-Cl6, С1-C14, С1-C12, С1-C10, С1-С8, С1-С6, С1-С4 или С1-С2). В некоторых вариантах осуществления алкенильная, гетероалкенильная, алкинильная или гетероалкинильная группа может содержать, например, 2-20, 2-18, 2-16, 2-14, 2-12, 2-10, 2-8, 2-6 или 2-4 атома углерода (например, С2-С20, С2-Cl8, С2-Cl6, С2-Cl4, С2-Cl2, С2-Cl0, С2-С8, С2-С6 или С2-С4). Примеры включают, но без ограничения, метил, этил, изобутил, втор-бутил, трет-бутил, 2-пропенил и 3-бутинил.
Используемый в настоящем документе термин «циклоалкил» представляет одновалентную насыщенную или ненасыщенную неароматическую циклическую алкильную группу. Циклоалкил может иметь, например, от трех до двадцати атомов углерода (например, С3-С7, С3-С8, С3-С9, С3-C10, С3-C11, С3-C12, С3-C14, С3-C16, С3-C18 или С3-С20 циклоалкил). Примеры циклоалкилов включают, но без ограничения, циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил и циклогептил. Когда циклоалкильная группа включает по меньшей мере одну двойную связь углерод-углерод, циклоалкильная группа может называться как «циклоалкенильная» группа. Циклоалкенил может иметь, например, от четырех до двадцати атомов углерода (например, С4-С7, С4-С8, С4-С9, С4-C10, С4-C11, С4-C12, С4-C14, С4-C16, С4-C18 или С4-С20 циклоалкенил). Примеры циклоалкенильных групп включают, но без ограничения, циклопентенил, циклогексенил и циклогептенил. Когда циклоалкильная группа включает по меньшей мере одну тройную связь углерод-углерод, циклоалкильная группа может называться как «циклоалкинильная» группа. Циклоалкинил может иметь, например, от восьми до двадцати атомов углерода (например, С8-С9, С8-C10, С8-C11, С8-C12, С8-C14, С8-C16, С8-C18 или С8-С20 циклоалкинил). Термин «циклоалкил» также включает циклическое соединение, имеющее мостиковую полициклическую структуру, в которой один или несколько атомов углерода связывают два несмежных члена моноциклического кольца, например, бицикло [2.2.1.]гептил и адамантан. Термин «циклоалкил» также включает бициклические, трициклические и тетрациклические конденсированные кольцевые структуры, например, декалин и с пир о циклические соединения.
Используемый в настоящем документе термин «арил» относится к любой моноциклической или конденсированной кольцевой бициклической или трициклической системе, которая имеет характеристики ароматичности с точки зрения распределения электронов по всей кольцевой системе, например, фенил, нафтил или фенантрен. В некоторых вариантах осуществления кольцевая система содержит 5-15 атомов в кольце или 5-10 атомов в кольце. Арильная группа может иметь, например, от пяти до пятнадцати атомов углерода (например, С5-С6, С5-С7, С5-С8, С5-С9, С5-C10, С5-C11, С5-C12, С5-C13, С5-C14 или С5-C15 арил). Термин «гетероарил» также относится к таким моноциклическим или конденсированным бициклическим кольцевым системам, содержащим один или несколько, например, 1-4, 1-3, 1, 2, 3 или 4 гетероатома, выбранных из О, S и N. Гетероарильная группа может иметь, например, от двух до пятнадцати атомов углерода (например, С2-С3, С2-С4, С2-С5, С2-С6, С2-С7, С2-С8, С2-С9. С2-C10, С2-C11, С2-C12, С2-C13, С2-C14 или С2-C15 гетероарил). Включение гетероатома позволяет рассматривать включение 5-членных колец как ароматические, а также 6-членные кольца. Таким образом, типичные гетероарильные системы включают, например, пиридил, пиримидил, индолил, бензимидазолил, бензотриазолил, изохинолил, хинолил, бензотиазолил, бензофуранил, тиенил, фурил, пирролил, тиазолил, оксазолил, изоксазолил, бензоксазолил, бензоизоксазолил и имидазолил. Поскольку таутомеры являются возможными, группа, такая как фталимидо, также считается гетероарильной. В некоторых вариантах осуществления арильная или гетероарильная группа представляет собой 5- или 6-членную систему ароматических колец, необязательно содержащую 1-2 атома азота. В некоторых вариантах осуществления арильная или гетероарильная группа представляет собой необязательно замещенный фенил, пиридил, индолил, пиримидил, пиридазинил, бензотиазолил, бензимидазолил, пиразолил, имидазолил, изоксазолил, тиазолил или имидазопиридинил. В некоторых вариантах осуществления арильная группа представляет собой фенил. В некоторых вариантах осуществления арильная группа может быть необязательно замещена заместителем, таким как арильный заместитель, например, бифенил.
Термин «алкарил» относится к арильной группе, которая соединена с алкиленовой, алкениленовой или алкиниленовой группой. Обычно, если соединение присоединено к алкарильной группе, алкиленовая, алкениленовая или алкиниленовая часть алкарила присоединена к соединению. В некоторых вариантах осуществления алкарил представляет собой С6-С35 алкарил (например, С6-C16, С6-C14, С6-C12, С6-C10, С6-С9, С6-С8, С7 или С6 алкарил), в котором число атомов углерода обозначает общее число атомов углерода в арильной части и алкиленовой, алкениленовой или алкиниленовой части алкарила. Примеры алкарилов включают, но без ограничения, (С1-С8)алкилен(С6-С12)арил, (С2-С8)алкенилен(С6-С12)арил или (С2-С8)алкинилен(С6-С12)арил. В некоторых вариантах осуществления алкарил представляет собой бензил или фенетил. В гетероалкариле один или несколько гетероатомов, выбранных из N, О и S, могут присутствовать в алкиленовой, алкениленовой или алкиниленовой части алкарильной группы и/или могут присутствовать в арильной части алкарильной группы. В необязательно замещенном алкариле заместитель может присутствовать в алкиленовой, алкениленовой или алкиниленовой части алкарильной группы и/или может присутствовать в арильной части алкарильной группы.
Термин «амино», используемый в настоящем документе, представляет -N+(Rx)2 или -N+(Rx)3, где каждый Rx независимо представляет собой Н, алкил, алкенил, алкинил, арил, алкарил, циклоалкил, или два Rx объединены с образованием гетероциклоалкила. В некоторых вариантах осуществления аминогруппа представляет собой -NH2.
Используемый в настоящем документе термин «алкамино» относится к описанной в настоящем документе аминогруппе, которая присоединена к алкиленовой (например, С1-С5 алкилен), алкениленовой (например, С2-С5 алкенилен) или алкиниленовой группе (например, С2-С5 алкенилен). Обычно, если соединение присоединено к алкаминогруппе, алкиленовая, алкениленовая или алкиниленовая часть алкамино присоединена к соединению. Амино-часть алкамино относится к -N(Rx)2 или -N+(Rx)3, где каждый Rx независимо представляет собой Н, алкил, алкенил, алкинил, арил, алкарил, циклоалкил, или два Rx объединены с образованием гетероциклоалкила. В некоторых вариантах осуществления амино-часть алкамино представляет собой -NH2. Примером алкамино группы является С1-С5 алкамино, например, С2 алкамино (например, CH2CH2NH2 или CH2CH2N(CH3)2). В гетероалкаминогруппе один или несколько, например, 1-4, 1-3, 1, 2, 3 или 4 гетероатома, выбранные из N, О и S, могут присутствовать в алкиленовой, алкениленовой или алкиниленовой части гетероалкаминогруппы. В некоторых вариантах осуществления алкамино-группа может быть необязательно замещенной. В замещенной алкаминогруппе заместитель может присутствовать в алкиленовой, алкениленовой или алкиниленовой части алкамино группы и/или может присутствовать в амино-части алкамино группы.
Используемый в настоящем документе термин «алкамид» относится к амидной группе, которая присоединена к алкиленовой (например, С1-С5 алкилен), алкениленовой (например, С2-С5 алкенилен) или алкиниленовой (например, С2-С5 алкенилен) группе. Обычно, если соединение присоединено к алкамидной группе, алкиленовая, алкениленовая или алкиниленовая часть алкамида присоединена к соединению. Амидная часть алкамида относится к -C(O)-N(Rx)2, где каждый Rx независимо представляет собой Н, алкил, алкенил, алкинил, арил, алкарил, циклоалкил, или два Rx объединены с образованием гетероциклоалкила. В некоторых вариантах осуществления амидная часть алкамида представляет собой -C(O)NH2. Алкамидная группа может представлять собой -(CH2)2-C(O)NH2 или -CH2-C(O)NH2. В гетероалкамидной группе один или несколько, например, 1-4, 1-3, 1, 2, 3 или 4 гетероатома, выбранные из N, О и S, могут присутствовать в алкиленовой, алкениленовой или алкиниленовой части гетероалкиламидной группы. В некоторых вариантах осуществления алкамидная группа может быть необязательно замещенной. В замещенной алкамидной группе заместитель может присутствовать в алкиленовой, алкениленовой или алкиниленовой части алкамидной группы и/или может присутствовать в амидной части алкамидной группы.
Используемые в настоящем документе термины «алкилен», «алкенилен» и «алкинилен» относятся к двухвалентным группам, имеющим определенный размер. В некоторых вариантах осуществления алкилен может содержать, например, 1-20, 1-18, 1-16, 1-14, 1-12, 1-10, 1-8, 1-6, 1-4 или 1-2 атома углерода (например, С1-С20, С1-C18, С1-C16, С1-C14, С1-C12, С1-C10, С1-С8, С1-С6, С1-С4 или С1-С2). В некоторых вариантах осуществления алкенилен или алкинилен может содержать, например, 2-20, 2-18, 2-16, 2-14, 2-12, 2-10, 2-8, 2-6 или 2-4 атома углерода (например, С2-С20, С2-C18, С2-C16, С2-C14, С2-C12, С2-C10, С2-С8, С2-С6 или С2-С4). Алкилен, алкенилен и/или алкинилен включает формы с прямой и разветвленной цепью, а также их комбинации. Двухвалентность алкиленовой, алкениленовой или алкиниленовой группы не включает необязательные заместители в алкиленовой, алкениленовой или алкиниленовой группе. Например, два ингибитора нейраминидазы могут быть присоединены друг к другу посредством линкера, который включает алкилен, алкенилен и/или алкинилен или их комбинации. Каждая из алкиленовых, алкениленовых и/или алкиниленовых групп в линкере считается двухвалентной по отношению к двум присоединениям на любом конце алкиленовой, алкениленовой и/или алкиниленовой группы. Например, если линкер включает -(необязательно замещенный алкилен)-(необязательно замещенный алкенилен)-(необязательно замещенный алкилен), алкенилен считается двухвалентным по отношению к его присоединениям к двум алкиленам на концах линкера. Необязательные заместители в алкенилене не включены в двухвалентность алкенилена. Двухвалентная природа алкиленовой, алкениленовой или алкиниленовой группы (например, алкиленовой, алкениленовой или алкиниленовой группы в линкере) относится к обоим концам группы и не включает необязательные заместители, которые могут присутствовать в алкиленовой, алкениленовой или алкиниленовой группе. Поскольку они двухвалентные, они могут связывать вместе несколько (например, две) частей конъюгата, например, первый ингибитор нейраминидазы и второй ингибитор нейраминидазы. Алкиленовые, алкениленовые и/или алкиниленовые группы могут быть замещены группами, обычно подходящими в качестве заместителей для алкильных, алкенильных и алкинильных групп, как указано далее в настоящем документе. Например, С=O представляет собой Cl-алкилен, который замещен оксо (=О). Например, -HCR-C=C- может рассматриваться как необязательно замещенный алкинилен и считается двухвалентной группой, даже если он имеет необязательный заместитель, R. Гетер о алкиленовые, гетероалкениленовые и/или гетероалкиниленовые группы относятся к алкиленовым, алкениленовым и/или алкиниленовым группам, включающим один или несколько, например, 1-4, 1-3, 1, 2, 3 или 4 гетероатома, например, N, О и S. Например, полимер полиэтиленгликоль (PEG) или звено PEG -(СН2)2-O- в полимере PEG считается гетероалкиленом, содержащим один или несколько атомов кислорода.
Используемый в настоящем документе термин «циклоалкилен» относится к двухвалентной циклической группе, связывающей вместе две части соединения. Например, один атом углерода в циклоалкиленовой группе может быть связан с одной частью соединения, в то время как другой углерод в циклоалкиленовой группе может быть связан с другой частью соединения. Циклоалкиленовая группа может включать насыщенные или ненасыщенные не ароматические циклические группы. Циклоалкилен может иметь, например, от трех до двадцати атомов углерода в циклической части циклоалкилена (например, С3-С7, С3-С8, С3-С9, С3-C10, С3-C11, С3-C12, С3-C14, С3-C16, С3-C18 или С3-С20 циклоалкилен). Когда циклоалкиле новая группа включает по меньшей мере одну двойную связь углерод-углерод, циклоалкиленовая группа может называться как «циклоалкенил е новая» группа. Циклоалкенил ен может иметь, например, от четырех до двадцати атомов углерода в циклической части циклоалкенилена (например, С4-С7, С4-С8, С4-С9. С4-C10, С4-C11, С4-C12, С4-C14, С4-C16, С4-C18 или С4-С20 циклоалкенилен). Когда циклоалкиленовая группа включает по меньшей мере одну тройную связь углерод-углерод, циклоалкиленовая группа может называться «циклоалкиниленовой» группой. Цикл о алкинилен может иметь, например, от четырех до двадцати атомов углерода в циклической части циклоалкинилена (например, С4-С7, С4-С8, С4-С9. С4-C10, С4-C11, С4-C12, С4-C14, С4-C16, С4-C18 или С8-С20 циклоалкинилен). Циклоалкиленовая группа может быть замещена группами, обычно подходящими в качестве заместителей для алкильной, алкенильной и алкинильной групп, как указано в настоящем документе. Гетероциклоалкилен относится к циклоалкиленовой группе, включающей один или несколько, например, 1-4, 1-3, 1, 2, 3 или 4 гетероатома, например, N, О и S. Примеры циклоалкиленов включают, но без ограничения, циклопропилен и циклобутилен. Тетрагидрофуран можно рассматривать как гетеро цикл оал киле н.
Используемый в настоящем документе термин «арилен» относится к поливалентной (например, двухвалентной или трехвалентной) арильной группе, связывающей вместе несколько (например, две или три) частей соединения. Например, один углерод в ариленовой группе может быть связан с одной частью соединения, в то время как другой углерод в ариленовой группе может быть связан с другой частью соединения. Арилен может иметь, например, от пяти до пятнадцати атомов углерода в арильной части арилена (например, С5-С6, С5-С7, С5-С8, С5-С9. С5-C10, С5-C11, С5-C12, С5-C13, С5-C14 или С5-C15 арилен). Ариленовая группа может быть замещена группами, обычно подходящими в качестве заместителей для алкильной, алкенильной и алкинильной групп, как указано в настоящем документе. Гетероарилен относится к ароматической группе, включающей один или несколько, например, 1-4, 1-3, 1, 2, 3 или 4 гетероатома, например N, О и S. Гетероариленовая группа может иметь, например, от двух до пятнадцати атомов углерода (например, С2-С3, С2-С4, С2-С5, С2-С6, С2-С7, С2-С8, С2-С9. С2-C10, С2-C11, С2-C12, С2-C13, С2-C14 или С2-C15 гетероарилен).
Используемый в настоящем документе термин «необязательно замещенный» относится к наличию 0, 1 или более заместителей, таких как 0-25, 0-20, 0-10 или 0-5 заместителей. Заместители включают, но без ограничения, алкил, алкенил, алкинил, арил, алкарил, ацил, гетероарил, гетероалкил, гетер о алкенил, гетеро алкинил, гетероалкарил, галоген, оксо, циано, нитро, амино, алкамино, гидрокси, алкокси, алканоил, карбонил, карбамоил, гуанидинил, уреидо, амидинил, любую из групп или фрагментов, описанных выше, и гетеро-версии любой из групп или фрагментов, описанных выше. Заместители включают, но без ограничения, F, Cl, метил, фенил, бензил, OR, NR2, SR, SOR, SO2R, OCOR, NRCOR, NRCONR2, NRCOOR, OCONR2, RCO, COOR, алкил-OOCR, SO3R, CONR2, SO2NR2, NRSO2NR2, CN, CF3, OCF3, SiR3, and NO2, где каждый R независимо представляет собой Н, алкил, алкенил, арил, гетероалкил, гетероалкенил или гетероарил, и где два из необязательных заместителей на одном и том же или соседних атомах могут быть соединены с образованием конденсированного, необязательно замещенного ароматического или не ароматического, насыщенного или ненасыщенного кольца, которое содержит 3-8 членов, или два из необязательных заместителей на одном и том же атоме могут быть соединены с образованием необязательно замещенного ароматического или не ароматического, насыщенного или ненасыщенного кольца, которое содержит 3-8 членов.
Необязательно замещенная группа или фрагмент относится к группе или фрагменту (например, к любой из групп или фрагментов, описанных выше), в которых один из атомов (например, атом водорода) необязательно заменен другим заместителем. Например, необязательно замещенный алкил может быть необязательно замещенным метилом, в котором атом водорода метальной группы заменен, например, на ОН. В качестве другого примера заместитель в гетероалкиле или его двухвалентном аналоге, гетероалкилене, может заменять водород на углерод или водород на гетероатом, такой как N. Например, атом водорода в группе -R-NH-R- может быть замещен алкамидным заместителем, например, -R-N[(CH2C(O)N(CH3)2]-R.
Как правило, необязательный заместитель представляет собой не мешающий заместитель. «Не мешающий заместитель» относится к заместителю, который оставляет способность конъюгатов, описанных в настоящем документе (например, конъюгатов любой из формул (1)-(5), (D-I)-(D-X), (D'-I), (M-I)-(M-X) или (M'-I)), либо связываться с вирусной нейраминидазой, либо ингибировать пролиферацию вируса гриппа. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления заместитель может изменять степень такой активности. Однако, пока конъюгат сохраняет способность связываться с вирусной нейраминидазой или ингибировать вирусную пролиферацию, заместитель будет классифицироваться как «не мешающий». Например, не мешающий заместитель будет оставлять способность соединения обеспечивать противовирусную эффективность исходя из значения IC50, равного 10 мкМ или менее, в анализе уменьшения вирусных бляшек, таком как в примере 2, исходя из значения IC50 против нейраминидазы вируса гриппа, равного менее 500 нМ. Таким образом, заместитель может изменять степень ингибирования исходя из уменьшения бляшек или ингибирования нейраминидазы вируса гриппа. Однако, при условии, что соединения в настоящем документе, такие как соединения формул (A-I), (А-II), (А-III), (A-IV), (A-V), (А-VI), (А-VII), (А-VIII), (A-IX), (А-Х), (A-XI) и (А-XII), сохраняют способность ингибировать активность нейраминидазы вируса гриппа, заместитель будет классифицирован как «не мешающий». Ряд анализов для определения уменьшения вирусных бляшек или способности любого соединения ингибировать нейраминидазу вируса гриппа доступен в данной области, и некоторые из них проиллюстрированы в примерах ниже.
Термин «гетеро», когда он используется для описания химической группы или фрагмента, относится к наличию по меньшей мере одного гетероатома, который не является углеродом или водородом, например, N, О и S. Любая из групп или фрагментов, описанных выше, может называться «гетеро», если она содержит по меньшей мере один гетероатом. Например, гетероциклоалкильная, гетероциклоалкенильная или гетероциклоалкинильная группа относится к циклоалкильной, циклоалкенильной или циклоалкинильной группе, которая имеет один или несколько гетероатомов, независимо выбранных, например, из N, О и S. Примером гетероциклоалкенильной группы является малеимидо. Например, гетероарильная группа относится к ароматической группе, которая имеет один или несколько гетероатомов, независимо выбранных, например, из N, О и S. Один или несколько гетероатомов также могут быть включены в заместитель, который заменяет атом водорода в группе или фрагменте, как описано в настоящем документе. Например, в необязательно замещенной гетероарильной группе, если один из атомов водорода в гетероарильной группе заменен заместителем (например, метилом), заместитель также может содержать один или несколько гетероатомов (например, метанол).
Используемый в настоящем документе термин «ацил» относится к группе, имеющей структуру: 
где Rz представляет собой необязательно замещенный алкил, алкенил, алкинил, циклоалкил, циклоалкенил, циклоалкинил, арил, алкарил, алкамино, гетероалкил, гетеро алкенил, гетероалкинил, гетероциклоалкил, гетероциклоалкенил, гетероциклоалкинил, гетероарил, гетероалкарил или гетероалкамино.
Термин «галогено» или «галоген» в контексте настоящего описания относится к любому атому галогена, например, F, Cl, Br или I. Любая из описанных в настоящем документе групп или фрагментов может называться как «фрагмент галогено», если он содержит хотя бы один атом галогена, такой как галогеналкил.
Используемый в настоящем документе термин «гидроксил» представляет собой группу -ОН.
Используемый в настоящем документе термин «оксо» относится к заместителю, имеющему структуру =O, где существует двойная связь между атомом и атомом кислорода.
Термин «карбонил», используемый в настоящем документе, относится к группе, имеющей структуру: 
Термин «тиокарбонил», используемый в настоящем документе, относится к группе, имеющей структуру: 
Термин «фосфат», используемый в настоящем документе, относится к группе, имеющей структуру: 
Термин «фосфорил», используемый в настоящем документе, представляет группу, имеющую структуру: 
Термин «сульфонил», используемый в настоящем документе, представляет группу, имеющую структуру: 
Термин «имино», используемый в настоящем документе, представляет группу, имеющую структуру: 
где R представляет собой необязательный заместитель.
Термин «N-защитная группа», используемый в настоящем документе, представляет те группы, которые предназначены для защиты аминогруппы от нежелательных реакций во время синтетических процедур. Обычно используемые N-защитные группы раскрыты в Greene, "Protective Groups in Organic Synthesis," 5th Edition (John Wiley & Sons, New York, 2014), которая включена в настоящий документ посредством ссылки. N-защитные группы включают, например, ацильные, арилоильные и карбамильные группы, такие как формил, ацетил, пропионил, пивалоил, трет-бутилацетил, 2-хлорацетил, 2-бромацетил, трифторацетил, трихлорацетил, фталил, о-нитрофеноксиацетил, α-хлорбутирил, бензоил, карбоксибензил (CBz), 4-хлорбензоил, 4-бромбензоил, 4-нитробензоил и хиральные вспомогательные вещества, такие как защищенные или незащищенные D, L или D, L-аминокислотные остатки, такие как аланин, лейцин, фенилаланин; сульфонил содержащие группы, такие как бензолсульфонил и п-толуолсульфонил; образующие карбамат группы, такие как бензилоксикарбонил, п-хлорбензилоксикарбонил, п-метоксибензилоксикарбонил, п-нитробензилоксикарбонил, 2-нитробензилоксикарбонил, п-бромбензилоксикарбонил, 3,4-диметоксибензилоксикарбонил, 3,5-диметоксибензилоксикарбонил, 2,4-диметоксибензилоксикарбонил, 4-диметоксибензилоксикарбонил, 2-нитро-4,5-диметоксибензилоксикарбонил, 3,4,5-триметоксибензилоксикарбонил, 1-(п-бифенилил)-1-метилэтоксикарбонил, α,α-диметил-3,5-диметоксибензилоксикарбонил, бензгидрилоксикарбонил, трет-бутилоксикарбонил (ВОС), диизопропилметоксикарбонил, изопропилоксикарбонил, этоксикарбонил, метоксикарбонил, аллилоксикарбонил, 2,2,2-трихлорэтоксикарбонил, феноксикарбонил, 4-нитрофеноксикарбонил, флуоренил-9-метоксикарбонил (Fmoc), циклопентилоксикарбонил, адамантилоксикарбонил, циклогексилоксикарбонил и фенилтиокарбонил; алкарильные группы, такие как бензил, трифенилметил и бензилоксиметил; и силильные группы, такие как триметилсилил.
Используемый в настоящем документе термин «аминокислота» означает встречающиеся в природе аминокислоты и не встречающиеся в природе аминокислоты.
Используемый в настоящем документе термин «встречающиеся в природе аминокислоты» означает аминокислоты, включая Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr и Val.
Используемый в настоящем документе термин «не встречающаяся в природе аминокислота» означает альфа-аминокислоту, которая не продуцируется в природе или не обнаруживается у млекопитающего. Примеры не встречающихся в природе аминокислот включают D-аминокислоты; аминокислоту, имеющую ацетиламинометальную группу, присоединенную к атому серы в цистеине; пегилированную аминокислоту; омега-аминокислоты формулы NH2(CH2)nCOOH, где n равно 2-6, нейтральные неполярные аминокислоты, такие как саркозин, трет-бутилаланин, трет-бутил глицин, N-метилизолейцин и норлейцин; оксиметионин; фенилглицин; цитруллин; метионин сульфоксид; цистеиновую кислоту; орнитин; диаминомасляную кислоту; 3-аминоаланин; 3-гидрокси-D-пролин; 2,4-диаминомасляную кислоту; 2-аминопентановую кислоту; 2-аминооктановую кислоту, 2-карбоксипиперазин; пиперазин-2-карбоновую кислоту, 2-амино-4-фенилбутановую кислоту; 3-(2-нафтил)аланин и гидроксипролин. Другие аминокислоты представляют собой α-аминомасляную кислоту, α-амино-α-метилбутарат, аминоциклопропанкарбоксилат, аминоизомасляную кислоту, аминонорборнилкарбоксилат, L-циклогексилаланин, циклопентилаланин, L-N-метиллейцин, L-N-метилметионин, L-N-метилнорвалин, L-N-метилфенилаланин, L-N-метилпролин, L-N-метилсерин, L-N-метилтриптофан, D-орнитин, L-N-метилэтилглицин, L-норлейцин, α-метил-аминоизобутират, α-метилциклогексилаланин, D-α-метилаланин, D-α-метиларгинин, D-α-метиласпарагин, D-α-метиласпартат, D-α-метилцистеин, D-α-метилглутамин, D-α-метилгистидин, D-α-метилизолейцин, D-α-метиллейцин, D-α-метиллизин, D-α-метилметионин, D-α-метилорнитин, D-α-метилфенилаланин, D-α-метилпролин, D-α-метилсерин, D-N-метилсерин, D-α-метилтреонин, D-α-метилтриптофан, D-α-метилтирозин, D-α-металвалин, D-N-метилаланин, D-N-метиларгинин, D-N-метиласпарагин, D-N-метиласпартат, D-N-метилцистеин, D-N-метилглутамин, D-N-метилглутамат, D-N-метилгистидин, D-N-метилизолейцин, D-N-метиллейцин, D-N-метиллизин, N-метилциклогексилаланин, D-N-метил орнитин, N-метилглицин, N-метиламиноизобутират, N-(1-метилпропил)глицин, N-(2-метилпропил)глицин, D-N-метилтриптофан, D-N-метилтирозин, D-N-метилвалин, γ-аминомасляную кислоту, L-t-бутилглицин, L-этилглицин, L-гомофенилаланин, L-α-метил аргинин, L-α-метиласпартат, L-α-метилцистеин, L-α-метилглутамин, L-α-метилгистидин, L-α-метилизолейцин, L-α-метиллейцин, L-α-метилметионин, L-α-метилнорвалин, L-α-метилфенилаланин, L-α-метилсерин, L-α-метилтриптофан, L-α-метилвалин, N-(N-(2,2-дифенилэтил)карбамилметилглицин, 1-карбокси-1-(2,2-дифенилэтиламино)-циклопропан, 4-гидроксипролин, орнитин, 2-аминобензоил (антранилоил), D-циклогексилаланин, 4-фенил-фенилаланин, L-цитруллин, α-циклогексилглицин, L-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-3-карбоновую кислоту, L-тиазолидин-4-карбоновую кислоту, L-гомотирозин, L-2-фурилаланин, L-гистидин (3-метил), N-(3-гуанидинопропил)глицин, О-метил-L-тирозин, О-гликан-серин, метатирозин, нор-тирозин, L-N,N',N''-триметиллизин, гомолизин, норлизин, N-гликановый аспарагин, 7-гидрокси-1,2,3,4-тетрагидро-4-фторфенилаланин, 4-метилфенилаланин, бис-(2-пиколил)амин, пентафторфенилаланин, индолин-2-карбоновую кислоту, 2-аминобензойную кислоту, 3-амино-2-нафтойную кислоту, асимметричный диметиларгинин, L-тетрагидроизохинолин-1-карбоновую кислоту, D-тетрагидроизохинолин-1-карбоновую кислоту, 1-аминоциклогексануксусную кислоту, D/L-аллилглицин, 4-аминобензойную кислоту, 1-аминоциклобутанкарбоновую кислоту, 2- или 3- или 4-аминоциклогексанкарбоновую кислоту, 1-амино-1-циклопентанкарбоновую кислоту, 1-аминоиндан-1-карбоновую кислоту, 4-аминопирролидин-2-карбоновую кислоту, 2-аминотетралин-2-карбоновую кислоту, азетидин-3-карбоновую кислоту, 4-бензилпиролидин-2-карбоновую кислоту, трет-бутилглицин, b-(бензотиазолил-2-ил)аланин, b-циклопропилаланин, 5,5-диметил-1,3-тиазолидин-4-карбоновую кислоту, (2R,4S)4-гидроксипиперидин-2-карбоновую кислоту, (2S,4S) и (2S,4R)-4-(2-нафтилметокси)пирролидин-2-карбоновую кислоту, (2S, 4S) и (2S,4R)4-феноксипирролидин-2-карбоновую кислоту, (2R,5S) и (2S,5R)-5-фенилпирролидин-2-карбоновую кислоту, (2S,4S)-4-амино-1-бензоилпирролидин-2-карбоновую кислоту, трет-бутилаланин, (2S,5R)-5-фенилпирролидин-2-карбоновую кислоту, 1-аминометилциклогексануксусную кислоту, 3,5-бис-(2-амино)-этоксибензойную кислоту, 3,5-диаминобензойную кислоту, 2-метиламинобензойную кислоту, N-метилантраниловую кислоту, L-N-метилаланин, L-N-метиларгинин, L-N-метиласпарагин, L-N-метиласпарагиновую кислоту, L-N-метилцистеин, L-N-метилглутамин, L-N-метилглутаминовую кислоту, L-N-метилгистидин, L-N-метилизолейцин, L-N-метиллизин, L-N-метилнорлейцин, L-N-метилорнитин, L-N-метилтреонин, L-N-метилтирозин, L-N-метилвалин, L-N-метил-трет-бутилглицин, L-норвалин, α-метил-γ-аминобутират, 4,4'-бифенилаланин, α-метилцилкопентилаланин, α-метил-α-нафтилаланин, α-метилпеницилламин, N-(4-аминобутил)глицин, N-(2-аминоэтил)глицин, N-(3-аминопропил)глицин, N-амино-α-метилбутират, α-нафтилаланин, N-бензилглицин, N-(2-карбамилэтил)глицин, N-(карбамилметил)-глицин, N-(2-карбоксиэтил)глицин, N-(карбоксиметил)глицин, N-циклобутилглицин, N-циклодецилглицин, N-циклогептилглицин, N-циклогексилглицин, N-циклодецилглицин, N-цикододецилглицин, N-циклооктилглицин, N-циклопропилглицин, N-циклоундецилглицин, N-(2,2-дифенилэтил)глицин, N-(3,3-дифенилпропил)глицин, N-(3-гуанидинопропил)глицин, N-(1-гидроксиэтил)глицин, N-(гидроксиэтил))глицин, N-(имидазолилэтил))глицин, N-(3-индолилиэтил)глицин, N-метил-γ-амино бутират, D-N-метилметионин, N-метилциклопентилаланин, D-N-метилфенилаланин, D-N-метилпролин, D-N-метилтреонин, N-(1-метилэтил)глицин, N-метил-нафтилаланин, N-метилпеницилламин, N-(п-гидроксифенил)глицин, N-(тиометил)глицин, пеницилламин, L-α-метилаланин, L-α-метиласпарагин, L-α-метил-трет-бутилглицин, L-метилэтилглицин, L-α-метилглутамат, L-α-метилгомофенилаланин, N-(2-метилтиоэтил)глицин, L-α-металлизин, L-α-метилнорлейцин, L-α-метилорнитин, L-α-метилпролин, L-α-метилтреонин, L-α-метилтирозин, L-N-метил-гомофенилаланин, N-(N-(3,3-дифенилпропил)-карбамилметилглицин, L-пироглутаминовую кислоту, D-пироглутаминовую кислоту, О-метил-L-серин, О-метил-L-гомосерин, 5-гидроксилизин, α-карбоксиглутамат, фенилглицин, L-пипеколиновую кислоту (гомопролин), L-гомолейцин, L-лизин (диметил), L-2-нафтилаланин, L-диметилдопа или L-диметоксифенилаланин, L-3-пиридилаланин, L-гистидин (бензоилоксиметил), N-циклогептилглицин, L-дифенилаланин, О-метил-L-гомотирозин, L-β-гомолизин, О-гликан-треоин, орто-тирозин, L-N,N'-диметиллизин, L-гомоаргинин, неотриптофан, 3-бензотиенилаланин, изохинолин-3-карбоновую кислоту, диаминопропионовую кислоту, гомоцистеин, 3,4-диметоксифенилаланин, 4-хлорфенилаланин, L-1,2,3,4-тетрагидроноргарман-3-карбоновую кислоту, адамантилаланин, симметричный диметиларгинин, 3-карбокситиоморфолин, D-1,2,3,4-тетрагидроноргарман-3-карбоновую кислоту, 3-аминобензойную кислоту, 3-амино-1-карбоксиметилпиридин-2-он, 1-амино-1-циклогексанкарбоновую кислоту, 2-аминоциклопентанкарбоновую кислоту, 1-амино-1-циклопропанкарбоновую кислоту, 2-аминоиндан-2-карбоновую кислоту, 4-аминотетрагидротиопиран-4-карбоновую кислоту, азетидин-2-карбоновую кислоту, b-(бензотиазол-2-ил)-аланин, неопентилглицин, 2-карбоксиметилпиперидин, b-циклобутилаланин, аллилглицин, диаминопропионовую кислоту, гомоциклогексилаланин, (2S,4R)-4-гидроксипиперидин-2-карбоновую кислоту, октагидроиндол-2-карбоновую кислоту, (2S,4R) и (2S,4R)-4-гидроксипиперидин-2-карбоновую кислоту, октагидроиндол-2-карбоновую кислоту, (2S,4R) и (2S,4R)-4-(2-нафтил), пирролидин-2-карбоновую кислоту, нипекотиновую кислоту, (2S,4R) и (2S,4R)-4-(4-фенилбензил)пирролидин-2-карбоновую кислоту, (3S)-1-пирролидин-3-карбоновую кислоту, (2S,4S)-4-тритилмеркаптопирролидин-2-карбоновую кислоту, (2S,4S)-4-меркаптопролин, трет-бутилглицин, N,N-бис(3-аминопропил)глицин, 1-аминоциклогексан-1-карбоновую кислоту, N-меркаптоэтилглицин и селеноцистеин. В некоторых вариантах осуществления аминокислотные остатки могут быть заряженными или полярными. Заряженные аминокислоты включают аланин, лизин, аспарагиновую кислоту или глутаминовую кислоту или их неприродные аналоги. Полярные аминокислоты включают глутамин, аспарагин, гистидин, серии, треонин, тирозин, метионин или триптофан, или их не встречающиеся в природе аналоги. В частности, предполагается, что в некоторых вариантах осуществления концевая аминогруппа в аминокислоте может представлять собой амидогруппу или карбаматную группу.
Используемый в настоящем документе термин «процент (%) идентичности» относится к процентному содержанию аминокислотных остатков последовательности-кандидата, например, Fc-IgG или ее фрагмента, которые идентичны аминокислотным остаткам контрольной последовательности после выравнивание последовательностей и введения пробелов, если необходимо, для достижения максимальной процентной идентичности (т.е. пробелы могут быть введены в одну или обе из последовательностей-кандидатов и эталонных последовательностей для оптимального выравнивания, и негомологичные последовательности можно не принимать во внимание для целей сравнения). Выравнивание для определения процента идентичности может быть достигнуто различными способами, которые известны специалистам в данной области техники, например, с использованием общедоступного компьютерного программного обеспечения, такого как программное обеспечение BLAST, ALIGN или Megalign (DNASTAR). Специалисты в данной области могут определить подходящие параметры для измерения выравнивания, включая любые алгоритмы, необходимые для достижения максимального выравнивания по всей длине сравниваемых последовательностей. В некоторых вариантах осуществления процент идентичности аминокислотной последовательности заданной последовательности-кандидата заданной эталонной последовательности, с заданной эталонной последовательностью или против заданной эталонной последовательности (которую можно иначе перефразировать как заданная последовательность-кандидат, которая имеет или включает определенный процент идентичности аминокислотной последовательности заданной эталонной последовательности, с заданной эталонной последовательностью или против заданной эталонной последовательности) рассчитывается следующим образом:
100 × (доля А/В)
где А представляет собой количество аминокислотных остатков, оцениваемых как идентичные при выравнивании последовательности-кандидата и эталонной последовательности, и где В представляет собой общее количество аминокислотных остатков в эталонной последовательности. В некоторых вариантах осуществления, где длина последовательности-кандидата не равна длине эталонной последовательности, процент идентичности аминокислотной последовательности последовательности-кандидата эталонной последовательности не будет равен проценту идентичности аминокислотной последовательности эталонной последовательности последовательности-кандидату.
Две полинуклеотидные или полипептидные последовательности называются «идентичными», если последовательность нуклеотидов или аминокислот в этих двух последовательностях является одинаковой при выравнивании для максимального соответствия, как описано выше. Сравнения между двумя последовательностями обычно выполняют путем сравнения последовательностей в окне сравнения для идентификации и сравнения локальных областей сходства последовательностей. «Окно сравнения», используемое в настоящем документе, относится к участку по меньшей мере из около 15 смежных положений, около 20 смежных положений, около 25 смежных положений или более (например, от около 30 до около 75 смежных положений или от около 40 до около 50 смежных положений), в котором последовательность можно сравнивать с эталонной последовательностью из такого же количества смежных положений после оптимального выравнивания двух последовательностей.
Термин «лечение» или «лечить» в контексте настоящего описания относится к терапевтическому лечению вирусной инфекции (например, вирусной инфекции, такой как инфекция гриппа) у субъекта. В некоторых вариантах осуществления терапевтическое лечение может замедлить прогрессирование вирусной инфекции, улучшить результат лечения пациента и/или устранить инфекцию. В некоторых вариантах осуществления терапевтическое лечение вирусной инфекции у субъекта может способствовать или облегчить один или несколько симптомов или состояний, связанных с вирусной инфекцией, уменьшить степень распространения вируса, стабилизировать (т.е. не ухудшить) состояние вирусной инфекции, предотвратить распространение вирусной инфекции и/или задерживать или замедлять развитие вирусной инфекции по сравнению с состоянием и/или состоянием вирусной инфекции при отсутствии терапевтического лечения.
Термин «среднее значение Т», используемое в настоящем документе, относится к среднему количеству мономеров ингибитора нейраминидазы или димеров ингибиторов нейраминдазы, конъюгированных с Fc-доменом или белком альбумином в группе конъюгатов. В некоторых вариантах осуществления в группе конъюгатов среднее количество мономеров ингибитора нейраминидазы или димеров ингибиторов нейраминдазы, конъюгированных с мономером Fc-домена, может составлять от 1 до 20 (например, среднее значение Т составляет 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 5-10, 10-15 или 15-20). В некоторых вариантах осуществления среднее значение Т равно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20.
Используемый в настоящем документе термин «субъект» может представлять собой человека, примата, отличного от человека, или другое млекопитающее, такое как, но без ограничения, собака, кошка, лошадь, корова, свинья, индейка, коза, рыба, обезьяна, курица, крыса, мышь и овца.
Термин «терапевтически эффективное количество» в контексте настоящего описания относится к количеству, например, фармацевтической дозе, эффективному в отношении индукции желаемого эффекта у субъекта или лечения субъекта, имеющего состояние или нарушение, описанное в настоящем документе (например, вирусную инфекцию, например, инфекцию гриппа). В настоящем документе следует также понимать, что «терапевтически эффективное количество» может быть интерпретировано как количество, дающее желаемый терапевтический и/или профилактический эффект, принимаемое в одной или нескольких дозах или в любой дозе или любым путем, и/или принимаемое отдельно или в комбинации с другими терапевтическими агентами (например, противовирусным агентом, описанным в настоящем документе). Например, в контексте введения конъюгата, описанного в настоящем документе (например, конъюгата любой из формул (1)-(5), (D-I)-(D-X), (D'-I), (M-I)-(M-X) или (M'-I)), который применяют для лечения вирусной инфекции, эффективное количество конъюгата представляет собой, например, количество, достаточное для предупреждения, замедления или прекращение прогрессирования вирусной инфекции по сравнению с ответом, получаемым без введения конъюгата.
Используемый в настоящем документе термин «фармацевтическая композиция» относится к лекарственному или фармацевтическому составу, который содержит по меньшей мере один активный ингредиент (например, конъюгат любой из формул (1)-(5), (D-I)-(D-X), (D'-I), (M-I)-(M-X) или (M'-I)), а также один или несколько вспомогательных веществ и разбавителей, которые позволяют сделать активный ингредиент подходящим для способа введения. Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению включает фармацевтически приемлемые компоненты, которые совместимы с конъюгатом, описанным в настоящем документе (например, конъюгатом любой из формул (1)-(5), (D-I)-(D-X), (D'-I), (M-I)-(M-X) или (M'-I)).
Используемый в настоящем документе термин «фармацевтически приемлемый носитель» относится к вспомогательному веществу или разбавителю в фармацевтической композиции. Например, фармацевтически приемлемый носитель может представлять собой носитель, способный суспендировать или растворять активный конъюгат (например, конъюгат любой из формул (1)-(5), (D-I)-(D-X) или (М-I)-(M-VI)). Фармацевтически приемлемый носитель должен быть совместим с другими ингредиентами состава и не вреден для реципиента. В настоящем раскрытии фармацевтически приемлемый носитель должен обеспечивать адекватную фармацевтическую стабильность описанному в настоящем документе конъюгату. Природа носителя различается в зависимости от способа введения. Например, для перорального введения предпочтительным является твердый носитель; для внутривенного введения обычно применяют водный раствор в качестве носителя (например, WFI и/или забуференный раствор).
Термин «фармацевтически приемлемая соль», используемый в настоящем документе, представляет соли конъюгатов, описанных в настоящем документе (например, конъюгатов любой из формул (1)-(5), (D-I)-(D-X), (D'-I), (M-I)-(M-X) или (M'-I)), которые в рамках обоснованного медицинского заключения подходят для применения в описанных в настоящем документе способах без чрезмерной токсичности, раздражения и/или аллергической реакции. Фармацевтически приемлемые соли хорошо известны в данной области. Например, фармацевтически приемлемые соли описаны в: Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use (Eds. P.H. Stahl and C.G. Wermuth), Wiley-VCH, 2008. Соли могут быть получены in situ во время окончательного выделения и очистки конъюгатов, описанных в настоящем документе, или отдельно, путем взаимодействия группы свободного основания с подходящей органической кислотой.
Термин «соотношение лекарственное средство/антитело» или «DAR» относится к среднему количеству низко молекулярных фрагментов лекарственного средства (например, среднему количеству мономеров или димеров низко молекулярного лекарственного средства), конъюгированных с описанным в настоящем документе антителом, Fc-доменом или белком альбумином. В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, DAR представлен буквой «Т» (например, в формулах (1)-(5), (D-I)-(D-X), (D'-I), (M-I)-(M-X) или (M'-I)). В данном контексте каждый мономерный фрагмент (например, каждый мономер занамивира или перамивира) или каждый димерный фрагмент (например, каждый димер занамивира или димер перамивира), конъюгированный с Fc-доменом, антителом или белком альбумином, соответствует значению DAR, равному 1,0 (например, значение «Т», равное 1,0). Например, Fc-домен, конъюгированный с 4 мономерами занамивира, будет иметь значение DAR, равное 4,0 (например, значение «Т», равное 4,0). Fc-домен, конъюгированный с 4 димерами занамивира (например, всего 8 молекулами занамивира), также будет иметь значение DAR, равное 4,0 (например, значение «Т», равное 4,0). Значение DAR также может быть вычислено в виде среднего значения DAR для группы молекул, такой как группа Fc-доменов. антител или белков альбуминов. Значения DAR могут влиять на эффективность, удельную активность, фармакокинетику или токсичность лекарственного средства.
Термин «около», используемый в настоящем документе, указывает на отклонение в пределах ±5%. Например, около 10% означает от 9,5% до 10,5%.
Любые значения, представленные в виде диапазона значений, включают верхнюю и нижнюю границы, а также любые значения, содержащиеся в пределах верхней и нижней границ.
Термин «(1)-(5), (D-I)-(D-X), (D'-I), (M-I)-(M-X) или (M'-I)», используемый в настоящем документе, представляет формулы по любому из (1), (2), (3), (4), (5), (D-I), (D-II), (D-II-1), (D-II-2), (D-II-3), (D-II-4), (D-II-5), (D-II-6), (D-II-7), (D-II-8), (D-II-9), (D-II-10), (D-III), (D-III-1), (D-III-2), (D-III-3), (D-III-4), (D-III-5), (D-III-6), (D-III-7), (D-III-8), (D-III-9), (D-IV), (D-IV-1), (D-IV-2), (D-V), (D-V-1), (D-V-2), (D-V-3), (D-V-4), (D-V-5), (D-V-6), (D-V-7), (D-V-8), (D-V-9), (D-V-10), (D-VI), (D-VI-1), (D-VI-2), (D-VI-3), (D-VI-4), (D-VI-5), (D-VI-6), (D-VI-7), (D-VI-8), (D-VI-9), (D-VII), (D-VIII), (D-VIII-1), (D-VIII-2), (D-VIII-3), (D-VIII-4), (D-VIII-5), (D-VIII-6), (D-VIII-7), (D-VIII-8), (D-VIII-9), (D-VIII-10), (D-VIII-11), (D-ГХ), (D-IX-1), (D-IX-2), (D-IX-3), (D-IX-4), (D-IX-5), (D-IX-6), (D-X), (D-X-1), (D-X-2), (D-X-3), (D'-I), (M-I), (М-П), (M-II-1), (M-II-2), (M-II-3), (M-II-4), (M-II-5), (M-II-6), (M-II-7), (M-II-8), (M-II-9), (M-II-10), (M-III), (M-III-1), (M-III-2), (M-III-3), (M-III-4), (M-III-5), (M-III-6), (M-III-7), (M-III-8), (M-III-9), (M-IV), (M-IV-1), (M-IV-2), (M-V), (M-V-1), (M-V-2), (M-V-3), (M-V-4), (M-V-5), (M-V-6), (M-V-7), (M-V-8), (M-V-9), (M-V-10), (M-VI), (M-VI-1), (M-VI-2), (M-VI-3), (M-VI-4), (M-VI-5), (M-VI-6), (M-VI-7), (M-VI-8), (M-VI-9), (M-VII), (M-VIII), (M-VIII-1), (M-VIII-2), (M-VIII-3), (M-VIII-4), (M-VIII-5), (M-VIII-6), (M-VIII-7), (M-VIII-8), (M-VIII-9), (M-VIII-10), (M-VIII-11), (M-IX), (M-IX-1), (M-IX-2), (М-ГХ-3), (М-ГХ-4), (M-IX-5), (M-IX-6), (M-X), (M-X-1), (M-X-2), (M-X-3) или (M'-I)).
Другие признаки и преимущества описанных в настоящем документе конъюгатов будут очевидны из следующего подробного описания и формулы изобретения.
Описание чертежей
ФИГ. 1 представляет собой изображение, изображающее иллюстративные способы конъюгирования мономера или димера ингибитора нейраминидазы, например, посредством линкера, с мономером Fc-домена, Fc-доменом, Fc-связывающим пептидом, белком альбумином или белок альбумин-связывающим пептидом.
ФИГ. 2 показывает SDS-PAGE в не восстановительных и восстановительных условиях, и схематическую иллюстрацию Fc-домена, образованного из мономеров Fc-домена, имеющих последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1.
ФИГ. 3 показывает SDS-PAGE в не восстановительных и восстановительных условиях, и схематическую иллюстрацию Fc-домена, образованного из мономеров Fc-домена, имеющих последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3.
ФИГ. 4 показывает SDS-PAGE в не восстановительных и восстановительных условиях и схематическую иллюстрацию Fc-домена, образованного из мономеров Fc-домена, имеющих последовательность, представленную в SEQ ID NO: 5.
ФИГ. 5 показывает SDS-PAGE в не восстановительных и восстановительных условиях и схематическую иллюстрацию Fc-домена, образованного из мономеров Fc-домена, имеющих последовательность, представленную в SEQ ID NO: 7.
ФИГ. 6 показывает SDS-PAGE в не восстановительных и восстановительных условиях, и схематическую иллюстрацию Fc-домена, образованного из мономеров Fc-домена, имеющих последовательность, представленную в SEQ ID NO: 9.
ФИГ. 7 показывает SDS-PAGE в не восстановительных и восстановительных условиях и схематическую иллюстрацию Fc-домена, образованного из мономеров Fc-домена, имеющих последовательность, представленную в SEQ ID NO: 12.
ФИГ. 8 показывает SDS-PAGE в не восстановительных и восстановительных условиях, и схематическую иллюстрацию Fc-домена, образованного из мономеров Fc-домена, имеющих последовательность, представленную в SEQ ID NO: 14.
ФИГ. 9 показывает SDS-PAGE в не восстановительных условиях конъюгата 1.
ФИГ. 10 показывает SDS-PAGE в не восстановительных условиях конъюгата 2.
ФИГ. 11 показывает SDS-PAGE в не восстановительных условиях конъюгата 3.
ФИГ. 12 показывает SDS-PAGE в не восстановительных условиях конъюгата 4.
ФИГ. 13 показывает SDS-PAGE в не восстановительных условиях конъюгата 5.
ФИГ. 14 показывает SDS-PAGE в не восстановительных условиях конъюгата 6.
ФИГ. 15 представляет собой график, показывающий значения IC50 из анализа ингибирования нейраминидазы H1N1 для промежуточного соединения 2 и конъюгата 1.
ФИГ. 16 представляет собой график, показывающий значения IC50 из анализа ингибирования нейраминидазы H1N1 для конъюгатов 1-6.
ФИГ. 17 представляет собой график, показывающий значения IC50 из анализа ингибирования нейраминидазы H3N2 для конъюгатов 1-6.
ФИГ. 18А-18С представляют собой серии графиков, показывающих клеточную способность клеток А549, обработанных конъюгатом 3 (ФИГ. 18А), конъюгатом 4 (ФИГ. 18В) или конъюгатом 6 (ФИГ. 18С).
ФИГ. 19А-19Е представляют собой серию графиков, показывающих способность конъюгата 3 ингибировать рост патогенных штаммов вируса гриппа A/WSN/33 H1N1 (ФИГ. 19А), А/Wyoming/3/03 H3N2 (ФИГ. 19В), A/California/04/09 H1N1 pdm (ФИГ. 19С), A/Vietnam/1203/04 H5N1 HALo (ФИГ. 19D) или B/Lee/40 Victoria (ФИГ. 19Е) в эпителиальных клетках человека.
ФИГ. 20А-20Е представляют собой серию графиков, показывающих способность конъюгата 4 ингибировать рост патогенных штаммов вируса гриппа A/WSN/33 H1N1 (ФИГ. 20А), А/Wyoming/3/03 H3N2 (ФИГ. 20В), A/California/04/09 H1N1 pdm (ФИГ. 20С), A/Vietnam/1203/04 H5N1 HALo (ФИГ. 20D) или B/Lee/40 Victoria (ФИГ. 20Е) в эпителиальных клетках человека.
ФИГ. 21А-21Е представляют собой серии графиков, показывающих способность конъюгата 6 ингибировать рост патогенных штаммов вируса гриппа A/WSN/33 H1N1 (ФИГ. 21А), A/Wyoming/3/03 H3N2 (ФИГ. 21В), A/California/04/09 H1N1 pdm (ФИГ. 21С), A/Vietnam/1203/04 H5N1 HALo (ФИГ. 21D) или B/Lee/40 Victoria (ФИГ. 21Е) в эпителиальных клетках человека.
ФИГ. 22А-22Е представляют собой серии графиков, показывающих способность конъюгата 6 ингибировать рост патогенных штаммов вируса гриппа A/WSN/33 H1N1 (ФИГ. 22А), A/Wyoming/3/03 H3N2 (ФИГ. 22В), A/California/04/09 H1N1 pdm (ФИГ. 22С), B/Lee/40 Victoria (ФИГ. 22D) или A/Vietnam/1203/04 (ФИГ. 22Е) в эпителиальных клетках человека по сравнению с осельтамивиром.
ФИГ. 23 представляет собой график, показывающий относительную концентрацию конъюгата 6 в сыворотке крови у мышей по сравнению с взятым в отдельности Fc (hIgG1).
ФИГ. 24 представляет собой график, показывающий эффект конъюгата 6 на вес мыши в модели летального гриппа мышей. Исследование проводили, как описано в примере 29.
ФИГ. 25 представляет собой график, показывающий эффект конъюгата 6 на выживаемость в модели летального гриппа мышей. Исследование проводили, как описано в примере 29.
ФИГ. 26 представляет собой график, показывающий эффект конъюгата 6 на вес мыши в летальной модели гриппа мышей. Исследование проводили, как описано в примере 30.
ФИГ. 27 представляет собой график, показывающий эффект конъюгата 6 на выживаемость в модели летального гриппа мышей. Исследование проводили, как описано в примере 30.
ФИГ. 28 представляет собой изображение, отражающее способ конъюгирования мономера или димера ингибитора нейраминидазы, например, посредством линкера, с мономером Fc-домена, Fc-доменом, Fc-связывающим пептидом, белком альбумином или белок альбумин-связывающим пептидом путем конъюгации оксима с аминокислотным остатком, например, с атомом азота экспонируемого на поверхности лизина.
ФИГ. 29 представляет собой изображение, отражающее способ конъюгирования мономера или димера ингибитора нейраминидазы, например, посредством линкера, с мономером Fc-домена, Fc-доменом, Fc-связывающим пептидом, белком альбумином или белок альбумин-связывающим пептидом путем конъюгации тиоэфира с аминокислотным остатком, например, с атомом азота экспонированного на поверхности лизина.
ФИГ. 30 представляет собой изображение, отражающее способ конъюгирования мономера или димера ингибитора нейраминидазы, например, посредством линкера, с мономером Fc-домена, Fc-доменом, Fc-связывающим пептидом, белком альбумином или белок альбумин-связывающим пептидом путем повторной конъюгации цистеина, например, повторной конъюгации цистеина с парой атомов серы двух шарнирных цистеинов в мономере Fc-домена или Fc-домене.
ФИГ. 31А-31F представляют собой серии графиков, показывающих выживаемость мышей, подвергнутых лечению конъюгатом 6, в модели летального гриппа мышей. Мышей подвергали лечению либо осельтамивиром (Tamiflu™) в качестве контроля, 20 мг/кг, 2 раза в сутки, начиная через 8 часов после инфицирования (ФИГ. 31А); конъюгатом 6, 50 мг/кг, 1 доза за 28 дней до инфицирования (ФИГ. 31В); конъюгатом 6, 10 мг/кг, 1 доза за 28 дней до инфицирования (ФИГ. 31С); конъюгатом 6, 5 мг/кг, 1 доза за 28 дней до инфицирования (ФИГ. 31D); конъюгатом 6, 2,5 мг/кг, 1 доза за 28 дней до инфицирования (ФИГ. 31Е); или конъюгатом 6, 1,25 мг/кг, 1 доза за 28 дней до инфицирования (ФИГ. 31F). Это исследование выполняли, как описано в примере 33.
ФИГ. 32A-32F представляет собой серии графиков, показывающих, что конъюгат 6 расширяет окно лечения по сравнению с осельтамивиром (Tamiflu™), что определяется по выживаемости в модели летального гриппа мышей. Мышей подвергали лечению либо носителем (PBS), только Fc в дозе 10 мг/кг массы тела, либо конъюгатом 6, за 4 часа до инфицирования (ФИГ. 32А); конъюгатом 6 или осельтамивиром (Tamiflu™) через 8 часов после инфицирования (ФИГ. 32В); конъюгатом 6 или осельтамивиром (Tamiflu™) через 24 часа после инфицирования (ФИГ. 32С); конъюгатом 6 или осельтамивиром (Tamiflu™) через 48 часов после инфицирования (ФИГ. 32D); конъюгатом 6 или осельтамивиром (Tamiflu™) через 72 часа после инфицирования (ФИГ. 32Е); или конъюгатом 6 или осельтамивиром (Tamiflu™) через 96 часов после инфицирования (ФИГ. 32F). Исследование проводили, как описано в примере 34.
ФИГ. 33 представляет собой график, показывающий отсутствие значительного эффекта прироста массы тела после введения конъюгата 6 в 14-дневном исследовании на крысах токсичности с определением диапазона доз. Исследование проводили, как описано в примере 35.
ФИГ. 34A-34D представляют собой серии графиков, показывающих, что конъюгат 6 расширяет окно лечения по сравнению с осельтамивиром (Tamiflu™), что определяется по выживаемости в модели летального гриппа мышей. Мышей подвергали лечению либо осельтамивиром (Tamiflu™) в качестве контроля, 20 мг/кг, 2 раза в сутки, начиная через 8 часов после инфицирования (ФИГ. 34А); конъюгатом 6 в дозе 10 мг/кг, 1 дозу за 4 часа до инфицирования (ФИГ. 34В); конъюгатом 6 в дозе 2 мг/кг, 1 дозу за 4 часа до инфицирования (ФИГ. 34С); или конъюгатом 6 в дозе 0,4 мг/кг, 1 дозу за 4 дня до инфицирования (ФИГ. 34D). Исследование проводили, как описано в примере 37.
ФИГ. 35 представляет собой график, показывающий эффект конъюгата 6 на вес мыши в модели летального гриппа мышей. Исследование проводили, как описано в примере 37.
ФИГ. 36 представляет собой график, показывающий 7-дневное фармакокинетическое исследование на крысах после IV (внутривенного) введения конъюгата 6. Исследование выполняли, как описано в примере 38.
ФИГ. 37 представляет собой график, показывающий 14-дневное фармакокинетическое исследование на крысах после IV введения конъюгата 6. Исследование выполняли, как описано в примере 39.
ФИГ. 38 представляет собой график, показывающий 28-дневное фармакокинетическое исследование на крысах, сравнивающее IV и SC (подкожное) введение конъюгата 6. Исследование выполняли, как описано в примере 40.
ФИГ. 39 представляет собой график, показывающий 28-дневное фармакокинетическое исследование на нечеловеческих приматах после IV введения конъюгата 6. Исследование проводили, как описано в примере 41.
ФИГ. 40 представляет собой график, показывающий фармакокинетическое исследование распределения в легких у мышей после IV введения конъюгата 6. Исследование выполняли, как описано в примере 42.
ФИГ. 41 представляет собой график, показывающий 5-дневное фармакокинетическое исследование на мышах, сравнивающее IV, SC и IM (внутримышечное) введение конъюгата 6. Исследование проводили, как описано в примере 43.
ФИГ. 42 показывает SDS-PAGE в не восстановительных условиях конъюгата 8. ФИГ. 43 показывает структуру конъюгата 6.
ФИГ. 44 представляет собой график, показывающий 24-часовое исследование стабильности in vitro в плазме мышей, сравнивающее конъюгат 6, инкубированный при 37°С в течение 24 часов, с контрольным и чистым соединением.
ФИГ. 45 представляет собой график, показывающий 24-часовое исследование стабильности in vitro в плазме человека, сравнивающее конъюгат 6, инкубированный при 37°С в течение 24 часов, с контрольным и чистым соединением.
ФИГ. 46 представляет собой график, показывающий 24-часовое исследование микросомальной стабильности в печени у мышей, сравнивающее конъюгат 6, инкубированный при 37°С в течение 24 часов в микросомальных клетках печени у мышей, и микросомальные клетки печени мыши, убитые нагреванием, в качестве контроля.
ФИГ. 47 представляет собой график, показывающий 24-часовое исследование микросомальной стабильности в печени у человека, сравнивающее конъюгат 6, инкубированный при 37°С в течение 24 часов в микросомальных клетках печени человека, и микросомальные клетки печени, убитые нагреванием, в качестве контроля.
ФИГ. 48 представляет собой график, показывающий % изменения массы тела у мышей в течение 15 дней после заражения вирусом. Исследование проводили, как описано в примере 66.
ФИГ. 49 представляет собой график, показывающий % выживаемости у мышей в течение 15 дней после заражения вирусом. Исследование проводили, как описано в примере 66.
ФИГ. 50 представляет собой график, показывающий связывание конъюгата 6 и конъюгата 12 по сравнению с hIgG1 Fc (WT) и hIgG1 Fc (N297A) с Fcγ рецептором IIIA. Исследование проводили, как описано в примере 67.
ФИГ. 51 представляет собой график, показывающий связывание конъюгата 6 и конъюгата с рецептором Fcγ IIIA. Исследование проводили, как описано в примере 67.
ФИГ. 52 представляет собой график, показывающий 7-дневное токсикокинетическое исследование на нечеловеческих приматах после IV введения конъюгата 6. Исследование проводили, как описано в примере 68.
ФИГ. 53 представляет собой график, показывающий 28-дневное фармакокинетическое исследование на нечеловеческих приматах, сравнивающее IV и SC введение конъюгата 6. Исследование проводили, как описано в примере 68.
ФИГ. 54 показывает SDS-PAGE в не восстановительных условиях конъюгата 12.
ФИГ. 55 показывает SDS-PAGE в не восстановительных условиях конъюгата 13, имеющего различные значения отношения лекарственное средство - антитело (DAR) (конъюгат 13а, конъюгат 13b, конъюгат 13 с, конъюгат 13d, конъюгат 13е, конъюгат 13f и конъюгат 13g).
ФИГ. 56 представляет собой график, показывающий % выживаемости мышей с ослабленным иммунитетом в течение 35 дней после заражения вирусом. Группа лечения конъюгатом 6 в дозе 0,3 мг/кг сохранила 100% выживаемость, но для ясности на графике немного смещена. Исследование проводили, как описано в примере 95.
ФИГ. 57 представляет собой график, показывающий % изменения массы тела у мышей с ослабленным иммунитетом в течение 35 дней после заражения вирусом. Исследование проводили, как описано в примере 95.
ФИГ. 58 представляет собой график, показывающий, что введение конъюгата 6 приводит к дозозависимому клиренсу вируса в легких в мышиной модели, инфицированной гриппом A (H1N1), и что этот вирусный клиренс больше, чем PBS в качестве контроля, только Fc в качестве контроля или осельтамивира в качестве контроля. Это исследование выполняли, как описано в примере 96.
ФИГ. 59 представляет собой график, показывающий, что введение конъюгата 6 приводит к дозозависимому снижению воспалительных цитокинов в легких в мышиной модели, инфицированной гриппом А (H1N1). Это исследование было выполнено, как описано в примере 97.
ФИГ. 60 представляет собой график, показывающий фармакокинетику конъюгата 6 у мышей BALB/c SCID (с ослабленным иммунитетом) и мышей CD-1 (иммунокомпетентных). Это исследование выполняли, как описано в примере 98.
ФИГ. 61 представляет собой изображение, отражающее конъюгат 33.
ФИГ. 62А-62В представляют собой графики, показывающие изменение массы тела (%) у мышей BALB/c, интраназально зараженных 3-кратной дозой LD95 адаптированного мышиного вируса гриппа A.PR/8/1934 (H1N1). Это исследование выполняли, как описано в примере 133.
ФИГ. 63А представляет собой график, показывающий вирусную нагрузку на 4-й день после инфицирования. Это исследование выполняли, как описано в примере 133.
ФИГ. 63В представляет собой график, показывающий логарифмическое снижение вирусной нагрузки на 4-й день после инфицирования. Это исследование выполняли, как описано в примере 133.
ФИГ. 64А представляет собой график, показывающий, что введение конъюгата 33 приводит к дозозависимому снижению вирусной нагрузки в мышиной модели, инфицированной гриппом A (H1N1), по сравнению с PBS в качестве контроля или только Fc в качестве контроля. Это исследование выполняли, как описано в примере 133.
ФИГ. 64В представляет собой график, показывающий логарифмическое снижение вирусной нагрузки на 4-й день после инфицирования. Это исследование выполняли, как описано в примере 133.
ФИГ. 65А-65Е представляют собой серии гистограмм, показывающих, что введение конъюгата 33 приводит к дозозависимому кратному снижению уровней цитокинов для TNF-α (ФИГ. 65A), IL-6 (ФИГ. 65 В), INF-γ (ФИГ. 65С), МСР-1 (ФИГ. 65D) и MIP-1α (ФИГ. 65Е). Это исследование выполняли, как описано в примере 133.
ФИГ. 66 представляет собой хроматограф, показывающий стабильность промежуточного соединения 80 по сравнению с промежуточным соединением 4 на 7 день инкубации при 37°С и 60°С. Это исследование выполняли, как описано в примере 142.
ФИГ. 67 представляет собой график, показывающий последовательный пассаж А/СА/09 pdm в присутствии конъюгата 6, осельтамивира, балоксавира или PBS в качестве контроля в клетках А549 для оценки возможности развития устойчивых к лекарственным средствам мутантных вирусных штаммов под давлением селективности с вирусными ингибиторами. Это исследование выполняли, как описано в примере 147.
ФИГ. 68 представляет собой график, показывающий последовательный пассаж A/WSN/1933 в присутствии конъюгата 6, конъюгата 33, осельтамивира, балоксавира или PBS в качестве контроля в клетках MDCK для оценки потенциала развития устойчивых к лекарственным средствам мутантных вирусных штаммов при селективном давлении с помощью вирусных ингибиторов. Это исследование выполняли, как описано в примере 147.
Подробное описание изобретения
В раскрытии представлены конъюгаты, композиции и способы лечения вирусных инфекций (например, инфекций, вызванных вирусами гриппа). Раскрытые в настоящем документе конъюгаты включают мономеры или димеры ингибиторов вирусной нейраминидазы (например, занамивир, перамивир или их аналоги), конъюгированные с Fc-мономерами, Fc-доменами, Fc-связывающими пептидами, белками альбуминами или белок альбумин-связывающими пептидами. Ингибитор нейраминидазы (например, занамивир, перамивир или их аналоги) в конъюгатах воздействует на нейраминидазу на поверхности вирусной частицы. Мономеры Fc или Fc-домены в конъюгатах связываются с FcγR (например, FcRn, FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIc, FcγRIIIa и FcγRIIIb) на иммунных клетках, например, нейтрофилах, для активации фагоцитоза и эффекторных функций, таких как антителозависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность (ADCC), что приводит к поглощению и разрушению вирусных частиц иммунными клетками и дальнейшему усилению противовирусной активности конъюгатов. Альбумин или альбумин-связывающий пептид может увеличивать период полужизни конъюгата, например, за счет связывания альбумина с рециркулирующим неонатальным Fc-рецептором. Такие композиции являются полезными в способах ингибирования роста вирусов и в способах лечения вирусных инфекций, таких как инфекции, вызываемые вирусом гриппа А, вирусом гриппа В и вирусом гриппа С.
I. Вирусные инфекции
Описанные в настоящем документе соединения и фармацевтические композиции (например, конъюгат любой из формул (1)-(5), (D-I)-(D-X), (D'-I), (M-I)-(М-Х) или (M'-I)) может быть использован для лечения вирусной инфекции (например, инфекции, вызванной вирусом гриппа, таким как вирус гриппа А, В, С или парагриппа).
Вирусная инфекция относится к патогенному росту вируса (например, вируса гриппа) в организме-хозяине (например, у субъекта-человека). Вирусной инфекцией может быть любая ситуация, в которой присутствие вирусной популяции(й) наносит вред организму хозяина. Таким образом, субъект страдает вирусной инфекцией, когда чрезмерное количество вирусной популяции присутствует в или на теле субъекта, или когда присутствие вирусной популяции(й) повреждает клетки или другую ткань субъекта.
Грипп, широко известный как «острая респираторная вирусная инфекция», представляет собой инфекционное заболевание, вызываемое вирусом гриппа. Симптомы могут быть от легких до тяжелых. Наиболее частые симптомы включают: высокую температуру, насморк, боль в горле, мышечные боли, головную боль, кашель и чувство усталости. Эти симптомы обычно начинаются через два дня после контакта с вирусом и длятся менее недели. Однако кашель может длиться более двух недель. У детей может возникать тошнота и рвота, но у взрослых они встречаются реже. Осложнения гриппа могут включать вирусную пневмонию, вторичную бактериальную пневмонию, инфекции носовых пазух и ухудшение предыдущих проблем со здоровьем, таких как астма или сердечная недостаточность. Серьезные осложнения могут возникать у субъектов с ослабленной иммунной системой, таких как молодые, старые, люди с заболеваниями, ослабляющими иммунную систему, и те, кто проходит терапевтическое лечение, приводящее к ослаблению иммунной системы.
Три типа вирусов гриппа поражают людей, а именно тип А, тип В и тип С. Обычно вирус распространяется по воздуху при кашле или чихании. Считается, что это происходит в основном на относительно небольших расстояниях. Он также может передаваться при прикосновении к поверхностям, зараженным вирусом, а затем при прикосновении ко рту или глазам. Человек может заразить других как до, так и во время появления симптомов. Инфекция может быть подтверждена тестированием на вирус горла, мокроты или носа. Доступен ряд экспресс-тестов; однако люди могут иметь инфекцию в случае отрицательных результатов. Для диагностики инфекции, вызванной вирусом гриппа, может применяться тип полимеразной цепной реакции, которая обнаруживает РНК вируса.
II. Конъюгаты по раскрытию
В настоящем документе обеспечены синтетические конъюгаты, полезные для лечения вирусных инфекций (например, инфекций, вызванных вирусом гриппа). Описанные в настоящем документе конъюгаты включают Fc-домен или белок альбумин, конъюгированный с одним или несколькими мономерами ингибиторов нейраминидазы или одним или несколькими димерами двух ингибиторов нейраминидазы (например, ингибиторов нейраминидазы, выбранных из занамивира, сульфозанамивира, перамивира, А-315675 или их аналогов). Димеры двух ингибиторов нейраминидазы включают ингибитор нейраминидазы (например, первый ингибитор нейраминидазы формулы (A-I), (А-II), (А-III), (A-IV), (A-V), (А-VI), (А-VII), (A-VIII), (A-IX), (А-Х), (A-XI) или (А-XII)) и второй ингибитор нейраминидазы (например, второй ингибитор нейраминидазы формулы (A-I), (А-II), (А-III), (A-IV), (A-V), (А-VI), (А-VII), (А-VIII), (A-IX), (А-Х), (A-XI) или (А-XII)). Первый и второй ингибиторы нейраминидазы связаны друг с другом посредством линкера.
Не ограничиваясь теорией, в некоторых аспектах описанные в настоящем документе конъюгаты связываются с поверхностью вирусной частицы (например, связываются с вирусным ферментом нейраминидазой на поверхности частицы вируса гриппа) посредством взаимодействий между фрагментами ингибитора нейраминидазы в конъюгатах и белками на поверхности вирусной частицы. Ингибитор нейраминидазы разрушает нейраминидазу, оболочечный гликопротеин, который отщепляет сиаловые кислоты, то есть концевые остатки нейраминовой кислоты, от гликановых структур на поверхности инфицированных клеток-хозяев, высвобождая потомственные вирусы и обеспечивая распространение вируса из клетки-хозяина в неинфицированные окружающие клетки.
Конъюгаты по изобретению включают мономеры и димеры ингибитора нейраминидазы, конъюгированные с Fc-доменом, мономером Fc или Fc-связывающим пептидом. Fc-домен в описанных в настоящем документе конъюгатах связывается с FcγR (например, FcRn, FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIc, FcγRIIIa и FcγRIIIb) на иммунных клетках. Связывание Fc-домена в описанных в настоящем документе конъюгатах с FcγR на иммунных клетках активирует фагоцитоз и эффекторные функции, такие как антителозависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность (ADCC), что приводит к поглощению и разрушению вирусных частиц иммунными клетками и дальнейшее усиление противовирусной активности конъюгатов.
Конъюгаты по изобретению включают мономеры и димеры ингибитора нейраминидазы, конъюгированные с белком альбумином или белок-альбумин-связывающим пептидом. Белок альбумин или белок альбумин-связывающий пептид может увеличивать период полужизни конъюгата, например, за счет связывания альбумина с ре циркулирующим неонатальным Fc-рецептором.
Обеспеченные в настоящем документе конъюгаты описываются любой из формул (1)-(5), (D-I)-(D-X), (D'-I), (M-I)-(M-X) или (M'-I). В некоторых вариантах осуществления описанные в настоящем документе конъюгаты включают один или несколько мономеров ингибиторов нейраминидазы, конъюгированных с Fc-доменом или белком альбумином. В некоторых вариантах осуществления описанные в настоящем документе конъюгаты включают один или несколько димеров ингибиторов нейраминидазы, конъюгированных с Fc-доменом или белком альбумином. В некоторых вариантах осуществления, когда n равно 2, Е (мономер Fc-домена) димеризуется с образованием Fc-домена.
Описанные в настоящем документе конъюгаты могут быть синтезированы с использованием доступных в данной области методов химического синтеза. В случаях, когда функциональная группа недоступна для конъюгации, молекула может быть дериватизирована с использованием обычных методов химического синтеза, хорошо известных в данной области. В некоторых вариантах осуществления описанные в настоящем документе конъюгаты содержат один или несколько хиральных центров. Конъюгаты включают каждую из изолированных стереоизомерных форм, а также смеси стереоизомеров с различной степенью хиральной чистоты, включая рацемические смеси. Также, охвачены различные диастереомеры, энантиомеры и таутомеры, которые могут быть образованы.
Ингибиторы нейраминидазы
Компонент описанных в настоящем документе конъюгатов представляет собой фрагмент ингибитора нейраминидазы вируса гриппа. Ингибитор нейраминидазы вируса гриппа разрушает нейраминидазу, оболочечный гликопротеин, который отщепляет сиаловые кислоты, т.е. концевые остатки нейраминовой кислоты, от гликановых структур на поверхности инфицированных клеток-хозяев, высвобождая потомственные вирусы и обеспечивая распространение вируса от клетки-хозяина к неинфицированным окружающим клеткам. Примеры ингибитора нейраминидазы вируса гриппа включают занамивир (Relenza), сульфозанамивир, А-315675 и перамивир. Кроме того, производные занамивира, сульфозанамивира, А-315675 и перамивира, такие как те, которые описаны в литературе, обладают активностью ингибитора нейраминидазы и являются полезными в качестве ингибиторных фрагментов нейраминидазы соединений, описанных в настоящем документе (см., например, Hadházi et al. A sulfozanamivir analogue has potent anti-influenza virus activity. ChemMedChem Comm. 13: 785-789 (2018) and In vitro characterization of A-315675, a highly potent inhibitor of A and В strain of influenze virus neuraminidases and influenza virus replication. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 46(4): 1014-1021 (2002)).
Описанные в настоящем документе конъюгаты делятся на два типа: (1) один или несколько димеров ингибиторов нейраминидазы, конъюгированных с Fc-доменом или белком альбумином, и (2) один или несколько мономеров ингибиторов нейраминидазы, конъюгированных с Fc-доменом или белком альбумином. Димеры ингибиторов нейраминидазы связаны друг с другом посредством линкера, такого как линкеры, описанные в настоящем документе.
Ингибиторы нейраминидазы вирусов по изобретению включают занамивир, сульфозанамивир, А-315675, перамавир и их аналоги, такие как ингибиторы нейраминидазы вирусов формул (A-I)-(A-XII):
где R1 выбран из -ОН, -NH2, -NHC(=NH)NH2 и -NHC(=NH)NHR6; R2 и R3, каждый, независимо выбраны из -Н, -ОН, -F, -Cl и -Br; R4 выбран из -CO2H, -Р(=O)(ОН)2, -SO3H; R5 выбран из -СОСН3, -COCF3, -SO2CH3; X выбран из -О- и -S-; Y выбран из
R6 выбран из 
R7 выбран из Н, (С1-С20)алкила, (С3-С20)циклоалкила, (С3-С20)гетероциклоалкила; (С5-С15)арила и (С2-С15)гетероарила; R8 выбран из (С3-С20)гетероциклоалкила, (С5-С15)арила и (С2-С15)гетероарила. Наиболее предпочтительно ингибитор вирусной нейраминидазы формулы (A-I), (А-II), (А-III), (A-IV), (A-V), (А-VI), (А-VII), (А-VIII), (A-IX), (А-Х), (A-XI) или (А-XII) ковалентно присоединен к конъюгату через Y.
Предпочтительно ингибитор вирусной нейраминидазы выбран из занамивира, сульфозанамивира, перамивира или А-315675:
Конъюгаты димеров ингибиторов нейраминидазы, связанных с Fc-доменом или белком альбумином
Конъюгаты, описанные в настоящем документе, включают Fc-домен и мономер Fc, Fc-связывающий пептид и белок альбумин или белок альбумин-связывающий пептид, ковалентно связанный с одним или несколькими димерами ингибиторов нейраминидазы. Димеры двух ингибиторов нейраминидазы включают первый ингибитор нейраминидазы (например, первый ингибитор нейраминидазы вирусов формул (AI)-(A-XII)) и второй ингибитор нейраминидазы (например, второй ингибитор нейраминидазы вирусов формул (AI)-(A-XII)). Первый и второй ингибиторы нейраминидазы связаны друг с другом посредством линкера, такого как линкер, описанный в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления димеров ингибиторов нейраминидазы первый и второй ингибиторы нейраминидазы являются одинаковыми. В некоторых вариантах осуществления первый и второй ингибиторы нейраминидазы являются различными.
Димеры ингибиторов нейраминидазы включают гомодимеры занамивира или его аналогов (например, (AI), (А-II), (А-VI), (А-VII), (А-VIII) или (A-IX)). Например, димеры ингибитора нейраминидазы по изобретению включают димеры, имеющие структуру A1-L-A2, где каждый Ai и каждый А2 выбран из (A-I), (А-II), (А-VI), (A-VII), (А-VIII) и (А-IX).
Димеры ингибиторов нейраминидазы включают гомодимеры перамивира или его аналогов (например, (А-III), (A-IV) или (A-V)). Например, димеры ингибитора нейраминидазы по изобретению включают димеры, имеющие структуру A1-L-A2, где каждый A1 и каждый А2 выбран из (А-III), (A-IV) и (A-V).
Димеры ингибиторов нейраминидазы включают гетеродимеры, включая занамивир или его аналоги, и перамивир или его аналоги (например, (A-I)-(A-IX)). Например, димеры ингибитора нейраминидазы по изобретению включают димеры, имеющие структуру A1-L-A2, где каждый A1 выбран из (AI), (А-II), (А-VI), (A-VII), (А-VIII) и (A-IX), и каждый А2 выбран из (А-III), (А-IV) и (A-V).
В некоторых вариантах осуществления, когда Т больше 1 (например, Т равно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20), каждый A1-L-A2 может быть независимо выбран (например, независимо выбран из любой из структур A1-L-A2, описанных в настоящем документе). В некоторых вариантах осуществления Е может быть конъюгирован с 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более различными фрагментами A1-L-A2. В некоторых вариантах осуществления Е конъюгирован с первым фрагментом A1-L-A2 и вторым фрагментом A1-L-A2. В некоторых вариантах осуществления A1 и А2 первого фрагмента A1-L-A2 независимо выбраны из любой из формул (A-III)-(A-V):
и A1 и А2 второго фрагмента A1-L-A2 независимо выбраны из любой из формул (AI), (А-II), (A-VI), (A-VII), (A-VIII) или (A-IX):
В некоторых вариантах осуществления первый фрагмент A1-L-A2 специфически конъюгирован с остатками лизина Е (например, атомами азота экспонированных на поверхности остатков лизина Е), а второй фрагмент A1-L-A2 специфически конъюгирован с остатками цистеина Е (например, атомами серы экспонированных на поверхности остатков цистеина Е). В некоторых вариантах осуществления первый фрагмент A1-L-A2 специфически конъюгирован с остатками цистеина Е (например, атомами серы экспонированных на поверхности остатков цистеина Е), и второй фрагмент A1-L-A2 специфически конъюгирован с остатками лизина Е (например, атомами азота экспонированных на поверхности остатков лизина Е).
В некоторых вариантах осуществления раскрытие обеспечивает конъюгат или его фармацевтически приемлемую соль, описанные формулами, приведенными ниже.
или его фармацевтически приемлемая соль.
В описанных в настоящем документе конъюгатах волнистая линия, соединенная с Е, указывает, что один или несколько (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20) димеров ингибиторов нейраминидазы могут быть присоединены к мономеру Fc-домена, Fc-домену, Fc-связывающему пептиду, белку альбумину или белок альбумин-связывающему пептиду. В некоторых вариантах осуществления, когда n равно 1, один или несколько (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10) димеров ингибиторов нейраминидазы могут быть присоединены к мономеру Fc-домена, Fc-домену, Fc-связывающему пептиду, белку альбумину или белок альбумин-связывающему пептиду. В некоторых вариантах осуществления, когда n равно 2, один или несколько (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20) димеров ингибиторов нейраминидазы могут быть присоединены к Fc-домену. Волнистая линия в описанных в настоящем документе конъюгатах не должна рассматриваться как одинарная связь между одним или несколькими димерами ингибиторов нейраминидазы и атомом в Fc-домене или белке альбумине. В некоторых вариантах осуществления, когда Т равно 1, один димер ингибиторов нейраминидазы может быть присоединен к атому в мономере Fc-домена, Fc-домене, Fc-связывающем пептиде, белке альбумине или белок альбумин-связывающем пептиде. В некоторых вариантах осуществления, когда Т равно 2, два димера ингибиторов нейраминидазы могут быть присоединены к атому в мономере Fc-домена, Fc-домене, Fc-связывающем пептиде, белке альбумине или белок альбумин-связывающем пептиде.
Как описано далее, линкер в описанном в настоящем документе конъюгате (например, L или L') может представлять собой разветвленную структуру. Как описано далее в настоящем документе, линкер в конъюгате, описанном в настоящем документе (например, L или L') может представлять собой поливалентную структуру, например, двухвалентную или трехвалентную структуру, имеющую две или три группы, соответственно. В некоторых вариантах осуществления, когда линкер имеет три группы, два группы могут быть присоединены к первому и второму ингибиторам нейраминидазы, а третья группа может быть присоединена к мономеру Fc-домена, Fc-домену, Fc-связывающему пептиду, белку альбумину или белок альбумин-связывающему пептиду.
В конъюгатах, имеющих Fc-домен, ковалентно связанный с одним или несколькими димерами ингибиторов нейраминидазы, как представлено формулами выше, когда n равно 2, два мономера Fc-домена (каждый мономер Fc-домена представлен буквой Е) димеризуются с образованием Fc-домена.
Конъюгаты мономеров ингибиторов нейраминидазы, связанных с Fc-доменом или белком альбумином
В некоторых вариантах осуществления конъюгаты, описанные в настоящем документе, включают мономер Fc-домена, Fc-домен, Fc-связывающий пептид, белок альбумин или белок альбумин-связывающий пептид, ковалентно связанный с одним или несколькими мономерами ингибиторов нейраминидазы. Конъюгаты мономера Fc-домена или белка альбумина и одного или нескольких мономеров ингибиторов нейраминидазы могут быть образованы путем связывания Fc-домена или белка альбумина с каждым из мономеров ингибиторов нейраминидазы через линкер, такой как любой из линкеров, описанных в настоящем документе.
В конъюгатах, содержащих Fc-домен или белок альбумин, ковалентно связанный с одним или несколькими мономерами ингибиторов нейраминидазы, описанными в настоящем документе, волнистая линия, соединенная с Е, указывает, что один или несколько (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20) мономеров ингибиторов нейраминидазы могут быть присоединены к мономеру Fc-домена, Fc-домену, Fc-связывающему пептиду, белку альбумину или белок альбумин-связывающему пептиду. В некоторых вариантах осуществления, когда n равно 1, один или несколько (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10) мономеров ингибиторов нейраминидазы могут быть присоединены к мономеру Fc-домена или белку-альбумину. В некоторых вариантах осуществления, когда n равно 2, один или несколько (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20) мономеров ингибиторов нейраминидазы могут быть присоединены к Fc-домену. Волнистая линия в конъюгатах, описанных в настоящем документе, не должна рассматриваться как одинарная связь между одним или несколькими мономерами ингибиторов нейраминидазы и атомом в мономере Fc-домена, Fc-домене, Fc-связывающем пептиде, белке альбумине или белок альбумин-связывающем пептиде. В некоторых вариантах осуществления, когда Т равно 1, один мономер ингибитора нейраминидазы может быть присоединен к атому в мономере Fc-домена, Fc-домене, Fc-связывающем пептиде, белке альбумине или белок альбумин-связывающем пептиде. В некоторых вариантах осуществления, когда Т равно 2, два мономера ингибиторов нейраминидазы могут быть присоединены к атому в мономере Fc-домена, Fc-домене, Fc-связывающем пептиде, белке альбумине или белок альбумин-связывающем пептиде.
В некоторых вариантах осуществления, когда Т больше 1 (например, Т равно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20), каждый A1-L может быть независимо выбран (например, независимо выбран из любой из структур A1-L, описанных в настоящем документе). В некоторых вариантах осуществления Е может быть конъюгирован с 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более различными фрагментами A1-L. В некоторых вариантах осуществления Е конъюгирован с первым фрагментом A1-L и вторым фрагментом A1-L. В некоторых вариантах осуществления A1 первого фрагмента A1-L выбран из любой из формул (A-III)-(A-V):
и A1 второго фрагмента A1-L выбран из любой из формул (A-I), (А-II), (A-VI), (А-VII), (А-VIII) или (A-IX):
В некоторых вариантах осуществления первый фрагмент A1-L конъюгирован специфически с остатками лизина в Е (например, атомами азота, экспонированных на поверхности остатков лизина в Е), и второй фрагмент A1-L специфически конъюгирован с экспонированными на поверхности остатками цистеина Е (например, атомы серы экспонированных на поверхности остатков цистеина Е). В некоторых вариантах осуществления первый фрагмент A1-L специфически конъюгирован с остатками цистеина в Е (например, атомами серы экспонированных на поверхности остатков цистеина в Е), и второй фрагмент A1-L специфически конъюгирован с остатками лизина в Е (например, атомами азота экспонированных на поверхности остатков лизина в Е).
Как описано далее в настоящем документе, линкер в конъюгате, имеющем мономер Fc-домена, Fc-домен, Fc-связывающий пептид, белок альбумин или белок альбумин-связывающий пептид, ковалентно связанный с одним или несколькими мономерами ингибиторов нейраминидазы, описанных в настоящем документе (например, L или L') может представлять собой двухвалентную структуру, имеющую две группы. Одна группа двухвалентном линкере может быть присоединена к мономеру ингибитора нейраминидазы, а другая группа может быть присоединена к мономеру Fc-домена, Fc-домену, Fc-связывающему пептиду, белку альбумину или белок альбумин-связывающему пептиду.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат, содержащий мономер Fc-домена, Fc-домен, Fc-связывающий пептид, белок альбумин или белок альбумин-связывающий пептид, ковалентно связанный с одним или несколькими мономерами ингибиторов нейраминидазы, представленных в настоящем документе, описывается любой из следующих формул:
или его фармацевтически приемлемая соль.
В конъюгатах, имеющих Fc-домен, ковалентно связанный с одним или несколькими мономерами ингибиторов нейраминидазы, как представлено формулами выше, когда n равно 2, два мономера Fc-домена (каждый мономер Fc-домена представлен буквой Е) димеризуются с образованием Fc-домена.
Региоизомеры конъюгатов, включая занамивир или его аналоги
Конъюгаты (например, конъюгаты мономеров или димеров, как подробно описано в настоящем документе) могут быть получены в виде смеси или региоизомеров. Конкретный региоизомер или смесь региоизомеров могут быть предпочтительными по причинам, таким как простота синтеза, термическая стабильность, окислительная стабильность, фармакокинетика (например, метаболическая стабильность или биодоступность), связывание эффектора или терапевтическая эффективность.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат по изобретению включает занамивир или его аналог (например, любой из (AI), (А-II), (А-VI), (А-VII), (A-VIII), (А-IX) или (АХ)). Занамивир или его аналог может быть конъюгирован с Fc-доменом или белком альбумином (например, посредством линкера), например, через положение С7 (см., например, (AI), (А-II) или (АХ)) или через положение С9 (см., например, (А-VI) или (А-VII)):
Настоящее раскрытие включает группу мономерных конъюгатов (например, группу конъюгатов формулы (M-I)), где группа конъюгатов включает любой из мономерных конъюгатов, описанных в настоящем документе, и один или несколько его соответствующих региоизомеров. Например, группа конъюгатов может включать (1) занамивир или его аналог, конъюгированный (например, посредством линкера) в положении С7 с Fc-доменом или белком альбумином, и (2) занамивир или его аналог, конъюгированный (например, посредством линкера) в положении С9 с Fc-доменом или белком-альбумином.
Популяция мономерных конъюгатов может иметь определенное соотношение С7-соединенного конъюгата к С9-соединенному конъюгату. Например, группа конъюгатов может содержать по существу 100% С-7-соединенного конъюгата и по существу 0% С-9-соединенного конъюгата. Популяция конъюгатов может содержать около 95% С-7-соединенного конъюгата и около 5% С-9-соединенного конъюгата. Популяция конъюгатов может содержать около 90% С-7-соединенного конъюгата и около 10% С-9-соединенного конъюгата. Популяция конъюгатов может содержать около 85% С-7-соединенного конъюгата и около 15% С-9-соединенного конъюгата. Популяция конъюгатов может содержать около 80% С-7-соединенного конъюгата и около 20% С-9-соединенного конъюгата. Популяция конъюгатов может содержать около 75% С-7-соединенного конъюгата и около 25% С-9-соединенного конъюгата. Популяция конъюгатов может содержать около 70% С-7-соединенного конъюгата и около 30% С-9-соединенного конъюгата. Популяция конъюгатов может содержать около 65% С-7-соединенного конъюгата и около 35% С-9-соединенного конъюгата. Популяция конъюгатов может содержать около 60% С-7-соединенного конъюгата и около 40% С-9-соединенного конъюгата. Популяция конъюгатов может содержать около 55% С-7-соединенного конъюгата и около 45% С-9-соединенного конъюгата. Популяция конъюгатов может содержать около 50% С-7-соединенного конъюгата и около 50% С-9-соединенного конъюгата. Популяция конъюгатов может содержать около 45% С-7-соединенного конъюгата и около 55% С-9-соединенного конъюгата. Популяция конъюгатов может содержать около 40% С-7-соединенного конъюгата и около 60% С-9-соединенного конъюгата. Популяция конъюгатов может содержать около 35% С-7-соединенного конъюгата и около 65% С-9-соединенного конъюгата. Популяция конъюгатов может содержать около 30% С-7-соединенного конъюгата и около 70% С-9-соединенного конъюгата. Популяция конъюгатов может содержать около 25% С-7-соединенного конъюгата и около 75% С-9-соединенного конъюгата. Популяция конъюгатов может содержать около 20% С-7-соединенного конъюгата и около 80% С-9-соединенного конъюгата. Популяция конъюгатов может содержать около 15% С-7-соединенного конъюгата и около 85% С-9-соединенного конъюгата. Популяция конъюгатов может содержать около 10% С-7-соединенного конъюгата и около 90% С-9-соединенного конъюгата. Популяция конъюгатов может содержать по существу 0% С-7-соединенного конъюгата и по существу 100% C-9-соединенного конъюгата.
Популяция конъюгатов может содержать более 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 60%, 65%, 60%, 55%, или 50% С7-соединенного конъюгата.
Популяция конъюгатов может содержать менее 50%, 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2% или 1% С9-соединенного конъюгата.
Настоящее раскрытие также включает популяцию группу димерных конъюгатов (например, популяцию группу конъюгатов формулы (D-I)), где популяция группа конъюгатов включает любой из димерных конъюгатов, описанных в настоящем документе, и один или несколько его соответствующих региоизомеров. Например, популяция группа конъюгатов может включать (1) димер С7-С7 (например, фрагменты лимера занамивира или его аналога конъюгированы (например, посредством линкера) в их соответствующих положениях С7 с Fc-доменом или белком альбумином), (2) димер С9-С9 (например, фрагменты димера занамивира или его аналога конъюгированы (например, посредством линкера) в их соответствующих положениях С9 с Fc-доменом или белком альбумином), и/или (3) димер С7-С7 (например, один фрагмент занамивира или его аналога конъюгирован (например, посредством линкера) с Fc-доменом или белком альбумином через его положение С7, а другой фрагмент занамивира или его аналога конъюгирован (например, посредством линкера) с Fc-доменом или белком альбумином через его положение С9).
Популяция димерных конъюгатов может иметь определенное соотношение С7-С7-соединенного конъюгата к С7-С9-соединенному конъюгату и С9-С9-соединенному конъюгату. Например, популяция группа конъюгатов может содержать по существу 100% С7-С7-соединенного конъюгата и по существу 0% С7-С9- или С9-С9-соединенного конъюгата. Популяция конъюгатов может содержать по существу 100% С9-С9-соединенного конъюгата и по существу 0% С7-С7- или С7-С9-соединенного конъюгата. Популяция конъюгатов может содержать по существу 100% С7-С9-соединенного конъюгата и по существу 0% С7-С7- или С9-С9-соединенного конъюгата.
Популяция конъюгатов может содержать более 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 60%, 65%, 60%, 55%, или 50% С7-С7-соединенного конъюгата.
Популяция конъюгатов может содержать менее 50%, 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2% или 1% С9-С9-соединенного конъюгата.
Популяция конъюгатов может содержать менее 50%, 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2% или 1% С7-С9-соединенного конъюгата.
Для любой из описанных выше популяций групп региоизомеров A1 и/или А2 (например, (MI) или (DI)) могут быть выбраны из занамивира или любого из аналогов занамивира, описанных в настоящем документе (например, любого из (AI), (А-II), (А-VI), (A-VII), (A-VIII), (A-IX) или (A-X)). В частности, С7-соединенный занамивир или его аналоги описываются (AI), (А-II) и (А-Х), и С9-соединенный занамивир или его аналоги описываются (А-VI) или (А-VII). Типичные способы получения региоизомеров, например, региоизомеров, соединенных через С7, С9, С7-С7, С7-С9 и С9-С9, описаны в примерах 100-103, 123 и 124. В некоторых случаях может быть предпочтительно иметь 95% или более, 96% или более, 97% или более, 98% или более, 99% или более, или по существу 100% С7-соединенных мономерных конъюгатов или С7-С7-соединенных димерных конъюгатов. В этих случаях может быть предпочтительно получить промежуточное соединение с помощью способа, в котором образуются по существу С7-соединенные мономерные или С7-С7-соединенные промежуточные димерные соединения, такого как способы, описанные, например, в примерах 103 и 123. Способ в примере 103 служит в качестве иллюстрации способов, используемых в первую очередь для получения С7- или С7-С7-соединенного промежуточного соединения и может быть использован для получения любого промежуточного соединения, описанного в настоящем документе.
В предпочтительных вариантах осуществления конъюгат представляет собой конъюгат по любой из формул (D-I)-(D-X), (D'-I), (M-I)-(M-X) или (M'-I), где A1 и/или А2 описываются формулой (A-I), (А-II) или (А-Х), и Y представляет собой 
где R7 выбран из Н, (С1-С20)алкила, (С3-С20)циклоалкила, (С3-С20)гетероциклоалкила; (С5-С15)арила и (С2-С15)гетероарила. В предпочтительных вариантах осуществления A1 и/или А2 описываются формулой (A-I) (например, занамивир). В предпочтительных вариантах осуществления R7 представляет собой (C1-С20)алкил (например, -СН3, -СН2СН3, -СН2СН2СН3). Было показано, что такие конъюгаты демонстрируют повышенную стабильность С7-соединения, что приводит к меньшей миграции от С7 к С9. Поэтому ожидается, что полученный продукт будет более гомогенным и продемонстрирует повышенную эффективность.
III. Мономеры Fc-домена и Fc-домены
Мономер Fc-домена включает шарнирный домен, константный домен CH2 антитела и константный домен CH3 антитела. Мономер Fc-домена может представлять собой иммуноглобулиновое антитело изотипа IgG, IgE, IgM, IgA или IgD. Мономер Fc-домена также может быть любого изотипа иммуноглобулинового антитела (например, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3 или IgG4). Мономером Fc-домена может быть любой аллотип иммуноглобулинового антитела (например, IGHG1*01 (т.е. G1m(za)), IGHG1*07 (т.е. G1m(zax)), IGHG1*04 (т.е. G1m(zav)), IGHG1*03 (G1m(f)), IGHG1*08 (т.е. G1m(fa)), IGHG2*01, IGHG2*06, IGHG2*02, IGHG3*01, IGHG3*05, IGHG3*10, IGHG3*04, IGHG3*09, IGHG3*11, IGHG3*12, IGHG3*06, IGHG3*07, IGHG3*08, IGHG3*13, IGHG3*03, IGHG3*14, IGHG3*15, IGHG3*16, IGHG3*17, IGHG3*18, IGHG3*19, IGHG2*04, IGHG4*01, IGHG4*03 или IGHG4*02) (как описано, например, в Vidarsson et al. IgG subclasses and allotypes: from structure to effector function. Frontiers in Immunology. 5(520):1-17 (2014)). Мономер Fc-домена также может быть любого вида, например, человеческим, крысиным или мышиным. Димер мономеров Fc-домена представляет собой Fc-домен, который может связываться с Fc-рецептором, который представляет собой рецептор, расположенный на поверхности лейкоцитов.
В некоторых вариантах осуществления мономер Fc-домена в описанных внастоящем документе конъюгатах может содержать одну или несколько аминокислотных замен, добавлений и/или делеций по отношению к мономеру Fc-домена, имеющему последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 1-68. В некоторых вариантах осуществления Asn в мономере Fc-домена в конъюгатах, как описано в настоящем документе, может быть заменен на Ala, чтобы предотвратить N-связанное гликозилирование (см., например, SEQ ID NO: 12-15, где замена Asn на Ala помечена *). В некоторых вариантах осуществления мономер Fc-домена в конъюгатах, описанных в настоящем документе, также может содержать дополнительные добавления Cys (см., например, SEQ ID NO: 9, 10 и 11, где добавления Cys помечены *).
В некоторых вариантах осуществления мономер Fc-домена в конъюгатах, как описано в настоящем документе, включает дополнительный фрагмент, например, альбумин-связывающий пептид, очищающий пептид (например, гексагистидиновый пептид (НННННН (SEQ ID NO: 72)) или сигнальную последовательность (например, сигнальную последовательность IL2 MYRMQLLSCIALSLALVTNS (SEQ ID NO: 73)), присоединенную к N- или С-концу мономера Fc-домена. В некоторых вариантах осуществления мономер Fc-домена в конъюгате не содержит какой-либо тип вариабельной области антитела, например, VH, VL, определяющую комплементарность область (CDR) или гипервариабельную область (HVR).
В некоторых вариантах осуществления мономер Fc-домена в конъюгатах, как описано в настоящем документе, может иметь последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична (например, на 97%, 99% или 99,5% идентична) последовательности любой из SEQ ID NO: 1-68, показанных ниже. В некоторых вариантах осуществления мономер Fc-домена в конъюгатах, как описано в настоящем документе, может иметь последовательность любой из SEQ ID NO: 1-68, показанных ниже.
SEQ ID NO: 1: мышиный Fc-IgG2a с сигнальной последовательностью IL2 на N-конце (жирный шрифт)
SEQ ID NO: 2: зрелый мышиный Fc-IgG2a
SEQ ID NO: 3: Fc-IgG1 человека с сигнальной последовательностью IL2 на N-конце (жирный шрифт) и добавленными N-концевыми аминокислотными остатками MVRS (подчеркнуты).
SEQ ID NO: 4: зрелый человеческий Fc-IgG1 с добавленными N-концевыми аминокислотными остатками MVRS (подчеркнуты)
SEQ ID NO: 5: мышиный Fc-IgG2a с сигнальной последовательностью IL2 (жирный шрифт) на N-конце и гексагистидиновым пептидом (выделен курсивом) на С-конце
SEQ ID NO: 6: зрелый мышиный Fc-IgG2a с гексагистидиновым пептидом (выделен курсивом) на С-конце
SEQ ID NO: 7: Fc-IgG1 человека с сигнальной последовательностью IL2 (жирный шрифт) на N-конце, добавленными N-концевыми аминокислотными остатками MVRS (подчеркнуты) и гексагистидиновым пептидом (выделен курсивом) на С-конце
SEQ ID NO: 8: зрелый человеческий Fc-IgG1 с гексагистидиновым пептидом (выделен курсивом) на С-конце и добавленными N-концевыми аминокислотными остатками MVRS (подчеркнуты)
SEQ ID NO: 9: человеческий Fc-IgG1 с сигнальной последовательностью IL2 (жирный шрифт) на N-конце, добавленные N-концевые аминокислотные остатки MVRS (подчеркнуты), два дополнительных цистеина в шарнирной области (*) и гексагистидиновый пептид (выделен курсивом) на С-конце
SEQ ID NO: 10: зрелый человеческий Fc-IgG1 с добавленными N-концевыми аминокислотными остатками MVRS (подчеркнуты), двумя дополнительными цистеинами в шарнирной области (*) и гексагистидиновым пептидом (выделен курсивом) на С-конце
SEQ ID NO: 11: зрелый человеческий Fc-IgG1 с добавленными N-концевыми аминокислотными остатками MVRS (подчеркнуты) и двумя дополнительными цистеинами в шарнирной области (*)
SEQ ID NO: 12: мышиный Fc-IgG2a с сигнальной последовательностью IL2 (жирный шрифт) на N-конце, заменой Asn на Ala (*) и гексагистидиновым пептидом (выделен курсивом) на С-конце
SEQ ID NO: 13: зрелый мышиный Fc-IgG2a с заменой Asn на Ala (*) и гексагистидиновым пептидом (выделен курсивом) на С-конце
SEQ ID NO: 14: человеческий Fc-IgG1 с сигнальной последовательностью IL2 (жирный шрифт) на N-конце, добавленными N-концевыми аминокислотными остатками MVRS (подчеркнуты), заменой Asn на Ala (*) и гексагистидиновым пептидом (выделено курсивом) на С-конце
SEQ ID NO: 15: зрелый человеческий Fc-IgG1 с заменой Asn на Ala (*), добавленными N-концевыми аминокислотными остатками MVRS (подчеркнуты) и гексагистидиновым пептидом (выделен курсивом) на С-конце
SEQ ID NO: 16: Fc человеческого IgG1 с сигнальной последовательностью человеческого сывороточного альбумина (жирный шрифт) на N-конце и добавленными N-концевыми аминокислотными остатками ISAMVRS (подчеркнуты)
SEQ ID NO: 17: Fc человеческого IgG1 с сигнальной последовательностью человеческого сывороточного альбумина (жирный шрифт) на N-конце, добавленными N-концевыми аминокислотными остатками ISAMVRS (подчеркнуты), С-концевым линкером G4S (выделено курсивом) и С-концевой меткой с-Мус (подчеркнуто, выделено курсивом)
SEQ ID NO: 18: Fc зрелого человеческого IgG1 с добавленными N-концевыми аминокислотными остатками ISAMVRS (подчеркнуто), С-концевым линкером G4S (выделено курсивом) и С-концевой меткой с-Мус (подчеркнуто, выделено курсивом)
SEQ ID NO: 19: Fc человеческого IgG1 с сигнальной последовательностью человеческого сывороточного альбумина (жирный шрифт), добавленными N-концевыми аминокислотными остатками ISAMVRS (подчеркнуто) и модификацией лизина на серин (*) для предотвращения конъюгации лизина в этом участке
SEQ ID NO: 20: Fc зрелого человеческого IgG1 с добавленными N-концевыми аминокислотными остатками ISAMVRS (подчеркнуто) и модификацией лизина на серин (*) для предотвращения конъюгации лизина в этом участке
SEQ ID NO: 21: Fc человеческого IgG1 с сигнальной последовательностью человеческого сывороточного альбумина (жирный шрифт) на N-конце, добавленными N-концевыми аминокислотными остатками ISAMVRS (подчеркнуто), модификацией лизина на серин (*) для предотвращения конъюгации лизина в этом участке, С-концевой линкер G4S (выделено курсивом) и С-концевая метка С-Мус (подчеркнуто, выделено курсивом)
SEQ ID NO: 22: Fc зрелого человеческого IgG1 с добавленными N-концевыми аминокислотными остатками ISAMVRS (подчеркнуто), модификацией лизина на серин (*) для предотвращения конъюгации лизина в этом участке, С-концевым линкером G4S (выделено курсивом) и С-концевой меткой С-Мус (подчеркнуто, выделено курсивом)
SEQ ID NO: 23: Fc человеческого IgG1 с сигнальной последовательностью человеческого сывороточного альбумина (жирный шрифт) на N-конце, добавленными N-концевыми аминокислотными остатками ISAMVRS (подчеркнуто), заменой Asn на Ala (*), С-концевым линкером G4S (выделено курсивом) и С-концевой меткой С-myc (подчеркнуто, выделено курсивом)
SEQ ID NO: 24: Fc зрелого человеческого IgG1 с добавленными N-концевыми аминокислотными остатками ISAMVRS (подчеркнуто), заменой Asn на Ala (*), С-концевым линкером G4S (выделено курсивом) и С-концевой меткой С-myc (подчеркнуто, выделено курсивом)
SEQ ID NO: 25: Fc человеческого IgG1 с сигнальной последовательностью человеческого сывороточного альбумина (жирный шрифт) на N-конце, добавленными N-концевыми аминокислотными остатками ISAMVRS (подчеркнуто), мутациями Н310А (*) и Н435А (*), препятствующими связыванию FcRn, С-концевой G4S (выделено курсивом) и С-концевой меткой С-myc (подчеркнуто, выделено курсивом)
SEQ ID NO: 26: Fc зрелого человеческого IgG1 с сигнальной последовательностью человеческого сывороточного альбумина (жирный шрифт) на N-конце, добавленными N-концевыми аминокислотными остатками ISAMVRS (подчеркнуто), с мутациями Н310А (*) и Н435А (*), препятствующими связыванию FcRn, С-концевой G4S (выделено курсивом) и С-концевой меткой С-myc (подчеркнуто, выделено курсивом)
SEQ ID NO: 27: Fc человеческого IgG1 с сигнальной последовательностью человеческого сывороточного альбумина (жирный шрифт) на N-конце, добавленными N-концевыми аминокислотными остатками ISAMVRS (подчеркнуто), С-концевым линкером G4S (выделено курсивом) и мутированной на С-конце (лизин на фенилаланина, жирный шрифт) меткой С-myc (подчеркнуто, выделено курсивом)
SEQ ID NO: 28: Fc зрелого человеческого IgG1 с добавленными N-концевыми аминокислотными остатками ISAMVRS (подчеркнуто), С-концевым линкером G4S (выделено курсивом) и С-концевой мутированной (лизин на фенилаланин, жирный шрифт) меткой С-myc (подчеркнуто, выделено курсивом)
SEQ ID NO: 29: Fc человеческого IgG1 с сигнальной последовательностью человеческого сывороточного альбумина (жирный шрифт) на N-конце, добавленными N-концевыми аминокислотными остатками ISAMVRS (подчеркнуто), заменой Asn на Ala (*), С-концевым линкером G4S (курсивом) и С-концевой мутированной (лизин на фенилаланин, жирный шрифт) меткой С-myc (подчеркнуто, выделено курсивом)
SEQ ID NO: 30: Fc зрелого человеческого IgG1 с добавленными N-концевыми аминокислотными остатками MVRS (подчеркнуто), заменой Asn на Ala (*), С-концевым линкером G4S (выделено курсивом) и С-концевой мутированной (лизин на фенилаланин, жирный шрифт) меткой С-myc (подчеркнуто, выделено курсивом)
SEQ ID NO: 31: Fc человеческого IgG1 с сигнальной последовательностью человеческого сывороточного альбумина (жирный шрифт) на N-конце, аллотипом G1m(fa) (жирный курсив), С-концевым линкером G4S (выделено курсивом) и С-концевой мутированной (лизин на фенилаланина, жирный шрифт) меткой С-myc (подчеркнуто)
SEQ ID NO: 32: Fc человеческого IgG1 с сигнальной последовательностью человеческого сывороточного альбумина (жирный шрифт) на N-конце, аллотип G1m(fa) (жирный курсив)
SEQ ID NO: 33: Fc зрелого человеческого IgG1 с тройной мутацией YTE (жирный шрифт и подчеркивание) с добавленными N-концевыми аминокислотными остатками MVRS (подчеркнуто)
SEQ ID NO: 34: Fc человеческого IgG1 с сигнальной последовательностью человеческого сывороточного альбумина (жирный шрифт) на N-конце, содержит остатки EPKSS, содержащие полную шарнирную область на N-конце Fc зрелого человеческого IgG1 (подчеркнуто), замену Cys на Ser (#), аллотип G1m(fa) (жирный курсив)
SEQ ID NO: 35: Fc человеческого IgG1 с сигнальной последовательностью мышиного IgG (жирный шрифт) на N-конце, с удалением шарнирных остатков EPKSSD с N-конца зрелого человеческого IgG1 Fc, аллотипом G1m(fa) (жирный курсив)
SEQ ID NO: 36: зрелый человеческий Fc IgG1 с тройной мутацией YTE (жирный шрифт и подчеркивание), с удалением шарнирных остатков EPKSSD с N-конца зрелого человеческого IgG1 Fc, аллотип G1m(fa) (жирный курсив)
SEQ ID NO: 37: Fc зрелого человеческого IgG1 с двойной мутацией LS (жирный шрифт и подчеркивание), с удалением шарнирных остатков EPKSSD с N-конца Fc зрелого человеческого IgG1, аллотипом G1m(fa) (жирный курсив)
SEQ ID NO: 38: Fc зрелого человеческого IgG1 с сигнальной последовательностью человеческого сывороточного альбумина (жирный шрифт) на N-конце, тройной мутацией YTE (жирный шрифт и подчеркивание), аллотипом G1m(fa) (жирный курсив), С-концевым линкером G4S (курсив) и С-концевой меткой С-myc (подчеркнуто)
SEQ ID NO: 39: Fc зрелого человеческого IgG1, где X1 представляет собой Met или Trp, X2 представляет собой Ser или Thr, Х3 представляет собой Thr или Glu, Х4 представляет собой Asp или Glu, и Х5 представляет собой Leu или Met, Х6 представляет собой Met или Leu, и Х7 представляет собой Asn или Ser
SEQ ID NO: 40: Fc зрелого человеческого IgG1, где X4 представляет собой Asp или Glu, и Х5 представляет собой Leu или Met
SEQ ID NO: 41: Fc зрелого человеческого IgG1 с тройной мутацией YTE (жирный шрифт и подчеркивание), где Х4 представляет собой Asp или Glu, и Х5 представляет собой Leu или Met
SEQ ID NO: 42: Fc зрелого человеческого IgG1 с тройной мутацией YTE (жирный шрифт и подчеркивание), аллотипом G1m(fa) (жирный курсив)
SEQ ID NO: 43: Fc зрелого человеческого IgG1 с тройной мутацией YTE (жирный шрифт и подчеркивание), аллотипом G1m(f) (жирный курсив)
SEQ ID NO: 44: Fc зрелого человеческого IgG1 с двойной мутацией LS (жирный шрифт и подчеркивание), где Х4 представляет собой Asp или Glu, и Х5 представляет собой Leu или Met
SEQ ID NO: 45: Fc зрелого человеческого IgG1 с двойной мутацией LS (жирный шрифт и подчеркивание), аллотипом G1m(fa) (жирный курсив)
SEQ ID NO: 46: Fc зрелого человеческого IgG1 с двойной мутацией LS (жирный шрифт и подчеркивание), аллотипом G1m(f) (жирный курсив)
SEQ ID NO: 47: Fc зрелого человеческого IgG1 с сигнальной последовательностью MIgG Vh тяжелой цепи мыши (жирный шрифт), заменой Cys на Ser (#), и где X1 представляет собой Met или Trp, Х2 представляет собой Ser или Thr, Х3 представляет собой Thr или Glu, Х4 представляет собой Asp или Glu, и Х5 представляет собой Leu или Met, Х6 представляет собой Met или Leu, и Х7 представляет собой Asn или Ser
SEQ ID NO: 48: Fc зрелого человеческого IgG1 с сигнальной последовательностью MIgG Vh тяжелой цепи мыши (жирный шрифт), заменой Cys на Ser (#), аллотипом G1m(fa) (жирный курсив)
SEQ ID NO: 49: Fc зрелого человеческого IgG1 с сигнальной последовательностью MIgG Vh тяжелой цепи мыши (жирный шрифт), заменой Cys на Ser (#), аллотипом G1m (f) (жирный курсив)
SEQ ID NO: 50: Fc зрелого человеческого IgG1 с сигнальной последовательностью MIgG Vh тяжелой цепи мыши (жирный шрифт), заменой Cys на Ser (#), мутациями M428L, N434S (жирный шрифт/подчеркивание), аллотипом G1m(fa) (жирный курсив)
SEQ ID NO: 51: Fc зрелого человеческого IgG1 с сигнальной последовательностью MIgG Vh тяжелой цепи мыши (жирный шрифт), заменой Cys на Ser (#), мутациями M428L, N434S (жирный шрифт/подчеркивание), аллотипом G1m(f) (жирный курсив)
SEQ ID NO: 52: Fc зрелого человеческого IgG1 с сигнальной последовательностью MIgG Vh тяжелой цепи мыши (жирный шрифт), заменой Cys на Ser (#), тройной мутацией YTE (жирный шрифт и подчеркивание), аллотипом G1m(fa) (жирный курсив)
SEQ ID NO: 53: Fc зрелого человеческого IgG1 с сигнальной последовательностью MIgG Vh тяжелой цепи мыши (жирный шрифт), заменой Cys на Ser (#), тройной мутацией YTE (жирный шрифт и подчеркивание), аллотипом G1m(f) (жирный курсив)
SEQ ID NO: 54: Fc зрелого человеческого IgG1 с сигнальной последовательностью MIgG Vh тяжелой цепи мыши (жирным шрифтом), добавленными N-концевыми аминокислотными остатками ISAMVRS (выделено курсивом), мутациями M428L, N434S (жирный шрифт / подчеркивание), линкером G4S (выделено курсивом) и С-концевой меткой С-myc (подчеркнуто), аллотипом G1m(f) (жирный курсив)
SEQ ID NO: 55: Fc зрелого человеческого IgG1 с сигнальной последовательностью MIgG Vh тяжелой цепи мыши (жирный шрифт), добавленными N-концевыми аминокислотными остатками ISAMVRS (выделено курсивом), мутациями M428L, N434S (жирный шрифт/подчеркивание), линкером G4S (выделено курсивом), С-концевой меткой С-myc (подчеркнуто), аллотипом G1m(fa) (жирный курсив)
SEQ ID NO: 56: Fc зрелого человеческого IgG1 с сигнальной последовательностью MIgG Vh тяжелой цепи мыши (жирный шрифт), добавленными N-концевыми аминокислотными остатками ISAMVRS (выделено курсивом), тройным мутантом YTE (жирный шрифт/подчеркивание), линкером G4S (выделено курсивом) и С-концевой меткой С-myc (подчеркнуто), аллотипом G1m(f) (жирный курсив)
SEQ ID NO: 57: Fc зрелого человеческого IgG1 с сигнальной последовательностью MIgG Vh тяжелой цепи мыши (жирный шрифт), добавленными N-концевыми аминокислотными остатками ISAMVRS (выделено курсивом), тройным мутантом YTE (жирный шрифт/подчеркивание), линкером G4S (выделено курсивом), С-концевой меткой С-myc (подчеркнуто), аллотипом G1m(fa) (жирный курсив)
SEQ ID NO: 58: зрелый человеческий IgG1 с сигнальной последовательностью мышиной тяжелой цепи MIgG1 (жирный шрифт), заменой Cys на Ser (#), С-концевым G4S (выделено курсивом) и С-концевым пептидом IgA (подчеркнуто), аллотипом G1m(fa) (жирный курсив)
SEQ ID NO: 59: зрелый человеческий IgG1 с сигнальной последовательностью мышиной тяжелой цепи MIgGI (жирный шрифт), заменой Cys на Ser (#), мутациями M428L, N434S (жирный шрифт/подчеркивание), С-концевым G4S (курсив) и С-концевым пептидом IgA (подчеркивание), аллотипом G1m(fa) (жирный курсив)
SEQ ID NO: 60: Fc зрелого человеческого IgG1, Z1 представляет собой Cys или Ser, и где X1 представляет собой Met или Trp, Х2 представляет собой Ser или Thr, Х3 представляет собой Thr или Glu, Х4 представляет собой Asp или Glu, и Х5 представляет собой Leu или Met, Х6 представляет собой Met или Leu, и Х7 представляет собой Asn или
SEQ ID NO: 61: Fc зрелого человеческого IgG1, замена Cys на Ser (#), и где X1 представляет собой Met или Trp, Х2 представляет собой Ser или Thr, Х3 представляет собой Thr или Glu, Х4 представляет собой Asp или Glu, и Х5 представляет собой Leu или Met, Х6 представляет собой Met или Leu, и Х7 представляет собой Asn или Ser
SEQ ID NO: 62: Fc зрелого человеческого IgG1, замена Cys на Ser (#), X4 представляет собой Asp или Glu, и Х5 представляет собой Leu или Met
SEQ ID NO: 63: Fc зрелого человеческого IgG1, замена Cys на Ser (#), аллотип G1m(f) (жирный курсив)
SEQ ID NO: 64: Fc зрелого человеческого IgG1, замена Cys на Ser (#), аллотип G1m(fa) (жирный курсив)
SEQ ID NO: 65: Fc зрелого человеческого IgG1, замена Cys на Ser (#), мутации M428L, N434S (жирный шрифт/подчеркивание), аллотип G1m(fa) (жирный курсив)
SEQ ID NO: 66: Fc зрелого человеческого IgG1, замена Cys на Ser (#), мутации M428L, N434S (жирный шрифт/подчеркивание), аллотип G1m(f) (жирный курсив)
SEQ ID NO: 67: Fc зрелого человеческого IgG1, замена Cys на Ser (#), тройная мутация YTE (жирный шрифт и подчеркивание), аллотип G1m(fa) (жирный курсив)
SEQ ID NO: 68: Fc зрелого человеческого IgG1, замена Cys на Ser (#), тройная мутация YTE (жирный шрифт и подчеркивание), аллотип G1m(f) (жирный курсив)
Как определено в настоящем документе, Fc-домен включает два мономера Fc-домена, которые димеризуются за счет взаимодействия между константными доменами CH3 антитела, а также одну или несколько дисульфидных связей, которые образуются между шарнирными доменами двух димеризующихся мономеров Fc-домена. Домен Fc образует минимальную структуру, которая связывается с Fc-рецептором, например, Fc-гамма рецепторами (т.е. Fcγ-рецепторами (FcγR)), Fc-альфа рецепторами (т.е. Fcα-рецепторами (FcαR)), Fc-эпсилон рецепторами (т.е. Fcε-рецепторами (FcεR)) и/или неонатальным Fc-рецептором (FcRn). В некоторых вариантах осуществления Fc-домен по настоящему изобретению связывается с Fcγ-рецептором (например, FcRn, FcγRI (CD64), FcγRIIa (CD32), FcγRIIb (CD32), FcγRIIIa (CD16a), FcγRIIIb (CD16b)) и/или FcγRIV, и/или неонатальным Fc-рецептором (FcRn).
В некоторых вариантах осуществления мономер Fc-домена или Fc-домен по настоящему изобретению представляет собой агликозилированный мономер Fc-домена или Fc-домен (например, мономер Fc-домена или Fc-домен, который поддерживает взаимодействие с Fc-рецептором (например, FcRn). Например, Fc-домен представляет собой агликозилированный вариант IgG1, который поддерживает взаимодействие с Fc-рецептором (например, IgG1, имеющий аминокислотную замену в N297 и/или Т299 мотива гликозилирования). Иллюстративные агликозилированные Fc-домены и способы получения агликозилированных Fc-доменов известны в данной области, например, как описано в работе Sazinsky S.L. et al., Aglycosylated immunoglobulin Gl variants productively engage activating Fc receptors, PNAS, 2008, 105(51):20167-20172, которая полностью включена в настоящий документ.
В некоторых вариантах осуществления Fc-домен или мономер Fc-домена по изобретению сконструирован для усиления связывания с неонатальным Fc-рецептором (FcRn). Например, Fc-домен может включать тройную мутацию, соответствующую M252Y/S254T/T256E (YTE) (например, IgG1, такой как человеческий или гуманизированный IgG1, имеющий мутацию YTE, например, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 56 или SEQ ID NO: 57). Домен Fc может включать двойной мутант, соответствующий M428L/N434S (LS) (например, IgG1, такой как человеческий или гуманизированный IgG1, имеющий мутацию LS, такой как SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55 или SEQ ID NO: 59). Домен Fc может включать единственный мутант, соответствующий N434H (например, IgG1, такой как человеческий или гуманизированный IgG1, имеющий мутацию N434H). Домен Fc может включать единственный мутант, соответствующий C220S (например, IgG1, такой как человеческий или гуманизированный IgG1, имеющий мутацию C220S, такой как SEQ ID NOs: 34, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68). Домен Fc может включать комбинацию одной или нескольких описанных выше мутаций, которые усиливают связывание с FcRn. Усиленное связывание с FcRn может увеличивать период полужизни конъюгата, содержащего Fc-домен. Например, включение одной или нескольких аминокислотных мутаций, которые увеличивают связывание с FcRn (например, мутация YTE, мутация LS или мутация N434H), может увеличить период полужизни конъюгата на 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%. 100%, 200%, 300%, 400%, 500% или более относительно конъюгата, имеющего соответствующий Fc-домен без мутации, которая усиливает связывание с FcRn. Иллюстративные Fc-домены с усиленным связыванием с FcRN и способы получения Fc-доменов, имеющих усиленное связывание с FcRN, известны в данной области, например, как описано в работе Maeda, A. et al., Identification of human IgG1 variant with enhanced FcRn binding and without increased binding to rheumatoid factor autoantibody, MABS, 2017, 9(5):844-853, которая полностью включена в настоящий документ. Как используется в настоящем документе, следует понимать, что аминокислота, «соответствующая» конкретному аминокислотному остатку (например, конкретной SEQ ID NO.), включает любой аминокислотный остаток, который, как понимается специалистом в данной области, будет выравниваться с конкретным остатком (например, конкретной последовательности). Например, любая из SEQ ID NO: 1-68 может быть мутирована, чтобы включать мутацию YTE, мутацию LS и/или мутацию N434H, путем мутации «соответствующих остатков» аминокислотной последовательности.
В данном контексте следует понимать, что атом серы, «соответствующий» конкретному остатку цистеина конкретной SEQ ID NO., включает атом серы любого остатка цистеина, который специалист в данной области поймет для выравнивания с конкретным цистеином конкретной последовательности. Выравнивание белковой последовательности человеческого IgG1 (UniProtKB: Р01857; SEQ ID NO: 94), человеческого IgG2 (UniProtKB: P01859; SEQ ID NO: 95), человеческого IgG3 (UniProtKB: P01860; SEQ ID NO: 96) и человеческого IgG4 (UniProtKB: P01861; SEQ ID NO: 97) приведен ниже (выровнен с использованием Clustal Omega Multiple Pairwise Alignment). Выравнивание указывает остатки цистеина (например, атомы серы остатков цистеина), которые «соответствуют» друг другу (в прямоугольниках и обозначены символом •). Специалист в данной области легко сможет выполнить такое выравнивание с любым вариантом IgG по изобретению, чтобы определить атом серы цистеина, который соответствует любому атому серы конкретного цистеина конкретной SEQ ID NO., описанной в настоящем документе (например, любой из SEQ ID NO: 1-68). Например, специалист в данной области легко сможет определить, что Cys10 из SEQ ID NO: 10 (первый цистеин консервативного мотива СРРС шарнирной области Fc-домена) соответствует, например, Cys109 of IgG1, Cys106 of IgG2, Cys156 of IgG3, Cys29 of SEQ ID NO: 1, Cys9 of SEQ ID NO: 2, Cys30 of SEQ ID NO: 3 или Cys10 из SEQ ID NO: 10.
В некоторых вариантах осуществления Fc-домен или мономер Fc-домена по изобретению имеет последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 39-68, может дополнительно включать дополнительные аминокислоты на N-конце (Хаа)х и/или дополнительные аминокислоты на С-конце (Xaa)z, где Хаа представляет собой любую аминокислоту, и х и z представляют собой целые числа, равные нулю или больше, обычно меньше 100, предпочтительно меньше 10 и более предпочтительно равные 0, 1, 2, 3, 4 или 5. В некоторых вариантах осуществления дополнительные аминокислоты являются по меньшей мере на 70% (например, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, или 100%) идентичными одной или нескольким последовательным аминокислотам, представленным в SEQ ID NO: 94. Например, дополнительные аминокислоты могут представлять собой одну вспомогательную аминокислоту на С-конце, соответствующую Lys330 из IgG1 (SEQ ID NO: 94).
Используемый в настоящем документе атом азота, «соответствующий» конкретному остатку лизина конкретной SEQ ID NO, следует понимать как включающий атом азота любого остатка лизина, который специалист в данной области поймет для выравнивания с конкретным лизином конкретной последовательности. Выравнивание белковой последовательности человеческого IgG1 (UniProtKB: Р01857; SEQ ID NO: 94), человеческого IgG2 (UniProtKB: P01859; SEQ ID NO: 95), человеческого IgG3 (UniProtKB: P01860; SEQ ID NO: 96) и человеческого IgG4 (UniProtKB: P01861; SEQ ID NO: 97) приведено ниже (выровнено с использованием Clustal Omega Multiple Pairwise Alignment). Выравнивание указывает остатки лизина (например, атомы азота остатков лизина), которые «соответствуют» друг другу (в прямоугольниках и обозначены символом *). Специалист в данной области легко сможет выполнить такое выравнивание с любым вариантом IgG по изобретению, чтобы определить атом азота лизина, который соответствует любому атому азота конкретного лизина конкретной SEQ ID NO, описанной в настоящем документе (например, любой из SEQ ID NO: 1-68). Например, специалист в данной области легко сможет определить, что Lys35 из SEQ ID NO: 10 соответствует, например, Lys129 из IgG1, Lys126 из IgG2, Lys176 из IgG3, Lys51 из SEQ ID NO: 1, Lys31 из SEQ ID NO: 2, Lys50 из SEQ ID NO: 3 или Lys30 из SEQ ID NO: 10.
Выравнивание белковых последовательностей IgG1 (SEQ ID NO: 94), IgG2 (SEQ ED NO: 95), IgG3 (SEQ ED NO: 96) и IgG4 (SEQ ID NO: 97)
Активация иммунных клеток
F с-гамма-рецепторы (FcγR) связывают F с-часть иммуноглобулина G (JgG) и играют важную роль в активации и регуляции иммунной системы. Например, Fc-домены IgG в иммунных комплексах (IC) взаимодействуют с FcγR с высокой авидностью, тем самым запуская сигнальные каскады, которые регулируют активацию иммунных клеток. Семейство человеческих FcγR содержит несколько активирующих рецепторов (FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIc, FcγRIIIa и FcγRIIIb) и один ингибирующий рецептор (FcγRIIb). Передача сигналов FcγR опосредуется внутриклеточными доменами, которые содержат иммунные активирующие мотивы на основе тирозина (ITAM) для активации FcγR и иммунные ингибирующие мотивы на основе тирозина (ITIM) для ингибирующего рецептора FcγRIIb. В некоторых вариантах осуществления связывание FcγR Fc-доменами приводит к фосфорилированию ITAM киназами семейства Src; это активирует киназы семейства Syk и индуцирует нижележащие сигнальные сети, которые включают пути PI3K и Ras.
В описанных в настоящем документе конъюгатах часть конъюгатов, включающая мономеры или димеры ингибиторов нейраминидазы, связывается и ингибирует вирусную нейраминидазу, что приводит к ингибированию вирусной репликации, в то время как часть Fc-домена конъюгатов связывается с FcγR (например, FcRn, FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIc, FcγRIIIa и FcγRIIIb) на иммунных клетках и активируют фагоцитоз и эффекторные функции, такие как антителозависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность (ADCC), что приводит к поглощению и разрушению вирусных частиц иммунными клетками и дальнейшему усилению противовирусной активности конъюгатов. Примеры иммунных клеток, которые могут быть активированы описанными в настоящем документе конъюгатами, включают, но без ограничения, макрофаги, нейтрофилы, эозинофилы, базофилы, лимфоциты, фолликулярные дендритные клетки, естественные клетки-киллеры и тучные клетки.
IV. Белки альбумины и белок альбумин связывающие пептиды
Белки альбумины
Белок альбумин по изобретению может представлять собой встречающийся в природе альбумин или его вариант, такой как сконструированный вариант встречающегося в природе белка альбумина. Варианты включают полиморфизмы, фрагменты, такие как домены и субдомены, а также слитые белки. Белок альбумин может включать последовательность белка альбумина, полученного из любого источника. Предпочтительно источником является млекопитающее, такое как человек или крупный рогатый скот. Наиболее предпочтительно белок альбумин представляет собой человеческий сывороточный альбумин (HSA) или его вариант. Человеческие сывороточные альбумины включают любой белок альбумин, имеющий аминокислотную последовательность, встречающуюся в природе у человека, и его варианты. Кодирующая белок альбумин последовательность может быть получена с помощью способов, известных специалистам в данной области, для выделения и секвенирования кДНК, соответствующей генам человека. Белок альбумин по изобретению может включать аминокислотную последовательность человеческого сывороточного альбумина (HSA), представленную в SEQ ID NO: 69 или SEQ ID NO: 70, или аминокислотную последовательность мышиного сывороточного альбумина мыши (MSA), представленную в SEQ. ID NO: 71, или его вариант или фрагмент, предпочтительно функциональный вариант или его фрагмент. Фрагмент или вариант могут быть или не быть функциональными, или могут до некоторой степени сохранять функцию альбумина. Например, фрагмент или вариант могут сохранять способность связываться с рецептором альбумина, таким как HSA или MSA, по меньшей мере на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% или 105% от способности исходного альбумина (например, исходного альбумина, из которого происходит фрагмент или вариант). Относительная связывающая способность может быть определена способами, известными в данной области, такими как поверхностный плазмонный резонанс.
Белок альбумин может представлять собой природный полиморфный вариант белка альбумина, такого как человеческий сывороточный альбумин. Как правило, варианты или фрагменты человеческого сывороточного альбумина будут иметь по меньшей мере 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60% или 70%, и предпочтительно 80%, 90%, 95%. %, 100% или 105% или более активности связывания с лигандом человеческого сывороточного альбумина или мышиного сывороточного альбумина.
Белок альбумин может включать аминокислотную последовательность бычьего сывороточного альбумина. Белки бычьего сывороточного альбумина включают любой альбумин, имеющий аминокислотную последовательность, встречающуюся в природе у коров, например, как описано под номером доступа Swissprot Р02769, и его варианты, как определено в настоящем документе. Белки бычьего сывороточного альбумина также включают фрагменты полноразмерного бычьего сывороточного альбумина или его варианты, как определено в настоящем документе.
Белок альбумин может содержать последовательность альбумина, полученного из одного из сывороточного альбумина собаки (например, номер доступа Swissprot Р49822-1), свиньи (например, номер доступа Swissprot Р08835-1), козы (например, продукт Sigma номер А2514 или А4164), кошки (например, номер доступа Swissprot Р49064-1), цыпленка (например, номер доступа Swissprot Р19121-1), овальбумина (например, овальбумина цыпленка) (например, номер доступа Swissprot Р01012-1), овальбумина индейки (например, номер доступа Swissprot 073 860-1), осла (например, номер доступа Swissprot Q5XLE4-1), морской свинки (например, номер доступа Swissprot Q6WDN9-1), хомяка (например, как описано в DeMarco et al. International Journal for Parasitology 37(11): 1201-1208 (2007)), лошади (например, номер доступа Swissprot Р35747-1), макаки-резус (например, номер доступа Swissprot Q28522-1), мыши (например, номер доступа Swissprot Р07724-1), голубя (например, как определено Khan et al. Int. J. Biol. Macromol. 30(3-4),171-8 (2002)), кролика (например, номер доступа Swissprot Р4 9065-1), крысы (например, номер доступа Swissprot Р02770-1) или овцы (например, номер доступа Swissprot Р14639-1), и включает их варианты и фрагменты, как определено в настоящем документе.
Многие встречающиеся в природе мутантные формы альбумина известны специалистам в данной области. Встречающиеся в природе мутантные формы альбумина описаны, например, в Peters, et al. All About Albumin: Biochemistry, Genetics and Medical Applications, Academic Press, Inc., San Diego, Calif., p.170-181 (1996).
Белки альбумины по изобретению включают варианты встречающихся в природе белков альбуминов. Вариант альбумина относится к белку альбумину, имеющему по меньшей мере одну аминокислотную мутацию, такую как аминокислотная мутация, генерированная вставкой, делецией или заменой, консервативной или неконсервативной, при условии, что такие изменения приводят к получению белка альбумина, для которого по меньшей мере одно базовое свойство не было существенно изменено (например, не было изменено более чем на 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35% или 40%). Иллюстративные свойства, которые могут определять активность белка альбумина, включают связывающую активность (например, включая специфичность связывания или сродство к билирубину или жирной кислоте, такой как длинноцепочечная жирная кислота), осмолярность или поведение в определенном диапазоне рН.
Обычно вариант белка альбумина будет иметь по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60% и предпочтительно по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичности аминокислотной последовательности с природным белком альбумином, таким как белок альбумин любой из SEQ ID NO: 69-71.
Способы получения и очистки рекомбинантных альбуминов человека хорошо известны (Sleep et al. Biotechnology, 8(1):42-6 (1990)) и включают получение рекомбинантного альбумина человека для фармацевтического применения (Bosse et al. J Clin Pharmacol 45(1): 57-67 (2005)). Трехмерная структура HSA была выявлена с помощью рентгеновской кристаллографии (Carter et al. Science. 244(4909): 1195-8(1998)); Sugio et al. Protein Eng. 12(6):439-46 (1999)). Полипептидная цепь HSA имеет 35 остатков цистеина, которые образуют 17 дисульфидных связей, и один неспаренный (например, свободный) цистеин в положении 34 зрелого белка. Cys-34 HSA использовали для конъюгации молекул с альбумином (Leger et al. Bioorg Med Chem Lett 14(17):4395-8 (2004); Thibaudeau et al. Bioconjug Chem 16(4): 1000-8 (2005)), и обеспечивает участок для сайт-специфической конъюгации. SEQ ID NO: 69 (Человеческий сывороточный альбумин (HSA), вариант 1)
SEQ ID NO: 70 (Человеческий сывороточный альбумин (HSA), вариант 2)
KLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTK
VPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLV
RRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAA
VEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALG
SEQ ID NO: 71 (Мышиный сывороточный альбумин (MSA))
RGVFRREAHKSEIAHRYNDLGEQHFKGLVLIAFSQYLQKCSYDEHAKLVQEVTDFA KTCVADESAANCDK
SLHTLFGDKLCAIPNLRENYGELADCCTKQEPERNECFLQHKDDNPSLPPFERPEAEA MCTS FKENPTTF
MGHYLHEVARRHPYFYAPELLYYAEQYNEILTQCCAEADKESCLTPKLDGVKEKAL VSSVRQRMKCSSM
QKFGERAFKAWAVARLSQTFPNADFAEITKLATDLTKVNKECCHGDLLECADDRAE
LAKYMCENQATISSKLQTCCDKPLLKKAHCLSEVEHDTMPADLPAIAADFVEDQEV
CKNYAEAKDVFLGTFLYEYSRRHPDYSV
SLLLRLAKKYEATLEKCCAEANPPACYGTVLAEFQPLVEEPKNLVKTNCDLYEKLGE YGFQNAILVRYTQK
APQVSTPTLVEAARNLGRVGTKCCTLPEDQRLPCVEDYLSAILNRVCLLHEKTPVSE HVTKCCSGSLVER
RPCFSALTVDETYVPKEFKAETFTFHSDICTLPEKEKQIKKQTALAELVKHKPKATAE QLKTVMDDFAQFL
DTCCKAADKDTCFSTEGPNLVTRCKDALA
Конъюгация белков альбуминов
Белок альбумин по изобретению может быть конъюгирован (например, посредством ковалентной связи) с любым соединением по изобретению (например, с помощью линкерной части мономера или димера ингибитора нейраминидазы). Белок альбумин можно конъюгировать с любым соединением по изобретению любым способом, хорошо известным специалистам в данной области, для получения конъюгатов малая молекула-белок. Это может включать ковалентную конъюгацию с экспонированной растворителю аминокислотой, такой как экспонированный в растворитель цистеин или лизин. Например, человеческий сывороточный альбумин может быть конъюгирован с соединением по изобретению за счет ковалентной связи с атомом серы, соответствующим Cys34 из SEQ ID NO: 69 или Cys40 из SEQ ID NO: 70.
Белок альбумин по изобретению может быть конъюгирован с любым соединением по изобретению посредством аминокислоты, расположенной в пределах 10 аминокислотных остатков С-терминального или N-терминального конца белка альбумина. Белок альбумин может включать С-терминальный или N-терминальный полипептид слияния 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 или 20 или более аминокислот. С-терминальный или N-терминальный полипептид слияния может включать один или несколько экспонированных в растворитель остатков цистеина или лизина, которые могут быть использованы для ковалентной конъюгации соединения по изобретению (например, конъюгации с мономером или димером ингибитора нейраминидазы, в том числе посредством линкера).
Белки альбумины по изобретению включают любой белок альбумин, который был сконструирован таким образом, чтобы включать один или несколько экспонированных в растворитель остатков цистеина или лизина, которые могут обеспечивать участок для конъюгации с соединением по изобретению (например, конъюгации с мономером или димером ингибитора нейраминидазы, в том числе посредством линкера). Наиболее предпочтительно, чтобы белок альбумин содержал единственный экспонированный в растворитель цистеин или лизин, обеспечивая таким образом сайт-специфическую конъюгацию соединения по изобретению.
Иллюстративные способы получения сконструированных вариантов белков альбуминов, которые включают один или несколько подходящих для конъюгации остатков цистеина, представлены в заявке на патент США №2017/0081389, которая полностью включена в настоящий документ посредством ссылки. Вкратце, предпочтительными вариантами белка альбумина являются те, которые содержат единственный, экспонированный в растворитель, неспаренный (например, свободный) остаток цистеина, таким образом обеспечивая сайт-специфическую конъюгацию линкера с остатком цистеина.
Белки альбумины, которые были сконструированы для обеспечения химической конъюгации с экспонированным в растворитель неспаренным остатком цистеина, включают следующие варианты белка альбумина:
(a) белок альбумин, имеющий замену нецистеинового аминокислотного остатка на цистеин в аминокислотном остатке, соответствующем любому из L585, D1, А2, D562, А364, А504, Е505, Т79, Е86, D129, D549, А581, D121, Е82, S270, Q397 и А578 из SEQ ID NO: 69;
(b) белок альбумин, имеющий вставку цистеина в положение, прилегающем к N-или С-концевой стороне аминокислотного остатка, соответствующего любому из L585, D1, А2, D562, А364, А504, Е505, Т79, Е86, D129, D549, А581, D121, Е82, S270, Q397 и А578 из SEQ ID NO: 69;
(c) белок альбумин, сконструированный таким образом, чтобы он содержал неспаренный цистеин, имеющий свободную тиольную группу при остатке, соответствующем любому из С369, С361, С91, С177, С567, С316, С75, С169, С124 или С558 из SEQ ID NO: 69, и который может быть образован или может быть не образован путем удаления или замены остатка, соответствующего С360, С316, С75, С168, С558, С361, С91, С124, С169 или С567 в SEQ ID NO: 69; и/или
(d) добавление цистеина к N- или С-концу белка альбумина.
В некоторых вариантах осуществления изобретения конечным результатом событий замены, делеции, добавления или вставки (а), (b), (с) и/или (d) является то, что количество способных к конъюгации цистеиновых остатков полипептидной последовательности увеличивается по сравнению с исходной последовательностью альбумина. В некоторых вариантах осуществления изобретения конечным результатом событий замены, делеции, добавления или вставки (а), (b), (с) и/или (d) является то, что количество способных к конъюгации остатков цистеина полипептидной последовательности равно одному, что обеспечивает возможность сайт-специфической конъюгации.
Предпочтительные варианты белка альбумина также включают белки альбумины, имеющие единственный экспонированный в растворитель остаток лизина, обеспечивая тем самым сайт-специфическую конъюгацию линкера с остатком лизина. Такие варианты могут быть созданы путем конструирования белка альбумина, включая любой из способов, описанных ранее (например, вставка, делеция, замена или С-терминальной или N-терминальное слияние).
Белок альбумин-с вязы вающие пептиды
Конъюгирование биологически активного соединения с белок альбумин-связывающим пептидом может изменять фармакодинамику биологически активного соединения, включая изменение поглощения тканями, проникновения и диффузии. В предпочтительном варианте осуществления конъюгация белок альбумин связывающего пептида с соединением по изобретению (например, мономером или димером ингибитора нейраминидазы посредством линкера) увеличивает эффективность или снижает токсичность соединения по сравнению с соединением, взятым в отдельности.
Белок альбумин-связывающие пептиды по изобретению включают любой полипептид, имеющий аминокислотную последовательность из 5-50 (например, 5-40, 5-30, 5-20, 5-15, 5-10, 10-50, 10-30 или 10-20) аминокислотных остатков, которые обладают аффинностью в отношении белка альбумина и функциями связывания с белком альбумином, таким как любой из белков альбуминов, описанных в настоящем документе. Предпочтительно белок альбумин-связывающий пептид связывается с природным сывороточным альбумином, наиболее предпочтительно с человеческим сывороточным альбумином. Белок альбумин-связывающий пептид может иметь различное происхождение, например синтетическое, человеческое, мышиное или крысиное. Белок альбумин-связывающие пептиды по изобретению включают белок альбумин-связывающие пептиды, которые были сконструированы таким образом, чтобы включать один или несколько (например, два, три, четыре или пять) экспонированных в растворитель остатков цистеина или лизина, которые могут обеспечивать участок для конъюгации с соединением по изобретению (например, конъюгации с мономером или димером ингибитора нейраминидазы, в том числе посредством линкера). Наиболее предпочтительно белок альбумин-связывающий пептид будет содержать единственный экспонированный в растворитель цистеин или лизин, таким образом, обеспечивая сайт-специфическую конъюгацию соединения по изобретению. Белок альбумин-связывающие пептиды могут включать только встречающиеся в природе аминокислотные остатки или могут включать один или несколько не встречающихся в природе аминокислотных остатков. В случае включения, не встречающийся в природе аминокислотный остаток (например, боковая цепь не встречающегося в природе аминокислотного остатка) может быть использована в качестве точки присоединения для соединения по изобретению (например, мономера или димера ингибитора нейраминидазы), в том числе посредством линкера). Белок альбумин-связывающие пептиды по изобретению могут быть линейными или циклическими. Белок альбумин-связывающие пептиды по изобретению включают любые белок альбумин-связывающие пептиды, известные специалисту в данной области, примеры которых представлены в настоящем документе.
Белок альбумин-связывающий пептид и конъюгаты, включающие белок альбумин-связывающий пептид, предпочтительно связывают белок альбумин (например, человеческий сывороточный альбумин) с аффинностью, характеризующейся константой диссоциации, Kd, которая составляет менее чем около 100 мкМ, предпочтительно менее чем около 100 нМ, и наиболее предпочтительно по существу не связывают другие белки плазмы. Конкретными примерами таких соединений являются линейные или циклические пептиды, предпочтительно длиной примерно от 10 до 20 аминокислотных остатков, необязательно модифицированные на N-конце или С-конце, или на обоих.
Белок альбумин-связывающие пептиды включают линейные и циклические пептиды, содержащие следующие общие формулы, где Хаа представляет собой любую аминокислоту: SEQ ID NO: 74
Xaa-Xaa-Cys-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Cys-Xaa-Xaa-Phe-Cys-Xaa-Asp-Trp-Pro-Xaa-Xaa-Xaa-Ser-Cys
SEQ ID NO: 75
Val-Cys-Tyr-Xaa-Xaa-Xaa-Ile-Cys-Phe
SEQ ID NO: 76
Cys - Tyr-Xaa- Pro- Gly-Xaa- Cys
SEQ ID NO: 77
Asp-Xaa-Cys-Leu-Pro-Xaa-Trp-Gly-Cys-Leu-Trp
SEQ ID NO: 78
Trp-Cys-Asp-Xaa-Xaa-Leu-Xaa-Ala-Xaa-Asp-Leu-Cys
SEQ ID NO: 79
Asp-Leu-Val-Xaa-Leu-Gly-Leu-Glu-Cys-Trp
Белок альбумин-связывающие пептиды по изобретению, кроме того, включают любую из следующих пептидных последовательностей, которые могут быть линейными или циклическими:
SEQ ID NO: 80 DLCLRDWGCLW
SEQ ID NO: 81 DICLPRWGCLW
SEQ ID NO: 82 MEDICLPRWGCLWGD
SEQ ID NO: 83 QRLMEDICLPRWGCLWEDDE
SEQ ID NO: 84 QGLIGDICLPRWGCLWGRSV
SEQ ID NO: 85 QGLIGDICLPRWGCLWGRSVK
SEQ ID NO: 86 EDICLPRWGCLWEDD
SEQ ID NO: 87 RLMEDICLPRWGCLWEDD
SEQ ID NO: 88 MEDICLPRWGCLWEDD
SEQ ID NO: 89 MEDICLPRWGCLWED
SEQ ID NO: 90 RLMEDICLARWGCLWEDD
SEQ ID NO: 91 EVRSFCTRWPAEKSCKPLRG
SEQ ID NO: 92 RAPESFVCYWETICFERSEQ
SEQ ID NO: 93 EMCYFPGICWM
Белок альбумин-связывающие пептиды, представленные в SEQ ID NO: 74-93, могут, кроме того, включать дополнительные аминокислоты на N-конце (Хаа)х и/или дополнительные аминокислоты на С-конце (Xaa)z, где Хаа представляет собой любую аминокислоту, и х и z представляют собой целое число, которое равно нулю или большее, обычно менее 100, предпочтительно менее 10 и более предпочтительно равно 0, 1,2, 3,4 или 5.
Дополнительные иллюстративные белок альбумин-связывающие пептиды представлены в заявке на патент США №2005/0287153, которая полностью включена в настоящий документ посредством ссылки.
Конъюгирование белок алъбумин-связывающих пептидов
Белок альбумин-связывающий пептид по изобретению может быть конъюгирован (например, за счет ковалентной связи) с любым соединением по изобретению (например, с помощью линкерной части мономера или димера ингибитора нейраминидазы). Белок альбумин-связывающие пептиды могут быть конъюгированы с любым соединением по изобретению с помощью любого способа, известного специалистам в данной области, для получения конъюгатов пептид-малая молекула. Это может включать ковалентную конъюгацию с группой боковой цепи аминокислотного остатка, такого как цистеин, лизин или неприродная аминокислота. Альтернативно, ковалентная конъюгация может происходить на С-конце (например, с С-концевой карбоновой кислотой или с группой боковой цепи С-концевого остатка) или на N-конце (например, с N-концевой аминогруппой или с группой боковой цепи N-концевой аминокислоты).
V. Линкеры
Линкер относится к связи или соединению между двумя или более компонентами в конъюгате, описанном в настоящем документе (например, между двумя ингибиторами нейраминидазы в описанном в настоящем документе конъюгате, между ингибитором нейраминидазы и Fc-доменом или белком альбумином в описанном в настоящем документе конъюгате, и между димером двух ингибиторов нейраминидазы и Fc-доменом или белком альбумином в конъюгате, описанном в настоящем документе).
Линкеры в конъюгатах, содержащие Fc-домен или белок альбумин, ковалентно связанный с димерами ингибиторов нейраминидазы.
В конъюгате, содержащем мономер Fc-домена, Fc-домен, Fc-связывающий пептид, белок альбумин или белок альбумин-связывающий пептид, ковалентно связанный с одним или несколькими димерами ингибиторов нейраминидазы, как описано в настоящем документе, линкер в конъюгате (например, L или L') может иметь разветвленную структуру. Как описано далее в настоящем документе, линкер в описанном в настоящем документе конъюгате (например, L или L') может иметь поливалентную структуру, например, двухвалентную или трехвалентную структуру, имеющую два или три ответвления, соответственно. В некоторых вариантах осуществления, когда линкер имеет три ответвления, два из ответвлений могут быть присоединены к первому и второму ингибиторам нейраминидазы, а третье ответвление может быть присоединено к мономеру Fc-домена и Fc-домену, Fc-связывающему пептиду, белку альбумину или белок альбумин-связывающему пептиду. В некоторых вариантах осуществления, когда линкер имеет два ответвления, одно ответвление может быть присоединено к Fc-домену или белку альбумину, а другое ответвление может быть присоединено к одному из двух ингибиторов нейраминидазы. В других вариантах осуществления линкер с двумя ответвлениями может быть использован для присоединения двух ингибиторов нейраминидазы к конъюгату, содержащему Fc-домен или белок альбумин, ковалентно связанный с одним или несколькими димерами ингибиторов нейраминидазы.
В некоторых вариантах осуществления линкер в конъюгате, имеющем Fc-домен или белок альбумин, ковалентно связанный с одним или несколькими димерами ингибиторов нейраминидазы, описывается формулой (D-L-I):
где LA описывается формулой GA1-(ZA1)g1-(YA1)h1-(ZA2)ii-(YA2)j1-(ZA3)k1-(YA3)l1-(ZA4)m1-(YA4)n1-(ZA5)O1-GA2; LB описывается формулой GB1-(ZB1)g2-(YB1)h2-(ZB2)i2-(YB2)j2-(ZB3)k2-(YB3)l2-(ZB4)m2-(YB4)n2-(ZB5)O2-GB2; LC описывается формулой GC1-(ZC1)g3-(YC1)h3-(ZC2)i3-(YC2)j3-(ZC3)k3-(YC3)l3-(ZC4)m3-(YC4)n3-(ZC5)O3-GC2; GA1 представляет собой связь, присоединенную к Q в формуле (D-L-I); GA2 представляет собой связь, присоединенную к первому ингибитору нейраминидазы (например, A1); GB1 представляет собой связь, присоединенную к Q в формуле (D-L-I); GB2 представляет собой связь, присоединенную ко второму ингибитору нейраминидазы (например, А2); GC1 представляет собой связь, присоединенную к Q в формуле (D-L-I); GC2 представляет собой связь, присоединенную к мономеру Fc-домена, Fc-домену, Fc-связывающему пептиду, белку альбумину или белок альбумин-связывающему пептиду, или функциональной группе, способной взаимодействовать с функциональной группой, конъюгированной с мономером Fc-домена, Fc-доменом, Fc-связывающим пептидом, белком альбумином или белок альбумин-связывающим пептидом (например, малеимид и цистеин, амин и активированная карбоновая кислота, тиол и малеимид, активированная сульфоновая кислота и амин, изоцианат и амин, азид и алкин, а также алкен и тетразин); каждый из ZA1, ZA2, ZA3, ZA4, ZA5, ZB1, ZB2, ZB3, ZB4, ZB5, ZC1, ZC2, ZC3, ZC4 и ZC5 независимо представляет собой необязательно замещенный (С1-С20)алкилен, необязательно замещенный (С1-С20)гетероалкилен, необязательно замещенный (С2-С20)алкенилен, необязательно замещенный (С2-С20)гетероалкенилен, необязательно замещенный (С2-С20)алкинилен, необязательно замещенный (С2-С20)гетероалкинилен, необязательно замещенный (С3-С20)циклоалкилен, необязательно замещенный (С3-С20)гетероциклоалкилен, необязательно замещенный (С4-С20)циклоалкенилен, необязательно замещенный (С4-С20)гетероциклоалкенилен, необязательно замещенный (С8-С20)циклоалкинилен, необязательно замещенный (С8-С20)гетероциклоалкинилен, необязательно замещенный (С5-С15)арилен или необязательно замещенный (С2-С15)гетероарилен; каждый из YA1, YA2, YA3, YA4, YB1, YB2, YB3, YB4, YC1, YC2, YC3 и YC4 независимо представляет собой О, S, NR.1, P, карбонил, тиокарбонил, сульфонил, фосфат, фосфорил или имино; Ri представляет собой Н, необязательно замещенный (С1-С20)алкил, необязательно замещенный (С1-С20)гетероалкил, необязательно замещенный (С2-С20)алкенил, необязательно замещенный (С2-С20)гетероалкенил, необязательно замещенный (С2-С20)алкинил, необязательно замещенный (С2-С20)гетероалкинил, необязательно замещенный (С3-С20)циклоалкил, необязательно замещенный (С3-С20)гетероциклоалкил, необязательно замещенный (С4-С20)циклоалкенил, необязательно замещенный (С4-С20)гетероциклоалкенил, необязательно замещенный (С8-С20)циклоалкинил, необязательно замещенный (С8-С20)гетероциклоалкинил, необязательно замещенный (С5-С15)арил или необязательно замещенный (С2-С15)гетероарил; каждый из g1, h1, i1, j1, k1, l1, m1, n1, o1, g2, h2, i2, j2, k2, 12, m2, n2, o2, g3, h3, i3, j3, k3, l3, m3, n3 и о3 независимо равен 0 или 1; Q представляет собой атом азота, необязательно замещенный (С1-С20)алкилен, необязательно замещенный (С1-С20)гетероалкилен, необязательно замещенный (С2-С20)алкенилен, необязательно замещенный (С2-С20)гетероалкенилен, необязательно замещенный (С2-С20)алкинилен, необязательно замещенный (С2-С20)гетероалкинилен, необязательно замещенный (С3-С20)циклоалкилен, необязательно замещенный (С3-С20)гетероциклоалкилен, необязательно замещенный (С4-С20)циклоалкенилен, необязательно замещенный (С4-С20)гетероциклоалкенилен, необязательно замещенный (С8-С20)циклоалкинилен, необязательно замещенный (С8-С20)гетероциклоалкинилен, необязательно замещенный (С5 -С 15)арилен или необязательно замещенный (С2-С15)гетероарилен.
В некоторых вариантах осуществления LC может иметь две точки прикрепления к Fc-домену (например, два GC2). В некоторых вариантах осуществления L включает линкер полиэтиленгликоль (PEG). Линкер PEG включает линкер, имеющий структуру повторяющегося звена (-CH2CH2O-)n, где n представляет собой целое число от 2 до 100. Линкер полиэтиле нгликоль может ковалентно присоединяться к ингибитору нейраминидазы и Е (например, в конъюгате любой из формул (MI)-(MX)). Линкер полиэтиленгликоль может ковалентно присоединяться к первому ингибитору нейраминидазы и второму ингибитору нейраминидазы (например, в конъюгате любой из формул (D-I)-(D-X)). Линкер полиэтиленгликоль может ковалентно соединять димер ингибитора нейраминидазы и Е (например, в конъюгате любой из формул (D-I)-(D-X)).
Линкер полиэтиленгликоль может быть выбран из любого из PEG2 to PEG100 (e.g., PEG2, PEG3, PEG4, PEG5, PEG5-PEG10, PEG10-PEG20, PEG20-PEG30, PEG30-PEG40, PEG50-PEG60, PEG60-PEG70, PEG70-PEG80, PEG80-PEG90, PEG90-PEG100). В некоторых вариантах осуществления LC включает линкер PEG, где LC ковалентно присоединен к каждому из Q и Е.
Линкеры формулы (D-L-I), которые можно использовать в конъюгатах, описанных в настоящем документе, включают, но без ограничения:
где z1 и z2, каждый, независимо представляют собой целое число от 1 до 20; и R9 выбран из Н, С1-С20 алкила, С3-С20 циклоалкила, С3-С20 гетероциклоалкила; С5-С15 арила и С2-С15 гетероарила.
Линкеры формулы (D-L-I) могут также включать любой из
Линкеры в конъюгатах, содержащие Fc-домен или белок альбумин, ковалентно связанный с мономерами ингибиторов нейраминидазы
В конъюгате, содержащем мономер Fc-домена, Fc-домен, Fc-связывающий пептид, белок альбумин или белок альбумин-связывающий пептид, ковалентно связанный с одним или несколькими мономерами ингибиторов нейраминидазы, как описано в настоящем документе, линкер в конъюгате (например, L или L') может представлять собой двухвалентную структуру, имеющую два ответвления. Одно ответвление двухвалентного линкера может быть присоединено к мономеру ингибитора нейраминидазы, а другое плечо может быть присоединено к мономеру Fc-домена и Fc-домену, Fc-связывающему пептиду, белку альбумину или белок альбумин-связывающему пептиду. В некоторых вариантах осуществления один или несколько мономеров ингибиторов нейраминидазы в конъюгатах, описанных в настоящем документе, могут быть, каждый, независимо соединены с атомом в мономере Fc-домена и Fc-домене, Fc-связывающем пептиде, белке альбумине или белок альбумин-связывающем пептиде.
В некоторых вариантах осуществления линкер описывается формулой (M-L-I):
где J1 представляет собой связь, присоединенную к ингибитору нейраминидазы; J2 представляет собой связь, присоединенную к мономеру Fc-домена, Fc-домену, Fc-связывающему пептиду, белку альбумину или белок альбумин-связывающему пептиду, или функциональной группе, способной взаимодействовать с функциональной группой, конъюгированной с мономером Fc-домена, Fc-доменом, Fc-связывающим пептидом, белком альбумином или белок альбумин-связывающим пептидом (например, малеимид и цистеин, амин и активированная карбоновая кислота, тиол и малеимид, активированная сульфоновая кислота и амин, изоцианат и амин, азид и алкин, а также алкен и тетразин); каждый из Q1, Q2, Q3, Q4 и Q5 независимо представляет собой необязательно замещенный (С1-С20)алкилен, необязательно замещенный (С1-С20)гетероалкилен, необязательно замещенный (С2-С20)алкенилен, необязательно замещенный (С2-С20)гетероалкенилен, необязательно замещенный (С2-С20)алкинилен, необязательно замещенный (С2-С20)гетероалкинилен, необязательно замещенный (С3-С20)циклоалкилен, необязательно замещенный (С3-С20)гетероциклоалкилен, необязательно замещенный (С4-С20)циклоалкенилен, необязательно замещенный (С4-С20)гетероциклоалкенилен, необязательно замещенный (С8-С20)циклоалкинилен, необязательно замещенный (С8-С20)гетероциклоалкинилен, необязательно замещенный (С5-С15)арилен или необязательно замещенный (С2-С15)гетероарилен; каждый из Т1, Т2, Т3, Т4 независимо представляет собой О, S, NR1, Р, карбонил, тиокарбонил, сульфонил, фосфат, фосфорил или имино; Ri представляет собой Н, необязательно замещенный (С1-С20)алкил, необязательно замещенный (C1-С20)гетероалкил, необязательно замещенный (С2-С20)алкенил, необязательно замещенный (С2-С20)гетероалкенил, необязательно замещенный (С2-С20)алкинил, необязательно замещенный (С2-С20)гетероалкинил, необязательно замещенный (С3-С20)циклоалкил, необязательно замещенный (С3-С20)гетероциклоалкил, необязательно замещенный (С4-С20)циклоалкенил, необязательно замещенный (С4-С20)гетероциклоалкенил, необязательно замещенный (С8-С20)циклоалкинил, необязательно замещенный (С8-С20)гетероциклоалкинил, необязательно замещенный (С5-С15)арил или необязательно замещенный (С2-С15)гетероарил; и каждый из g, h, i, j, k, 1, m, n и о независимо равен 0 или 1.
В некоторых вариантах осуществления J2 может иметь две точки присоединения к мономеру Fc-домена и Fc-домену, Fc-связывающему пептиду, белку альбумину или белок альбумин-связывающему пептиду (например, два J2).
Линкеры формулы (M-L-I), которые можно использовать в конъюгатах, описанных в настоящем документе, включают, но без ограничения,
где d представляет собой целое число от 1 до 20 (например, d равно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20).
Линкеры формулы (M-L-I), которые можно использовать в конъюгатах, описанных в настоящем документе, включают, но без ограничения:
где каждый из d и е независимо представляет собой целое число от 1 до 26.
Связывающие группы
В некоторых вариантах осуществления линкер обеспечивает пространство, жесткость и/или гибкость между ингибиторами нейраминидазы и мономером Fc-домена и Fc-доменом, Fc-связывающим пептидом, белком альбумином или белок альбумин-связывающим пептидом в конъюгатах, описанных в настоящем документе, или между двумя ингибиторами нейраминидазы в конъюгатах, описанных в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления линкер может представлять собой связь, например, ковалентную связь, например, амидную связь, дисульфидную связь, связь С-О, связь C-N, связь N-N, связь C-S или любой тип связи, созданной в результате химической реакции, например, химической конъюгации. В некоторых вариантах осуществления линкер (L или L', как показано в любой из формул (1)-(5), (D-I)-(D-X), (D'-I), (M-I)-(M-X) или (M'-I)) включает не более 250 атомов (например, 1-2, 1-4, 1-6, 1-8, 1-10, 1-12, 1-14, 1-16, 1-18, 1-20, 1-25, 1-30, 1-35, 1-40, 1-45, 1-50, 1-55, 1-60, 1-65, 1-70, 1-75, 1-80, 1-85, 1-90, 1-95, 1-100, 1-110, 1-120, 1-130, 1-140, 1-150, 1-160, 1-170, 1-180, 1-190, 1-200, 1-210, 1-220, 1-230, 1-240 или 1-250 атома(атомов); 250, 240, 230, 220, 210, 200, 190, 180, 170, 160, 150, 140, 130, 120, 110, 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 28, 26, 24, 22, 20, 18, 16, 14, 12, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 атом (атомов)). В некоторых вариантах осуществления линкер (L или L') включает не более 250 неводородных атомов (например, 1-2, 1-4, 1-6, 1-8, 1-10, 1-12, 1-14, 1-16, 1-18, 1-20, 1-25, 1-30, 1-35, 1-40, 1-45, 1-50, 1-55, 1-60, 1-65, 1 -70, 1-75, 1-80, 1-85, 1-90, 1-95, 1-100, 1-110, 1-120, 1-130, 1-140, 1-150, 1-160, 1-170, 1-180, 1-190, 1-200, 1-210, 1-220, 1-230, 1-240 или 1-250 неводородных атомов; 250, 240, 230, 220, 210, 200, 190, 180, 170, 160, 150, 140, 130, 120, 110, 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 28, 26, 24, 22, 20, 18, 16, 14, 12, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 неводородный атом (атомов)). В некоторых вариантах осуществления основная цепь линкера (L или L') включает не более 250 атомов (например, 1-2, 1-4, 1-6, 1-8, 1-10, 1-12, 1-14, 1-16, 1-18, 1-20, 1-25, 1-30, 1-35, 1-40, 1-45, 1-50, 1-55, 1-60, 1-65, 1 -70, 1-75, 1-80, 1-85, 1-90, 1-95, 1-100, 1-110, 1-120, 1-130, 1-140, 1-150, 1-160, 1-170, 1-180, 1-190, 1-200, 1-210, 1-220, 1-230, 1-240 или 1-250 атомов; 250, 240, 230, 220, 210, 200, 190, 180, 170, 160, 150, 140, 130, 120, 110, 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 28, 26, 24, 22, 20, 18, 16, 14, 12, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 атом (атомов)). «Основная цепь» линкера относится к атомам в линкере, которые вместе образуют кратчайший путь от одной части конъюгата к другой части конъюгата. Атомы в основной цепи линкера непосредственно участвуют в связывании одной части конъюгата с другой частью конъюгата. Например, атомы водорода, присоединенные к атомам углерода в основной цепи линкера, не рассматриваются как непосредственно участвующие в связывании одной части конъюгата с другой частью конъюгата.
Молекулы, которые могут быть использованы для получения линкеров (L или L'), включают по меньшей мере две функциональные группы, например, две группы карбоновых кислот. В некоторых вариантах осуществления трехвалентного линкера два ответвления линкера могут содержать две дикарбоновые кислоты, где первая карбоновая кислота может образовывать ковалентную связь с первым ингибитором нейраминидазы в конъюгате, и вторая карбоновая кислота может образовывать ковалентную связь со вторым ингибитором нейраминидазы в конъюгате, и третье ответвление линкера может обеспечивать ковалентную связь (например, связь С-О) с мономером Fc-домена, Fc-доменом, Fc-связывающим пептидом, белком альбумином или белок альбумин-связывающим пептидом в конъюгате. В некоторых вариантах осуществления двухвалентного линкера двухвалентный линкер может содержать две карбоновые кислоты, где первая карбоновая кислота может образовывать ковалентную связь с одним компонентом (например, ингибитором нейраминидазы) в конъюгате, и вторая карбоновая кислота может образовывать ковалентную связь (например, связь С-S или связь C-N) с другим компонентом (например, мономером Fc-домена, Fc-доменом, Fc-связывающим пептидом, белком альбумином или белок альбумин-связывающим пептидом) в конъюгате.
В некоторых вариантах осуществления в качестве линкеров могут быть использованы молекулы дикарбоновой кислоты (например, линкер дикарбоновая кислота). Например, в конъюгате, содержащем мономер Fc-домена, Fc-домен, Fc-связывающий пептид, белок альбумин или белок альбумин-связывающий пептид, ковалентно связанный с одним или несколькими димерами ингибиторов нейраминидазы, первая карбоновая кислота в молекуле дикарбоновой кислоты может образовывать ковалентную связь с гидроксильной или аминогруппой первого ингибитора нейраминидазы, и вторая карбоновая кислота может образовывать ковалентную связь с гидроксильной или аминогруппой второго ингибитора нейраминидазы.
Примеры молекул дикарбоновых кислот, которые могут быть использованы для образования линкеров, включают, но без ограничения,
где n равно целому числу от 1 до 20 (например, n равно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20).
Другие примеры молекул дикарбоновых кислот, которые могут быть использованы для образования линкеров, включают, но без ограничения:
В некоторых вариантах осуществления молекулы дикарбоновой кислоты, такие как описанные в настоящем документе, могут быть дополнительно функционализированы, чтобы содержать одну или несколько дополнительных функциональных групп. Дикарбоновые кислоты могут быть дополнительно функционализированы, например, для обеспечения точки присоединения к мономеру Fc-домена, Fc-домену, Fc-связывающему пептиду, белку альбумину или белок-альбумин-связывающему пептиду (например, посредством линкера, такого как линкер PEG).
В некоторых вариантах осуществления, когда ингибитор нейраминидазы присоединен к мономеру Fc-домена, Fc-домену, Fc-связывающему пептиду, белку альбумину или белок альбумин связывающему пептиду, связывающая группа может включать фрагмент, содержащий фрагмент карбоновой кислоты и фрагмент амино, которые расположены на расстоянии от 1 до 25 атомов. Примеры таких связывающих групп включают, но без ограничения:
где n равно целому числу от 1 до 20 (например, n равно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20).
В некоторых вариантах осуществления связывающая группа, включающая фрагмент, включающий фрагмент карбоновой кислоты и фрагмент амино, такие как описанные в настоящем документе, может быть дополнительно функционализирована, чтобы содержать одну или несколько дополнительных функциональных групп. Такие связывающие группы могут быть дополнительно функционализированы, например, для обеспечения точки присоединения к мономеру Fc-домена, Fc-домену, Fc-связывающему пептиду, белку альбумину или белок альбумин-связывающему пептиду, (например, посредством линкера, такого как линкер PEG). В некоторых вариантах осуществления, когда ингибитор нейраминидазы присоединен к мономеру Fc-домена, Fc-домену, Fc-связывающему пептиду, белку альбумина или белок альбумин-связывающему пептиду, связывающая группа может содержать фрагмент, содержащий два фрагмента амино (например, фрагмент диамино), которые расположены на расстроянии от 1 до 25 атомов. Примеры таких связывающих групп включают, но без ограничения:
где n равно целому числу от 1 до 20 (например, n равно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20).
В некоторых вариантах осуществления связывающая группа, включающая диаминогруппу, такую как описано в настоящем документе, может быть дополнительно функционализирована, чтобы содержать одну или несколько дополнительных функциональных групп. Такие диамино-связывающие группы могут быть дополнительно функционализированы, например, для обеспечения точки присоединения к мономеру Fc-домена, Fc-домену, Fc-связывающему пептиду, белку альбумина или белок альбумин-связывающему пептиду (например, посредством линкер, такого как линкер PEG).
В некоторых вариантах осуществления молекула, содержащая азидную группу, может быть использована для образования линкера, где азидная группа может подвергаться циклоприсоединению с алкином с образованием 1,2,3-триазольной связи. В некоторых вариантах осуществления молекула, содержащая алкиновую группу, может быть использована для образования линкера, где алкиновая группа может подвергаться циклоприсоединению с азидом с образованием 1,2,3-триазольной связи. В некоторых вариантах осуществления молекула, содержащая малеимидную группу, может быть использована для образования линкера, где малеимидная группа может взаимодействовать с цистеином с образованием связи C-S. В некоторых вариантах осуществления молекула, содержащая одну или несколько групп сульфоновой кислоты, может быть использована для образования линкера, где группа сульфоновой кислоты может образовывать сульфонамидную связь со связывающим азотом в ингибиторе нейраминидазы. В некоторых вариантах осуществления молекула, содержащая одну или несколько изоцианатных групп, может быть использована для образования линкера, где изоцианатная группа может образовывать связь мочевины со связывающим азотом в ингибиторе нейраминидазы. В некоторых вариантах осуществления молекула, содержащая одну или несколько галогеналкильных групп, может быть использована для образования линкера, где галогеналкильная группа может образовывать ковалентную связь, например, связи С N и С-О, с ингибитором нейраминидазы.
В некоторых вариантах осуществления линкер (L или L') может содержать синтетическую группу, полученную, например, из синтетического полимера (например, полимера полиэтиленглико ля (PEG)). В некоторых вариантах осуществления линкер может содержать один или несколько аминокислотных остатков. В некоторых вариантах осуществления линкер может представлять собой аминокислотную последовательность (например, последовательность из 1-25 аминокислот, 1-10 аминокислот, 1-9 аминокислот, 1-8 аминокислот, 1-7 аминокислот, 1-6 аминокислот, 1-5 аминокислот, 1-4 аминокислот, 1-3 аминокислот, 1-2 аминокислот или 1 аминокислоты). В некоторых вариантах осуществления линкер (L или L') может включать один или несколько из необязательно замещенного С1-С20 алкилена, необязательно замещенного (С1-С20)гетероалкилена (например, звено PEG), необязательно замещенного (С2-С20)алкенилена (например, С2 алкенилена), необязательно замещенного (С2-С20)гетероалкенилена, необязательно замещенного (С2-С20)алкинилена, необязательно замещенного (С2-С20)гетероалкинилена, необязательно замещенного (С3-С20)циклоалкилена (например, цикло про пилен, циклобутилен), необязательно замещенного (С3-С20)гетероциклоалкилена, необязательно замещенного (С4-С20)циклоалкенилена, необязательно замещенного (С4-С20)гетероциклоалкенилена, необязательно замещенного (С8-С20)циклоалкинилена, необязательно замещенного (С8-С20)гетероциклоалкинилена, необязательно замещенного (С5-С15)арилена (например, С6 арилена), необязательно замещенного (С2-С15)гетероарилена (например, имидазол, пиридин), О S, NRi (Ri представляет собой Н, необязательно замещенный (С1-С20)алкил, необязательно замещенный (С1-С20)гетероалкил, необязательно замещенный (С2-С20)алкенил, необязательно замещенный (С2-С20)гетероалкенил, необязательно замещенный (С2-С20)алкинил, необязательно замещенный (С2-С20)гетероалкинил, необязательно замещенный (С3-С20)циклоалкил, необязательно замещенный (С3-С20)гетероциклоалкил, необязательно замещенный (С4-С20)циклоалкенил, необязательно замещенный (С4-С20)гетероциклоалкенил, необязательно замещенный (С8-С20)циклоалкинил, необязательно замещенный (С8-С20)гетероциклоалкинил, необязательно замещенный (С5-С15)арил или необязательно замещенный (С2-С15)гетероарил, Р, карбонила, тиокарбонила, сульфонила, фосфата, фосфорила или имино.
Химия конъюгации
Мономер или димеры ингибитора нейраминидазы (например, в конъюгате любой из формул (1)-(5), (D-I)-(D-X), (D'-I), (M-I)-(M-X) или (M'-I)) могут быть конъюгированы с мономером Fc-домена, Fc-доменом, Fc-связывающим пептидом, белком альбумином или белок альбумин-связывающим пептидом, например, посредством линкера, с помощью любых стандартных химических методов конъюгации, известных специалистам в данной области. Следующие ниже химические методы конъюгации специально предусмотрены, например, для конъюгации линкера PEG (например, функционализированного линкера PEG) с мономером Fc-домена, Fc-доменом, Fc-связывающим пептидом, белком альбумином или белок альбумин-связывающим пептидом.
Ковалентное конъюгирование двух или более компонентов в конъюгате с использованием линкера может быть осуществлено с использованием хорошо известных методик и способов органического химического синтеза. Дополнительные функциональные группы двух компонентов могут взаимодействовать друг с другом с образованием ковалентной связи. Примеры дополнительных реакционноспособных функциональных групп включают, но без ограничения, например, малеимид и цистеин, амин и активированную карбоновую кислоту, тиол и малеимид, активированную сульфоновую кислоту и амин, изоцианат и амин, азид и алкин, а также алкен и тетразин. Сайт-специфическая конъюгация с полипептидом (например, мономером Fc-домена, Fc-доменом, Fc-связывающим пептидом, белком альбумином или белок альбумин-связывающим пептидом) может осуществляться с использованием методов, известных в данной области. Типичные методы сайт-специфической конъюгации малой молекулы с Fc-доменом представлены в Agarwall. P., et al. Bioconjugate Chem. 26: 176-192 (2015).
Другие примеры функциональных групп, способных реагировать с аминогруппами, включают, например, алкилирующие и ацилирующие агенты. Типичные алкилирующие агенты включают: (i) α-галогенацетильную группу, например, XCH2CO- (где X = Br, Cl или I); (ii) N-малеимидную группу, которая может взаимодействовать с аминогруппами либо посредством реакции типа Михаэля, либо посредством ацилирования путем добавления к карбонильной группе кольца; (iii) арилгалогенид, например, нитро гало генаромати чес кую группу; (iv) алкилгалогенид; (v) альдегид или кетон, способный к образованию основания Шиффа с аминогруппами; (vi) эпоксид, например, эпихлоргидрин и бисоксиран, которые могут взаимодействовать с амино, сульфгидр ильными или фенольными гидр оке ильными группами; (vii) хлор содержащий s-триазин, который является реакционноспособным по отношению к нуклеофилам, таким как амино, суфгидрильные и гидроксильные группы; (viii) азиридин, который является реакционноспособным в отношении нуклеофилов, таких как аминогруппы, за счет раскрытия кольца; (ix) диэтиловый эфир сквариковой кислоты; и (х) а-галогеналкиловый эфир.
Примеры амино-реакционноспособных ацилирующих групп включают, например, (i) изоцианат и изотиоцианат; (ii) сульфонилхлорид; (iii) галогенангидрид; (iv) активный сложный эфир, например, сложный нитрофениловый эфир или N-гидроксисукцинимидиловый эфир, или их производные (например, сложный эфир азидо-PEG2-PEG40-NHS); (v) ангидрид кислоты, например, смешанный, симметричный или N-карбоксиангидрид; (vi) ацилазид; и (vii) имидоэфир. Альдегиды и кетоны могут взаимодействовать с аминами с образованием оснований Шиффа, которые можно стабилизировать посредством восстановительного аминирования.
Следует понимать, что определенные функциональные группы могут быть преобразованы в другие функциональные группы перед реакцией, например, для придания дополнительной реакционной способности или селективности. Примеры методов, полезных для этой цели, включают превращение аминов в карбоксилы с использованием таких реагентов, как ангидриды дикарбоновых кислот; превращение аминов в тиолы с использованием таких реагентов, как N-ацетилгомоцистеин тиолактон, S-ацетилмеркаптоянтарный ангидрид, 2-иминотиолан или тиолсодержащие сукцинимидильные производные; превращение тиолов в карбоксилы с использованием таких реагентов, как α-галогенацетаты; превращение тиолов в амины с использованием таких реагентов, как этиленимин или 2-бромэтиламин; превращение карбоксилов в амины с использованием таких реагентов, как карбодиимиды, а затем диамины; и превращение спиртов в тиолы с использованием реагентов, таких как тозилхлорид, с последующей переэтерификацией тиоацетатом и гидролизом до тиола ацетатом натрия.
В некоторых вариантах осуществления линкер по изобретению (например, L или L', такой как LC в D-L-I) конъюгирован (например, с помощью любого из способов, описанных в настоящем документе) с Е (например, Fc-доменом или белком альбумином). В предпочтительных вариантах осуществления изобретения линкер конъюгирован посредством: (а) тиомочевинной связи (т.е. -NH(C=S)NH-) с лизином в Е; (b) карбаматной связи (т.е. -NH(C=O)-O) с лизином в Е; (с) аминовой связи посредством восстановительного аминирования (т.е. -NHCH2) между лизином и Е; (d) амидной связи (т.е. -NH-(C=O)CH2) с лизином в Е; (е) цистеин-малеимидного конъюгата между малеимидом линкера и цистеином в Е; (f) аминовой связи посредством восстановительного аминирования (т.е. -NHCH2) между линкером и углеводом в Е (например, гликозильной группы мономера Fc-домена или Fc-домена); (g) конъюгат цистеина, повторно соединенный мостиковой связью, где линкер конъюгирован с двумя цистеинами в Е; (h) оксимная связь между линкером и углеводом в Е (например, гликозильная группа мономера Fc-домена или Fc-домена); (i) оксимной связи между линкером и аминокислотным остатком в Е; (j) азидо-связи между линкером и Е; (к) прямого ацилирования линкера до Е; или (1) тиоэфирной связи между линкером и Е.
В некоторых вариантах осуществления линкер конъюгирован с Е, где связь включает структуру -NH(C=NH)X-, где X представляет собой О, HN или связь. В некоторых вариантах осуществления линкер конъюгирован с Е, где связь между остатком линкера и Е включает структуру -NH(C=O)NH-.
В некоторых вариантах осуществления линкер (например, активный сложный эфир, например, сложный нитрофениловый эфир или N-гидроксисукцинимидиловый эфир, или его производные (например, функционализированный линкер PEG (например, сложный эфир азидо-PEG2-PEG40-NHS)) конъюгирован с Е, при этом Т (например, DAR) составляет от 0,5 до 10,0, например, равно 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8.0, 7.9, 8, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9.0, 9.1, 9.2, 9.3, 9.4, 9.5, 9.6, 9.7, 9.8, 9.9 или 10.0. В этих случаях Е-(PEG2-PEG40)-азид может взаимодействовать с Int, имеющим концевой алкиновый линкер (например, L или L', такой как LC в D-L-I) посредством клик-конъюгации. Во время клик-конъюгации происходит катализируемая медью реакция азида (например, Ес-(PEG2-PEG40)-азид) с алкином (например, Int, имеющий концевой алкиновый линкер (например, L или L', такой как LC в D-L-I), образующий 5-членное гетероатомное кольцо. В некоторых вариантах осуществления линкер, конъюгированный с Е, представляет собой концевой алкин и конъюгирован с Int, имеющим концевой азид. Иллюстративные препараты препаратов Е-(PEG2-PEG40)-азида описаны в примерах 7, 8, 61, 84, 88 и 124. Иллюстративные фигуры конъюгатов, полученных посредством клик-конъюгирования, показаны на фигурах 43 и 61. Специалист в данной области легко поймет конечный продукт, полученный в результате конъюгации методом клик-химии.
Иллюстративные стратегии связывания (например, способы связывания мономера или димера ингибитора нейраминидазы с Е, например, посредством линкера) дополнительно изображены на фигурах 1, 28, 29, 30, 43 и 61. VI. Комбинированная терапия Противовирусные агенты
В некоторых вариантах осуществления один или несколько противовирусных агентов можно вводить в комбинации (например, вводить по существу одновременно (например, в одной и той же фармацевтической композиции или в отдельных фармацевтических композициях) или вводить отдельно в разное время) с конъюгатом, описанным в настоящем документе (например, конъюгатом любой из формул (1)-(5), (D-I)-(D-X), (D'-I), (M-I)-(M-X) или (M'-I)).
В некоторых вариантах осуществления противовирусный агент представляет собой противовирусный агент для лечения вируса гриппа. Например, противовирусный агент может представлять собой блокатор ионных каналов М2, ингибитор нейраминидазы (например, ингибитор нейраминидазы длительного действия), ингибитор полимеразы, ингибитор гемагглютинина, ингибитор белка слияния, ингибитор СОХ-2 или агонист PPAR. Противовирусный агент может быть нацелен либо на вирус, либо на субъекта-хозяина. Противовирусный агент для лечения вируса гриппа, используемый в комбинации с конъюгатом, описанным в настоящем документе (например, конъюгатом любой из формул (1)-(5), (D-I)-(D-X), (D'-I), (M-I)-(M-X) или (M'-I)), может быть выбран из осельтамивира, занамивира, перамивира, ланинамивира, CS-8958, амантадина, римантадина, циановирина-N, ингибитора кэп-зависимой эндонуклеазы (например, балоксавира марбоксил), ингибитора полимеразы (например, Т-705), ингибитора РВ2 (например, JNJ-63623872), конъюгированной сиалидазы (например, DAS181), тиазолида (например, нитазоксанид), ингибитора СОХ, агониста PPAR, нацеленного на гемагглютинин антитела (например, моноклональное антитело, такое как CR6261, CR8020, MEDI8852, МНАА4549А или VIS410) или siRNA, нацеленной на хозяина или вирусный ген, или их пролекарств, или их фармацевтически приемлемых солей.
Противовирусные вакцины
В некоторых вариантах осуществления любой из конъюгатов, описанных в настоящем документе (например, конъюгат любой из формул (1)-(5), (D-I)-(D-X), (D'-I), (M-I)-(M-X) или (M'-I)) вводят в комбинации с противовирусной вакциной (например, композицией, которая вызывает у субъекта иммунный ответ, направленный против вируса). Противовирусную вакцину можно вводить практически одновременно (например, в той же фармацевтической композиции или в отдельных фармацевтических композициях), что и конъюгаты, или можно вводить до или после конъюгатов (например, в течение периода, составляющего 1 день, 2 дня, 5 дней, 1 неделю, 2 недели, 3 недели, 1 месяц, 2 месяца, 6 месяцев или 12 месяцев или более).
В некоторых вариантах осуществления вирусная вакцина содержит иммуноген, который вызывает иммунный ответ у субъекта против вируса гриппа А, В, С или вируса парагриппа. В некоторых вариантах осуществления иммуноген представляет собой инактивированный вирус (например, вакцина представляет собой трехвалентную вакцину против гриппа, которая содержит очищенный и инактивированный материал вируса гриппа А, В, С или вируса парагриппа, или любую их комбинацию). В некоторых вариантах осуществления вакцину вводят в виде внутримышечной инъекции. В некоторых вариантах осуществления вакцина представляет собой живую вирусную вакцину, которая содержит аттенуированные (ослабленные) живые вирусы. В некоторых вариантах осуществления вакцину вводят в виде назального спрея.
VII. Способы
Способы, описанные в настоящем документе, включают, например, способы защиты от вирусной инфекции или лечения вирусной инфекции (например, инфекции, вызванной вирусом гриппа) у субъекта и способы предотвращения, стабилизации или ингибирования роста вирусных частиц. Способ лечения вирусной инфекции (например, инфекции, вызванной вирусом гриппа) у субъекта включает введение субъекту конъюгата, описанного в настоящем документе (например, конъюгата любой из формул (1)-(5), (D-I)-(D-X), (D'-I), (M-I)-(M-X) или (M'-I)), или его фармацевтической композиции. В некоторых вариантах осуществления вирусная инфекция вызвана вирусом гриппа (например, вирусом гриппа А, В, С или вирусом парагриппа). В некоторых вариантах осуществления вирусная инфекция вызвана устойчивым штаммом вируса. Способ предотвращения, стабилизации или ингибирования роста вирусных частиц или предотвращения репликации и распространения вируса включает контактирование вируса или участка, подверженного вирусному росту, с конъюгатом, описанным в настоящем документе (например, конъюгатом любой из формул (1)-(5), (D-I)-(D-X), (D'-I), (M-I)-(M-X) или (M'-I)) или его фармацевтической композицией.
Более того, способы, описанные в настоящем документе, также включают способы защиты от вирусной инфекции или лечения вирусной инфекции у субъекта путем введения субъекту конъюгата, описанного в настоящем документе (например, конъюгата любой из формул (1)-(5), (D-I)-(D-X), (D'-I), (M-I)-(M-X) или (M'-I)). В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает введение субъекту противовирусного агента или противовирусной вакцины.
Способы, описанные в настоящем документе, также включают способы защиты от вирусной инфекции или лечения вирусной инфекции у субъекта путем введения указанному субъекту (1) конъюгата, описанного в настоящем документе (например, конъюгата любой из формул (1)-(5), (D-I)-(D-X), (D'-I), (M-I)-(M-X) или (M'-I)), и (2) противовирусного агента или противовирусной вакцины. Способы, описанные в настоящем документе, также включают способы предотвращения, стабилизации или ингибирования роста вирусных частиц или предотвращения репликации или распространения вируса путем контактирования вируса или участка, подверженного вирусному росту, с (1) конъюгатом, описанным в настоящем документе (например, конъюгатом любой из формул (1)-(5), (D-I)-(D-X), (D'-I), (M-I)-(M-X) или (M'-I)), и (2) противовирусным средством или противовирусной вакциной.
В некоторых вариантах осуществления описанный в настоящем документе конъюгат (например, конъюгат любой из формул (1)-(5), (D-I)-(D-X), (D'-I), (M-I)-(M-X) или (M'-I)) вводят первым, а затем вводят взятый отдельно противовирусный агент или противовирусную вакцину. В некоторых вариантах осуществления сначала вводят противовирусный агент или противовирусную вакцину, а затем вводят взятый отдельно конъюгат, описанный в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления описанный в настоящем документе конъюгат и противовирусный агент или противовирусную вакцину вводят по существу одновременно (например, в одной фармацевтической композиции или в отдельных фармацевтических композициях). В некоторых вариантах осуществления сначала вводят конъюгат, описанный в настоящем документе, или противовирусный агент или противовирусную вакцину, а затем вводят конъюгат, описанный в настоящем документе, и противовирусный агент или противовирусную вакцину по существу одновременно (например, в одной фармацевтической композиции или в отдельных фармацевтических композициях). В некоторых вариантах осуществления описанный в настоящем документе конъюгат и противовирусный агент или противовирусную вакцину вводят сначала по существу одновременно (например, в одной фармацевтической композиции или в отдельных фармацевтических композициях) с последующим введением взятого отдельно конъюгата, описанного в настоящем документе, или противовирусного агента или противовирусной вакцины. В некоторых вариантах осуществления, когда конъюгат, описанный в настоящем документе (например, конъюгат любой из формул (1)-(5), (D-I)-(D-X), (D'-I), (M-I)-(M-X) или (M'-I)) и противовирусный агент или противовирусную вакцину вводят вместе (например, по существу одновременно в одной или отдельных фармацевтических композициях, или отдельно в одной схеме лечения), ингибирование вирусной репликации каждого из конъюгата и противовирусного агента или противовирусной вакцины может быть больше (например, возникать при более низкой концентрации), чем ингибирование вирусной репликации каждого из конъюгата и противовирусного агента или противовирусной вакцины, когда каждый из них используется отдельно в схеме лечения. VIII. Фармацевтические композиции и препараты
Описанный в настоящем документе конъюгат может быть составлен в фармацевтическую композицию для применения в описанных в настоящем документе способах. В некоторых вариантах осуществления описанный в настоящем документе конъюгат может быть составлен только в фармацевтическую композицию. В некоторых вариантах осуществления описанный в настоящем документе конъюгат может быть составлен в сочетании с противовирусным агентом или противовирусной вакциной в фармацевтическую композицию. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция включает конъюгат, описанный в настоящем документе (например, конъюгат, описанный любой из формул (1)-(5), (D-I)-(D-X), (D'-I), (M-I)-(М-Х) или (M'-I)), и фармацевтически приемлемые носители и вспомогательные вещества.
Приемлемые носители и вспомогательные вещества в фармацевтических композициях нетоксичны для реципиентов в используемых дозировках и концентрациях. Приемлемые носители и наполнители могут включать буферы, такие как фосфат, цитрат, HEPES и ТАЕ, антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота и метионин, консерванты, такие как хлорид гексаметония, октадецил диметил бензил аммония хлорид, резорцин и хлорид бензалкония, белки, такие как человеческий сывороточный альбумин, желатин, декстран и иммуноглобулины, гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон, аминокислотные остатки, такие как глицин, глутамин, гистидин и лизин, и углеводы, такие как глюкоза, манноза, сахароза и сорбит.
Примеры других вспомогательных веществ включают, но без ограничения, антиадгезивные вещества, связывающие вещества, покрытия, добавки для прессования, разрыхлители, красители, смягчающие вещества, эмульгаторы, наполнители (разбавители), пленкообразователи или покрытия, вкус о ароматические добавки, отдушки, глиданты (усилители текучести), смазывающие вещества, сорбенты, суспендирующие или диспергирующие агенты или подсластители. Иллюстративные вспомогательные вещества включают, но без ограничения: бутилированный гидрокситолуол (ВНТ), карбонат кальция, фосфат кальция (двухосновный), стеарат кальция, крое карме ллозу, сшитый поливинилпирролидон, лимонную кислоту, кросповидон, цистеин, этилцеллюлозу, желатин, гидроксипропилцеллюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозу, лактозу, стеарат магния, мальтит, маннит, метионин, метилцеллюлозу, метилпарабен, микрокристаллическую целлюлозу, полиэтиленгликоль, повидон, прежелатинизированный крахмал, пропилпарабен, ретинилпальмитат, шеллак, диоксид кремния, карбоксиметилцеллюлозу натрия, цитрат натрия, натрия крахмала гликолят, сорбит, крахмал (кукурузный), стеариновую кислоту, стеариновую кислоту, сахарозу, тальк, диоксид титана, витамин А, витамин Е, витамин С и ксилит.
Конъюгаты в настоящем документе могут иметь ионизируемые группы, чтобы их можно было получить в виде фармацевтически приемлемых солей. Эти соли могут быть кислотно-аддитивными солями, включающими неорганические или органические кислоты, или в случае кислотных форм конъюгатов, представленных здесь, соли могут быть получены из неорганических или органических оснований. Часто конъюгаты получают или используют в виде фармацевтически приемлемых солей, полученных как продукты присоединения фармацевтически приемлемых кислот или оснований. Подходящие фармацевтически приемлемые кислоты и основания хорошо известны в данной области, такие как соляная, серная, бромистоводородная, уксусная, молочная, лимонная или винная кислоты для образования кислотно-аддитивных солей, а также гидроксид калия, гидроксид натрия, гидроксид аммония, кофеин, различные амины и т.п. для образования основных солей. Способы получения соответствующих солей хорошо известны в данной области.
Типичные кислотно-аддитивные соли включают, но без ограничения, ацетат, адипат, альгинат, аскорбат, аспартат, бензолсульфонат, бензоат, бисульфат, борат, бутират, камфорат, камфорсульфонат, цитрат, циклопентанпропионат, диглюконат, додецилсульфат, этансульфонат, фумарат, глюкогептанат, глицерофосфат, гемисульфат, гептонат, гексаноат, гидробромид, гидрохлорид, гидроиодид, 2-гидрокси-этансульфонат, лактобионат, лактат, лаурат, лаурилсульфат, малат, малеат, малонат, метансульфонат, 2-нафталинсульфонат, никотинат, нитрат, олеат, оксалат, пальмитат, памоат, пектинат, персульфат, 3-фенилпропионат, фосфат, пикрат, пивалат, пропионат, стеарат, сукцинат, сульфат, тартрат, тиоцианат, толуолсульфонат, ундеканоат и валерат.Типичные соли щелочных или щелочноземельных металлов включают, но без ограничения, натрий, литий, калий, кальций и магний, а также нетоксичные катионы аммония, четвертичного аммония и аминов, включая, но без ограничения, аммоний, тетраметиламмоний, тетраэтиламмоний, метиламин, диметиламин, триметиламин, триэтиламин и этиламин.
В зависимости от пути введения и дозировки конъюгат в настоящем документе или его фармацевтическая композиция, применяющиеся в способах, описанных в настоящем документе, будут составлены в подходящие фармацевтические композиции для обеспечения легкой доставки. Конъюгат (например, конъюгат любой из формул (1)-(5), (D-I)-(D-X), (D'-I), (M-I)-(M-X) или (M'-I)) или его фармацевтическая композиция могут быть составлены для внутримышечного, внутривенного (например, в виде стерильного раствора и в системе растворителей, подходящих для внутривенного применения), внутрикожного, внутриартериального, внутрибрюшинного, внутриочагового, внутричерепного, внутрисуставного, интрапростатического, внутриплеврального, интратрахеального, интраназального, интравитреального, интравагинального, интраректального, местного, внутриопухолевого, перитонеального, подкожного, субконъюнктивального, интравезикулярного, мукозального, интраперикардиального, внутрипуповинного, внутриглазного, перорального (например, таблетка, капсула, твердая таблетка в форме капсулы, желатиновая капсула или сироп), топического (например, в виде крема, геля, лосьона или мази), местного, путем ингаляции, путем инъекции или инфузии (например, непрерывной инфузии, посредством локализованной перфузии с непосредственным омыванием клеток-мишеней, через катетер, лаваж, в виде крема или в виде липидных композиций). В зависимости от пути введения конъюгат по настоящему изобретению или его фармацевтическая композиция могут быть представлены в форме, например, таблеток, капсул, пилюль, порошков, гранулятов, суспензий, эмульсий, растворов, гелей, включая гидрогели, паст, мазей, кремов, пластырей, жидких лекарственных форм для перорального введения, устройств для осмотической доставки, суппозиториев, клизм, инъекционных растворов, имплантатов, спреев, препаратов, подходящих для ионтоферетической доставки, или аэрозолей. Композиции могут быть составлены в соответствии с обычной фармацевтической практикой.
Описанный в настоящем документе конъюгат может быть составлен различными способами, известными в данной области. Для применения в лечении людей и животных описанный в настоящем документе конъюгат может быть составлен в виде фармацевтических или ветеринарных композиций. В зависимости от субъекта (например, человека), подлежащего лечению, способа введения и типа желаемого лечения, например, профилактики или терапии, конъюгат, описанный в настоящем документе, составляют способами, соответствующими этим параметрам. Краткое изложение таких методов можно найти в Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22nd Edition, Lippincott Williams & Wilkins (2012); и Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, 4th Edition, J. Swarbrick and J. C. Boylan, Marcel Dekker, New York (2013), каждая из которых включена в настоящий документ посредством ссылки.
Составы могут быть изготовлены способом, подходящим для системного введения или топического, или местного введения. Системные составы включают составы, предназначенные для инъекции (например, внутримышечной, внутривенной или подкожной инъекции), или могут быть изготовлены для трансдермального, трансмукозального или перорального введения. Состав обычно включает разбавитель, а также, в некоторых случаях, адъюванты, буферы и консерванты. Конъюгаты можно также вводить в липосомальных композициях или в виде микроэмульсий. Системное введение может также включать относительно неинвазивные способы, такие как использование суппозиториев, трансдермальных пластырей, трансмукозальной доставки и интраназального введения. Для конъюгатов в настоящем документе также подходит пероральное введение. Подходящие формы включают сиропы, капсулы и таблетки, как известно в данной области.
Фармацевтические композиции можно вводить парентерально в форме инъекционного состава. Фармацевтические композиции для инъекции могут быть составлены с использованием стерильного раствора или любой фармацевтически приемлемой жидкости в качестве носителя. Составы могут быть изготовлены в виде твердых форм, подходящих для растворения или суспендирования в жидкости перед инъекцией, или в виде эмульсий. Фармацевтически приемлемые носители включают, но без ограничения, стерильную воду, физиологический раствор и среды для культивирования клеток (например, модифицированную по способу Дульбекко среду Игла (DMEM), α-модифицированную среду Игла (α-МЕМ), среду F-12). Такие инъекционные композиции могут также содержать количества нетоксичных вспомогательных веществ, таких как смачивающие или эмульгирующие агенты, буферные агенты для регулирования рН, такие как ацетат натрия и монолаурат сорбитана. Способы составления известны в данной области, см., например, Pharmaceutical Preformulation and Formulation, 2nd Edition, M. Gibson, Taylor & Francis Group, CRC Press (2009).
Фармацевтические композиции могут быть приготовлены в форме перорального препарата. Составы для перорального применения включают таблетки, содержащие активный ингредиент(ы) в смеси с нетоксичными фармацевтически приемлемыми вспомогательными веществами. Эти вспомогательные вещества могут представлять собой, например, инертные разбавители или наполнители (например, сахарозу, сорбит, сахар, маннит, микрокристаллическую целлюлозу, крахмалы, включая картофельный крахмал, карбонат кальция, хлорид натрия, лактозу, фосфат кальция, сульфат кальция или фосфат натрия); гранулирующие и дезинтегрирующие агенты (например, производные целлюлозы, включая микрокристаллическую целлюлозу, крахмалы, включая картофельный крахмал, кроскармеллозу натрия, альгинаты или альгиновую кислоту); связывающие агенты (например, сахарозу, глюкозу, сорбит, гуммиарабик, альгиновую кислоту, альгинат натрия, желатин, крахмал, прежелатинизированный крахмал, микрокристаллическую целлюлозу, алюмосиликат магния, натрийкарбоксиметил целлюлозу, метилцеллюлозу, гидроксипропилметил целлюлозу, этилцеллюлозу, поливинилпирролидон или полиэтиленгликоль); и смазывающие агенты, вещества, способствующие скольжению, и антиадгезивы (например, стеарат магния, стеарат цинка, стеариновая кислота, диоксид кремния, гидрогенизированные растительные масла или тальк). Составы для перорального применения также могут быть представлены в виде жевательных таблеток или твердых желатиновых капсул, в которых активный ингредиент смешан с инертным твердым разбавителем (например, картофельным крахмалом, лактозой, микрокристаллической целлюлозой, карбонатом кальция, фосфатом кальция или каолином) или в виде мягких желатиновых капсул, в которых активный ингредиент смешан с водой или масляной средой, например, арахисовым маслом, жидким парафином или оливковым маслом. Порошки, гранулы и пеллеты могут быть изготовлены с использованием ингредиентов, упомянутых выше в разделе таблеток и капсул, обычным способом с использованием, например, миксера, аппарата с псевдоожиженным слоем или оборудования для распылительной сушки.
Другие фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества для пероральных составов включают, но без ограничения, красители, ароматизаторы, пластификаторы, увлажнители и буферные агенты. Составы для перорального применения также могут быть представлены в виде жевательных таблеток или твердых желатиновых капсул, в которых активный ингредиент смешан с инертным твердым разбавителем (например, картофельным крахмалом, лактозой, микрокристаллической целлюлозой, карбонатом кальция, фосфатом кальция или каолином) или в виде мягких желатиновых капсул, в которых активный ингредиент смешан с водой или масляной средой, например, арахисовым маслом, жидким парафином или оливковым маслом. Порошки, гранулы и пеллеты могут быть изготовлены с использованием ингредиентов, упомянутых выше для таблеток и капсул, обычным способом с использованием, например, смесителя, аппарата с псевдоожиженным слоем или оборудования для распылительной сушки.
Контролируемое растворением или диффузией высвобождение конъюгата, описанного в настоящем документе (например, конъюгата любой из формул (1)-(5), (D-I)-(D-X), (D'-I), (M-I)-(M-X) или (M'-I)), или его фармацевтической композиции может быть достигнуто путем нанесения соответствующего покрытия на таблетку, капсулу, пилюлю или гранулированный состав конъюгата, или путем включения конъюгата в соответствующую матрицу. Покрытие с контролируемым высвобождением может включать одно или несколько веществ покрытия, упомянутых выше, и/или, например, шеллак, пчелиный воск, гликовакс, касторовый воск, карнаубский воск, стеариловый спирт, глицерилмоностеарат, глицерилдистеарат, глицерилпальмитостеарат, этилцеллюлозу, акриловые смолы, dl-полимолочную кислоту, ацетобутират целлюлозы, поливинилхлорид, полив инилацетат, винилпирролидон, полиэтилен, полиметакрилат, метилметакрилат, 2-гидроксиметакрилат, метакрилатные гидрогели, 1,3-бутиленгликоль, этиленгликоль метакрилата и/или полиэтиленгликоли. В составе с матрицей контролируемого высвобождения материал матрицы может также включать, например, гидратированную метилцеллюлозу, карнаубский воск и стеариловый спирт, карбопол 934, силикон, глицерилтристеарат, сополимер метилакрилат-метилметакрилат, поливинилхлорид, полиэтилен и/или галогениро ванный фторуглерод.
При необходимости фармацевтическая композиция может быть изготовлена в форме стандартной дозы. Количество активного компонента, например, конъюгата, описанного в настоящем документе (например, конъюгата любой из формул (1)-(5), (D-I)-(D-X), (D'-I), (M-I)-(M-X) или (M'-I)), включенного в фармацевтические композиции, таковы, что обеспечивается подходящая доза в указанном диапазоне (например, доза в диапазоне 0,01-100 мг/кг массы тела).
IX. Пути введения и дозировки
В любом из способов, описанных в настоящем документе, конъюгаты в настоящем документе могут быть введены любым подходящим путем для лечения или защиты от вирусной инфекции (например, инфекции, вызванной вирусом гриппа), или для предотвращения, стабилизации или ингибирования пролиферации или распространения вируса (например, вируса гриппа). Описанные в настоящем документе конъюгаты можно вводить людям, домашним животным, домашнему скоту или другим животным с фармацевтически приемлемым разбавителем, носителем или вспомогательным веществом. В некоторых вариантах осуществления введение включает введение любого из конъюгатов, описанных в настоящем документе (например, конъюгатов любой из формул (1)-(5), (D-I)-(D-X), (D'-I), (M-I)-(M-X) или (M'-I)), или композиций внутримышечно, внутривенно (например, в виде стерильного раствора и в системе растворителей, подходящей для внутривенного применения), внутрикожно, внутриартериально, внутрибрюшинно, внутрь очага поражения, интракраниально, внутрисуставно, внутрь предстательной железы, внутриплеврально, интратрахеально, интраназально, интравитреально, внутривагинально, интраректально, местно, внутрь опухоли, внутримышечно, подкожно, подконъюктивально, интравезикулярно, через слизистые оболочки, интраперикардиально, через пуповину, интраокулярно, перорально (например, таблетка, капсула, таблетка в форме капсулы, мягкая капсула или сироп), топически (например, в виде крема, геля, лосьона или мази), местно, путем ингаляции, путем инъекции или путем инфузии (например, непрерывной инфузии, посредством локализованной перфузии с непосредственным омыванием клеток-мишеней, через катетер, лаваж, в виде крема или в виде липидных композиций). В некоторых вариантах осуществления, если противовирусный агент также вводят в дополнение к конъюгату, описанному в настоящем документе, противовирусный агент или его фармацевтическую композицию также можно вводить любым из способов введения, описанных в настоящем документе.
Дозировка конъюгата, описанного в настоящем документе (например, конъюгата любой из формул (1)-(5), (D-I)-(D-X), (D'-I), (M-I)-(M-X) или (M'-I)) или его фармацевтических композиций зависит от факторов, включающих путь введения, заболевание, подлежащее лечению (например, степень и/или состояние вирусной инфекции), и физических характеристик, например, возраста, веса, общего состояния здоровья субъекта. Обычно количество конъюгата или его фармацевтической композиции, содержащейся в однократной дозе, может представлять собой количество, которое эффективно предотвращает, задерживает или лечит вирусную инфекцию, не вызывая значительной токсичности. Фармацевтическая композиция может включать дозировку конъюгата, описанного в настоящем документе, в диапазоне от 0,01 до 500 мг/кг (например, 0,01, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 или 500 мг/кг) и в более конкретном варианте осуществления от около 0,1 до около 30 мг/кг, и в более конкретном варианте осуществления от около 1 до около 30 мг/кг. В некоторых вариантах осуществления, когда конъюгат, описанный в настоящем документе (например, конъюгат любой из формул (1)-(5), (D-I)-(D-X), (D'-I), (M-I)-(M-X) или (M'-I)), и противовирусный агент или противовирусную вакцину вводят в комбинации (например, по существу одновременно в одной и той же или отдельных фармацевтических композициях, или по отдельности в одной и той же схеме лечения), необходимая доза конъюгата, описанного в настоящем документе, может быть ниже, чем необходимая доза конъюгата, если конъюгат применяют отдельно в схеме лечения.
Описанный в настоящем документе конъюгат (например, конъюгат любой из формул (1)-(5), (D-I)-(D-X), (D'-I), (M-I)-(M-X) или (M'-I)) или его фармацевтическая композиция может быть введена субъекту, нуждающемуся в этом, например, один или несколько раз (например, 1-10 раз или более; 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 раз) ежедневно, еженедельно, ежемесячно, раз в два года, ежегодно или по медицинским показаниям. Режим дозирования может быть обеспечен в виде режимов однократного или многократного дозирования. Время между введениями может уменьшаться по мере улучшения состояния здоровья или увеличиваться по мере ухудшения состояния пациента. Доза и частота введения могут быть адаптированы врачом в соответствии с общепринятыми факторами, такими как степень инфекции и различные параметры субъекта.
ПРИМЕРЫ
Следующие примеры приведены для того, чтобы предоставить рядовым специалистам в данной области описание того, как композиции и способы, описанные в настоящем документе, могут быть применены, изготовлены и оценены, и предназначены лишь для иллюстрации изобретения и не предназначены для ограничения объема того, что авторы изобретения рассматривают в качестве своего изобретения.
Пример 1: Получение конструкций Fc
Обратные трансляции аминокислот, содержащих белковые конструкции (SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 12 и 14), были синтезированы с помощью твердофазного синтеза. Олигонуклеотидные матрицы клонировали в pcDNA3.1 (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) в сайтах клонирования BamHI и XhoI (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA) и включали сигнальные последовательности, полученные из человеческого интерлейкина-2 или человеческого альбумина. Плазмиды pcDNA3.1 трансформировали в клетки Е. coli Тор 10 (LifeTech). ДНК амплифицировали, экстрагировали и очищали с использованием набора PURELINK® HiPure Plasmid Filter Maxiprep Kit (LifeTech). Плазмидную ДНК доставляли с использованием набора для трансфекции ExpiFectamine™ 293 Transfection Kit (LifeTech) в клетки НЕК-293 в соответствии с протоколом производителя. Клетки центрифугировали, фильтровали и супернатанты очищали с использованием смолы MabSelect Sure Resin (GE Healthcare, Chicago, IL, USA). Очищенные молекулы анализировали с использованием гелей 4-12% Bis Tris SDS PAGE путем загрузки 1-2 мкг каждой молекулы в гель и окрашивания с использованием мгновенного окрашивания синим. Каждый гель включал маркер размера молекулярной массы с указанными стандартами молекулярной массы (фиг.2-8). Полосы в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях обозначаются буквами «R» и «NR». На фиг.2-8 показан SDS-PAGE в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях Fc-домена, образованного из мономеров Fc-домена, имеющих последовательности, представленные в SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 12 и 14, соответственно.
Пример 2. Синтез промежуточного соединения занамивира
Стадия а.
Метил 5-ацетамидо-7,8,9-O-триацетил-2,6-ангидро-4-азидо-3,4,5-тридеокси-В-глицеро-D-галакто-нон-2-енонат (4,56 г, 10,0 ммоль) растворяли в безводном THF (15 мл), и раствор охлаждали приблизительно до 13°С. Трифенилфосфин (2,89 г, 11 ммоль) добавляли порциями в течение 20 минут. Полученную смесь перемешивали при температуре приблизительно 13°С до комнатной температуры в течение 2 часов, затем по каплям добавляли раствор LiOH (24 мг, 1 ммоль) в воде (1,5 мл). После перемешивания в течение 28 часов к реакционной смеси добавляли N,N'-бис-boc-1-гуанилпиразол (3,26 г, 10,5 ммоль) и 4-диметиламинопиридин (244,4 мг, 2 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в течение 1,5 дней. Затем его разбавляли смесью 1:1 этилацетаттексаны (100 мл) и экстрагировали водой (30 мл). Водный слой снова экстрагировали этилацетатом (30 мл). Объединенные органические слои концентрировали на роторном испарителе. Остаток очищали с помощью хроматографии на колонке с обращенной фазой С18 (150 г, 25-70% ацетонитрила в воде). Собранные фракции концентрировали на роторном испарителе при комнатной температуре. Получали мутный водный раствор, и большая часть продукта осаждалась на колбе в виде геля. Затем раствор экстрагировали этилацетатом (150 мл). Органический слой использовали для повторного растворения гелевого материала. Затем его сушили над Na2SO4, концентрировали на роторном испарителе и дополнительно сушили под высоким вакуумом с получением указанного в заголовке соединения в виде белой пены. Выход 6,24 г, 92,8%. Ион, обнаруженный с помощью LCMS: [М+Н]+=673,2.
Стадия b.
Раствор продукта, полученного на стадии-а (6,24 г, 9,28 ммоль) в безводном МеОН (20 мл) охлаждали на бане с ледяной водой и медленно добавляли 0,5 М раствор метоксида натрия в МеОН (26 мл, 13 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в течение 1 часа, затем ее рН осторожно доводили до 7-7,5 путем добавления по каплям 4 N раствора НС1 в диоксане (3 мл). Растворитель удаляли на роторном испарителе при температуре не выше комнатной. Остаток разбавляли смесью 2:1 этилацетата и гексана (150 мл), и полученный раствор экстрагировали водой (20 мл). Водный слой снова экстрагировали этилацетатом (30 мл). Объединенные органические слои сушили над Na2SO4, концентрировали на роторном испарителе и затем сушили под высоким вакуумом. Продукт переносили на следующую стадию без дополнительной очистки. Выход 5,03 г, 99,2%. Ион, обнаруженный с помощью LCMS: [М+Н]+=547.2.
Стадия с.
Продукт, полученный на стадии-b (713 мг, 1,3 ммоль) в безводном DCM (6 мл) охлаждали на бане с ледяной водой и добавляли 4-диметиламинопиридин (159,8 мг, 1,3 ммоль) и DIPEA (520 мг, 4 ммоль). Затем к смеси по каплям добавляли раствор 4-нитрофенилхлорформиата (356,6 мг, 2,2 ммоль) в безводном DCM (2 мл). Затем удаляли баню с ледяной водой и реакционную смесь перемешивали в течение 3 часов и контролировали с помощью LCMS (при необходимости может быть добавлено дополнительное количество 4-нитр о фенил хлорформиата). После завершения реакции ее гасили водой (10 мл), и органический слой экстрагировали и концентрировали роторным испарением. Остаток очищали хроматографией на колонке с обращенной фазой С18 (100 г, 20-70% ацетонитрила в воде). Ацетонитрил из собранных фракций удаляли роторным испарением при комнатной температуре. Затем водный слой экстрагировали смесью 1:1 этилацетата и гексана (120 мл). Водный слой снова экстрагировали этилацетатом (30 мл). Объединенные органические слои сушили над Na2SO4, концентрировали роторным испарением и дополнительно сушили под высоким вакуумом с получением указанного в заголовке соединения в виде белого твердого вещества. Выход 520 мг, 70%. Ион, обнаруженный с помощью LCMS: [М+Н]+=573.2.
Пример 3. Синтез линкера-1
Стадия а.
К смеси Z-D-глутаминового γ-метилового эфира (2,0 г, 6,77 ммоль) и метилового эфира глицина HCl (1,282 г, 10,2 ммоль) в безводном DMF (7 мл) добавляли DIPEA (2,02 г, 15,57 ммоль), а затем HATU (2,66 г, 7,0 ммоль) порциями в течение 25 минут. После растворения HATU добавляли дополнительное количество DIPEA (1,15 г, 8,8 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в течение 1,5 часов, затем экстрагировали 5% водной HCl (100 мл) и EtOAc (100 мл × 2). Органический слой концентрировали на роторном испарителе. Остаток повторно экстрагировали водой (100 мл) и смесью EtOAc/гексаны (2:1, 150 мл). Органический слой сушили над Na2S04, концентрировали на роторном испарителе и затем сушили под высоким вакуумом до белого твердого вещества. Неочищенный продукт использовали на следующей стадии без дополнительной очистки. Выход 2,3 г, 93%. Ион, обнаруженный с помощью LCMS: [М+Н]+ =367.
Стадия b.
Продукт, полученный на стадии-а (2,3 г, 6,29 ммоль) растворяли в смеси МеОН и THF (10 мл), 1: 1. После охлаждения раствора на бане с ледяной водой порциями в течение 1,5 часов добавляли раствор моногидрата LiOH (630 мг, 15 ммоль) в воде (9 мл). После перемешивания в течение 2 дополнительных часов реакционную смесь нейтрализовали 4N HCl в диоксане (3,7 мл). Органический растворитель частично удаляли роторным испарением при комнатной температуре. Оставшийся материал очищали непосредственно с помощью RPLC (150 г, 0-39% ацетонитрила в воде). Выход 2,03 г, 88,7% за две стадии. Ион, обнаруженный с помощью LCMS: [М+Н]+=339.2.
Стадия с.
К смеси продукта, полученного на стадии-b (1,41 г, 4,17 ммоль), и N-Boc-1,6-диаминогексана (1,99 г, 9,2 ммоль) в безводном DMF (6 мл) и DIPEA (1,3 г, 10 ммоль) добавляли раствор HATU (3,5 г, 9,2 ммоль) в DMF (10 мл) добавляли с помощью шприцевого насоса со скоростью 11 мл/ч. После завершения добавления HATU реакционную смесь перемешивали еще 30 минут и непосредственно очищали с помощью RPLC (150 г, 10-50% ацетонитрила в воде, используя 0,1% TFA в качестве модификатора). Выход 1,3 г, 42,4%. Ион, обнаруженный с помощью LCMS: [М+Н]+=735, [М - Boc+Н]+=635,4.
Стадия d.
Продукт, полученный на стадии-с (1,3 г, 1,77 ммоль), растворяли в МеОН (20 мл) и к раствору добавляли Pd/C. Смесь перемешивали в атмосфере водорода в течение 4 часов. Pd/C отфильтровывали, и фильтрат концентрировали роторным испарением, а затем сушили под высоким вакуумом. Выход 1,03 г, 96,9%. Ион, обнаруженный с помощью LCMS: [М+Н]+=601.
Стадия е.
Высушенную в пламени реакционную колбу продували азотом и загружали 4-азидомасляной кислотой (77 мг, 0,6 ммоль), N-гидроксисукцинимидом (92 мг, 0,8 ммоль) и безводным DMF (0,5 мл). Смесь перемешивали для растворения твердых веществ, а затем добавляли DCC (125,5 мг, 0,608 ммоль). После перемешивания в течение одного часа к реакционной смеси добавляли продукт, полученный на стадии-d (300 мг, 0,5 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в течение 6 часов и очищали непосредственно с помощью RPLC (150 г, 10-70% ацетонитрила в воде, используя 0,1% TFA в качестве модификатора). Собранные фракции лиофилизировали до белого твердого вещества (LCMS: [М+Н]+=712, [М - Вос + Н]+=612). Материал повторно растворяли в DCM (~ 2 мл) и TFA (~ 1 мл) и перемешивали в течение 15 минут. Затем его концентрировали роторным испарением и остаток очищали с помощью RPLC (50 г, 0-40% ацетонитрила в воде). Выход 255 мг, 68,9%. Ионы, обнаруженные с помощью LCMS: [М+Н]+=512, [(М+2Н)/2]+=256.
Пример 4. Синтез промежуточного соединения-1
Стадия а.
К раствору промежуточного соединения занамивира (пример 2) (532,5 мг, 0,93 ммоль) в безводном THF (2 мл) добавляли DMAP (490 мг, 4 ммоль), а затем бис(пентафторфенил)карбонат (385 мг, 0,911 ммоль). После перемешивания в течение ночи к реакционной смеси добавляли раствор линкера-1 (пример 3) (245,6 мг, 0,332 ммоль) в безводном DMF (1 мл) и DIPEA (91 мг, 0,3 ммоль). Реакцию продолжали в течение 2 часов, затем очищали с помощью RPLC (100 г, 5-67% ацетонитрила в воде). Выход 135 мг, 23,8%. Ион, обнаруженный с помощью LCMS: [(М+2Н)/2]+=845.9.
Стадия b.
Продукт, полученный на стадии-а (135 мг, 0,079 ммоль) растворяли в TFA (0,5 мл), и раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 20 минут. Затем его непосредственно очищали с помощью RPLC (50 г, 5-32% ацетонитрила в воде). Выход 88 мг, 85,1%. Ион, обнаруженный с помощью LCMS: [(М+2Н)/2]+=654.8.
Стадия с.
Раствор продукта, полученного на стадии b (88 мг, 0,0673 ммоль) в МеОН (1,5 мл) охлаждали на бане с ледяной водой и добавляли LiOH (5 мг, 0,2 ммоль) в воде (0,5 мл). После перемешивания смеси в течение 5 часов ее подкисляли раствором 4N HCl в диоксане (0,1 мл) и очищали с помощью HPLC (5-20% ацетонитрила в воде, используя 0,1% TFA в качестве модификатора). Выход 76,4 мг, 78%. Ион, обнаруженный с помощью LCM: [(М + 2Н)/2]+ =614.8.
Пример 5. Синтез линкера-2
Стадия а.
К раствору про пар гил-PEG4-кислоты (364,4 мг, 1,4 ммоль) в безводном DMF (2 мл) добавляли HATU (558,9 мг, 1,47 ммоль). После перемешивания для растворения всего связывающего реагента добавляли DIPEA (390 мг, 3 ммоль) и перемешивали в течение 10 минут. Добавляли раствор продукта, полученного на стадии-d линкера-1 (пример 3, стадия d) (701,1 мг, 1,167 ммоль) в безводном DMF (1 мл). Полученную смесь перемешивали в течение 30 минут и непосредственно очищали с помощью RPLC (100 г, 5-60% ацетонитрила в воде). Выход 830 мг, 84,4%. Ион, обнаруженный с помощью LCMS: [М+Н]+=843.
Стадия b.
Продукт, полученный на стадии-а, растворяли в THF (5 мл) и обрабатывали раствором 4N НС1 в диоксане (2,5 мл). После перемешивания при комнатной температуре в течение ночи реакционную смесь концентрировали роторным испарением. Остаток повторно растворяли в смеси ацетонитрил/вода (1:1, 16 мл) и раствор лиофилизировали. Неочищенный продукт использовали на следующей стадии без дополнительной очистки. Выход 761,8 мг, 100%. Ион, обнаруженный с помощью LCMS: [М+Н]+=643.8.
Пример 6. Синтез промежуточного соединения-2
Стадия а.
Высушенную пламенем реакционную колбу продували азотом и загружали промежуточным соединением занамивиром (пример 2) (533,6 мг, 0,812 ммоль), DMAP (99,8 мг, 0,81 ммоль) и безводным DCM (1 мл). После перемешивания для растворения исходного материала раствор охлаждали на бане с ледяной водой и добавляли 4-нитрофенилхлорформиат (242 мг, 1,2 ммоль). Полученную смесь перемешивали в течение 5 часов, затем добавляли к раствору линкера-2 (пример 5) (228,4 мг, 0,319 ммоль) в безводном DMF (1 мл) и DIPEA (130 мг, 1 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в течение ночи и очищали с помощью RPLC (150 г, 20-65% ацетонитрила в воде, используя 0,1% TFA в качестве модификатора). Собранные фракции лиофилизировали. Выход 178,3 мг, 30,4%. Ион, обнаруженный с помощью LCMS: [(М+2Н)/2]+=920.5, [(М+3Н)/3]+=614.2.
Стадия b.
Продукт, полученный на стадии а (178,3 мг, 0,0969 ммоль) растворяли в TFA (0,5 мл). Раствор перемешивали в течение 20 минут, затем очищали непосредственно с помощью HPLC (0-25% ацетонитрила в воде, используя 0,1% TFA в качестве модификатора). Выход 91,8 мг, 56,8%. Ионы, обнаруженные с помощью LCMS: [(М+2Н)/2]+=720.4, [(М+3H)/3]+=480.6.
Стадия с.
Продукт, полученный на стадии b (91,8 мг, 0,055 ммоль) растворяли в МеОН (1 мл) и раствор охлаждали на бане с ледяной водой. Моногидрат LiOH (21 мг, 0,5 ммоль) в воде (1 мл) добавляли частями в течение 1 часа. После перемешивания еще в течение 2 часов реакционную смесь подкисляли раствором 4N HCl в диоксане (0,3 мл) и очищали с помощью HPLC (0-20% ацетонитрила в воде, используя 0,1% TFA в качестве модификатора). Выход 36,2 мг, 59,4%.%. Ионы, обнаруженные с помощью LCMS: [(М+2Н)/2]+=680.3, [(М+3H)/3]+=454.0.
Пример 7. Синтез h-IgG1 Fc-PEG4-азида
Сложный эфир PEG4-азидоNHS (98%, 180 мкмоль, 9,5 эквивалентов, 71,4 мг в 0,5 мл DMF и разбавленный до 3,60 мл 1х буферным раствором PBS при рН 7,4) добавляли к раствору h-IgG1 Fc (SEQ ID NO: 4) (1103 мг в 70,0 мл PBS при рН 7,4, MW ~ 58000 Да, 19,0 мкмоль), и смесь осторожно встряхивали в течение 12 часов при температуре окружающей среды. Раствор концентрировали с использованием центробежного концентратора (30000 MWCO) до объема ~ 1,5 мл. Неочищенную смесь разбавляли 1:10 в PBS рН 7,4 и снова концентрировали. Эту процедуру промывки повторяли в общей сложности три раза. С помощью этой процедуры промывки удаляли низко молекулярный реагент. Концентрированный Ес-PEG4-азид разбавляли до 70,0 мл 1х буфером PBS при рН 7,4 и готовили для «клик»-конъюгации. Очищенный материал количественно оценивали с использованием УФ-спектрофотометра Nanodrop™ в видимой области спектра (с использованием рассчитанного коэффициента экстинкции, основанного на аминокислотной последовательности h-IgG1). Выход количественный после очистки. Значение DAR=4,3 определяли с помощью MALDI. Значение DAR можно регулировать путем изменения эквивалентов сложного эфира PEG4-азидо NHS в почти линейной зависимости. Например, при использовании 7,0 эквивалентов сложного эфира PEG4-азида NHS значение DAR будет равно 3,0.
Пример 8. Синтез рекомбинантного мышиного сывороточного альбумина (MSA)-PEG4-азида.
PEG4-азидоNHS-сложный эфир (98%, 81,7 мкмоль, 4,5 эквивалента, 32,4 мг в 0,3 мл DMF и разбавленный до 1,63 мл буферным раствором PBS при рН 7,4) добавляли к раствору рекомбинантного мышиного сывороточного альбумина (SEQ ID NO: 71) (1200 мг в 75,0 мл PBS с рН 7,4, MW ~ 66000 Да, 18,2 мкмоль), и смесь осторожно встряхивали в течение 12 часов при температуре окружающей среды. Раствор концентрировали с использованием центробежного концентратора (30000 MWCO) до объема ~ 1,5 мл. Неочищенную смесь разбавляли 1:10 в PBS рН 7,4 и снова концентрировали. Эту процедуру промывки повторяли в общей сложности три раза. С помощью этой процедуры промывки был удален низ ко молекулярный реагент. Концентрированный MSA-PEG4-азид разбавляли до 75,0 мл буфером 1x PBS при рН 7,4 и готовили для «клик»-конъюгации. Очищенный материал количественно оценивали с использованием УФ-спектрофотометра Nanodrop™ в видимой области спектра (с использованием рассчитанного коэффициента экстинкции, основанного на аминокислотной последовательности h-IgG1). Выход количественный после очистки. Значение DAR=3,5, определенное с помощью MALDI. Значение DAR может быть отрегулировано путем изменения эквивалентов PEG4-aзидoNHS-cлoжнoгo эфира, аналогично h-IgG1 Fc (пример 7).
Пример 9. Синтез конъюгата 1
Раствор PBS h-IgG1 Ес-PEG4-азида (пример 7) (50 мг, 2,815 мл, 0,8591 мкмоль) добавляли в центрифужную пробирку объемом 15 мл, содержащую промежуточное соединение-2 (пример 6) (35,2 мг, 0,02217 ммоль). После осторожного встряхивания смеси для растворения всего промежуточного соединения-2, 344 мкл раствора натриевой соли L-аскорбиновой кислоты (59,4 мг, 0,3 ммоль), сульфата меди (II) (10 мг, 0,05 ммоль) и ТНРТА (23 мг 0,05 ммоль) в буфере PBS при рН 7,4 (1 мл). Полученную смесь осторожно встряхивали в течение ночи. Ее очищали аффинной хроматографией на колонке с протеином А с последующей эксклюзионной хроматографией, как описано в примере 8. Анализ Maldi TOF очищенного конечного продукта дал среднюю массу 63797 Да (DAR=3,4). Выход 27,39 мг, 55%. На фиг.9 показан SDS-PAGE в не восстанавливающих условиях конъюгата 1.
Пример 10. Очистка конъюгатов
Неочищенную смесь разбавляли 1:10 в PBS при рН 7,4 и очищали с использованием смолы MabSelect Sure Resin (GE Healthcare, Chicago, IL, USA), с последующей эксклюзионной хроматографией. (HiLoad 26/600 Superdex200 pg, GE Healthcare, Chicago, IL, USA). Фракции, содержащие очищенный конъюгат, объединяли и концентрировали примерно до 20 мг/мл с использованием центрифужного концентратора (30000 MWCO). Очищенный материал количественно оценивали с использованием УФ-спектрофотометра Nanodrop™ в видимой области спектра с использованием рассчитанного коэффициента экстинкции на основе аминокислотной последовательности hIgG1 Fc(myc). Очищенные молекулы анализировали с использованием 4-12% гелей Bis Tris SDS PAGE путем загрузки 1 мкг каждой молекулы в гель и окрашивания с использованием Instant Blue (Expedeon, San Diego, CA, USA). Каждый гель включал маркер размера молекулярной массы с указанными стандартами молекулярной массы. Выходы рассчитывали, и чистоту определяли с помощью Agilent Analytical HPLC. Пик продукта и молекулярная масса были обнаружены с помощью Maldi MS и рассчитано конечное значение DAR.
Пример 11. Синтез промежуточного соединения-3
Стадия а.
К раствору пропаргил-PEG4-кислоты (260 мг, 1 ммоль) и HATU (380,2 мг, 1 ммоль) в безводном DMF (1 мл) добавляли DIPEA (130 мг). После перемешивания в течение 5 минут добавляли NH-бис(PEG3-Boc) (500 мг, 0,881 ммоль) и перемешивание продолжали при комнатной температуре в течение ночи. Затем его непосредственно очищали с помощью RPLC (9100 г, 5-50% ацетонитрила в воде, используя 0,1% TFA в качестве модификатора). Выход 683 мг, 95,8%. Ионы, обнаруженные с помощью LCMS: [М+Н]+=810.4, [М - Вос+Н]+=710.4, [(М - 2 Вос+2Н)/2]+=305.8.
Стадия b.
Продукт, полученный на стадии-а, растворяли в TFA (1 мл). Раствор перемешивали в течение 2 часов и затем очищали непосредственно с помощью RPLC (100 г, 0-30% ацетонитрила в воде). Выход 589 мг, 98,7%. Ион, обнаруженный в помощью LCMS: [(М+2Н)/2]+=305.8.
Стадия с.
Высушенную пламенем реакционную колбу продували азотом и загружали промежуточное соединение занамивир (пример 2) (572 мг, 1 ммоль) и безводный DCM (1 мл). После перемешивания для растворения исходного материала раствор охлаждали на бане с ледяной водой и добавляли 4-нитрофенилхлорформиат (302,4 мг, 1,5 ммоль), а затем DMAP (22,4 мг, 0,2 ммоль). Полученную смесь перемешивали в течение 5 часов, затем добавляли охлажденную воду (0,2 мл). После перемешивания в течение 10 минут добавляли продукт, полученный на стадии-b (256,7 мг, 0,355 ммоль) в безводном DMF (1 мл) и DIPEA (163,8 мг, 1,26 ммоль). Перемешивание продолжали в течение 2 часов, а затем реакционную смесь очищали непосредственно с помощью RPLC (150 г, 20-65% ацетонитрила в воде, используя 0,1% TFA в качестве модификатора). Собранные фракции лиофилизировали. Выход желаемого продукта, загрязненного некоторыми примесями, составил 422,8 мг, выход <69%. Материал использовали на следующей стадии без дополнительной очистки. Ион, обнаруженный с помощью LCMS: [(М+2Н)/2]+=903.9, [(М+3H)/3]+=603.2.
Стадия d.
Продукт, полученный на стадии-с (422,8 мг, <0,245 ммоль), растворяли в TFA (1 мл). Раствор перемешивали в течение 20 минут, затем очищали непосредственно с помощью HPLC (5-25% ацетонитрила в воде, используя 0,1% TFA в качестве модификатора). Выход 169,7 мг, 29,2% за две стадии. Ионы, обнаруженные с помощью LCMS: [(М+2Н)/2]+=704.0, [(М+3H)/3]+=469.6.
Стадия е.
Продукт, полученный на стадии-d (169,7 мг, 0,0923 ммоль) растворяли в МеОН (1,5 мл) и раствор охлаждали на бане с ледяной водой. Моногидрат LiOH (21 мг, 0,5 ммоль) в воде (1 мл) добавляли порциями в течение 1 часа. После перемешивания в течение ночи реакционную смесь подкисляли водородной формой Dowex 50W х 8 и очищали с помощью RPLC (0-30% ацетонитрила в воде, используя 0,1% TFA в качестве модификатора). Выход 107,9 мг, 66,9%. Ионы, обнаруженные с помощью LCMS: [(М+2Н)/2]+=663.8, [(М+3H)/3]+=442.9.
Пример 12. Синтез конъюгата 2
Указанный в заголовке конъюгат получали аналогично конъюгату 1 (пример 9) с использованием промежуточного соединения-3 (пример 11). Анализ Maldi TOF очищенного конечного продукта дал среднюю массу 63561 Да (DAR=3,3). Выход 43,4 мг, выход 43%. На фигуре 10 показан анализ SDS-PAGE в невосстанавливающих условиях конъюгата 2.
Пример 13. Синтез промежуточного соединения-4
Стадия а.
Высушенную пламенем реакционную колбу продували азотом и загружали промежуточным соединением занамивиром (пример 2) (343,2 мг, 0,6 ммоль) и безводным DCM (1,5 мл). Раствор охлаждали на бане с ледяной водой и добавляли DIPEA (234 мг, 1,8 ммоль), затем 4-нитрофенилхлорформиат (121 мг, 0,6 ммоль) и DMAP (67,4 мг, 0,6 ммоль). Полученную смесь перемешивали в течение 15 минут, затем добавляли дополнительное количество 4-нитрофенилхлорформиата (121 мг, 0,6 ммоль). После перемешивания в течение 2 часов добавляли воду (0,2 мл) для гашения непрореагировавшего хлорформиата. После перемешивания в течение 10 минут к реакционной смеси добавляли раствор пропаргил-PEG4-амина (185 мг, 0,8 ммоль) в безводном DMF (0,5 мл). Реакцию продолжали в течение 1 часа, а затем непосредственно очищали с помощью RPLC (100 г, 5-60% ацетонитрила в воде, используя 0,1% TFA в качестве модификатора). Собранные фракции лиофилизировали. Выход 355 мг, 71,3%. Ион, обнаруженный с помощью LCMS: [М+Н]+=830.2.
Стадия b.
Продукт, полученный на стадии-а (355 мг, 0,428 ммоль) растворяли в TFA (1 мл). Раствор перемешивали в течение ночи, затем очищали непосредственно с помощью RPLC (5-25% ацетонитрила в воде, используя 0,1% TFA в качестве модификатора). Выход 260,2 мг, 70,9% за две стадии. Ион, обнаруженный с помощью LCMS: [М+Н]+=630.2.
Стадия с.
Продукт, полученный на стадии-b (260,2 мг, 0,303 ммоль), растворяли в МеОН (1,5 мл). После охлаждения раствора на бане с ледяной водой порциями в течение 1 часа добавляли раствор моногидрата LiOH (42 мг, 1 ммоль) в воде (1 мл). Реакционную смесь перемешивали в течение ночи, затем подкисляли водородной формой Dowex 50W х 8 и очищали с помощью RPLC (0-50% ацетонитрила в воде, используя 0,1% TFA в качестве модификатора). Выход 78,1 мг, 99%. Ионы, обнаруженные с помощью LCMS: [М+Н]+=590.2.
Пример 14. Синтез конъюгата 3
Указанный в заголовке конъюгат получали аналогично конъюгату 1 (пример 9) с использованием промежуточного соединения-4 (пример 13). Анализ Maldi TOF очищенного конечного продукта дал среднюю массу 61182 Да (DAR=3,4). Выход 50,89 мг, выход 51%. На фигуре 11 показан анализ SDS-PAGE в невосстанавливающих условиях конъюгата 3.
Пример 15. Синтез промежуточного соединения-5
Стадия а.
Высушенную пламенем реакционную колбу продували азотом и загружали (1S, 2S, 3R, 4R)-метил-3-((S)-1-ацетамидо-2-этилбутил)-4-(трет-бутоксикарбониламино)-2-гидроксициклопентанкарбоксилатом (320,4 мг, 0,8 ммоль) и безводным DCM (2 мл). Раствор охлаждали на бане с ледяной водой и добавляли DIPEA (312 мг, 2,4 ммоль), затем 4-нитрофенилхлорформиат (161,3 мг, 0,8 ммоль) и DMAP (98 мг, 0,8 ммоль). Полученную смесь перемешивали в течение 15 минут, затем добавляли дополнительное количество 4-нитрофенилхлорформиата (161,3 мг, 0,8 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в течение 2 часов, затем добавляли воду (0,2 мл), чтобы погасить непрореагировавший хлорформиат. После перемешивания в течение 10 минут добавляли раствор пропаргил-PEG4-амина (259 мг, 1,12 ммоль) в безводном DMF (0,5 мл). Реакционную смесь перемешивали в течение 1 часа и затем очищали непосредственно с помощью RPLC (100 г, 5-60% ацетонитрила в воде, используя 0,1% TFA в качестве модификатора). Собранные фракции лиофилизировали. Выход 391,2 мг, 74,4%. Ион, обнаруженный с помощью LCMS: [М+Н]+=658.3, [М - Вос+Н]+=558.3.
Стадия b.
Продукт, полученный на стадии-а (391,2 мг, 0,595 ммоль) растворяли в TFA (0,8 мл), и раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 20 минут. Затем его непосредственно очищали с помощью RPLC (100 г, 5-60% ацетонитрила в воде). Выход 323,2 мг, 81%. Ион, обнаруженный с помощью LCMS: [М+Н]+=558.3.
Стадия с.
К раствору продукта, полученного на стадии-b (323,2 мг, 0,482 ммоль) в THF (2 мл) добавляли N,N'-бис-Вос-1-гуанилпиразол (224,4 мг, 0,723 ммоль) и PIPEA (260 мг, 2 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в течение 1 дня, а затем экстрагировали водой (3 мл) и смесью EtOAc/гексаны (1:1, 8 мл). Органический слой сушили над Na2SO4 и концентрировали роторным испарением. Остаток повторно растворяли в TFA (~ 1 мл), и раствор перемешивали в течение ночи. Затем его непосредственно очищали с помощью RPLC (100 г, 0-30% ацетонитрила в воде, используя 0,1% TFA в качестве модификатора). Собранные фракции лиофилизировали. Выход 254,2 мг, 83,2%. Ионы, обнаруженные с помощью LCMS: [М+Н]+=600.3, [М - Вос+Н]+=300.6.
Стадия d.
Продукт, полученный на стадии-с (254,2 мг, 0,356 ммоль) растворяли в THF (1,5 мл), и раствор охлаждали на бане с ледяной водой. Добавляли дигидрат CaCl2 (419 мг, 2,85 ммоль), затем добавляли 1,8 мл КОН (112 мг, 2 ммоль) в воде (2 мл) порциями в течение 1 часа. После перемешивания еще в течение 3 часов реакционную смесь подкисляли водородной формой Dowex 50W х 8 и очищали с помощью RPLC (0-30% ацетонитрила в воде, используя 0,1% TFA в качестве модификатора). Выход 102 мг, 49,8%. Ионы, обнаруженные с помощью LCMS: [М+Н]+=586.4, [(М+2Н)/2]+=293.8.
Пример 16. Синтез конъюгата 4
Указанный в заголовке конъюгат получали аналогично конъюгату 1 (пример 9) с использованием промежуточного соединения-5 (пример 15). Анализ Maldi-TOF очищенного конечного продукта дал среднюю массу 63002 Да (DAR=3,4). Выход 49,315 мг, выход 49%. На фигуре 12 показан анализ SDS-PAGE в невосстанавливающих условиях конъюгата 4.
Пример 17. Синтез промежуточного соединения-6
Стадия а.
Высушенную пламенем реакционную колбу продували азотом и загружали (1S, 2S, 3R, 4R)-метил-3-((S)-1-ацетамидо-2-этилбутил)-4-(трет-бутоксикарбониламино)-2-гидроксициклопентанкарбоксилатом (280,4 мг, 0,7 ммоль) и безводным DCM (1 мл). После перемешивания для растворения исходного материала к раствору добавляли DMAP (85,7 мг, 0,7 ммоль), а затем бис(пентафторфенил)карбонат (295,6 мг, 0,75 ммоль). Полученную смесь перемешивали в течение 1 часа, затем добавляли к раствору линкера-2 (пример 5) (157,5 мг, 0,22 ммоль) в безводном DMF (1 мл) и DIPEA (130 мг, 1 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в течение ночи и очищали с помощью RPLC (50 г, 5-90% ацетонитрила в воде). Собранные фракции лиофилизировали. Выход 134,1 мг, 40,7%. Ион, обнаруженный с помощью LCMS: [(М+2Н)/2]+=748.6.
Стадия b.
Продукт, полученный на стадии-а (134,1 мг, 0,0896 ммоль), растворяли в TFA (0,5 мл). Раствор перемешивали в течение 20 минут, затем очищали непосредственно с помощью RPLC (50 г, 5-60% ацетонитрила в воде). Выход 108,4 мг, 93,4%. Ионы, обнаруженные с помощью LCMS: [(М+2Н)/2]+=648.3, [(М+3H)/3]+=432.8.
Стадия с.
К раствору продукта, полученного на стадии-b (108,4 мг, 0,0837 ммоль), в безводном THF (1 мл) добавляли N,N'-бис-boc-1-гуанилпиразол (81,3 мг, 0,285 ммоль) и DIEPA (65 мг, 0,5 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2,5 дней, затем очищали непосредственно с помощью RPLC (100 г, 40-75% ацетонитрила в воде). Выход 73,6 мг, 49,4%. Ион, обнаруженный с помощью LCMS: [(М+3H)/3]+=594.2.
Стадия d.
Продукт, полученный на стадии-с (73,6 мг, 0,041 ммоль), растворяли в TFA (0,5 мл). Раствор перемешивали в течение 20 минут, затем очищали непосредственно с помощью RPLC (50 г, от 5% до 60% ацетонитрила в воде). Выход 62,1 мг, 94,1%. Ионы, обнаруженные с помощью LCMS: [(М+2Н)/2]+=690.4, [(М+3H)/3]+=460.8.
Стадия е.
Продукт, полученный на стадии-d (62,1 мг, 0,0386 ммоль) в THF (3 мл) охлаждали на бане с ледяной водой и добавляли 45%-ный раствор КОН (0,2 мл) порциями в течение 1 часа. Реакционную смесь перемешивали еще 2 часа, затем подкисляли раствором 4N HCl в диоксане (0,8 мл) и экстрагировали гексанами (10 мл) и водой (1,5 мл). Водный слой очищали с помощью HPLC (0-20% ацетонитрила в воде, используя 0,1% TFA в качестве модификатора). Выход 36,2 мг, 59,4%. Ионы, обнаруженные с помощью LCMS: [(М+2Н)/2]+=676.5, [(М+3H)/3]+=451.4.
Пример 18. Синтез конъюгата 5
Указанный в заголовке конъюгат получали аналогично конъюгату 1 (пример 9) с использованием промежуточного соединения-6 (пример 17). Анализ Maldi-TOF очищенного конечного продукта дал среднюю массу 63561 Да (DAR=3,3). Выход 43,4 мг, выход 43%. На фигуре 13 показан анализ SDS-PAGE в невосстанавливающих условиях конъюгата 5
Пример 19. Синтез промежуточного соединения-7
Стадия а.
К раствору про паргил-PEG4-кислоты (609 мг, 2,34 ммоль) и NH-бис(PEG1-азида) (500 мг, 2,055 ммоль) в безводном DMF (2 мл) добавляли HATU (889,7 мг, 2,34 ммоль) порциями в течение 5 минут. После перемешивания для растворения всего связывающего реагента добавляли DIPEA (390 мг, 3 ммоль) и перемешивание продолжали в течение 1 часа. Затем его очищали непосредственно с помощью RPLC (100 г, 5-40% ацетонитрила в воде). Выход 918 мг, 92%. Ион, обнаруженный с помощью LCMS: [М+Н]+=486.2.
Стадия b.
Продукт, полученный на стадии-а (918 мг, 1,89 ммоль) растворяли в THF, и раствор охлаждали до ~13°С. Трифенилфосфин (1,141 г, 4,35 ммоль) добавляли порциями в течение 10 минут. Полученную смесь перемешивали при -13°С до комнатной температуры в течение 2 часов. Добавляли раствор моногидрата LiOH (42 мг, 1 ммоль) в воде (2 мл) и МеОН (1 мл). После перемешивания в течение 20 часов реакционную смесь очищали с помощью RPLC (100 г, 0-30% ацетонитрила в воде, используя 0,1% TFA в качестве модификатора). Выход 825 мг, 65,9%. Ион, обнаруженный с помощью LCMS: [М+Н]+=434.4.
Стадия с.
Высушенную пламенем реакционную колбу продували азотом и загружали промежуточным соединением занамивиром (пример 2) (865 мг, 1,51 ммоль) и безводным DCM (5 мл). После перемешивания для растворения исходного материала раствор охлаждали на бане с ледяной водой и добавляли 4-нитрофенилхлорформиат (365,3 мг, 1,81 ммоль), а затем DMAP (152,2 мг, 0,755 ммоль). Баню с ледяной водой удаляли и смесь перемешивали в течение 3 часов. Добавляли дополнительное количество 4-нитрофенилхлорформиата (304,4 мг, 1,51 ммоль) и перемешивание продолжали в течение 1 часа. Затем реакцию гасили водой (1 мл). После интенсивного перемешивания в течение 1 часа реакционную смесь экстрагировали водой (20 мл × 2) и DCM (20 мл). Органический слой перемешивали в течение ночи, сушили над Na2S04 и концентрировали роторным испарением. Материал использовали на следующей стадии без дополнительной очистки. Ион, обнаруженный с помощью LCMS: [М+Н]+=738.2.
Стадия d.
Раствор смеси продукта, полученного на стадии-b (429,7 мг, 0,65 ммоль), и DIPEA (260 мг, 2 ммоль) в безводном THF (1 мл) добавляли по каплям к продукту, полученному на стадии-с. Полученную смесь перемешивали в течение 2 часов, затем очищали непосредственно с помощью RPLC (100 г, 10-65% ацетонитрила в воде). Ацетонитрил в собранных фракциях удаляли роторным испарением при комнатной температуре. Гетерогенный водный слой экстрагировали EtOAc (200 мл), затем снова экстрагировали EtOAc (50 мл). Объединенные органические слои сушили над Na2SO4 и концентрировали до сухого состояния роторным испарением. Выход 442 мг, 41,7%. Ионы, обнаруженные с помощью LCMS: [(М+2Н)/2]+=815.8, [(М - Boc+2Н)/2]+=765.8, [(М - 2 Вос+2Н)/2]+=716.
Стадия е.
Продукт, полученный на стадии-d (441 мг, 0,271 ммоль) растворяли в TFA (1 мл). Раствор перемешивали в течение 20 минут, затем очищали непосредственно с помощью HPLC (5-20% ацетонитрила в воде, используя 0,1% TFA в качестве модификатора). Выход 308 мг, 77,9%. Ионы, обнаруженные с помощью LCMS: [(М+2Н)/2]+=615.8, [(М+3H)/3]+=411.
Стадия f.
Продукт, полученный на стадии-е (308 мг, 0,211 ммоль), растворяли в МеОН (1 мл) и воде (0,5 мл), и раствор охлаждали на бане с ледяной водой. Раствор моногидрата LiOH (42 мг, 1 ммоль) в воде (1 мл) добавляли порциями в течение 1 часа. Реакционную смесь перемешивали в течение ночи, подкисляли раствором 4 N HCl в диоксане (0,25 мл) и очищали с помощью RPLC (0-20% ацетонитрила в воде, используя 0,1% TFA в качестве модификатора). Выход 198 мг, 64%. Ионы, обнаруженные с помощью LCMS: [(М+2Н)/2]+=575.8, [(М+3H)/3]+=384.2.
Пример 20. Синтез конъюгата 6
Указанный конъюгат получали аналогично конъюгату 1 (пример 9) с использованием промежуточного соединения-7 (пример 19). Анализ Maldi-TOF очищенного конечного продукта дал среднюю массу 62854 Да (DAR=3,1). Выход 175,4 мг, выход 50%. На фигуре 14 показан анализ SDS-PAGE в невосстанавливающих условиях конъюгата 6.
Пример 21. Синтез промежуточного соединения-8
Стадия а.
Метил 5-ацетоамидо-7,8,9-O-триацетил-2,6-ангидро-4-азидо-3,4,5-тридеокси-D-глицеро-D-галакто-нон-2-енонат (1,8 г, 4,0 ммоль) растворяли в 40 мл метанола и затем обрабатывали 400 мг 5% Pd/C и 1,1 г Вос-ангидрида (5,0 ммоль), затем реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в атмосфере водорода в течение 1 часа. Палладий на угле удаляли фильтрацией. Фильтрат концентрировали и использовали на следующей стадии без очистки.
Стадия b.
Продукт, полученный на предыдущей стадии, растворяли в 20 мл сухого метанола и затем обрабатывали 2 мл метоксида натрия в метаноле (0,5 М) по каплям при охлаждении на бане с ледяной водой. Через 2 часа ход реакции определяли с помощью LCMS. Реакцию гасили 1N HCl до рН 5-6. Полученный раствор концентрировали и очищали обращенно-фазовой жидкостной хроматографией (RPLC) с использованием жидкостного хроматографа Isco COMBIFLASH®, элюируя 5-100% ацетонитрила и водой, используя 0,1% TFA в качестве модификатора. Ионы, обнаруженные с помощью LCMS: (М+Н)+=405
Стадия с.
Метил 5-ацетамидо-2,6-ангидро-4-[(трет-бутоксикарбонил)амино]-3,4,5-тридеокси-D-эритро-нон-2-енонат (0,4 г, 1 ммоль) растворяли в 10 мл ацетона, 4 мл 2,2-диметоксипропана и 20 мг гидрата п-толуолсульфоновой кислоты (0,1 ммоль). Полученный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение ночи, затем гасили 1 мл насыщенного NaHCO3. Смесь концентрировали и очищали обращенно-фазовой жидкостной хроматографией (RPLC) с использованием жидкостного хроматографа Isco COMBIFLASH®, элюируя 5-100% ацетонитрилом и водой без модификатора. Ионы, обнаруженные с помощью LCMS: (М+Н)+=445.
Стадия d.
Гидрид натрия (40 мг, 60% в масле, 1,0 ммоль) добавляли к метил 5-ацетамидо-2,6-ангидро-4-[(трет-бутоксикарбонил)амино]-3,4,5-тридеокси-8,9-O-(1-метилэтилиден)-D-эритро-нон-2-енонату (0,25 г, 0,50 ммоль) в 5 мл сухого THF при охлаждении на бане с ледяной водой. Полученный раствор перемешивали в течение 0,5 часа, затем добавляли бензилбромацетат (0,23 г, 1,0 ммоль). Полученный раствор перемешивали в течение 2 часов и гасили 5 мл 10% хлорида аммония в воде. Затем раствор разбавляли 50 мл этилацетата. Органический слой отделяли и сушили сульфатом натрия. Высушенный органический раствор концентрировали и очищали обращенно-фазовой жидкостной хроматографией (RPLC), используя жидкостной хроматограф Isco COMBIFLASH®, элюируя 5-100% ацетонитрила и водой без модификатора. Ионы, обнаруженные с помощью LCMS: (М+Н)+=593.
Пример 22. Синтез промежуточного соединения 9
Стадия а.
Метил 5-ацетоамидо-7,8,9-O-триацетил-2,6-ангидро-4-азидо-3,4,5-тридеокси-D-глицеро-D-галакто-нон-2-енонат (10 г, 22 ммоль) растворяли в 100 мл метанола, а затем нагревали до 60°С на масляной бане, добавляли SnCl2 (5,7 г, 20 ммоль) к раствору 3 порциями (осторожно, выделяется газ). Реакционную смесь перемешивали в течение 10 минут, после чего реакция была завершена по данным HPLC. Реакционный раствор медленно добавляли к раствору 50 мл насыщенного NaHCO3 и 50 г целита при интенсивном перемешивании. Полученную суспензию фильтровали. Фильтрат обрабатывали BoC2O (6,6 г, 30 ммоль, 1,5 экв.). Через 2 часа при комнатной температуре раствор концентрировали для удаления большей части метанола, растворяли в 200 мл DCM и дважды экстрагировали 100 мл DCM. Объединенные экстракты сушили сульфатом натрия, фильтровали и использовали на следующей стадии без дополнительной очистки. Выход неочищенного продукта составил 12 г, 100%. Ион(ы), обнаруженный с помощью LCMS: М+Н=531.
Стадия b.
Материал, полученный на предыдущей стадии, растворяли в 60 мл сухого метанола, затем обрабатывали 10 мл метоксида натрия в метаноле (0,5 М) при охлаждении на бане с ледяной водой. Ход реакции контролировали с помощью LCMS, которая завершилась через 2 ч. Реакцию гасили 1N HCl до рН 5-6. Полученный раствор концентрировали и очищали с помощью жидкостной хроматографии с обращенной фазой (RPLC) с использованием жидкостного хроматографа Isco COMBIFLASH®, элюируя от 0% до 30% ацетонитрила и водой, используя 0,1% TFA в качестве модификатора. Выход продуктов составил 7,2 г, 80%. Ионы, обнаруженные с помощью LCMS: М+Н=405.
Стадия с.
Раствор продукта, полученного на предыдущей стадии (3,5 г, 8,5 ммоль), CDI (2,8 г, 2 экв.), триметиламина (4,2 мл, 30 ммоль) и DMAP (240 мг, 2 ммоль) нагревали в ацетонитриле (50 мл) в течение ночи, затем концентрировали и очищали обращенно-фазовой жидкостной хроматографией (RPLC) с использованием жидкостного хроматографа Isco COMBIFLASH®, элюируя 0-30% ацетонитрила и водой без модификатора. Выход желаемого продукта составил 2,3 г, 60%. Ионы, обнаруженные с помощью LCMS: М+Н=431.
Стадия d.
Гидрид натрия (400 мг, 60% в масле, 10 ммоль) добавляли к продукту, полученному на предыдущей стадии (1,45 г, 3,3 ммоль) в 50 мл сухого THF (чувствительная к влаге реакция) в бане с ледяной водой. Полученный раствор перемешивали в течение 0,5 часов, затем к вышеуказанному раствору добавляли трет-бутилбромацетат (2 г, 10 ммоль), полученный раствор нагревали до 60°С в течение ночи и гасили уксусной кислотой. Полученный раствор концентрировали и очищали обращенно-фазовой жидкостной хроматографией (RPLC) с использованием жидкостного хроматографа Isco COMBIFLASH®, элюируя 0-50% ацетонитрила и водой с TFA в качестве модификатора. Выход 1 г, 57%. Ионы, обнаруженные с помощью LCMS: М+Н=593.
Стадия е.
Продукт, полученный на предыдущей стадии (1,2 г, 2,2 ммоль), перемешивали с 10 мл TFA при комнатной температуре в течение ночи, и протекание снятия защиты контролировали с помощью LCMS. Полученный раствор концентрировали и использовали на следующей стадии без очистки. Остаток повторно растворяли в 20 мл THF, затем к раствору добавляли N,N'-бис-boc-1-гуанилпиразол (1 г, 3,3 ммоль), 4-диметиламинопиридин (120 мг, 1 ммоль) и триэтиламин (0,7 мл, 5 ммоль), и полученный раствор нагревали до 60°С в течение 2 часов. Полученный раствор концентрировали и очищали обращенно-фазовой жидкостной хроматографией (RPLC) с использованием жидкостного хроматографа Isco COMBIFLASH®, элюируя 0-50% ацетонитрила и водой без модификатора. Выход 700 мг, 84%. Ионы, обнаруженные с помощью LCMS: М+Н=631.
Стадия f.
К раствору линкера-3 (полученного, как описано в примере 19) (73 мг, 0,14 ммоль) и продукта, полученного на предыдущей стадии (200 мг, 0,32 ммоль, 2,2 экв.) в DMF (30 мл) добавляли EDC (100 мг, 0,5 ммоль), HOAt (65 мг, 3 ммоль) и DIEA (0,14 мл, 1 ммоль) при комнатной температуре. Раствор перемешивали в течение ночи. Полученный раствор концентрировали, очищали жидкостной хроматографией с обращенной фазой (RPLC) с использованием жидкостного хроматографа Isco COMBIFLASH®, элюируя градиентов 0-50% ацетонитрила в воде без модификатора. Выход 120 мг, 52%. Ионы, обнаруженные с помощью LCMS: М/2+Н=830.
Стадия g.
Гидроксид лития (24 мг, 1 ммоль) в 2 мл Н2О добавляли в раствор продукта, полученного на предыдущей стадии (120 мг, 0,07 ммоль) в 2 мл THF и 1 мл МеОН. Ход реакции контролировали с помощью LCMS. После завершения в раствор добавляли ионообменную смолу AMBERLITE® IRN-77 для доведения рН до 1, затем полученный раствор фильтровали и фильтрат концентрировали и использовали на следующей стадии без очистки. Полученное соединение обрабатывали 2 мл TFA при комнатной температуре, раствор перемешивали в течение ночи при 40°С, затем концентрировали и очищали с помощью HPLC, элюируя градиентом 0-20% ацетонитрила в воде, используя TFA в качестве модификатора. Выход 60 мг, выход 74%. Ионы, обнаруженные с помощью LCMS: [М/2]+1=589.8.
Пример 23. Анализ ингибирования нейраминидазы
Анализ ингибирования нейраминидазы с использованием субстрата 2'-(4-метилумбеллиферил)-альфа-D-N-ацетилнейраминовой кислоты (MUNANA) проводили, как описано ниже. Вкратце, 50 мкл очищенной рекомбинантной нейраминидазы вируса гриппа (0,1 нг/мкл, 50 мМ Трис, 5 мМ CaCl2, 200 мМ NaCl, рН 7,5) смешивали с 50 мкл ингибитора и инкубировали в течение 30 минут при комнатной температуре. Для каждого повтора использовали по меньшей мере 5 концентраций каждого ингибитора в соответствующем диапазоне. После инкубации к раствору добавляли 50 мкл 400 мкМ MUNANA в 50 мМ Трис, 5 мМ CaCl2, 200 мМ NaCl (рН 7,5), чтобы начать реакцию, используя пипетку с 12 наконечниками (Eppendorf). Положительный и отрицательный контроль были включены в каждую 12-луночную дорожку. После запуска реакции для каждой дорожки на планшете реакционную смесь немедленно загружали в SpectraMax М5 (Molecular Devices), где флуоресценцию определяли количественно в течение 25 минут при длине волны возбуждения 365 нм и длине волны испускания 445 нм. Были выбраны единичные моменты времени, когда положительный контроль производил флуоресцентный сигнал приблизительно 1000. Все анализы проводили в трех повторностях, и значения IC50 для каждого ингибитора рассчитывали с помощью сигмоидальной подгонки логарифма [ингибитор] в зависимости от процента ингибирования с использованием GraphPad Prism. На фигуре 15 показан график кинетических данных в виде RFU/мин в линейном диапазоне для конъюгата 1 и промежуточного соединения-2, демонстрирующий большую эффективность конъюгата 1 в качестве ингибитора нейраминидазы. На фигуре 16 и фигуре 17 показаны результаты анализа конъюгатов 1-6 против нейраминидазы rH1N1 и нейраминидазы rH3N2, соответственно (таблица 2).
Пример 24: Анализ цитотоксичности
Конъюгаты 1, 2, 3 и 6 тестировали на цитотоксичность. Десять двукратных серийных разведений каждого конъюгата, начиная с 10 мкМ, готовили в трех повторностях для инокуляции клетками MDCK в 96-луночных культуральных планшетах. Жизнеспособность клеток определяли через четыре дня после обработки с использованием набора С ell Titer- GLO. 50% цитотоксическую концентрацию (СС50) рассчитывали с использованием модели доза-ответ XLfit (таблица 3). Для всех тестируемых соединений цитотоксичность не наблюдалась вплоть до 10 мкМ, за исключением конъюгата 3. В случае конъюгата 3 значение ЕС50 в анализе цитопатического эффекта (СРЕ) (см. пример 23) в 725 раз ниже значения СС50 в этом анализе.
Пример 25. Анализ цитопатического эффекта
Анализ #1 микронейтрализации на основе СРЕ
Чтобы измерить способность конъюгатов нейраминидазы защищать клетки млекопитающих от инфекции и разрушения вирусом гриппа, были проведены анализы микр о нейтрализации на основе цитопатического эффекта (СРЕ). Вкратце, двадцатидвухкратные серийные разведения каждого конъюгата, начиная с 0,25 мкМ, готовили в двух повторностях для одночасовой инокуляции клетками MDCK, засеянными в 96-луночные планшеты. Вирус INFV СА/09 добавляли к клеткам при множественности инфицирования (MOI) 0,001 для инкубации в течение одного часа. На четвертый день после инкубации клетки окрашивали кристаллическим фиолетовым и считывали оптическую плотность для расчета 50-процентной эффективной концентрации (ЕС50) каждого ТА с использованием модели доза-ответ XLfit. Занамивир использовали в качестве препарата сравнения и положительного контроля. Человеческий Fc был включен в качестве отрицательного контроля. Все конъюгаты 1, 2, 3 и 6 продемонстрировали превосходную эффективность по сравнению с контролем занамивиром, демонстрируя значения ЕС50, в 42-227 раз более низкие, чем у занамивира (таблица 4).
Анализ # 2 микронейтрализации на основе СРЕ
Дополнительный анализ микронейтрализации на основе СРЕ проводили для дальнейшей оценки in vitro активности конъюгата 6 и конъюгата 7. Вкратце, испытуемые образцы изготавивали при начальной концентрации 160 нМ, и всего было сделано десять 2-кратных разведений. Затем разведения тестируемого вещества предварительно смешивали с вирусом гриппа A (INFV СА/09) при множественности инфицирования 0,001 относительно монослоя. Через один час смесь тестируемого вещества и вируса добавляли к клеткам почки собаки Madin-Darby (MDCK), выращенным до 70-80% конфлюэнтности в стандартных условиях в 96-луночном планшете. Контрольный занамивир обрабатывали так же, за исключением того, что исходная концентрация составляла 9600 нМ, поскольку ожидалось, что он будет менее активным, чем тестируемые конъюгаты. После четырех дней инкубации монослой окрашивали кристаллическим фиолетовым и определяли оптическую плотность (отражающую состояние монослоя) для расчета 50% эффективной концентрации (ЕС50) с использованием модели зависимости доза-ответ XLfit (idbs; https://www.idbs.com).
Как показано в таблице 5, занамивир при концентрации 496 нМ наполовину снижал опосредованные вирусом цитопатические эффекты. Напротив, конъюгат 6 был примерно в 100 раз более активным со значением ЕС50, равным всего лишь 4,64 нМ. Конъюгат 7 дополнительно улучшил активность приблизительно в 15 раз, снизив ЕС50 до уровня ниже субнаномолярного.
Пример 26. Анализ жизнеспособности клеток.
Клетки А549 высевали в 96-луночные планшеты за день до обработки соединением. Клетки обрабатывали конъюгатом 3 (фиг.18А), конъюгатом 4 (фиг.18 В) или конъюгатом 6 (фиг.18С) в концентрациях 1 мкМ - 10 нМ в течение 24 часов. Затем определяли жизнеспособность клеток с помощью Cell Titer Glow (Promega). Результаты представляют среднее значение и стандартное отклонение (SD) трех биологических повторностей. Эффектов на клеточную жизнеспособность не наблюдалось ни для одного из конъюгатов при любых концентрациях, используемых в анализе роста вирусов (пример 27).
Пример 27. Анализ роста вирусов.
Чтобы измерить способность конъюгатов нейраминидазы ингибировать рост представляющих интерес патогенных штаммов вируса гриппа в эпителиальных клетках человека, проводили анализы уменьшения вирусных бляшек. Вкратце, клетки А549 высевали в 24-луночные планшеты за день до обработки соединением. Клетки обрабатывали соединениями при концентрациях 1 мкМ - 10 нМ в течение 2 часов и инфицировали указанными вирусными штаммами при MOI 0,01 в течение одночасовой инкубации. Вирус удаляли, клетки промывали и повторно наносили соединения при концентрациях 1 мкМ - 10 нМ. Супернатанты собирали в указанные моменты времени и титровали с использованием метода анализа бляшек в клетках MDCK. Результаты представляют среднее значение и стандартное отклонение (SD) трех биологических повторностей. Осельтамивир использовали в качестве препарата сравнения и положительного контроля. Конъюгат 3 (фиг.19А-19Е), конъюгат 4 (фиг.20А-Е) или конъюгат 6 (фиг.21А-21Е и фиг.22А-22Е) все показали превосходные характеристики по сравнению с контролем осельтамивиром, демонстрируя сходное или (как правило) превосходное уменьшение бляшек посравнению с осельтамивиром при концентрациях, в 100 раз более низких. Эффекты соединений (для оценки тестируемых образцов на потенциальную цитотоксичность) на клетки А549 оценивали для каждого тестируемого вещества с использованием анализа клеточной жизнеспособности (пример 26). Вкратце, клетки А549 высевали в 96-луночные планшеты за день до обработки соединением. Клетки обрабатывали соединениями при концентрациях 1 мкМ - 10 нМ в течение 24 часов. Затем определяли жизнеспособность клеток с помощью Cell Titer Glow (Promega). Результаты представляют среднее значение и стандартное отклонение (SD) трех биологических повторностей.
Пример 28. Период полужизни в мышиной сыворотке
В фармакокинетических (РК) исследованиях использовали самок мышей CD-I (Charles River Laboratories) массой 20-22 грамм. Мышам вводили внутривенно (IV) через хвостовую вену 50 мг/кг тестируемого вещества (объем дозы 10 мл/кг). Животных содержали в условиях, одобренных IACUC (Комитетом по контролю над содержанием и использованием животных). В определенные моменты времени у животных брали кровь без окончательной остановки (ретроорбитальная, щечная или из хвостовой вены), собираемую в пробирки с EDTA для предотвращения коагуляции. Собранную кровь центрифугировали (2000 х g в течение 10 минут) и отбирали плазму для анализа концентраций тестируемого вещества во времени.
Концентрации конъюгата 6 или hIgG1 Fc в плазме в каждый момент времени измеряли с помощью сэндвич-ELISA следующим образом: молекулы конъюгата 6 захватывали либо на планшеты, покрытые нейраминидазой, либо на планшеты, покрытые анти-hIgG1антителом, а затем детектировали с использованием HRP-конъюгированного с античеловеческого IgG-Fc антитела. hIgG1 захватывали с использованием анти-hIgG1 Fc антитела. Концентрацию белка рассчитывали в GraphPad Prism с использованием четырехпараметрической модели нелинейной регрессии (4PL) стандартных кривых конъюгата 6 (или hIgG1 Fc). Более подробное описание способа приводится ниже.
Планшеты Qiagen Ni-NTA HisSorb (каталожный номер 35061, Qiagen) были покрыты либо нейраминидазой от вируса A/California/04/2009 (H1N1) (11058-VNAHC, Sino Bio) или анти-IgG1 Fc антителом в IX буфере для нанесения покрытия от KPL (5150-0041, SeraCare). В случаях, когда анти-IgG1 Fc антитело использовали для захвата тестируемого вещества, отбирали захватывающие и детектирующие анти-IgG1 Fc антитела, которые связываются с различными эпитопами. Планшеты инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. Серийные разведения образцов плазмы вносили в планшеты и инкубировали при комнатной температуре в течение 2 ч (разбавитель образца: 0,5% обезжиренное сухое молоко+3% козья сыворотка в растворе 0,05% Tween20 в PBS; конечная концентрация в плазме не подвергнутых воздействию мышей составляла 1:900). Стандартные кривые конъюгата 6 или hIgG1 Fc в диапазоне 500-0,230 нг/мл в двух повторностях были воспроизведены на каждом планшете.
После 2-часовой инкубации планшеты промывали 5х 300 мкл PBS с 0,05% Tween20. Конъюгат 6, связанный с нейраминидазой на планшетах (или анти-hIgG1 Fc антитело), затем метили HRP-конъюгированным античеловеческим IgG Fc F(ab')2 (Jackson 709-036-098), разведенным 1:2000 в разбавителе образца в течение 1 часа при комнатной температуре. Затем планшеты промывали 8х 300 мкл PBS с 0,05% Tween20 и проявляли с помощью субстрата ТМВ в течение 7 минут. Реакцию останавливали с помощью IN H2SO4. Поглощение считывали при 450 нм. Аналогичный протокол использовали для hIgG1 Fc, где для захвата использовали только анти-hIgG1 Fc антитело. Количества конъюгата 6, измеренные в разные моменты времени с использованием захвата либо нейраминидазы, либо анти-hIgG1 Fc антитела, были сходными в пределах экспериментальной ошибки, что позволяет предположить, что интактный конъюгат является стабильным in vivo.
Общий конъюгат 6 (или hIgG1 Fc) в тестируемых образцах интерполировали с использованием Graphpad Prism Version 6 после нелинейного регрессионного анализа (сигмоидальный, 4РЬ-анализ) стандартных кривых конъюгата 6 (или hIgG1 Fc). Параметры РК рассчитывали с помощью программного обеспечения WinNonlin. Кривые сравнения конъюгата 6 и hIgG1 Fc показаны на фиг.23, и краткое описание ключевых параметров РК представлено в таблице 6. Неожиданно оказалось, что концентрации в плазме и конечный период полужизни значительно лучше для конъюгата 6, чем для hIgG1 Fc дикого типа. Площади под кривой (AUC) за 8 дней в 3 раза выше для конъюгата 6, чем для hIgG1 Fc, а конечный период полужизни для конъюгата 6 составляет 214 часов по сравнению с 52 часами для человеческого IgG1 Fc.
Пример 29. Эффективность конъюгата 6 в летальной мышиной модели гриппа: исследование №1.
Конъюгат 6 оценивали против летальной инфекции, вызванной вирусом гриппа INFV A H1N1 у самок мышей BALB/c. В эксперименте участвовало 7 групп по 5 мышей. В день 0 всех мышей заражали 1xLD90 H1N1 A/Texas/36/91. Группы 1-6 получали лечение IV за 4 часа до заражения (таблица 7). Человеческий IgG1 (только Fc) был включен в качестве дополнительного отрицательного контроля. Группа 7 получала осельтамивир фосфат перорально, начиная через 8 часов после заражения, дважды в день в течение 5 дней. Всех мышей контролировали на потерю веса (фиг.24, таблица 8) и выживаемость (фиг.25, таблица 9) в течение 15 дней после заражения.
Мыши, получавшие лечение конъюгатом 6, показали 100% выживаемость при однократных дозах при всех испытанных концентрациях, по сравнению с выживаемостью, составляющей 20% и 0%, в контрольной группе, получавшей носитель, и контрольной группе, получавшей hIgG1, соответственно. Результаты были статистически значимыми по сравнению с группой, получавшей носитель (р=0,0135), несмотря на небольшой размер группы (n=5). По сравнению с группой, получавшей осельтамивира фосфат, конъюгат 6 продемонстрировал сходную эффективность при дозе, в 500-раз ниже кумулятивной (в мг/кг). Мыши при всех дозах конъюгата 6 сохраняли свой вес на протяжении всего эксперимента по сравнению с контрольной группой осельтамивира.
Пример 30. Эффективность конъюгата 6 в летальной мышиной модели гриппа: исследование #2
Конъюгат 6 оценивали против летальной инфекции, вызванной вирусом гриппа INFV A H3N2 у самок мышей BALB/c. В эксперименте участвовало 11 групп по 5 мышей. В день 0 всех мышей заражали 1xLD90 H3N2 A/Hong Kong/1/68. Группы 1-10 получали лечение IV за 4 часа до заражения (таблица 10). Человеческий IgG1 (взятый вотдельности Fc) был включен в качестве дополнительного отрицательного контроля. Группа 11 получала осельтамивир фосфат перорально, начиная через 8 часов после заражения дважды в день в течение 5 дней. У всех мышей контролировали потерю веса (фиг.26) и выживаемость (фиг.27, таблица 11) в течение 15 дней после заражения.
Мыши, получавшие лечение конъюгатом 6, показали 100% выживаемость при однократных дозах до 0,4 мг/кг и 80% выживаемость при однократной дозе 0,2 мг/кг по сравнению с 0% выживаемостью в контрольной группе, получавшей носитель, и контрольных группах, получавших hIgG1, соответственно. В контрольной группе, получавшей осельтамивир выжили 80% мышей. Результаты были статистически значимыми по сравнению с группой носителя (р=0,0128), несмотря на небольшой размер группы (n=5). По сравнению с группой, получавшей осельтамивира фосфат, конъюгат 6 продемонстрировал сходную эффективность в дозе, которая ниже кумулятивной в 1000 раз (в мг/кг). Мыши при всех дозах конъюгата 6 до 0,4 мг/кг поддерживали свой вес в пределах 5%, лучше, чем контрольная группа, получавшая осельтамивир.
Пример 31. Синтез промежуточного соединения 10
Стадия а.
Метил 5-ацетамидо-7,8,9-O-триацетил-2,6-ангидро-4-азидо-3,4,5-тридеокси-D-глицеро-D-галакто-нон-2-енонат (SM-1, 10 г, 22 ммоль) растворяли в 100 мл метанола и затем нагревали до 60°С на масляной бане, к раствору 3 порциями добавляли SnCl2 (5,7 г, 20 ммоль) (осторожно, выделяется газ). Реакционную смесь перемешивали в течение 10 мин, после чего реакция была завершена по данным HPLC. Реакционный раствор медленно добавляли к раствору 50 мл насыщенного NaHCO3 и 50 г целита при интенсивном перемешивании. Полученную суспензию фильтровали. Фильтрат обрабатывали Boc2O (6,6 г, 30 ммоль, 1,5 экв.). Через 2 часа при комнатной температуре раствор концентрировали для удаления большей части метанола, растворяли в 200 мл DCM и дважды экстрагировали 100 мл DCM. Объединенные экстракты сушили сульфатом натрия, фильтровали и использовали на следующей стадии без дополнительной очистки. Выход неочищенного продукта составил 12 г, 100%. Ион(ы), обнаруженный с помощью LCMS: М+Н=531.
Стадия b.
Материал, полученный на предыдущей стадии, растворяли в 60 мл сухого метанола, затем обрабатывали 10 мл метоксида натрия в метаноле (0,5М) при охлаждении на бане с ледяной водой. Протекание реакции контролировали с помощью LCMS, которая завершалась через 2 часа. Реакцию гасили 1N HCl до рН 5-6. Полученный раствор концентрировали и очищали жидкостной хроматографией с обращенной фазой (RPLC) с использованием жидкостного хроматографа Isco COMBIFLASH®, элюируя от 0% до 30% ацетонитрила и водой, используя 0,1% TFA в качестве модификатора. Выход продуктов составил 7,2 г, 80%. Ион(ы), обнаруженный с помощью LCMS: М+Н=405.
Стадия с.
Раствор промежуточного соединения, полученного на предыдущей стадии (3,5 г, 8,5 ммоль), CDI (2,8 г, 2 экв.), триметиламина (4,2 мл, 30 ммоль) и DMAP (240 мг, 2 ммоль) нагревали при 60°С в DMF (50 мл) в течение ночи, затем концентрировали и очищали обращенно-фазовой жидкостной хроматографией (RPLC) с использованием жидкостного хроматографа Isco COMBIFLASH® с элюированием от 0% до 30% ацетонитрила без модификатора. Выход желаемого продукта составил 2,3 г, 60%. Ион(ы), обнаруженный методом LCMS: М+Н=431.
Стадия d.
Гидрид натрия (400 мг, 60% в масле, 10 ммоль) добавляли к промежуточному соединению 4 (1,45 г, 3,3 ммоль) в 50 мл сухого THF (чувствительная к влаге реакция) под ледяной баней. Полученный раствор перемешивали в течение 0,5 ч, затем к указанному выше раствору добавляли трет-бутилбромацетат (2 г, 10 ммоль). Полученный раствор нагревали до 60°С в течение ночи и гасили уксусной кислотой, концентрировали и очищали жидкостной хроматографией с обращенной фазой (RPLC) с использованием жидкостного хроматографа Isco COMBIFLASH®, элюируя от 0% до 50% ацетонитрила и воды с TFA в качестве модификатора. Выход составил 1 г, 57%. Ион(ы), обнаруженный с помощью LCMS: М+Н=593 (реакция довольно чистая по данным HPLC, но низкий выделенный выход).
Стадия f.
Промежуточное соединение, полученное на предыдущей стадии (1,2 г, 2,2 ммоль) перемешивали с 10 мл TFA при комнатной температуре в течение ночи. За ходом снятия защиты следили с помощью LCMS. Полученный раствор концентрировали и использовали на следующей стадии без очистки.
Остаток, полученный в результате предыдущей реакции, растворяли в 20 мл THF, затем в раствор добавляли N,N'-бис-boc-1-гуанилпиразол (1 г, 3,3 ммоль), 4-диметиламинопиридин (120 мг, 1 ммоль) и триэтиламин (0,7 мл, 5 ммоль), и полученный раствор нагревали до 60°С в течение 2 часов. Полученный раствор концентрировали и очищали жидкостной хроматографией с обращенной фазой (RPLC) с использованием жидкостного хроматографа Isco COMBIFLASH®, элюируя 0-50% ацетонитрила и водой без модификатора. Выход 700 мг, 84%. Ион(ы), обнаруженный методом LCMS: М+Н=631.
Стадия g.
К раствору линкера-3 (полученному, как описано в примере 19) (73 мг, 0,14 ммоль) и промежуточного соединения, полученного на предыдущей стадии (200 мг, 0,32 ммоль, 2,2 экв.) в DMF (30 мл) добавляли EDC (100 мг, 0,5 ммоль), HOAt (65 мг, 3 ммоль) и DIEA (0,14 мл, 1 ммоль) при комнатной температуре. Раствор перемешивали в течение ночи. Полученный раствор концентрировали и очищали с помощью жидкостной хроматографии с обращенной фазой (RPLC) с использованием жидкостного хроматографа Isco COMBIFLASH® с элюированием 0-50% ацетонитрила и водой без модификатора. Выход составил 120 мг, 52%. Ион(ы), обнаруженные методом LCMS: М/2+Н=830.
Стадия h.
Гидроксид лития (24 мг, 1 ммоль) в 2 мл воды добавляли к раствору промежуточного соединения, полученного на предыдущей стадии (120 мг, 0,07 ммоль) в 2 мл THF и 1 мл МеОН. После завершения реакции по данным LCMS раствор гасили ионообменной смолой AMBERLITE® IRN-77 для доведения рН до 1, затем раствор фильтровали и фильтрат концентрировали и использовали на следующей стадии без дополнительной очистки. Промежуточный продукт, полученный на предыдущей стадии, обрабатывали в 2 мл TFA при комнатной температуре в течение ночи при 40°С. Неочищенную реакционную смесь концентрировали и очищали с помощью HPLC с использованием 0-20% ацетонитрила и воды, используя TFA в качестве модификатора. Выход составил 60 мг, выход 74%. Ион(ы), обнаруженный с помощью LCMS: [М/2]+1=589.8.
Пример 32. Синтез конъюгата 7
Раствор Ес-PEG4-азида (каждый мономер Fc-домена, имеющий последовательность, представленную в SEQ ID NO: 38) в PBSx1 буферном растворе (100 мг, 1,28 мкмоль, 6,1 мл, MW=57260 Да, DAR=3,6) добавляли к промежуточному соединению-10 (полученному, как описано в примере 31) (соль TFA, 44 мг, 0,031 ммоль) и свежеприготовленным растворам в PBS с рН 7,4 CuSO4 (0,7 мл, 50,0 мМ, 20 экв.), трис(3-гидр оксипропилтриазо лил метил)амина (ТНРТА, 0,7 мл 50,0 мМ, 20 экв.) и аскорбата натрия (1,05 мл 50,0 мМ, 30 экв.). Полученный гомогенный раствор перемешивали на шейкере в течение 12 ч. Неочищенные растворы разбавляли PBS с рН 7,4 до конечной концентрации 1 мг/мл и дважды подвергали ультрафильтрации (10000 MWCO) до объема 1 мл. Затем неочищенные смеси разбавляли 1:10 в PBS с рН 7,4 и очищали с использованием смолы MabSelect Sure Resin (GE Healthcare, Chicago, IL, USA), с последующей эксклюзионной хроматографией. Очищенный продукт количественно оценивали с помощью спектрофотометра Nanodrop™ в УФ и видимой части спектра (используя рассчитанный коэффициент экстинкции, основанный на аминокислотной последовательности Fc, используемого для конъюгации, и концентрировали приблизительно до 10 мг/мл с использованием центрифужного концентратора (10000 MWCO). Очищенные молекулы анализировали с использованием 4-12% гелей Bis Tris SDS PAGE путем загрузки 1-2 мкг каждой молекулы в гель и окрашивания с использованием мгновенного окрашивания синим. Каждый гель включал линейку молекулярной массы с указанными стандартами молекулярной массы. Выходы обычно составляют 40-60%. Анализ MALDI MS показал диапазон масс (60000-90000) со средней массой 63633. Среднее значение DAR=4,5.
Пример 33. Эффективность конъюгата 6 в модели летального гриппа у мьппей: исследование №3
Конъюгат 6 оценивали против летальной инфекции, вызванной вирусом гриппа INFV A H1N1 у самок мышей BALB/c. В эксперименте участвовало 7 групп по 5 мышей. В день 0 всех мышей заражали 1xLD90 H1N1 A/Texas/36/91. Группы 1-6 получали лечение IV за 28 дней до заражения (таблица 12). Носитель (PBS) был включен в качестве дополнительного отрицательного контроля. Группа 7 получала осельтамивира фосфат перорально, начиная через 8 часов после заражения дважды в день в течение 5 дней. Всех мышей наблюдали в отношении выживаемости (фиг.31А-31F) в течение 15 дней после заражения.
Мыши, получавшие лечение конъюгатом 6, показали 100% выживаемость при однократных дозах во всех концентрациях на уровне до 2,5 мг/кг и 80% выживаемость при 1,25 мг/кг по сравнению с 0% выживаемостью в контрольной группе, получавшей носитель. Все мыши в контрольной группе, получавшей осельтамивира фосфат, выжили. По сравнению с группой, получавшей осельтамивира фосфат, конъюгат 6 продемонстрировал сходную эффективность с осельтамивиром при кумулятивной дозе, в 20 раз более низкой (в мг/кг), несмотря на тот факт, что все группы, получавшие конъюгат 6, дозировали однократно, за 28 дней до инфицирования.
Пример 34. Эффективность конъюгата 6 в модели летального мышиного гриппа: исследование #4
Конъюгат 6 оценивали против летальной инфекции, вызванной вирусом гриппа INFV A H1N1 у самок мышей BALB/c. В эксперименте участвовало 13 групп по 5 мышей. В день 0 всех мышей заражали 1xLD90 H1N1 A/Texas/36/91. Все группы, получавшие конъюгат 6 (8-13), получали однократные IV дозы 10 мг/кг в разное время до и после инфицирования, как показано в таблице 13. Носитель (PBS) и взятый в отдельности Fc были включены в качестве отрицательных контролей. Группы 3-7 получали осельтамивира фосфат (20 мг/кг) путем пероральной доставки, начиная через разные моменты времени после инфицирования дважды в день в течение 5 дней, как показано в таблице 13. Всех мышей наблюдали в отношении выживаемости (фиг.32А-32F) в течение 15 дней после заражения.
Мыши, получавшие лечение конъюгатом 6, показали 100% выживаемость при однократных дозах 10 мг/кг при лечении через 24 часа после инфицирования, и 60 и 80% выживаемость через 48 и 72 часа после инфицирования, соответственно. В группе, получавшей осельтамивира фосфат, выживаемость резко упала до 0% и 20%, соответственно, в группах, в которых лечение начинали через 48 и 72 часа после инфицирования. Эти результаты позволяют предположить, что конъюгат 6 потенциально обладает лучшим терапевтическим окном по сравнению с осельтамивиром при лечении инфекций, вызванных вирусом гриппа А.
Пример 35. Исследование токсичности конъюгата 6
Безопасность конъюгата 6 оценивали в 14-дневном исследовании токсичности с подбором диапазона доз на крысах. Крысам вводили конъюгат 6 в дозе 5, 20 или 50 мг/кг массы тела внутривенно в дни 0 и 7 исследования. По сравнению с контролями, получавшими носитель, при любой испытанной дозе не наблюдалось значительных эффектов на прибавку массы тела (фиг.33), массу органов, потребление пищи. Концентрации в плазме (измеряемые по AUC) увеличивались пропорционально дозе. Эти доклинические результаты исследования безопасности соответствуют высокому терапевтическому индексу. Сводные данные наблюдений представлены в таблице 14.
Пример 36. Эффективность конъюгата 6 против дозы, тремя различными путями, в модели летального мышиного гриппа: исследование #5
Конъюгат 6 оценивали против летальной инфекции, вызванной вирусом гриппа IAV H1N1 у самок мышей BALB/c (Charles River Laboratories, 6-8 недель). Вирус для оценки и характеристики элиминации вирусов (A/Texas/36/91) представляет собой адаптированный к мышам изолят, способный вызывать летальные инфекции у мышей. В эксперименте участвовало 15 групп по 5 мышей. В день 0 всех мышей заражали вирусом при 1x LD90 путем интраназальной инокуляции в объеме 50 мкл после легкой анестезии изофлураном. Группы 1-14 получали однократное лечение за 4 часа до заражения (таблица 15). Для определения эффективности конъюгата 6 разными способами вводили соответствующие концентрации конъюгата (10, 2, 0,4 и 0,1 мг/кг) внутривенно (IV), внутримышечно (IM) или подкожно (SC). В дополнение к группе, получавшей только носитель (PBS), включали человеческий IgG1 (взятый в отдельности Fc) в качестве дополнительного отрицательного контроля (группа 2). Группа 15 получала осельтамивира фосфат перорально, начиная через 8 часов после инфицирования дважды в сутки в течение 5 дней. Всех мышей наблюдали на выживаемость (таблица 15) в течение 14 дней.
Мыши, подвергнутые лечению конъюгатом 6 против заражения вирусом гриппа (H1N1) с помощью однократных доз 10, 2 или 0,4 мг/кг, показали 100% выживаемость на 14 день независимо от пути введения. Только при самой низкой концентрации тестируемого препарата наблюдались различия у отдельных мышей между внутривенным (IV), внутримышечным (IM) и подкожным (SC) введением доз (таблица 16; 60, 80 и 100% выживаемость соответственно). Эти результаты убедительно свидетельствуют о том, что защитные концентрации конъюгата 6 в легких могут быть достигнуты несколькими путями введения.
Пример 37. Эффективность конъюгата 6 против осельтамивир-резистентного изолята в модели летального гриппа у мьппей: исследование #6
Конъюгат 6 оценивали против летальной инфекции, вызванной вирусом гриппа IAV H1N1 у самок мышей BALB/c (Charles River Laboratories, 6-8 недель). Контрольный вирус для заражения (A/Perth/261/2009) представляет собой адаптированный к мышам изолят, несущий мутацию H275Y, приводящую к рузистентности к ингибитору нейраминидазы осельтамивиру. В эксперименте участвовало 10 групп по 5 мышей. В день 0 всех мышей заражали A/Perth/261/2009 (H1N1) при 1x LD90 путем интраназальной инокуляции в объеме 50 мкл мышам, слегка анестезированным изофлураном. Группы 1-9 получали однократное лечение путем внутривенного введения за 4 часа до заражения (таблица 17). Дополнительно к группе, получавшей только носитель (PBS), включали человеческий IgG1 (взятый в отдельности Fc) в качестве дополнительного отрицательного контроля. Группа 10 получала осельтамивира фосфат перорально, начиная через 8 часов после инфицирования два раза в сутки в течение 5 дней. Всех мышей контролировали на выживаемость (фиг.34A-34D, таблица 18) и потерю веса (фиг.35, таблица 19) в течение 15 дней после заражения.
Мыши, подвергнутые лечению конъюгатом 6 в однократных дозах 50, 10 и 2 мг/кг, показали 100% выживаемость после заражения вирусом гриппа (A/Perth/261/2009). Кроме того, несмотря на небольшой размер группы (n=5), эти результаты были статистически значимыми по сравнению с контрольной группой, получавшей носитель (таблица 18). При концентрациях конъюгата 6, равных 0,4, 0,2 или 0,1 мг/кг, выживаемость составила 60%, при этом ни одна мышь не дожила до конца исследования, если им вводили только носитель (PBS) или hIgG1 (только Fc). В группе осельтамивира выжило только одно животное (эффективность 20%), несмотря на лечение дозой, которая, как было показано, ранее защищала против чувствительных к осельтамивиру изолятов (20 мг/кг, 2 раза в день х 5 дней). Эти результаты подтверждают, что контрольный вирус для заражения является резистентным к осельтамивиру и чувствительным к конъюгату 6.
Активность конъюгата 6 против мутантов, содержащих мутацию H275Y, дополнительно подтверждается данными по массе тела (фиг.35, таблица 19). Группы, получавшие однократную дозу конъюгата 6 в концентрациях 2 мг/кг или более, продемонстрировали кратковременную потерю веса, составляющую 5% или менее.
Пример 38. 7-дневное фармакокинетическое исследование (РК) на крысах после внутривенного введения исследуемого препарата.
Фармакокинетические (РК) исследования на крысах выполняли в лаборатории Seventh Wave Laboratories (Maryland Heights, МО) с использованием самцов крыс Sprague Dawley в возрасте 46-49 дней. Крысам вводили внутривенно через хвостовую вену 75 мг/кг тестируемого препарата (объем дозы 5 мл/кг). Животных содержали в стандартных условиях содержания, одобренных IACUC. В надлежащие моменты времени у животных вызывали несмертельное кровотечение (ретроорбитальное, щечное или из хвостовой вены), при этом кровь собирали в пробирки с K2EDTA для предотвращения коагуляции. Собранную кровь центрифугировали (2000 х g в течение 10 минут) и отбирали плазму для анализа концентраций исследуемого препарата во времени.
Концентрации конъюгата 6 или hIgG1 Fc в плазме в каждый момент времени измеряли с помощью сэндвич-ELISA следующим образом: молекулы конъюгата 6 захватывали либо на планшеты, покрытые нейраминидазой, либо на планшеты, покрытые антителами против hIgG1, а затем детектировали с помощью HRP-конъюгированного антитела против человеческого IgG-Fc. hIgG1 захватывали с использованием антитела против Fc hIgG1. Концентрацию белка рассчитывали в GraphPad Prism с использованием 4PL нелинейной регрессии стандартных кривых конъюгата 6 (или Fc hIgG1). Более подробное описание способа приведено ниже.
96-луночные планшеты Nunc Maxisorp (каталожный номер 12-565-136, ThermoFisher) покрывали либо нейраминидазой из A/California/04/2009 (H1N1) (11058-VNAHC, Sino Biological), либо антителом против Fc IgG1 в IX KPL покрывающем буфере (5150-0041, SeraCare). В случаях, когда для захвата тестируемого препарата использовали антитело против Fc IgG1, отбирали улавливающие и детектирующие антитела против Fc IgG1, которые связывают различные эпитопы. Планшеты инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч на орбитальном шейкере для планшетов (500 об/мин). Серийные разведения образцов плазмы вносили в планшеты и инкубировали при комнатной температуре в течение 2 ч (разбавитель образцов: 1% BSA в PBS 0,05% Tween 20 + конечная концентрация в плазме не подвергнутых воздействию крыс 1:900). Стандартные кривые конъюгата 6 или hIgG1 Fc в диапазоне 500-0,230 нг/мл в двух повторностях были воспроизведены на каждом планшете.
После 2-часовой инкубации планшеты промывали 5 раз в 300 мкл PBS с 0,05% Tween 20. Конъюгат 6, связанный с нейраминидазой на планшетах (или антитело против hIgG1-Fc), затем метили конъюгированным с HRP антителом против человеческого IgG Fc F(ab')2 (709-036-098, Jackson), разбавленным 1:1000 в разбавителе образцов в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем планшеты промывали 8 раз в 300 мкл PBS с 0,05% Tween 20 и проявляли субстратом ТМВ в течение 7-8 минут. Реакцию останавливали с помощью 1N H2SO4. Поглощение считывали при 450 нм. Аналогичный протокол использовали для hIgG1-Fc, где для захвата использовали только антитело против hIgG1-Fc. Количества конъюгата 6, измеренные в разные моменты времени с использованием захвата либо нейраминидазы, либо антитела против hIgG1-Fc, были сходными в пределах экспериментальной ошибки, что позволяет предположить, что интактный конъюгат является стабильным in vivo.
Общий конъюгат 6 (или hIgG1-Fc) в тестируемых образцах интерполировали с использованием программного обеспечения Graphpad Prism Version 6 после нелинейного регрессионного анализа (анализ сигмоидальной кривой с использованием четырехпараметрической модели нелинейной регрессии (4PL)) стандартных кривых конъюгата 6 (или hIgG1-Fc). Кривые, сравнивающие конъюгат 6 и hIgG1-Fc, показаны на фиг.36. Количества конъюгата 6, измеренные в разные моменты времени с использованием захвата либо нейраминидазы, либо антитела против hIgG1-Fc, были сходными в пределах экспериментальной ошибки, что позволяет предположить, что интактный конъюгат является стабильным in vivo.
Пример 39. 14-дневное фармакокинетическое (РК) исследование на крысах после внутривенного введения тестируемого препарата
Фармакокинетические (РК) исследования на крысах проводили в лаборатории Seventh Wave Laboratories (Maryland Heights, МО) с использованием самцов крыс Sprague Dawley в возрасте 46-49 дней. Крысам вводили внутривенно через хвостовую вену 5, 20 или 50 мг/кг тестируемого препарата (объем дозы 5 мл/кг) в дни 1 и 8. Животных содержали в стандартных условиях содержания, одобренных IACUC. В определенные моменты времени у животных вызывали несмертельное кровотечение (ретроорбитальное, щечное или из хвостовой вены), при этом кровь собирали в пробирки с K2EDTA для предотвращения коагуляции. Собранную кровь центрифугировали (2000 х g в течение 10 минут) и отбирали плазму для анализа концентраций тестируемого препарата во времени.
Концентрации конъюгата 6 в плазме в каждый момент времени измеряли с помощью сэндвич-ELISA следующим образом: молекулы конъюгата 6 захватывали на планшетах, покрытых нейраминидазой, и затем детектировали с использованием HRP-конъюгированного антитела против человеческого IgG-Fc. hIgG1 захватывали с использованием антитела против hIgG1-Fc. Концентрацию белка рассчитывали в GraphPad Prism с использованием 4PL нелинейной регрессии стандартных кривых конъюгата 6. Более подробное описание способа приведено ниже.
96-луночные планшеты Nunc Maxisorp (каталожный номер 12-565-136, ThermoFisher) были покрыты нейраминидазой из A/California/04/2009 (H1N1) (11058-VNAHC, Sino Biological) в покрывающем буфере IX KPL (5150-0041, SeraCare). Планшеты инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч на орбитальном шейкере для планшетов (500 об/мин). Серийные разведения образцов плазмы вносили в планшеты и инкубировали при комнатной температуре в течение 2 ч (разбавитель образцов: 1% BSA в PBS 0,05% Tween 20 + конечная концентрация в плазме не подвергнутых воздействию крыс 1:900). 6 стандартных кривых конъюгата в диапазоне 500-0,230 нг/мл, в двух повторностях, были воспроизведены на каждом планшете.
После 2 ч инкубации планшеты промывали 5 раз в 300 мкл PBS с 0,05% Tween 20. Конъюгат 6, связанный с нейраминидазой на планшетах, затем метили конъюгированным с HRP антителом против человеческого IgG Fc F(ab')2 (709-036-098, Jackson), разводили 1:1000 в разбавителе образцов в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем планшеты промывали 8 раз в 300 мкл PBS с 0,05% Tween 20 и проявляли субстратом ТМВ в течение 7-8 минут. Реакцию останавливали с помощью 1N H2SO4. Поглощение считывали при 450 нм.
Общий конъюгат 6 (или hIgG1-Fc) в тестируемых образцах интерполировали с использованием Graphpad Prism Version 6 после нелинейного регрессионного анализа (анализ сигмоидальной кривой с использованием четырехпараметрической модели нелинейной регрессии (4PL)) стандартных кривых конъюгата 6. Кривые, сравнивающие конъюгат 6, показанные на фиг.37, демонстрируют линейную пропорциональность дозе.
Пример 40. 28-дневное фармакокинетическое (РК) исследование на крысах, сравнивающее внутривенное (IV) и подкожное (SC) введение тестируемого препарата
Фармакокинетическое (РК) исследования на крысах проводили в лаборатории Seventh Wave Laboratories (Maryland Heights, МО) с использованием самцов крыс Sprague Dawley в возрасте 46-49 дней. Крысам вводили внутривенно или подкожно тестируемый препарат в дозе 5 мг/кг (объем дозы 5 мл/кг). Животных содержали в стандартных условиях содержания, одобренных IACUC. В определенные моменты времени животных подвергали не с мертель ному кровотечению (ретроорбитальное, щечное или из хвостовой вены), при этом кровь собирали в пробирки с K2EDTA для предотвращения коагуляции. Собранную кровь центрифугировали (2000 х g в течение 10 минут) и отбирали плазму для анализа концентраций тестируемого препарата во времени.
Концентрации конъюгата 6 или hIgG1-Fc в плазме в каждый момент времени измеряли с помощью сэндвич-ELISA следующим образом: молекулы конъюгата 6 захватывали на планшетах, покрытых нейраминидазой, а затем определяли с помощью HRP-конъюгированного антитела против человеческого IgG-Fc. Концентрацию белка рассчитывали в GraphPad Prism с использованием 4PL нелинейной регрессии стандартных кривых конъюгата 6. Более подробное описание способа приведено ниже.
96-луночные планшеты Nunc Maxisorp (каталожный номер 12-565-136, ThermoFisher) покрывали нейраминидазой из A/California/04/2009 (H1N1) (11058-VNAHC, Sino Biological) в покрывающем буфере 1X KPL (5150-0041, SeraCare). Планшеты инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч на орбитальном шейкере для планшетов (500 об/мин). Серийные разведения образцов плазмы вносили в планшеты и инкубировали при комнатной температуре в течение 2 ч (разбавитель образца: 1% BSA в PBS 0,05% Tween 20 + конечная концентрация в плазме не подвергнутых воздействию крыс 1:900). Стандартные кривые конъюгата 6 в диапазоне 500-0,230 нг/мл, в двух повторностях, были воспроизведены на каждом планшете.
После 2-часовой инкубации планшеты промывали 5 раз в 300 мкл PBS с 0,05% Tween 20. Конъюгат 6, связанный с нейраминидазой на планшетах, затем метили ко нъюгиро ванным с HRP антителом против человеческого IgG Fc F(ab')2 (709-036-098, Jackson), разводили 1:1000 в разбавителе образцов в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем планшеты промывали 8 раз в 300 мкл PBS с помощью 0,05% Tween 20 и проявляли субстратом ТМВ в течение 7-8 минут. Реакцию останавливали с помощью 1N H2SO4. Поглощение считывали при 450 нм.
Общий конъюгат 6 (или hIgG1-Fc) в тестируемых образцах интерполировали с использованием Graphpad Prism Version 6 после нелинейного регрессионного анализа (анализ сигмоидальной кривой с использованием четырехпараметрической модели нелинейной регрессии (4PL)) стандартных кривых конъюгата 6. Кривые, сравнивающие конъюгат 6, на фиг.38 показывают, что уровни в плазме при SC и IV введении сходились через 24 ч и были сходными в пределах экспериментальной ошибки до 336 ч.
Пример 41. 28-дневное фармакокинетическое (РК) исследование у приматов, отличных от человека, после внутривенного введения исследуемого препарата
Фармакокинетические (РК) исследования у приматов, отличных от человека (NHP), выполняла компания BTS Research (San Diego, СА) с использованием самцов и самок яванского макака в возрасте 4,5-8 лет с массой тела 2,5-6,5 кг. Приматам NHP вводили внутривенно через подкожную вену ноги или подкожную вену руки 5 или 20 мг/кг тестируемого препарата (объем дозы 5 мл/кг). Животных содержали в стандартных условиях содержания, одобренных IACUC. В определенные моменты времени животных подвергали нелетальному кровотечению (из бедренной или подкожной вены руки), при этом кровь собирали в пробирки с K2EDTA для предотвращения коагуляции. Собранную кровь центрифугировали (2000 х g в течение 10 минут) и отбирали плазму для анализа концентраций тестируемого препарата во времени.
Концентрации конъюгата 6 в плазме в каждый момент времени измеряли с помощью сэндвич-ELISA следующим образом: молекулы конъюгата 6 захватывали на планшетах, покрытых нейраминидазой, и затем детектировали с помощью конъюгированного с HRP антитела против человеческого IgG-Fc. Концентрацию белка рассчитывали в GraphPad Prism с использованием 4PL нелинейной регрессии стандартных кривых конъюгата 6. Более подробное описание способа приведено ниже.
96-луночные планшеты Nunc Maxisorp (каталожный номер 12-565-136, ThermoFisher) покрывали нейраминидазой из A/California/04/2009 (H1N1) (11058-VNAHC, Sino Biological) в покрывающем буфере IX KPL (5150-0041, SeraCare). Планшеты инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч на орбитальном шейкере для планшетов (500 об/мин). Серийные разведения образцов плазмы вносили в планшеты и инкубировали при комнатной температуре в течение 2 ч (разбавитель образца: 1% BSA в PBS 0,05% Tween 20 + конечная концентрация в плазме не подвергнутых воздействию яванских макак 1: 2,500). Стандартные кривые конъюгата 6 в диапазоне 500-0,230 нг/мл, в двух повторностях, были воспроизведены на каждом планшете.
После 2-часовой инкубации планшеты промывали 5 раз в 300 мкл PBS с 0,05% Tween 20. Конъюгат 6, связанный с нейраминидазой на планшетах, затем метили конъюгированным с HRP антителом к человеческому IgG Fc F(ab')2 (709-036-098, Jackson), разводили 1:1000 в разбавителе образцов в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем планшеты промывали 8 раз в 300 мкл PBS с 0,05% Tween 20 и проявляли субстратом ТМВ в течение 7-8 минут. Реакцию останавливали с помощью 1N H2SO4. Поглощение считывали при 450 нм.
Общий конъюгат 6 в тестируемых образцах интерполировали с использованием Graphpad Prism Version 6 после нелинейного регрессионного анализа (анализ сигмоидальной кривой с использованием четырехпараметрической модели нелинейной регрессии (4PL)) стандартных кривых конъюгата 6 (или hIgG1-Fc). Параметры РК рассчитывали с помощью программы WinNonlin. Кривые, сравнивающие конъюгат 6, показаны на фиг.39, и краткое изложение ключевых РК параметров представлено в таблице 20. Ответ на дозу является линейным в диапазоне 5-20 IV внутривенно, что приводит к периоду полужизни, составляющему приблизительно 9 дней для обеих доз (по сравнению с мышью/крысой).
Пример 42. Фармакокинетическое (РК) исследование распределения в легких у мышей после внутривенного введения тестируемого препарата
Фармакокинетические (РК) исследования на мышах проводили на самцах мышей CD-I в возрасте 6 недель. Мышам вводили внутривенно через хвостовую вену 10 мг/кг тестируемого препарата (объем дозы 5 мл/кг). Животных содержали в стандартных условиях содержания, одобренных IACUC. В определенные моменты времени животных умерщвляли для сбора крови (путем пункции сердца) в пробирки с K2EDTA и легкие. Кровь центрифугировали (2000 х g, в течение 10 минут) для получения плазмы. Легкие взвешивали и гомогенизировали в пробирках объемом 1,5 мл при помощи стерильного одноразового пестика (Z359947, Sigma) в 100 мкл буфера для гомогенизации, состоящего из 11,64 мл реагента для экстракции тканевого белка (78510, Thermo Scientific), 0,24 мл коктейля ингибиторов протеаз (78410, Thermo Scientific) и 0,12 мл EDTA. После 1-2 мин гомогенизации объем доводили до 1 мл буфером для гомогенизации и образцы инкубировали на льду в течение 20 мин с периодическим перемешиванием путем осторожного встряхивания. Гомогенаты центрифугировали при 8000 х g в течение 10 мин, и супернатант оставляли для анализа концентраций тестируемого препарата во времени.
Концентрации конъюгата 6 в плазме и легких в каждый момент времени измеряли с помощью сэндвич-ELISA следующим образом: молекулы конъюгата 6 захватывали на планшетах, покрытых нейраминидазой, и определяли с помощью конъюгированного с HRP антитела против человеческого IgG-Fc. Концентрацию белка рассчитывали в GraphPad Prism с использованием 4PL нелинейной регрессии стандартных кривых конъюгата 6. Более подробное описание способа приведено ниже.
96-луночные планшеты Nunc Maxisorp (каталожный номер 12-565-136, ThermoFisher) покрывали нейраминидазой из A/California/04/2009 (H1N1) (11058-VNAHC, Sino Biological) в покрывающем буфере IX KPL (5150-0041, SeraCare). Планшеты инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч на орбитальном шейкере для планшетов (500 об/мин). Серийные разведения образцов плазмы высевали и инкубировали при комнатной температуре в течение 2 ч (разбавитель образцов: 1% BSA в PBS 0,05% Tween 20 + конечная концентрация в плазме не подвергнутых воздействию мышей 1:100). Стандартные кривые конъюгата 6 в диапазоне 500-0,230 нг/мл, в двух повторностях, были воспроизведены на каждом планшете.
После 2-часовой инкубации планшеты промывали 5 раз в 300 мкл PBS с 0,05% Tween 20. Конъюгат 6, связанный с нейраминидазой на планшетах, затем метили конъюгированным с HRP антителом против человеческого IgG Fc F(ab')2 (709-036-098, Jackson), разводили 1:1000 в разбавителе образцов в течение 1 часа при комнатной температуре. Затем планшеты промывали 8 раз в 300 мкл PBS с 0,05% Tween 20 и проявляли субстратом ТМВ в течение 7-8 минут. Реакцию останавливали с помощью 1N H2SO4. Поглощение считывали при 450 нм.
Общий конъюгат 6 в тестируемых образцах интерполировали с использованием Graphpad Prism Version 6 после нелинейного регрессионного анализа (анализ сигмоидальной кривой с использованием четыре хпараметриче с кой модели нелинейной регрессии (4PL)) стандартных кривых конъюгата 6. На фиг.40 показаны кривые, сравнивающие концентрации конъюгата 6 в плазме и легких. Неожиданно, Cmax в легких была достигнута за t=1 ч (19,5 мкг/г легочной ткани, ~310 нМ). Воздействие конъюгата 6 на легкие составило приблизительно 10% по сравнению с плазмой.
Пример 43. 5-дневное фармакокинетическое (РК) исследование на мышах, сравнивающее внутривенное (IV), подкожное (SC) и внутримышечное (IM) введение тестируемого препарата
Фармакокинетические (РК) исследования проводили на самцах мышей CD-I в возрасте 6 недель. Мышам вводили внутривенно через хвостовую вену 5 мг/кг тестируемого препарата (объем дозы 5 мл/кг). Животных содержали в стандартных условиях содержания, одобренных IACUC. В определенное время животных подвергали несмертельному кровотечение (ретро орбитальное, щечное или из хвостовой вены), при этом кровь собирали в пробирки с K2EDTA для предотвращения коагуляции. Собранную кровь центрифугировали (2000 х g в течение 10 минут) и отбирали плазму для анализа концентраций тестируемого препарата во времени.
Концентрации конъюгата 6 в плазме в каждый момент времени измеряли с помощью сэндвич-ELISA следующим образом: молекулы конъюгата 6 захватывали на планшетах, покрытых нейраминидазой, и затем детектировали с помощью конъюгированного с HRP антитела против человеческого IgG-Fc. Концентрацию белка рассчитывали в GraphPad Prism с использованием 4PL нелинейной регрессии стандартных кривых конъюгата 6 (или hIgG1-Fc). Более подробное описание способа приведено ниже.
96-луночные планшеты Nunc Maxisorp (каталожный номер 12-565-136, ThermoFisher) покрывали нейраминидазой из A/California/04/2009 (H1N1) (11058-VNAHC, Sino Biological) в покрывающем буфере 1X KPL (5150-0041, SeraCare). Планшеты инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч на орбитальном шейкере для планшетов (500 об/мин). Серийные разведения образцов плазмы вносили в планшеты и инкубировали при комнатной температуре в течение 2 ч (разбавитель образцов: 1% BSA в PBS 0,05% Tween 20 + конечная концентрация в плазме не подвергнутых воздействию мышей 1:100). Стандартные кривые конъюгата 6 в диапазоне 500-0,230 нг/мл, в двух повторностях, были воспроизведены на каждом планшете.
После 2-часовой инкубации планшеты промывали 5 раз в 300 мкл PBS с 0,05% Tween 20. Конъюгат 6, связанный с нейраминидазой на планшетах, затем метили ко нъюгиро ванным с HRP антителом против человеческого IgG Fc F(ab')2 (709-036-098, Jackson), разводили 1:1000 в разбавителе образцов в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем планшеты промывали 8 раз в 300 мкл PBS с 0,05% Tween 20 и проявляли субстратом ТМВ в течение 7-8 минут. Реакцию останавливали с помощью 1N H2SO4. Поглощение считывали при 450 нм.
Общий конъюгат 6 в тестируемых образцах интерполировали с использованием Graphpad Prism Version 6 после нелинейного регрессионного анализа (анализ сигмоидальной кривой с использованием четыре хпараметриче с кой модели нелинейной регрессии (4PL)) стандартных кривых конъюгата 6. Кривые, сравнивающие конъюгат 6, показаны на фиг.41. Уровни воздействия для IV, IM и SC были сходными с AUC 2082, 1944 и 2500, соответственно.
Пример 44. Эффективность у мышей и РК многих видов обеспечивает нечастое профилактическое дозирование у людей
Аллометрическое масштабирование эффективного дозирования у мышей на основе РК исследований на мышах, крысах и приматах использовали для предсказания дозирования и РК параметров у субъектов-людей. Аллометрическое масштабирование было основано на площади под кривой (AUC) при эффективной дозе 2,5 мг/кг в 28-дневном исследовании профилактики на мышах (см. пример 33).
Для алло метрического масштабирования только яванских макак, человеческий клиренс (CL) рассчитывали на основе РК данных только яванских макак (пример 41) с использованием простого аллометрического уравнения: CL (человек)=CL (макак) ⋅ [BW(человек)/BW(макак)]w, где BW = масса тела, и w представляет собой коэффициент масштабирования, фиксированный на уровне 0,85. Результаты масштабирования только яванских макак представлены в таблице 21.
Для аллометрического масштабирования мыши-крысы-яванского макака, человеческий клиренс (CL) на основании видов животных наносили на график в зависимости от массы тела (BW) животного на двойную логарифмическую шкалу в соответствии со следующим аллометрическим уравнением: CL=а ⋅ BWx, где а представляет собой коэффициент, и х представляет собой показатель степени аллометрического уравнения. Коэффициент а и показатель степени х были рассчитаны из точки пересечения и наклона линии линейной регрессии, соответственно. Результаты масштабирования мышь-крыса-яванский макак представлены в таблице 22.
Значения человеческого клиренса, рассчитанные с помощью соответствующих алгоритмов, описанных выше, затем использовали для расчета соответствующей дозы для человека, необходимой для достижения целевого эффективного значения AUC 3700 мкг-ч/мл (из мышиной дозы 2,5 мг/кг, пример 33), используя следующее уравнение: Доза=CL ⋅ AUC.
Пример 45. Синтез промежуточного соединения 11
Стадия а.
Раствор трет-бутил (4-бромбутил)карбамата (11,2 г, 60 ммоль) и трет-бутил (4-аминобутил)карбамата (10 г, 40 ммоль), растворенных в DMF (150 мл), обрабатывали карбонатом калия (16,4 г, 120 ммоль), затем перемешивали при 80°С в течение 6 ч. Реакционную смесь распределяли между DCM (500 мл) и рассолом (100 мл). Органический слой отделяли и промывали рассолом, затем сушили сульфатом натрия. Раствор фильтровали, концентрировали и очищали обращенно-фазовой жидкостной хроматографией (RPLC) с использованием жидкостного хроматографа Isco COMBIFLASH®, элюируя 10-100% ацетонитрила и водой с 0,1% TFA в качестве модификатора. Выход продукта 11,0 г, 77%. Ион(ы), найденный с помощью LCMS: М+Н=360.4
Стадия b.
Продукт, полученный на предыдущей стадии (0,4 г, 1,11 ммоль) и Fmoc-OSu (0,45 мг, 1,3 ммоль) растворяли в DCM (10 мл), затем обрабатывали N-метилморфолином (0,22 мл, 2 ммоль) и перемешивали в течение 1 ч при комнатной температуре. Реакционную смесь концентрировали и очищали с помощью жидкостной хроматографии с обращенной фазой (RPLC) с использованием жидкостного хроматографа Isco COMBIFLASH®, элюируя 10%-100% ацетонитрила и водой без 0,1% TFA в качестве модификатора. Выход продуктов составил 450 мг, 69%. Ион(ы), найденный с помощью LCMS: М/2+Н=582.4.
Стадия с.
Продукт, полученный на предыдущей стадии (0,4 г, 0,7 ммоль), обрабатывали TFA (5 мл) при комнатной температуре в течение 0,5 ч, затем концентрировали до сухого состояния и использовали на следующей стадии без дополнительной очистки. Выход на этой стадии был количественным. Ион(ы), найденный с помощью LCMS: М/2+Н=382.3.
Стадия d.
Fmoc диамин (24 мг, 0,063 ммоль), полученный на предыдущей стадии, добавляли к раствору карбоновой кислоты (80 мг, 0,126 ммоль, описанный в синтезе промежуточного соединения 10, стадия f) в DMF (5 мл), затем обрабатывали HATU (50 мг, 0,13 ммоль), затем N-метил мор фол ин (0,06 мл, 0,50 ммоль). После перемешивания в течение 1 ч полученный раствор концентрировали и очищали обращенно-фазовой жидкостной хроматографией (RPLC) с использованием жидкостного хроматографа Isco COMBIFLASH®, элюируя 10-100% ацетонитрила и водой без TFA в качестве модификатора. Выход продуктов составил 80 мг, 79%. Ион(ы), найденный с помощью LCMS: М/2+Н=803.9.
Стадия е.
Продукт, полученный на предыдущей стадии (80 мг, 0,050 ммоль), обрабатывали 1% DBU (1,8-диазабицикло [5.4.0]ундец-7-ен) в DMF (2 мл) и перемешивали при комнатной температуре. Когда реакция была завершена по данным LCMS (15 минут), реакционную смесь концентрировали, затем обрабатывали TFA (2 мл) и перемешивали в течение 30 мин при комнатной температуре. Реакционный раствор концентрировали и очищали обращенно-фазовой жидкостной хроматографией (RPLC) с использованием жидкостного хроматографа Isco COMBIFLASH®, элюируя 10-100% ацетонитрилом и водой, используя 0,1% TFA в качестве модификатора. Выход продукта в виде соли TFA составил 52 мг. Ион(ы), найденный с помощью LCMS: М/2+Н=492.7.
Стадия f.
Продукт, полученный на предыдущей стадии, растворяли в воде (2 мл), затем обрабатывали раствором гидроксида лития (12 мг, 0,50 ммоль, в 1 мл воды). За протекающей реакцией следили с помощью LCMS. После перемешивания в течение 10 мин реакцию гасили 0,1 мл уксусной кислоты. Полученный раствор концентрировали и очищали с помощью жидкостной хроматографии с обращенной фазой (RPLC) с использованием жидкостного хроматографа Isco COMBIFLASH®, элюируя 0%-30% ацетонитрила и водой, используя 0,1% TFA в качестве модификатора. Выход продукта: 30 мг в виде соли TFA, 66%. Ион(ы), найденные с помощью LCMS: М/2+Н=452.7. М/3+Н=302.1.
Пример 46. Синтез промежуточного соединения 12
Стадия а.
К раствору трет-бутил (4-бромбутил)карбамата (4,8 г, 19 ммоль) и пропаргил-PEG4 амина (2 г, 8,6 ммоль) в DMF (50 мл) добавляли карбонат калия (3,6 г, 26 ммоль). Раствор перемешивали при 80°С в течение 6 ч, затем распределяли между DCM (200 мл) и рассолом (50 мл). Органический слой отделяли, промывали рассолом, сушили сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали, затем очищали обращенно-фазовой жидкостной хроматографией (RPLC) с использованием жидкостного хроматографа Isco COMBIFLASH®, элюируя 10%-100% ацетонитрила и водой с 0,1% TFA в качестве модификатора. Выход продукта составил 3,5 г, 70%. Ион(ы), найденные с помощью LCMS: М/2+Н=574.4.
Стадия b.
Продукт, полученный на предыдущей стадии (3,5 г, 8,6 ммоль), обрабатывали TFA (20 мл) при комнатной температуре в течение 0,5 ч, затем концентрировали до сухого состояния, растворяли в воде, замораживали, лиофилизировали и использовали на следующей стадии без дополнительной очистки. На этой стадии выход был количественным. Ион(ы), найденный с помощью LCMS: М/2+Н=374.3.
Стадия с.
Соль TFA диамина, полученная на предыдущей стадии (37 мг, 0,1 ммоль), добавляли к раствору карбоновой кислоты (130 мг, 0,2 ммоль, описанной в синтезе промежуточного соединения 10, стадия f) в 10 мл DMF, затем обрабатывали HATU (80 мг, 0,2 ммоль) и N-метилморфолином (0,25 мл, 2 ммоль). Полученный раствор перемешивали в течение 1 ч, затем концентрировали и очищали обращенно-фазовой жидкостной хроматографией (RPLC) с использованием жидкостного хроматографа Isco COMBIFLASH®, элюируя 10%-100% ацетонитрила и водой без 0,1% TFA в качестве модификатора. Выход продукта составил 120 мг, 75%. Ион(и), найденный с помощью LCMS: М/2+Н=799.9.
Стадия d.
Продукт, полученный на предыдущей стадии (120 мг, 0,075 ммоль), обрабатывали 2 мл трифторуксусной кислоты и перемешивали в течение 30 мин при комнатной температуре. Полученный раствор концентрировали, растворяли в воде (2 мл), затем обрабатывали раствором гидроксида лития (12 мг, 0,5 ммоль) в воде (1 мл). Полученный раствор перемешивали в течение 10 мин, затем слегка подкисляли с помощью 0,1 мл уксусной кислоты, концентрировали и очищали обращенно-фазовой жидкостной хроматографией (RPLC) с использованием жидкостного хроматографа Isco COMBIFLASH®, элюируя 0%-30% ацетонитрила и водой, используя 0,1% TFA в качестве модификатора. Выход продуктов составил 48 мг в виде соли TFA, 57%. Ион(ы), найденный с помощью LCMS: М/2+Н=559.757. М/3+Н=373.5.
Пример 47. Синтез конъюгата 8
К раствору h-IgG1 Рс-PEG4-азида в буферном растворе PBSx1 (100 мг, 1,71 мкмоль, 7,011 мл, MW=58200 Да, DAR=3,7) добавляли малую молекулу, цериватизированную алкином (соль TFA промежуточного соединения-12, 45 мг, 0,031 ммоль), и свежеприготовленные растворы в PBS при рН 7,4 CuSO4 (0,7 мл, 50,0 мМ, 20 жв.), трис(3-гидроксипропилтриазолилметил)-амина (ТНРТА, 0,7 мл, 50,0 мМ, 20 экв.) и аскорбата натрия (1,05 мл, 50,0 мМ, 30 экв.). Полученный гомогенный раствор перемешивали на шейкере в течение 12 ч. Неочищенные растворы разбавляли PBS при рН 7,4 до конечной концентрации 1 мг/мл и дважды подвергали ультрафильтрации (10000 MWCO) до объема 1 мл. Затем неочищенные смеси разбавляли 1:10 в PBS при рН 7,4 и очищали с использованием смолы MabSelect Sure Resin (GE Healthcare, Chicago, IL, USA), с последующей эксклюзионной хроматографией. Очищенный продукт количественно оценивали с помощью спектрофотометра Nanodrop™ в УФ и видимой части спектра (используя рассчитанный коэффициент экстинкции, эснованный на аминокислотной последовательности Fc, используемого для конъюгации, и концентрировали приблизительно до 10 мг/мл с использованием центрифужного концентратора (10000 MWCO). Очищенные молекулы анализировали с использованием 4-12% гелей Bis Tris SDS PAGE путем загрузки 1-2 мкг каждой молекулы в гель и окрашивания с использованием мгновенного окрашивания синим. Каждый гель включал линейку молекулярной массы с указанными стандартами молекулярной массы (фиг. 42). Выходы обычно составляют 40-60%. Анализ MALDI MS показал диапазон масс (60000-90000) со средней массой 62358. Среднее значение DAR=3.
Пример 48. Сравнение активности выбранных ингибиторов in vitro и in vivo с их Fc-конъюгатами в анализах СРЕ и в модели летального мышиного гриппа
Чтобы продемонстрировать, что конъюгирование описанных в настоящем цокументе ингибиторов нейраминидазы с Fc усиливает их активности в анализах вирусной репликации и в моделях эффективности in vivo, авторы сравнили активности выбранных неконъюгированных ингибиторов с их Fc-конъюгатами в анализах цитопатического эффекта (СРЕ) и в моделях летальной мышиной инфекции, вызванной вирусом гриппа. Для анализа микронейтрализации СРЕ десять двукратных серийных разведений каждого тестируемого препарата (ТА), начиная с 160 нМ или 400 нМ (9600 нМ для занамивира и осельтамивира в качестве контролей), готовили в двух повторностях для одночасовой инокуляции INF V А (А/С А/09 Н IN 1) при множественности инфицирования (MOI) 0,001 и INFV В при MOI 0,01 для одночасовой инкубации. Затем смесь ТА-вирус добавляли к клеткам MDCK, посеянным в 96-луночные планшеты, и инкубировали в течение одного часа. На 3-й день после инфицирования INFV А и на 5-й день после инфицирования INFV В (B/Brisbane), клетки фиксировали и окрашивали кристаллическим фиолетовым, и считывали оптическую плотность для расчета 50-процентной эффективной концентрации (ЕС50) каждого ТА с использованием модели доза-реакция XLfit. Собственная цитотоксичность каждого ТА также оценивали с использованием десяти двукратных серийных разведений каждого ТА, начиная с 160 нМ или 400 нМ, приготовленных в двух повторностях для инокуляции клетками MDCK в 96-луночных культуральных планшетах. Жизнеспособность клеток определяли через 3 и 5 дней после обработки с использованием набора CellTiter-Glo. Значение 50% цитотоксической концентрации (СС50) рассчитывали с использованием модели доза-реакция XLfit. Цитотоксичности не наблюдалось ни для одного из ТА при самых высоких протестированных концентрациях. Обобщенные данные анализа микро нейтрализации на основе СРЕ показаны в таблице 23.
Данные, приведенные в обобщенном виде в таблице 23, демонстрируют, что Fc-конъюгиро ванные формы димеров нейраминидазы обладают более высокой активностью в анализе микр о нейтрализации СРЕ, чем их неконъюгированные аналоги. При сравнении конъюгата 6 с промежуточным соединением-7 наблюдалось 166-кратное и 2-кратное увеличение против INFV А и INFV В, соответственно. При сравнении конъюгата 8 с промежуточным соединением-12 наблюдалось 26-кратное и 2-кратное увеличение против INFV А и INFV В, соответственно.
Конъюгат 6 сравнивали с наиболее мощным димером ингибитора нейраминидазы из исследования, приведенного в обобщенном виде в таблице 23 (промежуточное соединение-11, только димер, соответствующий промежуточному соединению-12 без тримерного линкера, обеспечивающего возможность конъюгации с Fc) в модели летальной инфекции, вызванной вирусом гриппа IAV HIN 1, с использованием самок мышей BALB/c (Charles River Laboratories, 6-8 недель). Контрольный вирус для заражения (A/Puerto Rico/08/1934, также известный как PR8) представляет собой адаптированный для мышей изолят со значением LD90, равным приблизительно 30 бляшкообразующих единиц (БОЕ) на мышь.
В эксперименте участвовало 8 групп по 5 мышей. В день 0 всех мышей заражали PR8 при 10-кратном превышении LD90 путем интраназальной инокуляции в объеме 50 мкл мышам, анестезированным смесью кетамин/ксилазин (150 и 10 мг/кг, соответственно). Группы получали однократное лечение носителем, только hIgG1-Fc, конъюгатом 6 или промежуточным соединением-11 внутривенно через 2 часа после заражения (таблица 24; группы 1-6). Группа 7 получала промежуточное соединение-11 (15 мг/кг) два раза в сутки (bid) в течение 5 дней, также внутривенно. Группа 8 получала осельтамивир (15 мг/кг) перорально (РО) 2 раза в сутки в течение 5 дней. Всех мышей наблюдали на выживаемость (таблица 25) и потерю массы тела (данные не показаны) в течение 10 дней после заражения вирусом.
Как и ожидалось, мыши, получавшие носитель или только hIgG1-Fc, умерли от инфекции на 7 день (таблица 25). Мыши, получавшие 10 доз (всего 150 мг/мышь) осельтамивир а, продемонстрировали статистически значимую задержку смерти, но только одно животное дожило до 10-го дня. Все мыши, получившие однократную дозу конъюгата 6 в дозе 0,3 или 3 мг/кг, выжили до конца исследования и показали чистую прибавку в весе за время эксперимента. Важно отметить, что все мыши, получавшие промежуточное соединение-11 в дозе 0,3 или 3 мг/кг, умерли в ходе исследования с лишь минимальной (2 дня или меньше) задержкой смерти по сравнению с носителем и только hIgG1-Fc в качестве контроля. Поскольку hIgG1-Fc не обладает внутренней противовирусной активностью (группа 2), это дает основание предположить, что значительно улучшенная активность конъюгата 6 является результатом улучшенной авидности в результате поливалентного дисплея на Fc, что подтверждается результатами, приведенными в таблице 23, а также улучшенной фармакокинетикой и вкладом Fc-опосредованного иммунного взаимодействия. Различие в активности между взятым в отдельности димером ингибитора и конъюгатом 6 была статистически значимой при обеих концентрациях доз (сравните группы 3 и 6, а также группы 4 и 5; таблица 25). В пересчете на массу потребовалась в 500 раз большая кумулятивная доза промежуточного соединения-11 для наблюдения эффективности, эквивалентной конъюгату 6.
Пример 49. Синтез промежуточного соединения-13 ((5R)-((1R)-ацетиламино-(2S)-метокси-(2S)-метилпентил)-(4S)-Е/Z-[3-(пропаргил-PEG4)-пропенил]пирролидин-(2R)-карбоновой кислоты)
Стадия а. (2R)-((1R)-Ацетиламино-(2S)-метокси-(2S)-метилпентил)-(5R)-карбокси-(3S)-Z-пропенилпирролидин-1-карбоновой кислоты трет-бутиловый эфир
К перемешиваемой смеси (5R)-((1R)-ацетиламино(2S)-метокси-(2S)-метилпентил)-(4S)-Z-пропенилпирролидин-(2R)-карбоновой кислоты, соли HCl (получена согласно ссылке JACS, 2002, 124, 4716-4721; 1,0 ммоль) в ацетонитриле (10 мл) добавляли гидроксид триметиламмония (1,5 ммоль). После перемешивания в течение 3 ч при комнатной температуре добавляли ди-трет-бутилдикарбонат (4 экв.). После завершения реакции все летучие компоненты выпаривали с помощью вакуумной технологии. Остаток разбавляли водой (10 мл). Добавляли этилацетат (10 мл) и добавляли 1М водный раствор серной кислоты до тех пор, пока водный слой не достигнет рН ~3. Водный слой промывали двумя дополнительными аликвотами этилацетата (10 мл). Объединенные органические слои сушили над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали. Остаток очищают хроматографическими методами с получением желаемого продукта.
Стадия b. (2R)-((1R)-ацетиламино-(2S)-метокси-(2S)-метилпентил)-(5R)-карбоксиметил-(3S)-Z-пропенилпирролидин-1-карбоновой кислоты трет-бутиловый эфир
К перемешиваемой при 0°С смеси (2R)-((1R)-ацетиламино(2S)-метокси-(2S)-метилпентил)-(5R)-карбокси-(3S)-7-пропенилпирролидин-1-карбоновой кислоты трет-бутилового эфира (1,0 ммоль) в дихлорметане (5,0 мл) и метаноле (1,0 мл) медленно добавляли (триметилс ил ил)диазо метан (1,1 ммоль). Смесь перемешивали до завершения реакции, при этом температура постепенно достигала комнатной температуры. Все летучие вещества выпаривали с помощью вакуумных технологий. При необходимости остаток очищали методом хроматографии с получением желаемого продукта.
Стадия с. (2R)-((1R)-Ацетиламино-(2S)-метокси-(2S)-метилпентил)-(5R)-карбоксиметил-(3S)-формилпирролидин-1-карбоновой кислоты трет-бутиловый эфир
Смесь при комнатной температуре (2R)-((1R)-ацетиламино-(2S)-метокси-(2S)-метилпентил)-(5R)-карбоксиметил-(3S)-7-пропенилпирролидин-1-карбоновой кислоты трет-бутилового сложного эфира (1 ммоль) в дихлорметане (15 мл) охлаждали до -78°С. Через раствор барботировали озон до тех пор, пока растворенный озон не приобретал слабый синий цвет. Через раствор барботировали азот до исчезновения синего цвета, затем добавляли диметилсульфид (4,0 ммоль), колбу переносили в морозильную камеру (-20°С) и оставляли на 1 час. Раствор концентровали, а остаток очищали методом хроматографии с получением желаемого продукта.
Стадия d. (2R)-((1R)-Ацетиламино-(2S)-метокси-(2S)-метилпентил)-(5R)-карбоксиметил-(3S)-Е/Z-[3-(пропаргил-PEG4)-пропенил]пирролидин-карбоновой кислоты трет-бутиловый эфир
К перемешиваемой при 0°С смеси пропаргил-PEG4-фосфония бромида (1,0 ммоль) в DMF (5,0 мл) добавляли гидрид натрия (1,1 ммоль) и через 10 минут температуру повышали до комнатной. Перемешивание продолжали в течение 1 ч, затем добавляли (2R)-((1R)-ацетиламино-(2S)-метокси-(2S)-метилпентил)-(5R)-карбоксиметил-(3S)-формилпирролидин-1-карбоновой кислоты трет-бутиловый эфир (1,0 ммоль) в DMF (1,0 мл). По завершении реакцию гасили насыщенным раствором хлорида аммония. Водный раствор несколько раз экстрагировали этилацетатом, и объединенные органические фазы промывали рассолом, сушили и выпаривали. Остаток очищали методом хроматографии с получением желаемого продукта.
Стадия е. (2R)-((1R)-Ацетиламино-(2S)-метокси-(2S)-метилпентил)-(5R)-карбокси-(3S) Е/Z-[3-(пропаргил-PEG4)-пропенил]пирролидин-1-карбоновой кислоты трет-бутиловый эфир
К перемешиваемой при 0°С смеси (2R)-((1R)-ацетиламино-(2S)-метокси-(2S)-метилпентил)-(5R)-карбоксиметил-(3S)-Е/Z-[3-(пропаргил-PEG4)-пропенил]-пирролидин-1-карбоновой кислоты трет-бутило во го эфира (1,0 ммоль) в тетрагидрофуране (12,0 мл) и воде (3,0 мл) добавляли гидроксид лития (1,1 ммоль). Перемешивание продолжали, и через 15 минут температуру повышали до комнатной. По завершении рН раствора доводили до кислого значения путем избыточного добавления смолы AMBERLITE® IRN-77. Смесь фильтровали и фильтрат концентрировали в вакууме с помощью вакуумных технологий, получая указанное в заголовке соединение. При необходимости остаток очищали методом хроматографии с получением желаемого продукта.
Стадия f. (5R)-((1R)-Ацетиламино-(2S)-метокси-(2S)-метилпентил)-(4S)-Е/Z-[3-(пропаргил-PEG4)-пропенил]пирролидин-(2R)-карбоновая кислота
К перемешиваемой при 0°С смеси трет-бутилового эфирв (2R)-((1R)-ацетиламино-(2S)-метокси-(2S)-метилпентил)-(5R)-карбокси-(3S)-E/Z-[3-(пропаргил-PEG4)-пропенил]пирролидин-1-карбоновой кислоты (1,0 ммоль) и 2-метил-2-бутена (0,5 мл) в дихлорметане (8,0 мл) добавляли трифторуксусную кислоту (4,0 мл). Через 10 минут температура повышалась до комнатной. По завершении все летучие компоненты выпаривали с помощью вакуумных технологий. Остаток очищали методами хроматографии, получая желаемый продукт.
Пример 50. Синтез конъюгата 9
Раствор hIgG1 Fc-PEG4-азида в буферном растворе PBS × 1 при рН 7,4 (100 мг, 1,71 мкмоль, 7,011 мл, MW=58,200 Да, DAR=3,7) добавляли к буферному раствору PBS × 1 при рН 7,4 (2,45 мл) промежуточного соединения-13 ((5R)-((1R)-ацетиламино-(2S)-метокси-(2S)-метилпентил)-(4S)-E/Z-[3-(пропаргил-PEG4)-пропенил]-пирролидин-(2R)-карбоновой кислоты) (0,031 ммоль), сульфата меди (0,62 ммоль), трис(3-гидроксипропилтриазолилметил)амина (0,62 ммоль) и аскорбата натрия (0,93 ммоль). Полученный однородный раствор осторожно встряхивали на шейкере в течение 12 ч. Неочищенный раствор разбавляли PBS при рН 7,4 до конечной концентрации 1 мг/мл и дважды подвергают ультрафильтрации (10000 MWCO) до объема 1 мл. Затем неочищенную смесь разбавляли 1:10 в PBS при рН 7,4 и очищали с использованием смолы MabSelect Sure Resin (GE Healthcare, Chicago, IL, USA), с последующей эксклюзионной хроматографией, с последующей эксклюзионной хроматографией. Очищенный продукт количественно оценивали с помощью спектрофотометра Nanodrop™ в УФ и видимой части спектра (используя рассчитанный коэффициент экстинкции, основанный на аминокислотной последовательности Fc, используемого для конъюгации, и концентрировали приблизительно до 10 мг/мл с использованием центрифужного концентратора (10000 MWCO). Очищенные молекулы анализировали с использованием 4-12% гелей Bis Tris SDS PAGE путем загрузки 1-2 мкг каждой молекулы в гель и окрашивания с использованием мгновенного окрашивания синим. Каждый гель включал линейку молекулярной массы с указанными стандартами молекулярной массы. Анализ MALDI MS использовали для определения среднего значения DAR.
Пример 51. Синтез пропаргил- PEG4-фосфония бромида
Смесь пропаргил-PEG4-бромида (1,0 ммоль) и трифенилфосфина (1,2 ммоль) в толуоле (10 мл) нагревали с обратным холодильником. По окончании смесь охлаждали до комнатной температуры. Твердые вещества фильтровали и использовали на следующей стадии без дополнительной очистки.
Пример 52. Синтез промежуточного соединения-14 ((5R)-[(1R)-(пропаргил-PEG4-карбоксиамид)-(2S)-метокси-(2S)-метилпентил]-(4S)-Z-пропенилпироллидин-(2R)-карбоновой кислоты, соль HCl)
Стадия a. N-{(2S)-метокси-((1R)-[1-(4-метоксибензил)-5-оксо-(3S)-Z- пропенилпироллидин-(2R)-ил]-(2S)-метилпентил}-(пропаргил-PEG4)-карбоксиамид
К перемешиваемой при 0°С смеси трет-бутило во го эфира {(2S)-метокси-(1R)-[1-(4-метоксибензил)-5-оксо-(3S)-7-пропенилпирролидин-(2R)-ил]-(2S)-метилпентил}-карбаминовой кислоты (его получали согласно ссылке JACS, 2002, 124, 4716-4721; 1,0 ммоль) в сухом дихлорметане (5 мл) добавляли трифторуксусную кислоту (10 ммоль), и температура поднималась до комнатной температуры. По завершении растворитель удаляли при пониженном давлении. Полученный остаток растворяли в дихлорметане (20 мл) и экстрагировали насыщенным водным раствором бикарбоната натрия. Органический слой отделяли, сушили (сульфат натрия), фильтровали и выпаривали. Неочищенный амин растворяли в DMF (5 мл) и обрабатывали при 0°С при перемешивании про пар гил-PEG4-кислотой (1,1 ммоль), диизопропилэтиламином (3,0 ммоль) и HATU (1,1 ммоль). По завершении реакции все летучие компоненты выпаривали с помощью вакуумной технологии. Остаток растворяли в этилацетате (15 мл) и промывают насыщенным водным раствором бикарбоната натрия (10 мл), затем 1М водным раствором серной кислоты (10 мл). Объединенные органические слои сушили над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали. Остаток очищали методом хроматографии с получением желаемого продукта.
Стадия b. Трет-бутиловый эфир (2R)-((1R)-(пропаргил-PEG4-карбоксиамид)-(2S)-метокси-(2S)-метилпентил)-(5R)-оксо-(3S)-Z-пропенилпирролидин-1-карбоновой кислоты
К перемешиваемому раствору N- {(2.8)-метокси-(1R)-[1 -(4-метоксибензил)-5-оксо-(3S)-7-пропенилпирролидин-(2R)-ил]-(2S)-метилпентил}-(пропаргил-PEG4)-карбоксиамида (1,0 ммоль) в смеси ацетонитрила и воды (10:1, 5 мл) небольшими порциями добавляли нитрат церия и аммония (2,0 ммоль) при 45°С в течение 1 ч, и перемешивание продолжали до завершения реакции. Реакцию гасили насыщенным водным раствором бикарбоната натрия (5 мл). Водный слой экстрагировали EtOAc (3×10 мл), объединенные органические слои сушили (сульфат натрия) и выпаривали с получением неочищенного продукта, который использовали на следующей стадии без дополнительной очистки. Продукт растворяли в ацетонитриле (5 мл), добавляли ди-трет- бутил карбонат (1,5 ммоль), затем триэтиламин (2,0 ммоль) и DM АР (каталитическое количество). По завершении реакцию гасили насыщенным раствором хлорида аммония (5 мл). Водный слой экстрагировали EtOAc (3×10 мл), и объединенные органические слои сушили (сульфат натрия). Все летучие вещества удаляли вакуумными методами. При необходимости остаток очищали хроматографическими методами, чтобы получить желаемый продукт.
Стадия с. Трет-бутиловый эфир (2R)-((1R)-(пропаргил-PEG4-карбоксиамид)-(2S)-метокси-(2S)-метилпентил)-(5R/S)-метокси-(3S)-Z-пропенилпирролидин-1-карбоновой кислоты
К перемешиваемому при -78°С раствору трет-бутило во го эфира (2R)-((1R)-(пропаргил-PEG4-карбоксиамид)-(2S)-метокси-(2S)-метилпентил)-(5R)-оксо-(3S)-7-пропенилпирролидин-1-карбоновой кислоты (1,0 ммоль) в THF (8 мл) добавляли SUPER-HYDRIDE® (1М в THF, 2,2 ммоль). Через 30 мин реакционную смесь гасили насыщенным водным раствором бикарбоната натрия (4 мл) и 30% пероксидом водорода (5 капель). Смесь нагревали до комнатной температуры и перемешивали еще в течение 30 мин, п водный слой экстрагировали EtOAc (3×10 мл). Объединенные органические слои сушили (сульфат натрия) и растворитель выпаривали с получением гемиаминаля, который использовали без дополнительной очистки. К раствору указанного выше продукта в метаноле (16 мл) добавляли гидрат п-толуолсульфоновой кислоты (0,1 ммоль) при комнатной температуре. Реакционную смесь перемешивали в течение ночи и гасили насыщенным водным раствором бикарбоната натрия (10 мл). Метанол удаляют при пониженном давлении, к полученному остатку добавляли воду (10 мл) и экстрагировали EtOAc (3×10 мл). Органические слои отделяли и сушили рассолом и сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали. При необходимости остаток очищали хроматографическими методами, чтобы получить желаемый продукт.
Стадия d. Трет-бутиловый эфир (2R)-((1R)-(пропаргил-PEG4-карбоксиамид)-(2S)-метокси-(2S)-метилпентил)-(5R)-циано-(3S)-Z-пропенилпирролидин-1-карбоновой кислоты
К перемешиваемому при -78°С раствору трет-бутило во го эфира (2R)-((1R)-(пропаргил-PEG4-карбоксиамид)-(2S)-метокси-(2S)-метилпентил)-(5R/S)-метокси-(3S)-7-пропенилпирролидин-1-карбоновой кислоты (1,0 ммоль) в дихлорметане (20 мл) добавляли триметилсилилцианид (2,0 ммоль), а затем диэтилэфират трифторида бора (1,2 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при температуре в диапазоне от -78°С до -50°С в течение 3 ч. Добавляли насыщенный водный раствор бикарбоната натрия (40 мл) и водный слой экстрагировали EtOAc (3×15 мл). Объединенные органические слои сушили (сульфат натрия), фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Полученный остаток, состоящий из смеси эпимерных цианопроизводных, очищали хроматографическими методами с получением желаемого продукта.
Стадия е. (5R)-[(1R)-(пропаргил-PEG4-карбоксиамид)-(2S)-метокси-(2S)-метилпентил]-(4S)-Z-пропенилпирролидин-(2R)-карбоновая кислота, соль HCl
К раствору трет-бутилового эфира (2R)-((1R)-(пропаргил-PEG4-карбоксиамид)-(2S)-метокси-(2S)-метилпентил)-(5R)-циано-(3S)-Z-пропенилпирролидин-1-карбоновой кислоты (1,0 ммоль) в АсОН (10 мл) добавляли 12N HCl (10 мл) при комнатной температуре. Раствор перемешивали при комнатной температуре до завершения реакции, растворитель выпаривали при пониженном давлении. При необходимости остаток очищали хроматографическими методами, чтобы получить желаемый продукт.
Пример 53. Синтез конъюгата 10
Раствор hIgG1 Ес-PEG4-азида в буферном растворе PBS×1 при рН 7,4 (100 мг, 1,71 мкмоль, 7,011 мл, MW=58,200 Да, DAR=3,7) добавляли к буферному раствору PBS×1 при рН 7,4 (2,45 мл) промежуточного соединения-14 ((5R)-[(1R)-(пропаргил-PEG4-карбоксиамид)-(2S)-метокси-(2S)-метилпентил]-(4S)-7-пропенилпирролидин-(2R)-карбоновой кислоты, соли HCl) (0,031 ммоль), сульфата меди (0,62 ммоль), трис(3-гидроксипропилтриазолилметил)-амина (0,62 ммоль) и аскорбата натрия (0,93 ммоль). Полученный однородный раствор осторожно встряхивали на шейкере в течение 12 ч. Неочищенный раствор разбавляли PBS при рН 7,4 до конечной концентрации 1 мг/мл и дважды подвергали ультрафильтрации (10000 MWCO) до объема 1 мл. Затем неочищенную смесь разбавляли 1:10 в PBS при рН 7,4 и очищали с использованием смолы MabSelect Sure Resin (GE Healthcare, Chicago, IL, USA), с последующей эксклюзионной хроматографией. Очищенный продукт количественно оценивали с помощью спектрофотометра Nanodrop™ в УФ и видимой части спектра (используя рассчитанный коэффициент экстинкции, основанный на аминокислотной последовательности Fc, используемого для конъюгации, и концентрировали приблизительно до 10 мг/мл с использованием центрифужного концентратора (10000 MWCO). Очищенные молекулы анализировали с использованием 4-12% гелей Bis Tris SDS PAGE путем загрузки 1-2 мкг каждой молекулы в гель и окрашивания с использованием мгновенного окрашивания синим. Каждый гель включал линейку молекулярной массы с указанными стандартами молекулярной массы. Анализ MALDI MS использовали для определения среднего значения DAR.
Пример 54. Синтез промежуточного соединения-15, соль HCl
Стадия a. N-{(2.S)-метокси-((1R)-[1-(4-метоксибензил)-5-оксо-(3S)-Z- пропенилпирролидин-(2R)-ил]-(2S)-метилпентил}-(3-бутинил)карбоксамид
К перемешиваемой при 0°С смеси трет-бутило во го эфир {(2S)-метокси-(1R)-[l-(4-метоксибензил)-5-оксо-(3S)-7-пропенилпирролидин-(2R)-ил]-(2S)-метилпентил}-карбаминовой кислоты (его получали согласно ссылке JACS, 2002, 124, 4716-4721; 1,0 ммоль) в сухом дихлорметане (5 мл) добавляли трифторуксусную кислоту (10 ммоль), и температура поднималась до комнатной температуры. По завершении растворитель удаляли при пониженном давлении. Полученный остаток растворяли в дихлорметане (20 мл) и экстрагировали насыщенным водным раствором бикарбоната натрия. Органический слой отделяли, сушили (сульфат натрия), фильтровали и выпаривали. Неочищенный амин растворяли в DMF (5 мл) и обрабатывали при 0°С при перемешивании 4-пентиновой кислотой (1,1 ммоль), диизопропилэтиламином (3,0 ммоль) и HATU (1,1 ммоль). По завершении реакции все летучие компоненты выпаривали с помощью вакуумной техники. Остаток растворяли в этилацетате (15 мл) и промывали насыщенным водным раствором бикарбоната натрия (10 мл), затем 1М водным раствором серной кислоты (10 мл). Объединенные органические слои сушили над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали. Остаток очищали хроматографическими методами с получением желаемого продукта.
Стадия b. трет-бутиловый эфир (2R)-((1R)-(4-пентиноил)-(2S)-метокси-(2S)-метилпентил)-(5R)-оксо-(3S)-Z-пропенилпирролидин-1-карбоновой кислоты
К перемешиваемому раствору N-{(2.S)-метокси-((1R)-[1-(4-метоксибензил)-5-оксо(3S)-7-пропенилпирролидин-(2R)-ил]-(2S)-метилпентил}-(3-бутинил)-карбоксиамида (1,0 ммоль) в смеси ацетонитрила и воды (10:1, 5 мл) добавляли нитрат церия и аммония (2,0 ммоль) небольшими порциями при 45°С в течение 1 ч, и перемешивание продолжали до завершения реакции. Реакцию гасили насыщенным водным раствором бикарбоната натрия (5 мл). Водный слой экстрагировали EtOAc (3×10 мл), объединенные органические слои сушили (сульфат натрия) и упаривали с получением неочищенного продукта, который использовали на следующей стадии без дополнительной очистки. Продукт растворяли в ацетонитриле (5 мл), добавляли ди-трет-бутил карбонат (1,5 ммоль), затем триэтиламин (2,0 ммоль) и DM АР (каталитическое количество). По завершении реакцию гасили насыщенным раствором хлорида аммония (5 мл). Водный слой экстрагировали EtOAc (3×10 мл), и объединенные органические слои сушили (сульфат натрия). Все летучие вещества удаляли вакуумными методами. При необходимости остаток очищали хромато графическими методами с получением желаемого продукта.
Стадия с. Трет-бутиловый эфир (2R)-((1R)-(4-пентиноил)-(2S)-метокси-(2S)-метилпентил)-(5R/S)-метокси-(3S)-Z-пропенилпирролидин-1-карбоновой кислоты
К перемешиваемому при -78°С раствору трет-бутило во го эфира (2R)-((1R)-(2R)-((1R)-(4-пентиноил)-(2S)-метокси-(2S)-метилпентил)-(5R)-оксо-(3S)-Z-пропенилпирролидин-1-карбоновой кислоты (1,0 ммоль) в THF (8 мл) добавляли SUPER-HYDRIDE® (1Mb THF, 2,2 ммоль). Через 30 мин реакционную смесь гасили насыщенным водным раствором бикарбоната натрия (4 мл) и 30% пероксидом водорода (5 капель). Смесь нагревали до комнатной температуры и перемешивали еще в течение 30 мин, и водный слой экстрагировали EtOAc (3×10 мл). Объединенные органические слои сушили (сульфат натрия) и растворитель выпаривали с получением гемиаминаля, который использовали без дополнительной очистки. К раствору указанного выше продукта в метаноле (16 мл) добавляли гидрат п-толуолсульфоновой кислоты (0,1 ммоль) при комнатной температуре. Реакционную смесь перемешивали в течение ночи и гасили насыщенным водным раствором бикарбоната натрия (10 мл). Метанол удаляли при пониженном давлении, к полученному остатку добавляют воду (10 мл) и экстрагировали EtOAc (3×10 мл). Органические слои отделяли и сушили рассолом и сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали. При необходимости остаток очищали хроматографическими методами, чтобы получить желаемый продукт.
Стадия d. Трет-бутиловый эфир (2R)-((1R)-(4-пентиноил)-(2S)-метокси-(2S)-метилпентил)-(5R)-циано-(3S)-Z-пропенилпирролидин-1-карбоновой кислоты
К перемешиваемому при -78°С раствору трет-бутило во го эфира (2R)-((1R)-(4-пентиноил)-(2S)-метокси-(2S)-метилпентил)-(5R/8)-метокси-(3S)-7-пропенилпирролидин-1-карбоновой кислоты (1,0 ммоль) в дихлорметане (20 мл) добавляли триметилсилил цианид (2,0 ммоль), а затем диэтилэфират трифторида бора (1,2 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при температуре от -78°С до -50°С в течение 3 ч. Добавляли насыщенный водный раствор бикарбоната натрия (40 мл) и водный слой экстрагировали EtOAc (3×15 мл). Объединенные органические слои сушили (сульфат натрия), фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Полученный остаток, состоящий из смеси эпимерных цианопроизводных, очищали хроматографическими методами с получением желаемого продукта.
Стадия е.
К перемешиваемой смеси N-{(2.8)-метокси-((1R)-[1-(4-метоксибензил)-5-оксо-(3S)-Z-пропенилпирролидин-(2R)-ил]-(2S)-метилпентил}-(3-бутинил)карбоксиамида (1,0 ммоль), бис-[N'-(2-азидоэтил)]иминодиуксусного амида (0,5 ммоль), 1Н-1,2,3-триазол-4-метанамина, 1-(фенилметил)-N,N-бис[1-(фенилметил)-1Н-1,2,3-триазол-4-ил]метила] (0,1 ммоль) и аскорбата натрия (1,0 ммоль) в этаноле (5 мл) и воде (5 мл) добавляли сульфат меди (0,1 ммоль). По завершении реакцию обрабатывали SiliaMetS TAAcONa (0,3 ммоль) в течение 30 минут. Реакционную смесь фильтровали и все летучие вещества выпаривали вакуумными методами. Остаток очищали хроматографическими методами с получением желаемого продукта.
Стадия f.
К перемешиваемому при 0°С раствору промежуточного соединения, полученного на стадии е (1,0 ммоль), пропаргил-PEG4-кислоте (1,05 ммоль) и DIPEA (3,0 ммоль) в DMF (10 мл) добавляли HATU (2,0 ммоль). Все летучие вещества выпаривали с помощью вакуумных методов и остаток очищали хроматографическими методами с получением желаемого продукта.
Стадия g. Промежуточное соединение-15, соль HCl
К раствору промежуточного соединения, полученного на стадии f (1,0 ммоль), в АсОН (10 мл) добавляли 12N HCl (10 мл) добавляют при комнатной температуре. Раствор перемешивали при комнатной температуре до завершения реакции, растворитель выпаривали при пониженном давлении. При необходимости остаток очищали хроматографическими методами с получением желаемого продукта.
Пример 55. Синтез конъюгата 11
Раствор hIgG1 Ес-PEG4-азида в буферном растворе PBS×1 при рН 7,4 (100 мг, 1,71 мкмоль, 7,011 мл, MW=58,200 Да, DAR=3,7) добавляли к буферному раствору PBS×1 при рН 7,4 (2,45 мл) промежуточного соединения-15, соли HCI (0,031 ммоль), сульфата меди (0,62 ммоль), трис(3-гидроксипропилтриазолилметил)амина (0,62 ммоль) и аскорбата натрия (0,93 ммоль). Полученный однородный раствор осторожно встряхивали на шейкере в течение 12 часов. Неочищенный раствор разбавляли PBS при рН 7,4 до конечной концентрации 1 мг/мл и дважды подвергают ультрафильтрации (10000 MWCO) до объема 1 мл. Затем неочищенную смесь разбавляли 1:10 в PBS при рН 7,4 и очищали с использованием смолы MabSelect Sure Resin (GE Healthcare, Chicago, IL, USA) с последующей эксклюзионной хроматографией. Очищенный продукт количественно оценивали с помощью спектрофотометра Nanodrop™ в УФ и видимой части спектра (используя рассчитанный коэффициент экстинкции, основанный на аминокислотной последовательности Fc, используемого для конъюгации, и концентрировали приблизительно до 10 мг/мл с использованием центрифужного концентратора (10000 MWCO). Очищенные молекулы анализировали с использованием 4-12% гелей Bis Tris SDS PAGE путем загрузки 1-2 мкг каждой молекулы в гель и окрашивания с использованием мгновенного окрашивания синим. Каждый гель включал линейку молекулярной массы с указанными стандартами молекулярной массы. Анализ MALDI MS использовали для определения среднего значения DAR.
Пример 56. Синтез бис-[N'-(2-азидоэтил)]-иминодиуксусного амида
Стадия а. Бис-[N'-(2-азидоэтил)]-N-Вос-иминодиуксусный амид
К перемешиваемому при 0°С раствору N-Boc-иминодиуксусной кислоты (1,0 ммоль), 2-азидоэтан-1-амина гидрохлорида (2,0 ммоль) и DIPEA (6,0 ммоль) в DMF (10 мл) добавляли HATU (2,0 ммоль). Все летучие компоненты выпаривали вакуумными методами и остаток очищали хроматографическими методами с получением желаемого продукта.
Стадия b. Бис-[N'-(2-азидоэтил)]-иминодиуксусный амид
К перемешиваемой при 0°С смеси бис-[N'-(2-азидоэтил)]-]N-Вос-иминодиуксусного амида (1,0 ммоль) и 2-метил-2-бутена (0,5 мл) в дихлорметане (8,0 мл) добавляли трифторуксусную кислоту (4,0 мл). Через 10 минут температура повышалась до комнатной температуры. По завершении все летучие вещества выпаривали вакуумными методами. Остаток очищали хроматографическими методами с получением желаемого продукта.
Пример 57. Синтез промежуточного соединения-16
Мономер сульфозанамивира, конъюгированный с PEG4-алкиновым линкером и который может быть дополнительно конъюгирован с доменом Fc или белком альбумином, получали в соответствии со следующей схемой синтеза. Исходный продукт сульфозанамивир получали в соответствии с Hadhazi et al. A sulfozanamivir analogue has potent anti-influenza virus activity. ChemMedChem Comm. 13:785-789 (2018).
Пример 58. Синтез промежуточного соединения-17
Димер сульфозанамивира, конъюгированный с PEG4-алкиновым линкером и который может быть дополнительно конъюгирован с доменом Fc или белком альбумином, получали в соответствии со следующей схемой синтеза. Исходный продукт сульфозанамивир получали согласно Hadhazi et al. A sulfozanamivir analogue has potent anti-influenza virus activity. ChemMedChem Comm. 13:785-789 (2018).
Пример 59. Синтез конъюгата 12
Раствор азидо функционализированного агликозилированного Fc (70 мг, 4,7 мл, 1,3709 мкмоль) добавляли в центрифужную пробирку объемом 15 мл, содержащую алкином-дериватизированную малую молекулу (29,8 мг, 0,0216 ммоль, промежуточное соединение-7). После осторожного встряхивания для растворения всех твердых веществ в смесь добавляли 206 мкл смешанного раствора натриевой соли L-аскорбиновой кислоты (59,4 мг, 0,3 ммоль), сульфата меди (II) (15,9 мг, 0,1 ммоль) и ТНРТА (43,5 мг, 0,1 ммоль) в буфере PBS при рН 7,4 (1 мл). Полученную смесь осторожно встряхивали в течение ночи. Ее очищали с помощью аффинной хроматографии на колонке с белком А с последующей эксклюзионной хроматографией, как описано в примере 8. Анализ Maldi TOF очищенного конечного продукта дал среднюю массу 56177 Да (DAR=3,6). Выход составил 10,1 мг, выход 14%. На фиг. 54 представлен анализ SDS-PAGE в не восстанавливающих условиях конъюгата 12.
Пример 60. Синтез промежуточного соединения-18
Стадия а. Синтез трет-бутил (17-{4-[(трет-бутоксикарбонил)амино]бутил}-16-оксо-4,7Д0Д3-тетраокса-17-азахеникос-1-ин-21-ил)карбамата
К раствору ди-трет-бутил[азандиилди(бутан-4,1-диил)]бискарбамата (1,5 г, 4,17 ммоль из примера 45, стадия а) и про паргил-PEG4-кислоты (1,08 г, 4,17 ммоль) в DCM (40 мл) добавляли EDC (1,0 г, 5 ммоль), HOBt (650 мг, 5 ммоль) и DIE А (1,4 мл, 10 ммоль) при комнатной температуре, затем перемешивали в течение ночи при комнатной температуре. Полученный раствор концентрировали и очищали с помощью жидкостной хроматографии с обращенной фазой (RPLC) с использованием жидкостного хроматографа Isco COMBIFLASH®, элюируя 10%-100% ацетонитрила и водой без модификатора. Выход 1,9 г, 76%. Ион(ы), найденный с помощью LCMS: М+Н=602,4.
Стадия b. Синтез N,N-бис(4-аминобутил)-4,7,10,13-тетраоксагексадек-15-ин-1-амида
Трет-бутил (17-{4-[(трет-бутоксикарбонил)амино]бутил}-16-оксо-4,7,10,13-тетраокса-17-азахеникос-1-ин-21-ил)карбамат (1,90, 3,1 ммоль) обрабатывали 20 мл TFA при комнатной температуре в течение 0,5 ч, затем концентрировали до сухого состояния и использовали на следующей стадии без дополнительной очистки. Выход является количественным для этой стадии. Ион(ы), найденные с помощью LCMS: М/2+Н=402.3.
Стадия с. Синтез полностью защищенного промежуточного соединения-18
N,N-бис(4-аминобутил)-4,7,10,13-тетраоксагексадек-15-ин-1-амид (0,150 г, 0,32 ммоль) добавляли к раствору связанной эфиром кислоты занамивира (0,400 г 0,63 ммоль, описанному в примере 31, стадия f) в DCM (10 мл), затем обрабатывали EDC (0,200 г, 1,0 ммоль), HOBt (0,135 г, 1,00 ммоль) и DIE А (0,14 мл, 1,00 ммоль) при комнатной температуре в течение ночи. Полученный раствор концентрировали и очищали с жидкостной хроматографией с обращенной фазой (RPLC) с использованием жидкостного хроматографа Isco COMBIFLASH®, элюируя 10%-100% ацетонитрила и водой без 0,1% TFA в качестве модификатора. Выход продуктов составил 310 мг, 60,3%. Ион(ы), обнаруженный методом LCMS: М/2+Н=813.9.
Стадия d. Синтез промежуточного соединения-18
Продукт, полученный на предыдущей стадии (300 мг, 0,18 ммоль), обрабатывали трифторуксусной кислотой (2 мл) кислоты и перемешивали в течение 30 мин при комнатной температуре. Полученный раствор концентрировали, повторно растворяли в воде (2 мл), затем обрабатывали раствором гидроксида лития (24 мг, 1 ммоль) в воде (1 мл). Реакционную смесь перемешивали 10 мин, затем гасили 0,1 мл уксусной кислоты, концентрировали и очищали обращенно-фазовой жидкостной хроматографией (RPLC) с использованием жидкостного хроматографа Isco COMBIFLASH®, элюируя 0%-50% ацетонитрила и водой, используя 0,1% TFA в качестве модификатора. Выход продуктов составил 140 мг, 52%. Ион(ы), найденный с помощью LCMS: М/2+Н=573.8, М/3+Н=382.9.
Пример 61. Синтез PEG4-азидо Fc для конъюгата 13а
Получение 0,05М раствора сложного эфира PEG4-азидоNHS в DMF/PBS
Сложный эфир PEG4-азидо NHS (80,5 мг) растворяли в DMF (0,50 мл) при 0°С и разбавляли до 4,063 мл путем добавления 3,50 мл PBS 1х буфера при 0°С. Этот раствор использовали для получения другого PEG4-азидо Fc с различными значениями отношения лекарственное средств о-антитело (DAR) путем регулирования эквивалентов этого PBS x1 раствора сложного эфира PEG4-азидо NHS.
Получение PEG4-азидо Fc
0,05М раствор сложного эфира PEG4-азидоNHS в PBS x1 буфере (0,0984 мл, 4,92 мкмоль, 2,5 эквивалента) добавляли к раствору h-IgG1-Fc (105 мг в 5,031 мл PBS при рН 7,4, MW ~ 53360 Да, 1,968 мкмоль) и смесь осторожно встряхивали в течение 12 часов при температуре окружающей среды. Раствор концентрировали с использованием центробежного концентратора (30000 MWCO) до объема ~1,5 мл. Неочищенную смесь разбавляли 1:10 в PBS рН 7,4 и снова концентрировали. Эту процедуру промывки повторяли в общей сложности три раза. Непрореагировавший азидо-реагент удаляли с помощью этой процедуры. Концентрированный Ес-PEG4-азид был разбавлен до 5,03 мл с помощью буфера PBS 1х при рН 7,4 и готов для «клик»-конъюгирования. Очищенный продукт количественно оценивали с помощью спектрофотометра Nanodrop™ в УФ и видимой части спектра (используя рассчитанный коэффициент экстинкции, основанный на аминокислотной последовательности h-IgG1). Выход был количественным после замены буфера/очистки.
Пример 62. Синтез конъюгата 13а
Приготовление раствора клик-реагента: 0,0050М CuSO4 в буферном растворе PBS: 20,0 мг CuSO4 растворяли в 25,0 мл PBS xl, затем брали 22,0 мл указанного выше раствора CuSO4 и добавляли 189,4 мг ВТТАА и 1090 мг аскорбата натрия с получением прозрачного раствора (0,0050М CuSO4, 0,020 М ВТТАА и 0,25М аскорбата натрия). Раствор азидо-функционализированного Fc (100 мг, 4,79 мл, 1,87 мкмоль, СТР-161-4А-Linker-1-Azide) добавляли в центрифужную пробирку объемом 15 мл, содержащую дериватизированную алкином небольшую молекулу, промежуточное соединение-18 (11,2 мг, 0,00750 ммоль, полученное в примере 60). После осторожного встряхивания для растворения всех твердых веществ раствор обрабатывали 3,00 мл указанного выше раствора клик-реагента. Полученный бесцветный гомогенный раствор осторожно встряхивали в течение ночи. Его очищали аффинной хроматографией на колонке с белком А с последующей эксклюзионной хроматографией (см. общий протокол очистки конъюгата в примере 10). Анализ Maldi TOF очищенного конечного продукта дал среднюю массу 55913 Да (DAR=1,7). Выход составил54,0 мг, выход 54%.
Пример 63. Синтез конъюгата 13b, конъюгата 13 с, конъюгата 13d, конъюгата 13е, конъюгата 13f и конъюгата 13g
PEG4-азидо Fc для конъюгата 13b, конъюгата 13 с, конъюгата 13d, конъюгата 13е, конъюгата 13f и конъюгата 13g получали аналогично PEG4-азидо Fc конъюгата 13а (пример 61), регулируя количество эквивалентов сложного эфира NHS PEG4-азидо, как описано в таблице ниже. Конъюгат 13b, конъюгат 13 с, конъюгат 13d, конъюгат 13е, конъюгат 13f и конъюгат 13g получали аналогично конъюгату 13а в примере 62, где количество эквивалентов нацеливающего фрагмента (промежуточное соединение-18) корректировали на основе желаемого значения DAR (таблица 26), и объем используемого раствора клик-реагента был таким же, как и используемого в методике для примера 62. В таблице ниже перечислены значения DAR, молекулярные массы и выходы. Конъюгаты продукта очищали аффинной хроматографией на колонке с белком А с последующей эксклюзионной хроматографией, как описано в примере 8.
Анализ SDS-PAGE в не во останавливающих условиях конъюгатов 13a-13g представлен на фиг. 55.
Пример 64. Стабильность конъюгата 6 in vitro
Для демонстрации стабильности конъюгата 6 in vitro использовали мышиные и человеческие микросомы плазмы и печени, обработанные свежеприготовленным K2EDTA. Стабильность in vitro в мышиной и человеческой плазме определяли путем сравнения соотношения лекарственного средства и антитела (DAR) после 24-часовой инкубации в плазме при 37°С с помощью масс-спектрометрического обнаружения MALDI-TOF. Микросомальную стабильность в печени с использованием микросом мышей и человека также оценивали после инкубации в течение 24 часов при 37°С с помощью масс-спектрометрического обнаружения MALDI-TOF. Это было сделано для идентификации потенциальных метаболически лабильных сайтов на Fc-белке, линкере или целевом фрагменте.
64.1 Подготовка образца для определения стабильности в плазме
Сначала 60 мкл конъюгата 6 при концентрации 3 мг/мл смешивали с 120 мкл плазмы. Аликвоты каждого типа плазмы вносили в 2 пробирки. Одну аликвоту каждого типа плазмы немедленно замораживали. Остальную аликвоту помещали на водяную баню (37°С) на 24 часа. Гранулы MAGNE® Protien A (Promega) уравновешивали путем осторожного встряхивания гранул в суспензии. В двух повторностях для обоих типов плазмы 50 мкл суспензии гранул добавляли в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл и помещали на магнитный штатив на 10 секунд. Через 10 секунд буфер для хранения удаляли и отбрасывали. 500 мкл буфера для связывания/промывки (0,1% BSA в 1X PBS, рН 7,4) добавляли в 1,5 мл микроцентрифужную пробирку, содержащую гранулы. Гранулы перемешивали (встряхивание) и помещали на магнитный штатив на 10 секунд. Через 10 секунд буфер для связывания/промывки удаляли и отбрасывали. 50 мкл буфера (1x PBS, рН 7,4) добавляли в микроцентрифужную пробирку, содержащую гранулы. К гранулам добавляли 50 мкл смеси плазмы и осторожно встряхивали для перемешивания. Используя встряхиватель пробирок, образец перемешивали при комнатной температуре в течение 60 минут, чтобы шарики оставались в суспензии. После перемешивания пробирку помещали на магнитный штатив на 10 секунд и удаляли супернатант. Добавляли 500 мкл буфера (1x PBS, рН 7,4) и осторожно встряхивали для перемешивания. После перемешивания пробирку помещали на магнитный штатив на 10 секунд, после чего удалили и отбрасывали промывочный буфер. Стадию промывки повторяли всего 2 раза. После 2 промывок с помощью 500 мкл буфера (lx PBS, рН 7,4) выполняли 3 промывания 500 мкл, 200 мкл и 100 мкл воды, соответственно. В пробирку добавляли соответствующий объем воды и осторожно встряхивали для хорошего перемешивания, а затем помещали на магнитный штатив на 10 секунд перед удалением и отбрасыванием воды. После третьей промывки водой к шарикам добавляли 30 мкл буфера для элюирования (90:10:0,4 вода:ацетонитрил:ТГА). Используя встряхиватель пробирок, буфер для элюирования и образец смешивали в течение 30 минут при комнатной температуре. После перемешивания пробирку помещали на магнитный штатив на 10 секунд, буфер для элюирования, содержащий образец, удаляли и хранили. 2 мкл образца смешивали с 2 мкл матрицы MALDI (20 мг/мл синаповой кислоты в соотношении 70:30:0,1 вода:ацетонитрил:ТГА) и наносили на планшет-мишень MALDI, используя двухслойную технику. Затем образец анализировали масс-спектрометрией MALDI-TOF.
64.2 Подготовка образцов макросом печени
10х буфер готовили с 500 мМ Tris-HCl при рН 7,5 и 50 мМ гексагидрата хлорида магния. ACV-006 разбавляли до 50 мкМ в 1x PBS, рН 7,4. Микросомы печени размораживали и перемешивали на вортексе. Аликвоту микросом печени каждого вида (человека и мыши) инактивировали нагреванием при 70°С в течение 15 минут для использования в качестве контроля. Реакционные смеси готовили для обоих видов в соответствии с таблицей 27. Пробирки инкубировали на водяной бане (37°С) в течение 24 часов. Образцы извлекали для анализа с использованием гранул MAGNE® Protein А (Promega) в соответствии с протоколом из 59.1.
64.3 Анализ образцов и полученных данных
Образцы получали с использованием Bruker Compass Flex Control version 3.4 для получения масс-спектров MALDI-TOF в полном диапазоне сканирования (таблица 28). BSA использовали в качестве внутреннего калибрующего вещества для диапазона измеряемых масс. Данные были дополнительно анализировали с помощью программного обеспечения Bruker Compass Flex Analysis version 3.4. Кроме того, картину DAR контроля сравнивали с картиной DAR тестируемого образца.
64.4 Результаты
Тестируемое соединение, конъюгат 6 (фиг. 43), тестировали на стабильность in vitro в обработанной свежеприготовленным K2EDTA плазме и микросомах печени мыши и человека. Конъюгат 6 вносили в обработанную свежеприготовленным K2EDTA плазму мыши и человека до конечной концентрации 1 мг/мл. Плазму разделяли на 2 аликвоты, одну немедленно замораживали, а другую инкубировали на водяной бане при 37°С в течение 24 часов. В конце инкубации образцы экстрагировали из матрицы плазмы с помощью магнитных шариков MAGNE® Protein А. После инкубации плазмы образцы анализировали с помощью масс-спектрометрии MALDI-TOF на предмет изменений в DAR. Было обнаружено, что конъюгат 6 в плазме мыши (фиг. 44) или человека (фиг. 45) при инкубации не вызывает каких-либо изменений в DAR.
Стабильность конъюгата 6 в микросомах печени тестировали при конечной концентрации 5 мкМ в буферном растворе Tris-HCl 50 мМ, рН 7,5, который содержал либо активные, либо инактивированные нагреванием микросомы печени при конечной концентрации 0,5 мг/мл и MgCl2 при конечной концентрации 5 мМ. Все образцы инкубировали при постоянной температуре, равной 37°С, и регенерирующий раствор никотинамидадениндинуклеотидфосфата (NADPH) использовали для обеспечения постоянной доступности кофактора во время инкубации. Инкубации осуществляли в течение 24 часов. В конце инкубации образцы экстрагировали из микросомального матрикса с помощью магнитных шариков с Protein А. После инкубации с микросомами печени образцы анализировали с помощью масс-спектрометрии MALDI-TOF на предмет изменений в DAR. Не было обнаружено, что конъюгат 6 в инкубациях микросом печени мыши (фиг. 46) или человека (фиг. 47) вызывал какие-либо изменения в DAR.
Стабильность в плазме in vitro после инкубации при 37°С в течение 24 ч предполагает отсутствие деградации Fc-конъюгата 6, линкера или нацеливающего фрагмента ни у мыши, ни у человека. Аналогичным образом отсутствие деградации наблюдалось после инкубации в микросомах печени мыши и человека, что свидетельствует об отсутствии метаболитов. Результаты этих исследований стабильности in vitro подтверждают, что это стабильное соединение с продуктами разложения, которые могут иметь биологические свойства.
Пример 65. Эффективность конъюгата 13 при различных соотношениях лекарственное средство-антитело (DAR) против гриппа типа A (H1N1) в летальной мышиной модели
Конъюгат 13 оценивали против летальной инфекции, представляющей собой грипп IAV H1N1 у самок мышей BALB/c (Charles River Laboratories, 6-8 недель). Контрольный вирус для заражения (A/Puerto Rico/8/1934) представляет собой адаптированный к мышам изолят, способный вызывать летальные инфекции у мышей. В эксперименте участвовало 13 групп по 5 мышей. В день 0 всех мышей заражали вирусом при 3х LD95 путем интраназальной инокуляции в объеме 30 мкл после анестезии смесью кетамин/ксилазин (150 и 10 мг/кг, соответственно).
Группы 1-13 через 2 часа после заражения вирусом получали однократное IV лечение тестируемым препаратом или носителем (PBS). В исследовании оценивали конструкции конъюгата 13 с 4 различными значениями DAR, соответствующими конъюгату 13а, конъюгату 13 с, конъюгату 13d и конъюгату 13g (DAR 1,7, 3,8, 5,8 и 10,3, соответственно). Синтез конъюгата 13а, конъюгата 13с, конъюгата 13d и конъюгата 13g описан в примере 61-примере 63. Каждую конструкцию оценивали при 0,03, 0,1 и 0,3 мг/кг. Общий план исследования для каждого конъюгата представлен в обобщенном виде в таблице 29.
Все конструкции были полностью защитными при 0,3 мг/кг, напротив, ни одна конструкция не была активной при 0,03 мг/кг (0% выживаемость для всех групп), что указывает на то, что низкая доза была ниже пороговой эффективной дозы. Однако могут быть выделены группы, получавшие 0,1 мг/кг конъюгатов (таблица 30). При этом уровне дозы конъюгаты со значением DAR 1,7, 3,8 и 5,8 были значительно более защитными, чем мыши, обработанные только носителем (р=0,0027). Конструкция с высоким значением DAR (10,3), однако, не была значительно более защитной, чем мыши, обработанные только носителем (р=0,091). Лежащий в основе механизм, посредством которого конструкция с высоким значением DAR теряет свою активность, в настоящее время неизвестен, но может быть вызван несколькими факторами, включая вмешательство в рециркуляцию антител, что приводит к более короткому периоду полужизни.
Пример 66. Эффективность конъюгата 6 и конъюгата 12 in vivo
Конъюгат 6 и конъюгат 12, аналог с мутацией Fc в N297A, оценивали против летальной инфекции гриппа IAV H1N1 у самок мышей BALB/c (Charles River Laboratories, 6-8 недель). Контрольный вирус для заражения (A/Puerto Rico/8/34) представляет собой изолят, адаптированный для мышей. В эксперименте участвовало по 5 мышей на группу. Мышей анестезировали кетамином/ксилазином (150/10 мг/кг) и заражали вирусом гриппа при 3-5-х LD95 интраназальной инокуляцией в объеме 30 мкл. Однократную 1 дозу лечения вводили IV через 2 ч после инфицирования. PBS использовали в качестве отрицательного контроля. Всех мышей наблюдали на % потери массы тела (фиг. 48) и выживаемость (фиг. 49) в течение 15 дней после заражения.
Пример 67. Связывание in vitro конъюгата 6 и конъюгата 12 с Fcγ рецептором IIIA
Связывание конъюгата 6 и конъюгата 12, аналога с мутацией Fc в N297A, оценивали против FcγRIIIA с помощью ELISA. Планшет покрывали 1 мкг/мл рекомбинантного человеческого FcγRIIIA в течение ночи. На следующий день планшет блокировали 1% раствором BSA в течение 1 ч. Конъюгаты вносили в планшет в дозах в диапазоне 0,01-1000 нМ и инкубировали в течение 2 ч. Связывание детектировали путем инкубации с конъюгированным с пероксидазой античеловеческим Fc в течение 1 ч и последующей инкубацией с субстратом ТМВ в течение 10-15 минут. Связывание определяли путем считывания оптической плотности при 450 нм (фиг. 50 и фиг. 51).
Пример 68. Анализ конъюгата 6 in vivo в образцах плазмы
Конъюгат 6 в образцах плазмы определяли количественно путем детекции захвата нейраминидазы с помощью ELISA. Вкратце, молекулы захватывали на планшетах, покрытых нейраминидазой, а затем детектировали с использованием конъюгированного с HRP антитела против человеческого IgG-Fc. Концентрацию белка рассчитывали в GraphPad Prism с использованием 4PL нелинейной регрессии стандартных кривых конъюгата 6. Более подробное описание метода приведено ниже.
96-луночные планшеты Nunc Maxisorp (каталожный номер 12-565-136, ThermoFisher) покрывали 0,1 Ед/лунка нейраминидазы из A/California/04/2009 (H1N1) (11058-VNAHC, Sino Biological) в IX KPL буфере для покрытия (5150-0041, SeraCare). Планшеты инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч на орбитальном шейкере для планшетов (500 об/мин). Серийные разведения образцов плазмы вносили в планшеты и инкубировали при комнатной температуре в течение 2 часов (разбавитель образца: 0,5% BSA в PBS, 0,025% Tween 20+конечная концентрация в плазме у не подвергнутых воздействию яванскых макак 1:2500). Стандартные кривые конъюгата 6 в диапазоне от 0,230 до 500 нг/мл, в двух повторностях, были воспроизведены на каждом планшете. После 2-часовой инкубации планшеты промывали 5 раз в 300 мкл PBS с 0,05% Tween 20. Затем конъюгат, связанный с нейраминидазой на планшетах, исследовали с помощью конъюгированного с HRP антитела против человеческого IgG Fc F(ab')2 (709-036-098, Jackson), разводили 1:1000 в разбавителе образцов в течение 1 часа при комнатной температуре. Затем планшеты промывали 8 раз в 300 мкл PBS с 0,05% Tween 20 и проявляли субстратом ТМВ в течение 7-8 минут. Реакцию останавливали IN H2SO4. Поглощение считывали при 450 нм. Конъюгат 6 в образцах плазмы интерполировали с использованием GraphPad Prism Version 6 после нелинейного регрессионного анализа (анализ сигмоидальной кривой с использованием четырехпараметрической модели нелинейной регрессии (4PL)) стандартных кривых.
Полученные средние концентрации в плазме затем использовали для расчета фармакокинетических параметров с помощью некомпартментного анализа с использованием программы Phoenix WinNonlin 7.0.
Токсикокинетика (TR), группы 2 (IV, 5 мг/кг) и 3 (IV, 20 мг/кг)
Концентрации были сопоставимы между самцами и самками животных в группе с одинаковой дозой в день 1 (таблица 31) и день 8 (таблица 32) после введения. Средние концентрации в плазме увеличивались приблизительно пропорционально дозе в течение обоих дней. После введения 2-й дозы отмечалось небольшое накопление, составляющее около 30%, в группах, получавших разные дозы. График средних концентраций в плазме на 1-й и 8-й дни для групп, получавших разные дозы, показан на фиг. 52.
Фармакокинетика (PR), группы 4 (IV, 10 мг/кг) и 5 (SC, 10 мг/кг)
После внутривенного введения концентрации в плазме самцов и самок были сопоставимы. После внутривенного введения наблюдался очень низкий клиренс, приводящий к длительному конечному периоду полувыведения (таблица 33А и таблица 33 В).
После подкожного введения время для достижения максимальных концентраций было достигнуто через 72 часа после введения дозы, но концентрации можно было измерить через 672 часа после введения дозы (таблица 34А и таблица 34 В). Биодоступность после подкожного введения дозы была высокой и составляла приблизительно 139%. На фиг. 53 показано сравнение концентрации в плазме с течением времени при внутривенном и подкожном введении 10 мг/кг.
Пример 69. Эффективность конъюгата 6 против гриппа A/Puerto Rico/8/1934 (H1N1) в летальной мышиной модели
Конъюгат 6 оценивали против летальной инфекции гриппа IAV H1N1 у самок мышей BALB/ с (Charles River Laboratories, 6-8 недель). Контрольный вирус длязаражения (A/Puerto Rico/8/1934) представляет собой адаптированный к мышам изолят, способный вызывать летальные инфекции у мышей. В эксперименте участвовало 7 групп по 5 мышей. В день 0 всех мышей заражали вирусом при Зх LD95 путем интраназальной инокуляции в объеме 30 мкл после анестезии смесью кетамин/ксилазин (150 и 10 мг/кг, соответственно). Смертность и массу тела регистрировали ежедневно, и любое животное с потерей массы тела 20% оценивалось как погибшее. Тестируемые группы получали лечение через 2 часа после вирусного заражения в виде однократного внутривенного введения конъюгата 6, контроля hIgG1-Fc или носителя (PBS). Животных, получавших осельтамивир, дозировали перорально дважды в день в течение 5 дней, начиная с 2 часов после вирусного заражения. В таблице 35 представлен дизайн исследования.
Как и ожидалось, мыши, получавшие носитель или только hIgG1-Fc, умерли от инфекции к 6 дню. Аналогичным образом мыши, получавшие осельтамивир в низкой дозе (5 мг/кг; два раза в сутки в течение 5 дней), погибали к 8 дню (таблица 36). Однако мыши, получавшие осельтамивир в дозе 20 мг/кг по той же схеме дозирования, были полностью защищены (р=0,0027). В отличие от осельтамивир а, мыши, получавшие конъюгат 6, были полностью защищены при всех уровнях доз (10, 2 и 0,4 мг/кг) в результате однократной IV дозы (р=0,0027).
Эффективность конъюгата 6 дополнительно подтверждалась ежедневными измерениями массы тела. Как и ожидалось, мыши, получавшие носитель или hIgG1-Fc, демонстрировали устойчивое снижение массы тела, пока оно не превысило 20%, после чего они считались умершими (таблица 37). Группа, получавшая лечение осельтамивир ом в дозе 5 мг/кг, также показала последовательную потерю массы до наступления смерти на 8-й день. Мыши, получавшие лечение осельтамивир ом в высокой дозе (20 мг/кг), показали устойчивую, но сниженную потерю массы тела, которая достигла 14% на 8-й день, перед восстановлением.
В отличие от контрольных мышей и мышей, получавших осельтамивир, те группы, которые получали конъюгат 6, сохраняли здоровую массу тела на протяжении всего исследования даже при самой низкой концентрации дозы (0,4 мг/кг) (таблица 37). Наибольшая временная потеря массы тела среди мышей, получавших лечение конъюгатом 6, составила только 2% на 14 день в группе, получавшей дозу 2 мг/кг. По данным измерений выживаемости и массы тела конъюгат 6 продемонстрировал надежную защиту от гриппа A/Puerto Rico/8/1934 с помощью однократной IV дозы, составляющей всего лишь 0,4 мг/кг.
Пример 70. Синтез конъюгата 14
Указанный в заголовке конъюгат получали аналогично конъюгату 13а (пример 61) с использованием PEG-азидо-Ес (SEQ ID NO: 35) и промежуточного соединения-7 (пример 19). Анализ Maldi TOF очищенного конечного продукта показал среднюю массу, равную 56502 Да (DAR=2,1). Выход составил 43,4 мг, 43,4%.
Пример 71. Синтез конъюгата 15
Этот конъюгат получали аналогично примеру 62 (конъюгат 13а) с помощью PEG4-азидо-Ес (SEQ ID NO: 35, пример 61) и промежуточного соединения-12 (пример 46). Анализ Maldi TOF очищенного конечного продукта показал среднюю массу, равную 56528 Да (DAR=2,2). Выход составил 40,0 мг, 40,0%.
Пример 72. Синтез конъюгата 16
Этот конъюгат получали аналогично примеру 62 (конъюгат 13а) с помощью PEG4-азидо-Ес (SEQ ID NO: 35, пример 61) и промежуточного соединения-10 (пример 31). Анализ Maldi TOF очищенного конечного продукта показал среднюю массу, равную 56507 Да (DAR=2,1). Выход составил 41,7 мг, 42%.
Пример 73. Синтез промежуточного соединения-19
Стадия а.
К раствору трет-бутил [2-(2-бромэтокси)этил]карбамата (1,8 г, 6,6 ммоль) и пропаргил-PEG4-амина (0,7 г, 3,0 ммоль) в 30 мл DMF добавляли карбонат калия (1,2 г, 9 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при 80°С в течение 6 ч, и затем распределяли между DCM (200 мл) и рассолом (50 мл). Органический слой отделяли, промывали рассолом и сушили безводным сульфатом натрия. После фильтрации полученный фильтрат концентрировали и очищали обращенно-фазовой жидкостной хроматографией (RPLC) с использованием жидкостного хроматографа Isco COMBIFLASH®, элюируя от 10% до 100% ацетонитрила и водой с 0,1% TFA в качестве модификатора. Выход продуктов составил 1,0 г, 65%. Ион(ы), найденный с помощью LCMS: М/2+Н=606.4.
Стадия b.
Продукт, полученный на предыдущей стадии (1,0 г, 1,6 ммоль), обрабатывали TFA (10 мл) при комнатной температуре в течение 0,5 ч, затем концентрировали до сухого состояния и использовали на следующей стадии без дополнительной очистки. Выход на этой стадии был количественным. Ион(и), найденный с помощью LCMS: М/2+Н=406.3.
Стадия с.
Продукт, полученный на предыдущей стадии (120 мг, 0,17 ммоль), обрабатывали раствором эфира кислоты занамивиром (230 мг, 0,38 ммоль, пример 31) в 10 мл DMF. К этому раствору добавляли EDC (100 мг, 0,5 ммоль), HOBt (65 мг, 0,5 ммоль) и DIE А (0,14 мл, 1 ммоль). Полученный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение ночи, затем очищали и очищали обращенно-фазовой жидкостной хроматографией (RPLC) с использованием жидкостного хроматографа Isco COMBIFLASH®, элюируя от 10% до 100% ацетонитрила и водой без TFA в качестве модификатора. Выход продуктов составил 180 мг, 60,2%. Ион(ы), найденный с помощью LCMS: М/2+Н=816.9.
Стадия d.
Продукт, полученный на предыдущей стадии (180 мг, 0,11 ммоль), обрабатывали трифторуксусной кислотой (2 мл) в течение 30 мин при комнатной температуре. Полученный раствор концентрировали и растворяли в воде (2 мл), затем обрабатывали раствором гидроксида лития (24 мг, 1 ммоль), растворенным в H2O (1 мл). Полученную реакционную смесь перемешивали 10 мин, затем гасили 0,1 мл уксусной кислоты. Раствор концентрировали и очищали обращенно-фазовой жидкостной хроматографией (RPLC) с использованием жидкостного хроматографа Isco COMBIFLASH®, элюируя от 0% до 50% ацетонитрила и водой, используя 0,1% TFA в качестве модификатора. Выход продукта составил 140 мг, 52%. Ион(ы), найденный с помощью LCMS: М/2+Н=575.8, М/3+Н=384.2.
Пример 74. Синтез конъюгата 17
Этот конъюгат получали аналогично примеру 62 (конъюгат 13а) с помощью PEG4-азидо-Рс (SEQ ID NO: 35, пример 61) и промежуточного соединения-19 (пример 73). Анализ Maldi TOF очищенного конечного продукта показал среднюю массу, равную 56672 Да (DAR=2,2). Выход 36,7 мг, 36,7%.
Пример 75. Синтез промежуточного соединения-20
Стадия а.
К раствору диэтилиминодиацетата (3,1 г, 16,06 ммоль) в безводном DMF (36 мл) добавляли бензилбромид (2,38 мл, 19,64 ммоль) и карбонат калия (6,44 г, 46,46 ммоль). Полученную смесь нагревали при 70°С в течение 16 часов. После охлаждения до комнатной температуры реакционную смесь разбавляли водой и экстрагировали трет-бутилметиловым эфиром (3×100 мл). Органические слои промывали рассолом, сушили над Na2SO4 и фильтровали, затем концентрировали. Остаток очищали нормально-фазовой хроматографией на силикагеле (Isco, от 0 до 10% этилацетата и гексан). Выход 3,13 г, 69,8%. Ион, найденный с помощью LCMS: [М+Н]+=280.2.
Стадия b.
Раствор диэтилового эфира, полученного на стадии а (3,2 г, 11,2 ммоль) в безводном THF (5 мл) медленно добавляли в круглодонную колбу, содержащую LiALH4 (425 мг, 14,2 ммоль) в THF (2 мл) в атмосфере газа азота при 0°С. Шприц промывали THF (2×5 мл). Полученную смесь медленно нагревали до комнатной температуры в течение ночи. Медленно добавляли метанол (2 мл), чтобы погасить реакцию, после чего добавляли водный NaOH (1 мл). Полученную смесь перемешивали в течение 1 часа, затем фильтровали под вакуумом. Фильтрат концентрировали и использовали на следующей стадии без очистки. Выход 2,4 г, 109%. Ион, найденный с помощью LCMS: [М+Н]+=196.2.
Стадия с.
Продукт, полученный на предыдущей стадии (1,02 г, 5,24 ммоль) в безводном THF (4 мл) медленно добавляли в колбу, содержащую NaH (чистота 60%, 2,09 г, 52,4 ммоль) и THF (5 мл), при 0°С в атмосфере газа-азота. Полученную смесь перемешивали в течение 1 часа, а затем по каплям добавляли 3-(Вос-амино)пропилбромид (3,8 г, 15,7 ммоль) в THF (20 мл). Реакционную смесь медленно нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение 3 дней. Реакционную смесь охлаждали до 0°С, затем гасили водой (6 мл) и перемешивали в течение 1 часа. Реакционную смесь экстрагировали этилацетатом (2×100 мл). Объединенные органические слои промывали водным раствором IN HCl и рассолом. Их сушили над Na2SO4, фильтровали и концентрировали. Остаток очищали нормально-фазовой хроматографией (Isco, от 0 до 5% метанола и дихлорметан). Выход 984 мг, 37%. Ион, найденный с помощью LCMS [М+Н]+=510.0.
Стадия d.
Гидроксид палладия (543 мг, 0,77 ммоль) добавляли в колбу, содержащую продукт, полученный на стадии с (985,3 мг, 1,93 ммоль) в безводном метаноле (19,5 мл), в атмосфере Н2. Полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 16 часов. Затем ее фильтровали через слой целита, промывали метанолом и концентрировали. Остаток использовали на следующей стадии без очистки. Выход 828,6 мг, 102%. Ион, найденный с помощью LCMS [М+Н]+=420.0.
Стадия е.
Продукт, полученный на стадии d (829 мг, 1,97 ммоль) в H2O:THF (1:1, 16 мл) охлаждали до 0°С. К этому раствору добавляли Na2CO3 (314 мг, 2,96 ммоль) с последующим добавлением сложного эфира Fmoc N-гидроксисукцинимида (826 мг, 2,37 ммоль). Полученную смесь нагревали до комнатной температуры и перемешивали до завершения реакции по данным LCMS, затем экстрагировали этилацетатом. Органический слой промывали рассолом и сушили над Na2SO4, фильтровали и концентрировали. Остаток очищали нормально-фазовой хроматографией (Isco, от 0 до 60% этилацетата и гексан). Выход 784 мг, 62%. Ион, найденный с помощью LCMS [М+Н-Вос]+=542.0.
Стадия f.
Продукт, полученный на стадии е (1,01 г, 1,57 ммоль), перемешивали в TFA (5 мл) и CH2Cl2 (9 мл) при комнатной температуре в течение 1 часа, затем концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью RPLP (Isco, 5-100% метанола в воде без модификатора). Выход 903 мг, 86%. Ион, найденный с помощью LCMS [М+Н]+=442.2.
Стадия g.
К смеси простого эфира кислоты занамивира (340 мг, 0,49 ммоль), продукта, полученного на стадии f (111 мг, 0,25 ммоль, пример 31) и HATU (206 мг, 0,53 ммоль) в безводном DMF (3 мл) добавляли DIE А (162 мг, 1,23 ммоль). Полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа, затем очищали непосредственно с помощью RPLC (Isco, 30-100% метанола в воде без модификатора). Выход 249 мг, 61%. Ион, найденный с помощью LCMS [(М+2Н)/2]+=833.8.
Стадия h.
К раствору продукта, полученного на стадии g (249 мг, 0,15 ммоль), в безводном DMF (0,5 мл) добавляли SilaMetS Thiol (1,2 г, 1,47 ммоль) и 1,8-диазабицикло[5.4.0]-ундец-7-ен (12 мг, 0,07 ммоль). Полученную смесь перемешивали в течение 1,5 часов, затем фильтровали непосредственно в смесь, содержащую HATU (69 мг, 0,18 ммоль), пропаргиловую кислоту PEG-4 (43 мг, 0,16 ммоль) и DIEA (43 мг, 0,33 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в течение 1 часа, затем очищали непосредственно с помощью RPLC (Isco, 30-100% метанола в вода без модификатора). Выход 298 мг, 118%. Ион, найденный с помощью LCMS [(М+2Н-Вос)/2]+=843.9.
Стадия i.
Продукт, полученный на стадии h (298 мг, 0,18 ммоль), растворяли в TFA (3 мл) и CH2CI2 (3 мл), и раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 16 часов. Затем его концентрировали при пониженном давлении и очищали с помощью HPLC (ACCQ Isco, 0-25% ацетонитрила в воде, используя 0,1% TFA в качестве модификатора). Выход 112 мг, 44%. Ионы, найденные с помощью LCMS [(М+2Н)/2]+=643.8 и [(М+3Н)/3]+=429.6.
Стадия j.
К раствору продукта, полученного на стадии-i (112 мг, 0,072 ммоль) в МеОН (4 мл) и воде (2 мл) добавляли LiOH (10,6 мг, 0,43 ммоль). Полученный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа, затем подкисляли TFA и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью HPLC (ACCQ Isco, 0-25% ацетонитрила в воде, используя 0,1% TFA в качестве модификатора). Выход 37 мг, 36%. Ионы, найденные с помощью LCMS [(М+2Н)/2]+=603.8, [(М+3Н)/3]+=402.9.
Пример 76. Синтез конъюгата 18
Раствор аз идо-функционализир о ванного агликозилированного Fc (100 мг, 5,4 мл, 1,87 мкмоль, SEQ ID NO: 35) вносили в центрифужную пробирку объемом 15 мл, содержащую дер иватизир о ванную алкином малую молекулу (16,1 мг, 0,011 ммоль, промежуточное соединение-20). После осторожного встряхивания для растворения всех твердых веществ смесь добавляли к 3 мл предварительно смешанного раствора натриевой соли L-аскорбиновой кислоты (149 мг, 0,75 ммоль, 0,25 М), сульфата меди (II) (2,4 мг, 0,015 ммоль, 0,005 М) и ВТТАА (25,8 мг, 0,6 ммоль, 0,02 М) в буфере PBS при рН 7,4. Полученный раствор осторожно встряхивали в течение ночи. Его очищали аффинной хроматографией на колонке с белком А с последующей эксклюзионной хроматографией (см. Общий протокол очистки конъюгата в примере 10). Анализ Maldi TOF очищенного конечного продукта показал среднюю массу, равную 56826 Да (DAR 2.2). Выход 36,64 мг, 37%.
Пример 77. Синтез промежуточного соединения-21
Стадия а.
К раствору 2-(2-Вос-аминоэтокси)этанола (6,15 г, 30 ммоль) в безводном DCM (60 мл) добавляли DIPEA (7,8 г, 60 ммоль) и DMAP (366,6 мг, 3 ммоль). Затем порциями в течение 30 минут добавляли п-толуолсульфонилхлорид (6,86 г, 36 ммоль). После перемешивания полученной смеси в течение 3 дней ее концентрировали на роторном испарителе и очищали с помощью RPLC (от 20% до 70% ацето нитрил/в ода без модификатора). Выход 3,71 г, 34,4%. Ион, найденный с помощью LCMS: [М-Boc+Н]+=260.
Стадия b.
К раствору продукта, полученного на стадии-а (2,1 г, 5,83 ммоль) в безводном THF (10 мл) добавляли карбонат натрия (1,24 г, 11,7 ммоль) и моно-N-Boc-1,4-диаминобутан (1,32 г, 7 ммоль). Полученную смесь нагревали при 60°С в течение 1 дня. Затем соль отфильтровывали и фильтрат концентрировали на роторном испарителе. Остаток очищали с помощью RPLC (100 г, 5-50% ацетонитрила в воде, используя 0,1% TFA в качестве модификатора). Выход 1,94 г, 88,6%. Ион, найденный с помощью LCMS: [М+Н]+=376.0.
Стадия с.
К раствору пропаргил-PEG-4-кислоты (781 мг, 3 ммоль) и HATU (1,14 г, 3 ммоль) в безводном DMF (3 мл) добавляли DIPEA (390 мг, 3 ммоль) с последующим добавлением раствора продукта, полученного на стадии-b (940 мг, 2,5 ммоль) и DIPEA (390 мг, 3 ммоль) в безводном DMF (3 мл). Реакционную смесь перемешивали в течение 30 минут, затем очищали непосредственно с помощью RPLC (100 г, 5-80% ацетонитрила в воде, используя 0,1% TFA в качестве модификатора). Выход 960,2 мг, 65,3%. Ион, найденный с помощью LCMS: [М+Н]+=618.3, [М-Boc+Н]+=518.3.
Стадия d.
Продукт, полученный на стадии-с (960,2 мг, 1,63 ммоль), растворяли в безводном THF (6 мл). Добавляли раствор 4N HCl в диоксане (4 мл) и реакционную смесь перемешивали в течение ночи. Затем ее концентрировали на роторном испарителе. Остаток экстрагировали водой (3 мл×3) и этилацетатом (10 мл). Объединенные водные слои лиофилизировали. Выход 760 мг, 95,1%. Ион, найденный с помощью LCMS: [М+Н]+=418.0.
Стадия е.
К смеси эфира кислоты занамивира (315 мг, 0,5 ммоль) и HATU (190 мг, 0,5 ммоль) в безводном DMF (1 мл) порциями добавляли раствор диаминового продукта, полученного на стадии-d (148 мг, 0,3 ммоль), и DIPEA (165 мг, 1,5 ммоль) в безводном DMF (1 мл) в течение 20 минут. После добавления реакционную смесь перемешивали еще 30 минут и очищали непосредственно с помощью RPLC (50 г, 30-90% ацетонитрила в воде, используя 0,1% TFA в качестве модификатора). Выход 233 мг, 56,7%. Ион, найденный с помощью LCMS: [(М+2Н)/2]+=821.3.
Стадия f.
Продукт, полученный на стадии-е (233 мг, 0,142 ммоль) растворяли в TFA (1,5 мл), и раствор нагревали при 30°С в течение 30 минут. Затем его концентрировали и непосредственно очищали с помощью RPLC (0-30% ацетонитрила в воде, используя 0,1% TFA в качестве модификатора). Выход 120 мг, 57,4%. Ионы, найденные с помощью LCMS: [(М+2Н)/2]+=621.4, [(М+3Н)/3]+=414.7.
Стадия g.
К раствору продукта, полученного на стадии-f (120 мг, 0,0816 ммоль) в МеОН (2 мл) добавляли раствор моногидрата LiOH (63 мг, 1,5 ммоль) в воде (2 мл). Полученную смесь перемешивали в течение 1,5 часов, а затем концентрировали на роторном испарителе. Остаток подкисляли раствором 4N HCl в диоксане (0,5 мл) и очищали с помощью HPLC (0-15% ацетонитрила в воде, используя 0,1% TFA в качестве модификатора). Выход 98,2 мг, 86,6%. Ионы, найденные с помощью LCMS: [(М+2Н)/2]+=581.8,[(М+3Н)/3]+=388.2.
Пример 78. Синтез конъюгата 19
Этот конъюгат получали аналогично примеру 62 (конъюгат 13а) с помощью PEG4-азидо-Fc (SEQ ID NO: 35, пример 61) и промежуточного соединения-21 (пример 78). Анализ Maldi TOF очищенного конечного продукта показал среднюю массу, равную 56548 Да (DAR=2,1). Выход 39,7 мг, 39,7%.
Пример 79. Синтез промежуточного соединения-22
Стадия а.
К смеси эфира кислоты занамивира (1,8 г, 2,8 ммоль, пример 31) и пропаргил-PEG4-амина (0,82 г, 3,5 ммоль, 1,2 экв.) в дихлорметане (50 мл) добавляли EDC (1,0 г, 5 ммоль), HOBt (0,65 г, 5 ммоль) и DIEA (1,4 мл, 10 ммоль). Полученный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение ночи, концентрировали и очищали обращенно-фазовой жидкостной хроматографией (RPLC) с использованием жидкостного хроматографа Isco COMBIFLASH®, элюируя 10%-100% ацетонитрила и водой без 0,1% TFA в качестве модификатора. Выход продуктов 1,35 г, 50,2%. Ион(ы), найденные с помощью LCMS: М+Н=830.4.
Стадия b.
Продукт, полученный на предыдущей стадии (1,35 г, 1,6 ммоль), обрабатывали трифторуксусной кислотой (20 мл) в течение 30 минут при комнатной температуре. Полученный раствор концентрировали, растворяли в воде (10 мл) и МеОН (10 мл), затем обрабатывали раствором гидроксида лития (120 мг, 5 ммоль) в воде (10 мл). Реакционную смесь перемешивали в течение 10 мин, затем гасили 0,5 мл уксусной кислоты. Реакционную смесь концентрировали и очищали обращенно-фазовой жидкостной хроматографией (RPLC) с использованием жидкостного хроматографа Isco COMBIFLASH®, элюируя 0%-50% ацетонитрила и водой, используя 0,1% TFA в качестве модификатора. Выход продуктов 510 мг, 52,8%. Ионы, найденные с помощью LCMS: М+Н=604.3.
Пример 80. Синтез конъюгата 20
Этот конъюгат получали аналогично примеру 62 (конъюгат 13а) с помощью PEG4-азидо-Рс (SEQ ID NO: 35, пример 61) и промежуточного соединения-22 (пример 79). Анализ Maldi TOF очищенного конечного продукта показал среднюю массу, равную 55508 Да (DAR=2,3). Выход 37,0 мг, 37,0%.
Пример 81. Синтез промежуточного соединения-23
Стадия а.
К раствору 1N-Вос-1,4-диаминобутана (941,5 мг, 5 ммоль) в безводном THF (10 мл) добавляли карбонат натрия (1,06 г, 10 ммоль) и 3-(Вос-амино)пропилбромид (1,43 г, 6 ммоль). Полученную смесь нагревали при 50°С в течение 1 дня. Затем соль фильтровали и концентрировали на роторном испарителе. Остаток очищали с помощью RPLC (100 г, 5-50% ацетонитрила в воде, используя 0,1% TFA в качестве модификатора). Выход 1,35 г, 58,8%. Ион, найденный с помощью LCMS: [М+Н]+=346.0.
Стадия b.
К раствору пропаргил-PEG-4-кислоты (781 мг, 3 ммоль) и HATU (1,14 г, 3 ммоль) в безводном DMF (3 мл) добавляли DIPEA (390 мг, 3 ммоль) с последующим добавлением раствора продукта, полученного на стадии-а (863,8 мг, 2,5 ммоль), и DIPEA (390 мг, 3 ммоль) в безводном DMF (3 мл). Реакционную смесь перемешивали в течение 30 минут, затем очищали непосредственно с помощью RPLC (100 г, 5-80% ацетонитрила в воде, используя 0,1% TFA в качестве модификатора). Выход 1,19 г, 81%. Ион, найденный с помощью LCMS: [М+Н]+=588.3.
Стадия с.
Продукт, полученный на стадии-b (1,19 г, 2,02 ммоль), растворяли в безводном THF (6 мл). Добавляли раствор 4N HCl в диоксане (4,5 мл) и реакционную смесь перемешивали в течение 1 дня. Затем его концентрировали на роторном испарителе. Остаток экстрагировали водой (3 мл×3) и этилацетатом (15 мл). Объединенные водные слои лиофилизировали. Выход 940 мг, количественный выход. Ион, найденный с помощью LCMS: [М+Н]+=388.3.
Стадия d.
К смеси эфира кислоты занамивира (315 мг, 0,5 ммоль, пример 31) и HATU (209,1 мг, 0,55 ммоль) в безводном DMF (1 мл) добавляли DIPEA (65 мг, 0,5 ммоль). Через 5 минут раствор продукта, полученного на стадии-с (170 мг, 0,439 ммоль), и DIPEA (130 мг, 1 ммоль) в безводном DMF (1 мл) добавляли порциями в течение 20 минут. Реакционную смесь перемешивали еще 30 минут, затем очищали непосредственно с помощью RPLC (50 г, 30-90% ацетонитрила в воде, используя 0,1% TFA в качестве модификатора). Выход 208 мг, 51,6%. Ион, найденный с помощью LCMS: [(М+2Н)/2]+=806.7.
Стадия е.
Продукт, полученный на стадии-d (208 мг, 0,129 ммоль), растворяли в TFA (1,5 мл), и раствор нагревали при 30°С в течение 30 минут. Затем его непосредственно очищали с помощью RPLC (100 г, 0-30% ацетонитрила в воде, используя 0,1% TFA в качестве модификатора). Выход 134 мг, 72%. Ионы, найденные с помощью LCMS: [(М+2Н)/2]+=606.8, [(М+ЗН)/3]+=405.0.
Стадия f.
К раствору продукта, полученного на стадии-е (134 мг, 0,093 ммоль), в МеОН (2 мл) добавляли раствор моногидрата LiOH (63 мг, 1,5 ммоль) в воде (2 мл). Полученную смесь перемешивали в течение 1,5 часов, а затем концентрировали на роторном испарителе. Остаток подкисляли раствором 4N НС1 в диоксане (0,5 мл) и очищали с помощью HPLC (0-15% ацетонитрила в воде, используя 0,1% TFA в качестве модификатора). Выход 78,4 мг, 62%. Ионы, найденные с помощью LCMS: [(М+2Н)/2]+=566.4, [(М+ЗН)/3]+=378.4.
Пример 82. Синтез конъюгата 21
Этот конъюгат получали аналогично примеру 62 (конъюгат 13а) с помощью PEG4-азидо-Fc (SEQ ID NO: 35, пример 61) и промежуточного соединения-23 (пример 81). Анализ Maldi TOF очищенного конечного продукта показал среднюю массу, равную 56503 Да (DAR=2,2). Выход 34,4 мг, 34%.
Пример 83. Активность конъюгатов 13-21 против высокопатогенного вируса гриппа A H7N9 и двух изолятов гриппа В в анализе цитопатических эффектов (СРЕ)
Всего 9 конъюгатов (таблица 38) использовали при концентрациях 100, 10, 1 и 0,1 нМ, и сравнивали с рибавирином в анализе СРЕ. Анализ СРЕ следовал стандартной методологии, но вкратце использовали 80-100% конфлюэнтных монослоев клеток MDCK в 96-луночном планшете. К ним добавляли тестируемые препараты в трех повторностях и инкубировали при 37°С (+5% СО2) до тех пор, пока эффекты СРЕ не становились визуально очевидными. Как только был отмечен СРЕ, слои клеток окрашивали 0,011% нейтральным красным в течение приблизительно 2 часов. После этого добавляли смесь 50:50 цитратный буфер Соренсена/этанол и оставляли для инкубации в течение 30 минут, затем А540 считывали на спектрофотометре и значения ЕС50/СС50 рассчитывали с помощью регрессионного анализа.
Все конъюгаты обладали значительной активностью против изолята гриппа B/Florida/4/2006 со значениями ЕС50 в диапазоне от 3,05 до 33,5 нМ (таблица 39). В среднем конъюгаты продемонстрировали преимущество, состоящее в 275-кратной эффективности, по сравнению с рибавирином (ЕС50 3250 нМ). Активность конъюгатов против гриппа B/Brisbane/60/2008 была очень схожей с активностью, наблюдаемой против B/Florida, за исключением конъюгата 14, который имел ЕС50 более 100 нМ.
Важно отметить, что все конъюгаты также были высокоактивными против высокопатогенного изолята вируса гриппа A/Anhui/1/2013 (H7N9). Среднее значение ЕС50 для всех конъюгатов составило 21,2 нМ против этого изолята (от 12 до 28,5 нМ) по сравнению с 14000 нМ для рибавирина. Наконец, непосредственных цитотоксических эффектов конъюгатов на монослои MDCK не было обнаружено при тестируемых концентрациях.
Способ 39: Активность конъюгатов в анализе СРЕ против подтипов гриппа
Пример 84. Синтез конъюгата 22
Стадия а. Синтез РЕG4-азидо IVIG
Получение 0,05М раствора РЕG4-азидо-NHS-сложного эфира в DMF/PBS: 6,05 мг РЕG4-азидо-NHS-сложного эфира растворяли в 0,050 мл DMF при 0°С и разбавляли до 0,305 мл путем добавления 0,250 мл 1х буфера PBS при 0°С. Этот раствор использовали для получения другого РЕG4-азидо IVIG с различными значениями DAR путем регулирования эквивалентов этого раствора РЕG4-азидо-NHS-сложный эфир в PBS.
Получение РЕG4-азидо IVIG: 0,05М РЕG4-азидо-NHS-с ложный эфир PBS буферный раствор (0,301 мл, 15,0 мкмоль, 5,5 эквивалентов) добавляли к раствору IVIG (внутривенный иммунный глобулин, Baxter)) (407 мг в 9,25 мл, рН 7,4, PBS, MW ~ 148863 Да, 1,968 мкмоль), и смесь осторожно встряхивали в течение 12 часов при температуре окружающей среды. Раствор концентрировали с использованием центробежного концентратора (100000 MWCO) до объема ~1,5 мл. Неочищенную смесь разбавляли 1:10 в PBS, рН 7,4, и снова концентрировали. Эту процедуру промывки повторяли всего три раза. С помощью этой процедуры промывки был удален низко молекулярный реагент. Концентрированный IVIG-PEG4-азид разбавляли до 9,25 мл буфером 1x PBS с рН 7,4 и готовили для «клик»-конъюгации. Очищенный продукт количественно оценивали с помощью спектрофотометра Nanodrop™ в УФ и видимой части спектра (используя рассчитанный коэффициент экстинкции, основанный на аминокислотной последовательности IVIG). Выход является количественным после очистки.
Стадия b. Синтез конъюгатов
Получали раствор «клик»-реагента: 0,0050М CuSO4 в буферном растворе PBS: 10,0 мг CuSO4 растворяли в 12,53 мл PBS x1, затем брали 6,00 мл 0,0050 М раствора CuSO4 и добавляли 57,7 мг ВТТАА (номер СAS 1334179-85-9) и 297,6 мг аскорбата натрия с получением раствора «клик»-реагента (0,0050 М CuSO4, 0,020М ВТТАА и 0,25 М аскорбат натрия).
Раствор азидо-функционализированного IVIG (140 мг, 3,17 мл, 0,936 мкмоль, IVIG-линкер-1-азид) добавляли в центрифужную пробирку объемом 15 мл, содержащую дериватизированную алкином малую молекулу (8,4 мг, 0,00618 ммоль, 6,6 экв., описанную в пример 60). После осторожного встряхивания для растворения всех твердых веществ добавляли 1,50 мл указанного выше раствора «клик»-реагента (натриевая соль L-аскорбиновой кислоты, 0,25 М, 74,2 мг, 0,374 ммоль, сульфат меди (II) 0,0050 М, 1,2 мг, 0,0075 ммоль, и ВТТАА 0,020 М, 12,9 мг, 0,0300 ммоль). Полученную смесь осторожно встряхивали в течение ночи. Ее очищали аффинной хроматографией на колонке с белком А с последующей эксклюзионной хроматографией (см. протокол очистки конъюгата в примере 10). Анализ Maldi TOF очищенного конечного продукта показал среднюю массу, равную 151873 Да (DAR=2,7). Выход 51,0 мг, выход 36%.
Пример 85. Синтез конъюгата 23
Конъюгат 23 получали аналогично конъюгату 22, заменяя соответствующую функционализированную алкином малую молекулу (промежуточное соединение-23, описанное в примере 81) на стадии «клик»-конъюгирования.
Пример 86. Синтез конъюгата 24
Конъюгат 24 получали аналогично конъюгату 22, заменяя соответствующую функционализированную алкином малую молекулу (описанную в примере 19) на стадии «клик»-конъюгирования.
Пример 87. Эффективность конъюгатов 13, 14 и 21 против гриппа В в летальной мышиной модели
Конъюгаты оценивали против летальной инфекции гриппа В у самок мышей BALB/c (Charles River Laboratories, 6-8 недель). Контрольный вирус для заражения (B/Malaysia/2506/04) представляет собой адаптированный к мышам изолят, способный вызывать летальные инфекции у мышей. В эксперименте участвовало 11 групп по 5 мышей. В день 0 всех мышей заражали вирусом при 3х LD95 путем интраназальной инокуляции в объеме 30 мкл (приблизительно 1Е4 на мышь) после анестезии смесью кетамин/ксилазин (150 и 10 мг/кг соответственно).
Все группы получали лечение через 2 часа после вирусного заражения путем однократного IV введения тестируемого препарата, носителя (PBS) или только Fc (hIgG1-Fc) в качестве контроля. В исследовании оценивали промежуточное соединение-18, промежуточное соединение-7 и промежуточное соединение-23, ко нъюгиро ванные с идентичными мономерами Fc (конъюгаты 13, 14 и 21, соответственно), тестировали при 3,0, 1,0 и 0,3 мг/кг. За мышами наблюдали в течение 2 недель, и животных, у которых потеря массы тела превышала 20% или которые были признаны умирающими, оценивались как погибшие.
Все мыши, получавшие носитель или только Fc в качестве контроля, погибали на 7 день. Напротив, мыши, получавшие конъюгаты 13, 14 и 21, были полностью защищены после получения однократной IV дозы 0,3 мг/кг (таблица 40). Как ожидалось, группы, получавшие конъюгаты в дозе 1,0 или 3,0 мг/кг, также были полностью защищены. Эффективность всех конъюгатов против гриппа В дополнительно подтверждалась ежедневными измерениями массы тела (таблица 41), которые показали временное падение менее чем на 5% в течение всего исследования для любой группы, подвергнутой лечению конъюгатом. Активность конъюгатов 13, 14 и 21 сопоставима по дозе с активностью конъюгата 6 против подтипов H1N1 и H3N2 гриппа А. Поскольку конъюгаты 6 и 14 имеют идентичные нацеливающие фрагменты (соответствующие промежуточному соединению-7), один конъюгат может быть активен против доминирующих типов сезонного гриппа (гриппа A (H1N1), гриппа А (H3N2) и гриппа В).
Пример 88. Синтез РЕG4-азидо Fc для конъюгата 25, конъюгата 26, конъюгата 27 и конъюгата 28
Получение 0,05М РЕG4-азидо-NНS-сложного эфира в растворе DMF/PBS x1: 27,40 мг РЕ04-азидо-NНS-сложного эфира растворяли в 0,155 мл DMF при 0°С и разбавляли путем добавления 1,200 мл буфера 1x PBS при 0°С. Этот раствор использовали для получения другого РЕG4-азидо-Ес с различными значениями DAR путем корректировки эквивалентов этого раствора РЕG4-азидо-NHS-сложного эфира в x1 PBS.
Получение РЕG4-азидо-Ес (SEQ ID NO: 48): 0,05М РЕ04-азидо-NHS-сложного эфира в буфере x1 PBS (0,0984 мл, 4,92 мкмоль, 2,5 эквивалента) добавляли к раствору h-IgG1-Fc (SEQ ID NO: 48) (234 мг в 13,605 мл PBS с рН 7,4, MW -57976 Да, 4,036 мкмоль), и смесь осторожно встряхивали в течение 2 часов при температуре окружающей среды. Раствор концентрировали с использованием центробежного концентратора (30000 MWCO) до объема ~ 2 мл. Неочищенную смесь разбавляли 1:7 в PBS рН 7,4 и снова концентрировали. Эту процедуру промывки повторяли всего три раза. С помощью этой процедуры промывки удаляли низ ко молекулярный реагент. Концентрированный Fc(SEQ ID NO: 48)-РЕG4-азид разбавляли до 13,60 мл буфером 1х PBS с рН 7,4 и готовили для «клик»-конъюгации. Очищенный продукт количественно оценивали с помощью спектрофотометра Nanodrop™ в УФ и видимой части спектра (используя рассчитанный коэффициент экстинкции, основанный на аминокислотной последовательности h-IgG1).
Получение РЕG4-азидо-Ес (SEQ ID NO: 50) аналогично указанному выше PEG4-азидо-Fc (SEQ ID NO: 48).
Пример 89. Синтез конъюгата 25
Получение раствора «клик»-реагента: 0,0050М CuSO4 в буферном растворе x1 PBS: 10,0 мг CuSO4 растворяли в 12,53 мл x1 PBS, затем брали 10,00 мл этого раствора CuSO4 и добавляли 86,1 мг ВТТАА и 495,3 мг аскорбата натрия с получением раствора «клик»-реагента (0,0050 М CuSO4, 0,020 М ВТТАА и 0,25 М аскорбат натрия). Этот раствор «клик»-реагента Click использован для конъюгата 25 и конъюгата 26.
Раствор азидо-функционализированного Fc (78,0 мг, 4,535 мл, 1,35 мкмоль, SEQ ID NO: 48-РЕG4-азид) добавляли в центрифужную пробирку объемом 15 мл, содержащую дериватизированную алкином малую молекулу (13,2 мг, 8,88 мкмоль, промежуточное соединение-23). После осторожного встряхивания для растворения всех твердых веществ к смеси добавляли 2,153 мл указанного выше раствора «клик»-реагента (натриевая соль L-аскорбиновой кислоты, 0,25 М, 106,6 мг, 0,538 ммоль, сульфат меди (II), 0,0050М, 1,72 мг, 0,0107 ммоль, и ВТТАА 0,020 М, 18,5 мг, 0,0431 ммоль). Полученную смесь осторожно встряхивали в течение 6 часов при температуре окружающей среды. Ее очищали аффинной хроматографией на колонке с белком А с последующей эксклюзионной хроматографией (см. протокол очистки конъюгата в примере 10). Анализ Maldi TOF очищенного конечного продукта показал среднюю массу 60973 Да (DAR=2,1). Выход 50,3 мг, выход 64%.
Пример 90. Синтез конъюгата 26
Получение конъюгата 26 аналогично конъюгату 25 с использованием той же партии РЕG4-азидо-Ес (SEQ ID NO: 48) и дериватизированной алкином небольшой молекулы (промежуточное соединение-7). Анализ Maldi TOF очищенного конечного продукта показал среднюю массу, равную 61068 Да (DAR=2,2). Выход 49,5 мг, выход 63%.
Пример 91. Синтез конъюгата 27
Получение раствора «клик»-реагента: 0,0050 М CuSO4 в буферном растворе x1 PBS: 10,0 мг CuSO4 растворяли в 12,53 мл x1 PBS, затем брали 12,00 мл этого раствора CuSO4 и добавляли 103,3 мг ВТТАА и 594,3 мг аскорбата натрия с получением раствора «клик»-реагента (0,0050 М CuSO4, 0,020 М ВТТАА и 0,25 М аскорбат натрия). Этот раствор «клик»-реагента будет использован для конъюгата 28.
Раствор азидо-функционализированного Fc (80,0 мг, 4,535 мл, 1,38 мкмоль, SEQ ID NO: 50-РЕG4-азид) добавляли в центрифужную пробирку объемом 15 мл, содержащую дериватизированную алкином малую молекулу (13,5 мг, 9,10 мкмоль, промежуточное соединение-23). После осторожного встряхивания для растворения всех твердых веществ к смеси добавляли 2,21 мл вышеуказанного раствора «клик»-реагента (натриевая соль L-аскорбиновой кислоты, 0,25 М, 109,3 мг, 0,552 ммоль, сульфат меди (II), 0,0050 М, 1,76 мг, 0,0110 ммоль, и ВТТАА, 0,020 М, 19,0 мг, 0,0441 ммоль). Полученную смесь осторожно встряхивали в течение 6 часов при температуре окружающей среды. Ее очищали аффинной хроматографией на колонке с белком А с последующей эксклюзионной хроматографией (см. протокол очистки конъюгата в примере 10). Анализ Maldi TOF очищенного конечного продукта показал среднюю массу 61447 Да (DAR=2,5). Выход 37,1 мг, выход 46%.
Пример 92. Синтез конъюгата 28
Конъюгат 28 получали аналогично конъюгату 27 с использованием той же партии РЕG4-азидо-Ес (SEQ ID NO: 50) и дериватизированной алкином небольшой молекулы (промежуточное соединение-7). Анализ Maldi TOF очищенного конечного продукта дал среднюю массу 61388 Да (DAR=2,4). Выход 44,6 мг, выход 56%.
Пример 93. Активность конъюгата 6 и конъюгата 21 против высокопатогенного гриппа A (H5N1, H7N9) в анализе цитопатических эффектов (СРЕ)
Анализ in vitro для определения активности конъюгатов по настоящему изобретению проводили против BSL-3 (высокопатогенного) гриппа А и обычно следовали стандартным процедурам. Вкратце, различные концентрации конъюгатов смешивали с вирусом (приблизительно 250 ТСID50) и оставляли инкубироваться при 35°С в течение одного часа. После инкубации смесь добавляли к 80-90% конфлюэнтному монослою клеток MDCK. После 90-минутной инкубации клетки промывали и повторно наносили конъюгаты. Затем монослой покрывали карбоксиметилцеллюлозой, чтобы минимизировать распространение вируса, и оставляли инкубироваться в течение двух дней. Через два дня культивирования клетки промывали PBS и фиксировали 10% формалином. После фиксации монослой MDCK пермеабилизировали Triton Х-100 и иммуноокрашивали с помощью мышиного mAb против нукле о протеина гриппа. Монослои считывали и рассчитывали площадь окрашивания на лунку для определения значений EC50/100.
Результаты исследования приведены в обобщенном в таблице 42 и демонстрируют эффективность конъюгата 6 и конъюгата 21 против высоко патогенных штаммов с пандемическим потенциалом. Важно отметить, что оба конъюгата генерировали значения ЕС100 на уровне 15 нМ или ниже против четырех H5N1 и одного изолята H7N9. Напротив, осельтамивир имел ЕС100 приблизительно 15 нМ только против одного изолята (A/Vietnam/1194/2004) и значения в диапазоне от 125 до >1000 нМ против других высокопатогенных штаммов. Эти результаты дают основание предположить, что потенциал конъюгата 6 и конъюгата 21 для лечения пандемий, вызванных высоковирулентным гриппом, превосходит потенциал осельтамивира.
Пример 94. Активность конъюгата 6 и конъюгата 21 против гриппа A (H1N1) при различной множественности инфекции (MOI) в анализе цитопатических эффектов (СРЕ)
Клетки MDCK высевали при плотности 4×104 клеток/лунку в среду MEM в 96-луночный планшет (обработанный ТС) и инкубировали при 37°С, 5% СО2 в течение 18-24 ч. Тестируемые препараты (занамивир, осельтамивир, балоксавир, конъюгат 6 и конъюгат 21) в диапазоне доз 1,93-10000 нМ инкубировали с вирусом гриппа A/WSN/1933 при множественности заражения (MOI) вирус : клетка от 0,001 до 1 в течение 1 ч при комнатной температуре (RT). Через 1 час предварительно инкубированный вирус и тестируемый препарат добавляли к 90-100% конфлюэнтному монослою клеток MDCK и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре.
Через 1 ч в лунки добавляли среду MEM, дополненную L-глутамином и пенициллином/стрептомицином. Инфицированные клетки инкубировали при 37°С, 5% СО2 в течение 72 ч. СРЕ определяли после фиксации и окрашивания клеток кристаллическим фиолетовым. Значение ЕС50 рассчитывали с помощью нелинейного регрессионного анализа с использованием программного обеспечения Graphpad Prism 6. Результаты анализа СРЕ, представленные в таблице 43, показывают, что конъюгат 6 и конъюгат 21 превосходят стандартные агенты лечения in vitro, особенно при высоких значениях MOI.
Пример 95. Эффективность конъюгата 6 против гриппа A (H1N1) в мышиной модели летального тяжелого комбинированного иммунодефицита
Конъюгаты оценивали против летальной инфекции гриппа А у самцов мышей BALB/c с тяжелым комбинированным иммунодефицитом (SCID) (Stock #001803; Jackson Laboratories, возраст 6-8 недель). Контрольный вирус для заражения (A/Puerto Rico/08/1934) представляет собой адаптированный к мышам изолят, способный вызывать летальные инфекции у мышей. В эксперименте участвовало 5 групп по 5 мышей в каждой. В день 0 всех мышей заражали вирусом при 3х LD95 путем интраназальной инокуляции в объеме 30 мкл (приблизительно 1ЕЗ на мышь) после анестезии смесью кетамина и ксилазина (150 и 10 мг/кг, соответственно).
Все группы получали лечение через 2 часа после заражения вирусом путем однократного IV введения тестируемого препарата, носителя (PBS) или только Fc (hIgG1-Fc) в качестве контроля. В исследовании оценивали 3 различные концентрации доз конъюгата 6 (0,3, 1,0 или 3,0 мг/кг). За мышами наблюдали в течение 5 недель, и животных, у которых потеря веса превышала 20%, или которые были признаны умирающими, оценивались как погибшие. Также регистрировали массу тела, чтобы контролировать общее состояние здоровья животных.
Все мыши, получавшие носитель или только Fc в качестве контроля, погибали ко 2 неделе. Напротив, мыши, получавшие конъюгат 6, были полностью защищены после получения однократных внутривенных доз 1 или 3 мг/кг в течение всего исследования (фиг. 56, таблица 44). Когда доза конъюгата 6 была снижена до 0,3 мг/кг, выживаемость упала до 20% к концу исследования. Доза 0,3 мг/кг была полностью защитной в течение 3 недель. Эффективность конъюгата 6 в этой модели тяжелого иммунодефицита дополнительно подтверждается данными по массе тела (фиг. 57, таблица 45). Группы, получавшие конъюгат 6 в дозах 1 или 3 мг/кг, продемонстрировали не более чем временную потерю массы тела, составляющую менее 3%, в течение всего курса исследования. Кроме того, к концу исследования группы, принимавшие обе дозы, показали чистую прибавку в весе (7,5% и 2,2%, соответственно). Группа, получавшая самую низкую концентрацию конъюгата 6 (0,3 мг/кг), имела менее чем 4% временную потерю массы тела в течение первых 3 недель исследования до появления признаков инфекции на 4 неделе, что в конечном итоге привело к смерти для четыре из пяти животных.
В совокупности эти данные демонстрируют эффективность конъюгата 6 в отношении защиты летально зараженных мышей с помощью однократных IV доз конъюгата, равных всего лишь 1 мг/кг. Кроме того, эта защита была длительной, на протяжении 5 недель исследования. Это было достигнуто в экстремальной модели иммунодефицита у мышей, полностью лишенных иммунных Т- и В-клеток, которые необходимы для избавления от инфекций гриппа. Эти данные подтверждают применение конъюгата 6 для лечения как иммунокомпетентных, так и иммунодефицитных популяций пациентов.
Пример 96. Зависимый от дозы конъюгата 6 клиренс вируса в легких
Исследования эффективности проводили на самках мышей BALB/c в возрасте 6-8 недель (Charles River), которым интраназально вводили 3×102 БОЕ/мышь (3х LD95) адаптированного к мышам вируса гриппа A/Puerto Rico/8/1934 (H1N1). Конъюгат 6 или человеческий IgG1-Fc в качестве контроля вводили в виде однократной внутривенной (IV) дозы через 2 часа после заражения в дозе 0,1-3 мг/кг. Осельтамивир вводили перорально два раза в сутки в течение 4 дней, начиная через 2 ч после инфицирования в дозе 5 или 15 мг/кг. Массу тела (BW) регистрировали в течение 4 дней. Через 4 дня после инфицирования мышей умерщвляли с помощью СО2 и собирали обе доли легких. Легкие гомогенизировали с помощью 1 мм гранул диоксида кремния в 1 мл PBS с использованием MagNA Lyser (Roche). Гомогенизацию проводили при 6000 об/мин в течение 60 сек и охлаждали на льду в течение 5 минут между циклами. После гомогенизации легких пробирки центрифугировали в течение 10 мин при 600 × g и супернатант переносили в новую пробирку.
Для определения вирусной нагрузки в легких (измеряемой в бляшкообразующих единицах (БОЕ)) супернатанты гомогената легких разбавляли в инфекционном буфере в диапазоне от 10-1 до 10-6. 100 мкл разведений вируса добавляли к конфлюэнтному монослою клеток MDCK в 24-луночных планшетах и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре с покачиванием каждые 15 мин. После удаления вируса жидкую среду, содержащую Avicel, добавляли к клеткам MDCK. Клетки инкубировали при 37°С, 5% СО2 в течение 40 ч. После инкубации среду удаляли и клетки окрашивали кристаллическим фиолетовым для подсчета бляшек. БОЕ рассчитывали относительно массы легкого (БОЕ/г легкого).
Результаты этого исследования демонстрируют, что низкие дозы конъюгата 6 быстро снижают вирусную нагрузку на несколько порядков лучше, чем осельтамивир (TAMIFLU®) (фиг. 58, таблица 46). Это наблюдение имеет клиническое значение, поскольку тяжелые инфекции гриппа вызваны переносом вируса из начальной инфекции верхних дыхательных путей в легкие.
Пример 97. Зависимое от дозы конъюгата 6 снижение воспалительных цитокинов в легких
Исследования эффективности проводили на самках мышей BALB/c в возрасте 6-8 недель (Charles River), которым интраназально вводили 3×102 БОЕ/мышь (3х LD95) адаптированного к мышам вируса гриппа A/Puerto Rico/8/1934 (H1N1). Конъюгат 6 или человеческий IgG1-Fc в качестве контроля вводили в виде однократной внутривенной (IV) дозы через 2 часа после заражения при 0,1-3 мг/кг. Осельтамивир вводили перорально два раза в сутки в течение 4 дней, начиная через 2 ч после инфицирования, в дозе 5 или 15 мг/кг. Массу тела (BW) регистрировали в течение 4 дней. Через 4 дня после инфицирования мышей умерщвляли с помощью СО2 и собирали обе доли легких. Легкие гомогенизировали с помощью 1 мм гранул диоксида кремния в 1 мл PBS с использованием MagNA Lyser (Roche). Гомогенизацию проводили при 6000 об/мин в течение 60 сек и охлаждали на льду в течение 5 минут между циклами. После гомогенизации легких пробирки центрифугировали в течение 10 мин при 600 × g и супернатант переносили в новую пробирку.
Для анализа цитокинов супернатанты гомогената легких серийно разводили 2-кратно в 96-луночном планшете. Уровни цитокинов для INF-γ, TNF-α, IL-6, MIP-1α и MCP-1 определяли с помощью ELISA в соответствии с инструкциями производителя (R&D Systems).
Заболеваемость и смертность от тяжелого гриппа в конечном итоге вызваны индуцированным вирусами потоком провоспалительных цитокинов в легкие. Одна из потенциальных проблем, связанных с использованием Fc-конъюгата для лечения гриппа, заключается в том, может ли Fc-фрагмент усугубить индуцированное цитокинами воспаление. Результаты модели летальной инфекции H1N1 показывают прямо противоположное: зависимое от дозы конъюгата 6 снижение провоспалительных цитокинов (например, TNFα и IL-6) в инфицированных тканях легких (фиг. 59, таблица 47).
Таблица 47: Цитокиновый ответ на 4-й день после инфицирования
Пример 98. Анализ in vivo содержания в образце плазмы конъюгата 6. Сравнение РK у мышей CD-1 и BALB/c с тяжелым комбинированным иммунодефицитом
Конъюгат 6 в образцах плазмы количественно определяли путем обнаружения захвата нейраминидазы с помощью ELISA. Вкратце, молекулы захватывали на планшетах, покрытых нейраминидазой, а затем обнаруживали с использованием конъюгированного с HRP антитела против человеческого IgG-Fc. Концентрацию белка рассчитывали в GraphPad Prism с использованием 4PL нелинейной регрессии стандартных кривых конъюгата 6. Более подробное описание метода приведено ниже.
96-луночные планшеты Nunc Maxisorp (каталожный номер 12-565-136, ThermoFisher) покрывали 0,1 Ед/лунка нейраминидазы из A/California/04/2009 (H1N1) (11058-VNAHC, Sino Biological) в IX KPL буфере для покрытия (5150-0041, SeraCare). Планшеты инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч на орбитальном шейкере для планшетов (500 об/мин). Серийные разведения образцов плазмы вносили в планшеты и инкубировали при комнатной температуре в течение 2 часов (разбавитель образца: 0,5% BSA в PBS, 0,025% Tween 20 + конечная концентрация в плазме у не подвергнутых воздействию мышей 1:2500). Стандартные кривые конъюгата 6 в диапазоне от 0,230 до 500 нг/мл, в двух повторностях, были воспроизведены на каждом планшете. После 2-часовой инкубации планшеты промывали 5 раз в 300 мкл PBS с 0,05% Tween 20. Затем конъюгат, связанный с нейраминидазой на планшетах, исследовали с помощью ко нъюгир о ванного с HRP антитела против человеческого IgG Fc F(ab')2 (709-036-098, Jackson), разводили 1:1000 в разбавителе образцов в течение 1 часа при комнатной температуре. Затем планшеты промывали 8 раз в 300 мкл PBS с 0,05% Tween 20 и проявляли субстратом ТМВ в течение 7-8 минут. Реакцию останавливали IN H2SO4. Поглощение считывали при 450 нм. Конъюгат 6 в образцах плазмы интерполировали с использованием GraphPad Prism Version 6 после нелинейного регрессионного анализа (анализ сигмоидальной кривой с использованием четырехпараметрической модели нелинейной регрессии (4PL)) стандартных кривых.
РK-профили, мыши CD-I по сравнению с SCID BALB/c
Конъюгат 6, вводимый внутривенно мышам SCID и CD-I (иммунокомпетентным) в дозе 5 мг/кг, демонстрировал аналогичные профили РК (фиг. 60). Концентрации были сопоставимыми в выбранных временных точках. Двухфазные профили РК содержат 24-часовые фазы распределения, за которыми следует фаза пологого удаления. Уровни конъюгата 6 в плазме оставались высокими (~ 10 мкг/мл) относительно уровней Сmax в течение однонедельного курса исследования.
Пример 99. Синтез центрального линкера пропаргилдиамина.
Стадия а.
Раствор 2-(2-Вос-аминоэтокси)этанола (16,0 г, 78,0 ммоль) и СВr4 (31,0 г, 93,5 ммоль) в DCM (100 мл) при 0°С медленно обрабатывали PPh3 (24,5 г, 93,5 ммоль) в течение 15 минут (экзотермическая реакция). Во время добавления внутренняя температура поддерживалась ниже 30°С. После добавления PPh3 реакционную смесь перемешивали в течение ночи при комнатной температуре. Неочищенную реакционную смесь концентрировали до масла, затем очищали нормально-фазовой хроматографией, элюируя смесью от 10% этилацетат/гексаны до 80% этилацетат/гексаны. Фракции, содержащие капли масла внутри пробирок для сбора, объединяли и концентрировали до бесцветного масла. Выход 18,1 г, 86%.
Стадия b.
Раствор продукта, полученного на стадии-а (10 г, 37,3 ммоль), бензиламина (1,60 г, 14,9 ммоль) и K2СО3 (6,19 г, 44,8 ммоль) в DMF (20 мл) нагревали на масляной бане при 75°С в течение 8 ч. Смесь фильтровали, концентрировали и очищали с помощью RPLC (от 5% ACN/вода до 100% ACN). Выход 6,8 г, 95%.
Стадия с.
К раствору продукта, полученного на стадии-b (5,35 г, 8,98 ммоль) в СНСl3/ЕtOН (1:20, 100 мл) добавляли 20% Pd(OH)2/C (1,26 г, 1/80 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в течение ночи под баллоном с водородом при температуре окружающей среды. Реакционную смесь фильтровали через слой целита. Растворители удаляли и переносили на следующую стадию без очистки.
Стадия d.
Продукт, полученный на стадии-с, повторно растворяли в 20 мл смеси DMF/дихлорметан (1:5). К этому раствору свободного амина добавляли пропаргил-PEG4-кислоту (2,36 г, 8,98 ммоль), EDCI (2,57 г, 13,5 ммоль), HOAt (1,83 г, 13,5 ммоль) и основание Хунига (3,13 мл, 18,0 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в течение четырех часов, затем концентрировали и очищали с помощью RPLC (от 10% ACN/вода до 60% ACN/вода). Выход 4,00 г, 70% за две стадии. Ионы, найденные с помощью LCMS: [М-Воc+Н]+=534.2, [М+Н]+=634.2.
Стадия е.
Продукт, полученный на стадии-d (4,00 г, 6,31 ммоль), обрабатывали 4N НСl в диоксане (30 мл) в течение 2 часов. Избыток НСl и диоксана удаляли с помощью роторного испарителя, и остаток дополнительно сушили в высоком вакууме с получением промежуточного соединения-10 в виде соли 2 НСl. Выход 3,15 г, 99%. Ион, найденный с помощью LCMS: [М+Н]+=434.2.
Пример 100. Синтез промежуточного соединения-7а (С7-С7 изомер)
Стадия а.
Метил 5-ацетамидо-7,8,9-О-триацетил-2,6-ангидро-4-азидо-3,4,5-тридеокси-D-глицеро-D-галакто-нон-2-енонат (30 г, 65,7 ммоль) растворяли в метаноле (100 мл) и объединяли с катализатором Линдлара (15 г). Полученную смесь продували водородом и перемешивали в течение 5 часов, продувая водород через свободное пространство каждые 30 минут. После завершения реакции, как определено с помощью HPLC, катализатор фильтровали через целит. Фильтрат использовали на следующей стадии.
Неочищенный амин, полученный на предыдущей стадии (18,9 г, 43,8 ммоль), обрабатывали N,N'-бис-bос-1-гуанилпиразолом (14,3 г, 46,0 ммоль) и DIEA (9,9 мл, 57,0 ммоль) в метаноле (100 мл). Полученный раствор перемешивали при комнатной температуре до полного расходования исходного материала, как определено с помощью LCMS (-30 мин). Раствор концентрировали до пены и хранили под высоким вакуумом в течение ночи, затем использовали без дополнительной очистки на следующей стадии.
Неочищенный триацетат, полученный на предыдущей стадии (43,8 ммоль), растворяли в 100 мл сухого метанола, затем обрабатывали метоксидом натрия в метаноле (1,9 мл, 25% раствор в метаноле, 8,76 ммоль) при комнатной температуре. За ходом реакции следили с помощью LCMS, которая завершалась через 10 минут. Реакцию гасили IN НСl до рН ~7. Полученный раствор концентрировали и очищали обращенно-фазовой жидкостной хроматографией (RPLC) с использованием жидкостного хроматографа Isco COMBIFLASH®, элюируя 10-100% ацетонитрила и водой. Для этой очистки не использовали модификатор TFA. Выход продукта 15,6 г, 65%.
Стадия b.
Смесь продукта, полученного на стадии-а (5,47 г, 10 ммоль) и DMAP (1,222 г, 10 ммоль) растворяли в безводном THF (30 мл). После охлаждения на водно-ледяной бане раствор медленно обрабатывали 1,1'-карбонилдиимидазолом (2,6 г, 16 ммоль), затем перемешивали в течение 30 минут при 0°С с последующим нагреванием при 60°С в течение 2 часов. Затем его охлаждали до комнатной температуры и экстрагировали водой (50 мл) и смесью EtOAc/гексан (1:1, 100 мл). Органический слой промывали водой (50 мл × 3); сушили над Na2SO4 и концентрировали роторным испарением. Продукт в виде белой пены дополнительно сушили в высоком вакууме и переносили на следующую стадию без дополнительной очистки. Ион, найденный с помощью LCMS: [М+Н]+=573.2.
Стадия с.
Реакционную колбу, содержащую продукт, полученный на стадии-b, продували азотом под вакуумом и растворяли в безводном DCM (50 мл), затем охлаждали на бане с ледяной водой. К охлажденному раствору добавляли DMAP (4,89 г, 40 ммоль), а затем добавляли 4-нитрофенилхлорформиат (6,05 г, 30 ммоль) порциями в течение 20 минут. Раствор перемешивали при 0°С, затем нагревали до комнатной температуры в течение 1 часа. Через 1 час анализ LCMS показал присутствие исходного материала, поэтому добавляли дополнительное количество DMАР (1,22 г, 10 ммоль) и 4-нитрофенилхлорформиата (1 г, 5 ммоль). Реакцию продолжали в течение 4 часов, затем очищали на двух колонках с силикагелем (220 г, предварительно смоченные смесью 20% EtOAc и гексана) и элюировали 20-80% EtOAc и гексаном. Выход 4,42 г, 59,9% за две стадии. Ион, найденный с помощью LCMS: [М+Н]+=738.2
Стадия d.
К раствору продукта, полученного на стадии-с (3,2 г, 4,34 ммоль) в безводном DCM (3 мл) добавляли порциями в течение 30 минут смесь центрального линкера пропаргилдиамина (1,26 г, 2,5 ммоль, описанного в примере 99) и DIPEA (1,68 г, 13 ммоль) в безводном DMF (5 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов. Затем ее концентрировали и очищали с помощью RPLC (30-90% ацетонитрила в воде, без модификатора TFA). Ионы, найденные с помощью LCMS: [(М+2Н)/2]+=815.8, [(М-Воc+2Н)/2]+=765.8, [(М-2Вос+2Н)/2]+=716. Выход 3,33 г, 94.2%.
Стадия е.
Продукт, полученный на стадии-d (3,33 г, 2,04 ммоль), растворяли в DCM (5 мл) и TFA (5 мл), затем перемешивали при 35°С в течение ~ 6 часов. За реакцией следили с помощью LCMS. После завершения реакции раствор концентрировали и очищали с помощью RPLC (5-30% ацетонитрила в воде, без TFA). Ионы, найденные с помощью LCMS: [(М+2Н)/2]+=615.8, [(М+3Н)/3]+=411. Выход 2,29 г, 91,3%.
Стадия f.
Продукт, полученный на стадии-е (61,5 мг, 0,05 ммоль) растворяли в смеси МеОН/вода (1:1, 0,6 мл). После охлаждения раствора до -6°С (соль/ледяная баня) по каплям добавляли 1,0 М LiOH (0,3 мл, 0,3 ммоль) и реакционную смесь перемешивали в течение 30 минут. Затем его гасили до рН ~ 7,0 с помощью 4N НСl в растворе диоксана (75 мкл) и непосредственно очищали с помощью препаративной HPLC (Isco ACCQ prep, Luna 5 μm С18(2) 100 Å LC колонка 100 мм x 30 мм; градиент: 0% ацетонитрил/вода в течение 2 минут, затем 0%-15% ацетонитрил/вода в течение 12 минут, затем изократический режим при 15% ацетонитрила в течение 10 минут с использованием 0,1% TFA). Выход 45 мг, 65,3%. Ионы, найденные с помощью LCMS: [(М+2Н)/2]+=575.8, [(М+3Н)/3]+=384.2. Аналитическое время удерживания: 6,013 мин. Условия: колонка Phenomemex Gemini для HPLC, 3 мкм WX-C18 110 Å, 100 мм × 3 мм, элюирование в течение 25 минут градиентом 5-95% ацетонитрила и воды с использованием 0,1% TFA.
Пример 101. Синтез промежуточного соединения-7b (С7-С9 изомер)
Гетеродимер С7-С9 (промежуточное соединение-7b) получали аналогично промежуточному соединению-7а (изомер С7-С7, пример 100), за исключением того, что реакцию проводили при 0°С и контролировали с помощью HPLC (время удерживания: 6,112 мин. Условия: см. пример 100, синтез промежуточного соединения-7а и остановка, когда преобладает изомер С7-С9 (~3 ч). Этот изомер выделяли в тех же условиях, которые использовали для выделения промежуточного соединения-7а. Ионы, найденные с помощью LCMS: [(М+2Н)/2]+=575.8, [(М+3Н)/3]+=384.2.
Пример 102. Синтез промежуточного соединения-7с (С9-С9 изомер)
Промежуточное соединение-7с (изомер С9-С9) получали аналогично промежуточному соединению-7а (изомер С7-С7, пример 100), за исключением того, что реакцию проводили при 0°С и контролировали с помощью HPLC (время удерживания: 6,232 мин. Условия: см. пример 100, синтез промежуточного соединения-7а и остановлен, когда преобладает изомер С9-С9 (~6 ч). Этот изомер выделяли в тех же условиях, которые использовали для выделения промежуточного соединения-7а. Ионы, найденные с помощью LCMS: [(М+2Н)/2]+=575.8, [(М+ЗН)/3]+=384.2.
Пример 103. Синтез промежуточного соединения-7 (ацетонидный путь)
Стадия а.
Метил 5-ацетамидо-7,8,9-O-триацетил-2,6-ангидро-4-азидо-3,4,5-тридеокси-D-глицеро-D-галакто-нон-2-енонат (10,0 г, 22 ммоль) растворяли в 60 мл сухого метанола, затем обрабатывали 20 мл метоксида натрия в метаноле (0,5 М в метаноле, 10 ммоль) при охлаждении на бане с ледяной водой. За ходом реакции следили с помощью LCMS, которая завершалась через 2 часа. Затем рН реакционного раствора доводили до значения от 5 до 6 с использованием ионообменной смолы Amberlite IRN-77. Смесь фильтровали для удаления смолы и упаривали досуха в вакууме. Полученное масло использовали на следующей стадии без дополнительной очистки. Ионы, найденные с помощью LCMS: М+Н=331.1.
Стадия b.
К раствору продуктов, полученных на предыдущей стадии, в 70 мл ацетона добавляли 30 мл 2,2-диметоксипропана и п-толуолсульфоновой кислоты 1 гидрата (400 мг, 2,0 ммоль), полученный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. По истечении этого времени добавляли бикарбонат натрия (170 мг, 2,0 ммоль) и смесь концентрировали до сухого состояния. Полученный остаток использовали на следующей стадии без очистки. Ион(ы), найденный с помощью LCMS: М+Н=371.2.
Стадия с.
К раствору продукта, полученного на предыдущей стадии, в 60 мл метанола добавляли 5,0 г катализатора Линдлара. Полученную смесь продували водородом каждые 30 минут и перемешивали в течение 5 часов. После завершения реакции, как определено с помощью HPLC, катализатор отфильтровывали через целит. Фильтрат концентрировали и использовали на следующей стадии без очистки.
Неочищенный продукт, полученный на предыдущей стадии, в 60 мл THF обрабатывали N,N'-бис-bос-1-гуанилпиразолом (9,3 г, 30,0 ммоль) и DIEA (9,9 мл, 57,0 ммоль). Полученный раствор перемешивали при комнатной температуре до тех пор, пока весь исходный материал не израсходовался, как определено с помощью LCMS (4 ч). Раствор концентрировали и очищали флэш-хроматографией, элюируя смесью 20%-80% этилацетата/дихлорметан. Выход 8,8 г, 59,0% за четыре стадии. Ион(ы), найденный с помощью LCMS: М+Н 587.3.
Стадия d.
Реакционную колбу, содержащую продукт, полученный на предыдущей стадии (6,5 г, 11 ммоль), продували азотом в вакууме и растворяли в безводном дихлорметане (100 мл). После охлаждения раствора на бане с ледяной водой добавляли DMAP (4,89 г, 40 ммоль) и перемешивали до растворения, затем порциями добавляли 4-нитрофенилхлорформиат (5,58 г, 28 ммоль) при перемешивании при 0°С до комнатной температуры в течение 1 часа. Через 1 час анализ LCMS показал присутствие исходного материала, поэтому добавляли дополнительное количество DMАР (1,22 г, 10 ммоль) и 4-нитрофенилхлорформиат (1,0 г, 5 ммоль). Реакцию продолжали еще 4 часа, затем концентрировали и очищали флэш-хроматографией, элюируя смесью 20%-80% этилацетата/дихлорметан. Выход 5,1 г, 59,9%. Ион, найденный с помощью LCMS: [М+Н]+=752.2
Стадия е.
К раствору нитрофенилкарбоната, полученного на предыдущей стадии (1,8 г, 2,3 ммоль), в безводном дихлорметане (20 мл) добавляли смесь центрального линкера (0,51 г, 1,0 ммоль, добавляли порциями в течение 30 минут) и DIPEA (1,4 мл, 10 ммоль) в безводном DMF (20 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи, затем концентрировали и очищали флэш-хроматографией, элюируя смесью 0%-10% метанола/дихлорметана. Выход 1,35 г, 80%. Ионы, найденные с помощью LCMS: [(М+2Н)/2]+=830.4, [(М-Воc+2Н)/2]+=780.4, [(М -2 Вос+2Н)/2]+=730.4.
Стадия f.
Продукт, полученный на предыдущей стадии (200 мг, 0,2 ммоль), растворяли в 2 мл МеОН и 2 мл THF, затем обрабатывали раствором гидроксида лития (24 мг, 1 ммоль), растворенным в 2 мл воды. Реакционную смесь перемешивали в течение 10 минут при комнатной температуре, после чего анализ HPLC показал завершение реакции. Значение рН реакционного раствора доводили до 5-6 путем использования ионообменной смолы Amberlite IRN-77, и фильтровали для удаления смолы. Неочищенный продукт упаривали до сухого состояния под вакуумом и использовали на следующей стадии с очисткой. Ион(ы), найденный с помощью LCMS: [(М+2Н)/2]+=815.4, [(М-Воc+2Н)/2]+=765.4, [(М-2 Вос+2Н)/2]+=715.4.
Стадия g.
Продукт, полученный на стадии g (400 мг, 0,25 ммоль), растворяли в 5 мл дихлорметана и 5 мл TFA, и полученный реакционный раствор перемешивали при комнатной температуре. За ходом реакции следили с помощью LCMS. После завершения реакции (6 ч) раствор упаривали до сухого состояния, и затем растворяли в 4 мл воды и 4 мл ацетонитрила. Полученный раствор перемешивали еще в течение 2 часов при комнатной температуре, при которой анализ LCMS показал полную депротекцию ацетонидных защитных групп. Эту смесь концентрировали и очищали обращенно-фазовой жидкостной хроматографией (RPLC) с использованием жидкостного хроматографа Isco COMBIFLASH®, элюируя смесью 5-40% ацетонитрил/вода с 0,1% TFA в качестве модификатора. Выход 270 мг, 68,0%. Ионы, найденные с помощью LCMS: [(М+2Н)/2]+=575.8, [(М+3Н)/3]+=384.2.
Пример 104. Результаты ЯМР для промежуточного соединения-7а, промежуточного соединения-7b и промежуточного соединения-7с
1H NMR (500 MHz, Метанол-d4) δ 5.91-5.89 (m, 2H), 5.00-4.96 (m, 2H), 4.58-4.53 (m, 2H),4.42-4.37(m, 2H), 4.20-4.17 (m, 6H), 4.02-3.97 (m, 2H), 3.78-3.49 (m, 28H), 3.29-3.18 (m, 4H), 2.86 (t,J=2.6 Hz, 1H), 2.85-2.72 (m, 2H), 1.96 (s, 3H), 1.95 (s, 3H).
13C NMR (125 MHz, MeOD) δ 171.73, 170.80, 170.29, 161.95, 156.06, 155.08, 154.99, 144.07, 143.93, 116.41, 114.10, 106.03, 105.86, 77.71, 74.46, 73.22, 68.62, 68.54, 68.50, 68.38, 68.12, 68.00, 67.94, 67.67, 67.64, 67.53, 67.20, 66.96, 65.44, 61.53, 56.17, 49.74, 49.64, 47.37, 45.17, 39.16, 39.06, 31.73, 19.96, 19.92.
ЯМР промежуточного соединения-7b
1H NMR (500 MHz, Метанол-d4) δ 5.91-5.87 (m, 2H), 5.04-4.95 (m, 1H), 4.58-4.48 (m, 2H), 4.45-4.37 (m, 3H), 4.20-4.10 (m, 5H), 4.08-3.98 (m, 2H), 3.79-3.44 (m, 29H), 3.29-3.18 (m, 4H), 2.88-2.70 (m, 3H), 2.02 (s, 3H), 1.96-1.94 (m, 3H).
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ: 8.28 (d, J=8.4 Hz, 2H, -NH), 7.98 (d, J=11.5 Hz, 2H, -NH), 7.78 (d, J=8.7 Hz, 2H, -NH), 7.60 (t, J=8.5 Hz, 2H, -NH), 7.20 (bs, 2H, -NH), 7.06 (bs, 2H, -NH), 5.69 (bs, 1H), 5.67 (d, J=2.4 Hz, 1H), 4.83 (dd, J=9.2, 2.2 Hz, 1H), 4.45 (dt, J=9, 2.5 Hz, 1H), 4.37 (d, J=2.2 Hz, 1H), 4.33-4.24 (m, 2H), 4.13 (d, J=2.5 Hz, 2H), 4.05-4.32 (m, 41H), 3.23 (m, 1H), 3.15-3.09 (m, 2H), 3.06-3.02 (m, 2H), 2.59 (t, J=6.7 Hz, 2H), 1.91 (s,3H), 1.78 (s, 3H).
13C NMR (125 MHz, MeOD) δ:173.19, 172.98, 172.25, 171.75, 164.26, 163.82, 157.88, 157.55, 156.51, 146.09, 107.21, 106.93, 106.59, 79.22, 76.19, 75.92, 74.72, 74.68, 70.12, 70.08, 70.03, 69.99, 69.92, 69.88, 69.66, 69.48, 69.12, 69.01, 68.94, 68.73, 68.69, 68.50, 68.19, 67.08, 66.93, 66.79, 63.04, 57.68, 51.24, 51.15, 50.13, 48.87, 48.72, 46.72, 46.58, 46.23, 40.64, 40.41, 33.21, 21.49, 21.45, 21.40.
ЯМР промежуточного соединения -7c
1H NMR (500 MHz, Метанол-d4) δ: 5.88 (d, J=2.6 Hz, 2H), 4.50 (dt, J=8.5, 2.7 Hz, 2H), 4.43 (ddd, J=9.7, 3.9, 1.5 Hz, 2H), 4.39 (dd, J=11.5, 2.4 Hz, 2H), 4.25-4.16 (m, 2H), 4.19 (d, J=2.4 Hz, 2H), 4.13 (dt, J=11.5, 5.9 Hz, 2H), 4.05 (m, 2H), 3.77 (t, J=6.2 Hz, 2H), 3.72-3.55 (m, 22H), 3.51 (m, 4H), 3.35-3.23 (m, 4H), 2.86 (t, J=2.4 Hz, 1H), 2.74 (t, J=6.2 Hz, 2H), 2.02 (s, 6H).
13C NMR (125 MHz, MeOD) δ:173.03, 163.76, 157.89, 157.54, 145.60, 107.21, 79.28, 76.29, 74.70, 70.11, 70.07, 70.03, 69.92, 69.70, 69.47, 68.96, 68.89, 68.72, 68.54, 68.19, 67.05, 66.75, 57.69, 50.09, 48.69, 48.08, 46.10, 40.44, 40.38, 33.23, 21.42.
Пример 105. Синтез промежуточного соединения-60
Стадия а.
К перемешиваемому при 0°С раствору предварительно приготовленного эфира-кислоты занамивира (1,00 г, 1,586 ммоль, пример 31), гидрохлорида 2-азидоэтиламина (213 мг, 1,744 ммоль) и DIPEA (1,105 мл, 6,343 ммоль) в DMF (8,0 мл) добавляли HATU (615 мг, 1,618 ммоль). Температуру повышали до температуры окружающей среды и перемешивание продолжали до завершения реакции. Все летучие вещества удаляли вакуумными методами. Остаток поглощали в этилацетате, промывали 1 М водным раствором серной кислоты (1 × 50 мл), затем насыщенным водным раствором бикарбоната натрия (3 × 20 мл) и солевым раствором (1 × 50 мл). Полученные органические слои сушили сульфатом магния, фильтровали и все летучие вещества удаляли вакуумными методами. Таким образом получали 816 мг желаемого промежуточного азида с высокой чистотой и использовали на следующей стадии без какой-либо дополнительной очистки. (Ион, найденный с помощью LCMS: [М+Н]+=699.2). К перемешиваемому раствору описанного неочищенного продукта (816 мг, 1,168 ммоль), дипропаргиламина (54 мг, 0,584 ммоль), трис((1-бензил-4-триазолил)-метил)амина (31 мг, 0,058 ммоль) и аскорбата натрия (58 мг, 0,292 ммоль) в этаноле (10 мл) и воде (5 мл) добавляли сульфат меди (10 мг, 0,061 ммоль). По завершении добавляли поглотитель меди SiliaMetS TAAcONa (300 мг, нагрузка 0,45 ммоль/г) и перемешивание продолжали в течение 1 ч. Смесь фильтровали с помощью дихлорметана. Фильтрат промывали насыщенным раствором бикарбоната натрия. Водный слой дополнительно промывали дихлорметаном (3 раза). Объединенные органические слои сушили сульфатом магния, фильтровали и концентрировали. Остаток очищали на колонке с диоксидом кремния, используя жидкостную хроматографию с помощью Isco COMBIFLASH®, элюируя 0%-100% гексана в этилацетате, а затем 0%-30% дихлорметана. Выход 817 мг, выход 94%. Ионы, найденные с помощью LCMS: [(М+2Н)/2]+=745.8, [(М+3Н)/3]+=497.5.
Стадия b.
К перемешиваемому при 0°С раствору продукта, полученного на стадии-а (817 мг, 0,548 ммоль), пропаргил-РЕG4-кислоты (185 мг, 0,712 ммоль) и DIPEA (286 мкл, 1,644 ммоль) в DMF (7,0 мл) добавляли HATU (212 мг, 0,544 ммоль). Температуру повышали до комнатной и перемешивание продолжали до завершения. Все летучие вещества удаляли вакуумными методами. Остаток очищали с помощью HPLC (0-90% метанола в воде). Выход 520 мг, 56%. Ионы, найденные с помощью LCMS: [(М+2Н)/2]+=866.8, [(М+3Н)/3]+=578.4.
Стадия с.
Перемешиваемый раствор соединения, полученного на стадии-Ь (520 мг, 0,300 ммоль) в 2-метил-2-бутене (0,25 мл), дихлорметане (4,0 мл) и TFA (2,0 мл) перемешивали до прекращения выделения газа. Все летучие вещества удаляли вакуумными методами. Остаток очищали с помощью HPLC (0-30% метанола в воде, используя 0,1% TFA в качестве модификатора). Выход 221 мг, 47%. Ионы, найденные с помощью LCMS: [(М+2Н)/2]+=666.8, [(М+3Н)/3]+=444.8.
Стадия d.
К перемешиваемому при 0°С раствору продукта, полученного на стадии-с (221 мг, 0,142 ммоль) в воде (3,0 мл) добавляли гидроксид лития (20 мг, 0,850 ммоль). Реакцию гасили уксусной кислотой (120 мкл) и все летучие вещества удаляли вакуумными методами. Остаток очищали с помощью HPLC (0-20% метанола в воде, используя 0,1% TFA в качестве модификатора). Выход 130 мг, 62%. Ионы, найденные с помощью LCMS: [(М+2Н)/2]+=626.8, [(М+3Н)/3]+=418.2.
Пример 106. Синтез конъюгата 29
Раствор азидо-функционализированного агликозилированного Fc (SEQ ID NO: 35) в буферном растворе x1 PBS при рН 7,4 (100 мг, 10 мл, 1,874 мкмоль) добавляли в центрифужную пробирку, содержащую дериватизир о ванную алкином малую молекулу (17 мг, 0,0112 ммоль; пример 105, промежуточное соединение-60), сульфат меди (4 мг, 0,0225 ммоль), трис(3-гидроксипропилтриазолилметил)амин (39 мг, 0,0900 ммоль) и аскорбат натрия (7,4 мг, 0,375 ммоль) в буферном растворе x1 PBS при рН 7,4 (10,50 мл). Полученную смесь осторожно встряхивали в течение ночи. Его очищали аффинной хроматографией на колонке с белком А с последующей эксклюзионной хроматографией (см. пример 10). Анализ Maldi TOF очищенного конечного продукта показал среднюю массу 56938 Да (DAR=2,3). Выход 49,9 мг, выход 49%.
Пример 107. Синтез промежуточного соединения-65
Стадия а.
К перемешиваемому при 0°С раствору полученного ранее эфир-занамивир-кислоты (2,00 г, 3,172 ммоль, пример 31) и 4-метилморфолина (0,628 мл, 5,709 ммоль) в тетрагидрофуране (30 мл) добавляли изобутилхлорформиат (0,617 мл, 4,7574 ммоль). Через 10 минут температуру повышали до комнатной и продолжали перемешивание в течение 20 минут. Температуру снова снижали до 0°С и одной порцией добавляли борогидрид натрия (360 мг, 9,515 ммоль) с последующим добавлением по каплям (10 мл) в течение 5 минут. По завершении реакцию гасили уксусной кислотой (2,860 мл, 50 ммоль), и через 5 минут температуру повышали до комнатной, при этом перемешивание продолжали до прекращения выделения газа. Все летучие вещества выпаривали, остаток суспендировали в дихлорметане и фильтровали. Фильтрат концентрировали и остаток очищали на колонке с диоксидом кремния с использованием жидкостной хроматографии при помощи Isco COMBIFLASH®, элюируя 20%-100% гексанами и этилацетатом, используя 3% метанол в качестве модификатора. Выход 1,302 г, выход 66%. Ионы, найденные с помощью LCMS: [(М+Н)]+=617.2.
Стадия b.
К перемешиваемому при 0°С раствору продукта, полученного на стадии-а (1,25 г, 2,027 ммоль), и DIPEA (1,095 мл, 6,284 ммоль) в дихлорметане (15 мл) добавляли метансульфонилхлорид (0,314 ммоль, 4,054 ммоль). После завершения реакционную смесь обрабатывали водой (15 мл). Слои разделяли, и слой дихлорметана сушили рассолом, затем сульфатом магния и фильтровали. Раствор концентрировали, остаток растворяли в DMF (10 мл) и добавляли азид натрия (264 мг, 4,054 ммоль) при повышении температуры до 50°С. Завершение наблюдалось через 18 ч, и все летучие вещества выпаривали вакуумными метоами. Остаток очищали на колонке с диоксидом кремния, используя жидкостную хроматографию при помощи Isco COMBIFLASH®, элюируя градиентом от 20% до 100% гексанов в этилацетате, используя 3% метанол в качестве модификатора. Выход 767 мг, выход 59%. Ионы, найденные с помощью LCMS: [(М+Н)]+=642.2.
Стадия с.
К перемешиваемому раствору продукта, полученного на стадии-b (496 мг, 0,773 ммоль), дипропаргиламина (36 мг, 0,386 ммоль), трис((1-бензил-4-триазолил)метил)-амина (41 мг, 0,077 ммоль) и аскорбата натрия (115 мг, 0,580 ммоль) в этаноле (16 мл) и воде (8 мл), добавляли сульфат меди (13 мг, 0,081 ммоль). После завершения добавляли поглотитель меди SiliaMetS TAAcONa (600 мг, нагрузка 0,45 ммоль/г) и перемешивание продолжали в течение 1 ч. Смесь фильтровали с помощью дихлорметана. Фильтрат промывали насыщенным раствором бикарбоната натрия. Водный слой дополнительно промывали дихлорметаном (3 раза). Объединенные органические слои сушили сульфатом магния, фильтровали и все летучие вещества выпаривали в вакууме. К перемешиваемому при 0°С раствору остатка, пропаргил-PEG4-кислоты (151 мг, 0,580 ммоль)) и DIPEA (337 мкл, 1,933 ммоль) в DMF (10,0 мл) добавляли HATU (220 мг, 0,580 ммоль). Температуру повышали до комнатной и перемешивание продолжали до завершения. Все летучие вещества удаляли вакуумными методами. Остаток очищали с помощью HPLC (от 0 до 90% метанола в воде). Выход 457 мг, 73%. Ионы, найденные с помощью LCMS: [(М+2Н)/2]+=809.8, [(М+2Н-Вос)/2]+=759.8.
Стадия d.
Перемешиваемый раствор соединения, полученного на стадии-с (451 мг, 0,279 ммоль) в 2-метил-2-бутене (0,25 мл), дихлорметане (4,0 мл) и TFA (2,0 мл) перемешивали до прекращения выделения газа. Все летучие вещества удаляли вакуумными методами. Ионы, найденные с помощью LCMS: [(М+2Н)/2]+=609.8, [(М+3Н)/3]+=407.0. К перемешиваемому при 0°С раствору остатка в тетрагидрофуране (6 мл) и воде (6 мл) добавляли гидроксид лития (240 мг, 10,03 ммоль). По завершении реакцию гасили уксусной кислотой (0,638 мл, 11,14 ммоль) и все летучие вещества удаляли вакуумными методами. Остаток очищали с помощью HPLC (от 0 до 90% метанола в воде, используя 0,1% TFA в качестве модификатора). Выход 209 мг, 67%. Ионы, найденные с помощью LCMS: [(М+2Н)/2]+=569.8, [(М+2Н-Вос)/2]+=380.3.
Пример 108. Синтез конъюгата 30
Раствор азидо-функционализированного агликозилированного Fc (пример 7, SEQ ID NO: 35) в буферном растворе x1 PBS при рН 7,4 (50 мг, 5 мл, 1,874 мкмоль) добавляли в центрифужную пробирку, содержащую дериватизированную алкином небольшую молекулу (8,7 мг, 0,0064 ммоль, промежуточное соединение-65), сульфат меди (2 мг, 0,013 ммоль), трис(3-гидроксипропилтриазолилметил)амин (22 мг, 0,0508 ммоль) и аскорбат натрия (25 мг, 0,127 ммоль) в буферном растворе x1 PBS при рН 7,4 (9,50 мл). Полученную смесь осторожно встряхивали в течение ночи. Его очищали аффинной хроматографией на колонке с белком А с последующей эксклюзионной хроматографией (см. пример 10). Анализ Maldi TOF очищенного конечного продукта показал среднюю массу 61548 Да (DAR=2,4). Выход 32,33 мг, выход 67%.
Пример 109: Синтез промежуточного соединения занамивнра п-нитрофенилкарбоната
Промежуточное соединение занамивира триацетокси-азидо (10,0 г, 22 ммоль) растворяли в 60 мл сухого метанола, затем обрабатывали 20 мл метоксида натрия в метаноле (0,5 М в метаноле, 10 ммоль) при охлаждении на бане со льдом и водой. За ходом реакции следили с помощью LCMS, которая завершалась через 2 часа. Затем значение рН реакционного раствора доводили до 5-6 с использованием ионообменной смолы Amberlite IRN-77. Смесь фильтровали для удаления смолы и упаривали до сухого состояния под вакуумом. Полученное масло использовали на следующей стадии без дополнительной очистки. Ион(ы), найденный с помощью LCMS: М+Н=331.1.
Стадия b.
К раствору полученных на предыдущей стадии продуктов в 70 мл ацетона добавляли 30 мл 2,2-диметоксипропана и п-толуолсульфоновой кислоты 1 гидрат (400 мг, 2,0 ммоль), полученный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. По истечении этого времени добавляли бикарбонат натрия (170 мг, 2,0 ммоль) и смесь концентрировали до сухого состояния. Полученный остаток использовали на следующей стадии без очистки. Ион(ы), найденный с помощью LCMS: М+Н=371.2.
Стадии c и d
К раствору полученного на предыдущей стадии продукта в 60 мл метанола добавляли 5,0 г катализатора Линдлара. Полученную смесь продували водородом каждые 30 минут и перемешивали в течение 5 часов. После завершения реакции, определенного с помощью HPLC, катализатор отфильтровывали через целит. Фильтрат концентрировали и использовали на следующей стадии без очистки.
Неочищенный продукт, полученный на предыдущей стадии, в 60 мл THF обрабатывали N,N'-бис-bос-1-гуанилпиразолом (9,3 г, 30,0 ммоль) и DIEA (9,9 мл, 57,0 ммоль). Полученный раствор перемешивали при комнатной температуре до полного расходования всего исходного материала по данным LCMS (4 ч). Раствор концентрировали и очищали флэш-хроматографией, элюируя градиентом от 20% до 80% этилацетата в дихлорметане. Выход 8,8 г, 59,0% за четыре стадии. Ион(ы), найденный с помощью LCMS: М+Н 587.3.
Стадия е.
Реакционную колбу, содержащую полученный на предыдущей стадии продукт (6,5 г, 11 ммоль), продували азотом в вакууме и растворяли в безводном дихлорметане (100 мл). После охлаждения раствора на бане с ледяной водой, добавляли DMAP (4,89 г, 40 ммоль) и перемешивали до растворения, затем порциями добавляли 4-нитрофенилхлорформиат (5,58 г, 28 ммоль) при перемешивании при температуре от 0°С до комнатной температуры в течение 1 часа. Анализ LCMS показал присутствие исходного продукта через 1 час, поэтому добавляли дополнительное количество DMAP (1,22 г, 10 ммоль) и 4-нитрофенилхлорформиата (1,0 г, 5 ммоль). Реакцию продолжали еще в течение 4 часов, затем реакционную смесь концентрировали и очищали флэш-хроматографией, элюируя градиентом от 20% до 80% этилацетата в дихлорметане. Выход 5,1 г, 59,9%. Ион, найденный с помощью LCMS: [М+Н]+=752.2.
Пример 110. Синтез промежуточного соединения-71
Стадия а.
К раствору 2-(2-Вос-аминоэтокси)этанола (6,15 г, 30 ммоль) в безводном DCM (60 мл) добавляли DIPEA (7,8 г, 60 ммоль) и DMAP (366,6 мг, 3 ммоль). Затем порциями в течение 30 минут добавляли п-толуолсульфонилхлорид (6,86 г, 36 ммоль). После перемешивания полученной смеси в течение 3 дней ее концентрировали на роторном испарителе и очищали с помощью RPLC (20-70% ацетонитрил/вода). Выход 3,71 г, 34,4%. Ион, найденный с помощью LCMS: [М -Воc+Н]+=260.
Стадия b.
К раствору продукта, полученного на стадии-а (2,1 г, 5,83 ммоль) в безводном THF (10 мл) добавляли карбонат натрия (1,24 г, 11,7 ммоль) и 1Ч-Вос-1,4-диаминобутан (1,32 г, 7 ммоль). Полученную смесь нагревали при 60°С в течение 1 дня. Затем соль отфильтровывали и фильтрат концентрировали на роторном испарителе. Остаток очищали с помощью RPLC (100 г, 5-50% ацетонитрила в воде). Выход 1,94 г, 88,6%. Ион, найденный с помощью LCMS: [М+Н]+=376.0.
Стадия с.
К раствору пропаргил-PEG-4-кислоты (781 мг, 3 ммоль) и HATU (1,14 г, 3 ммоль) в безводном DMF (3 мл) добавляли DIPEA (390 мг, 3 ммоль) с последующим добавлением полученного на стадии b раствора продукта (940 мг, 2,5 ммоль) и DIPEA (390 мг, 3 ммоль) в безводном DMF (3 мл). Реакционную смесь перемешивали в течение 30 минут, затем очищали непосредственно с помощью RPLC (5-80% ацетонитрила в воде, используя 0,1% TFA в качестве модификатора). Выход 960,2 мг, 65,3%. Ион, найденный с помощью LCMS: [М+Н]+=618.3, [М-Воc+Н]+=518.3.
Стадия d.
Продукт, полученный на стадии-с (960,2 мг, 1,63 ммоль), растворяли в безводном THF (6 мл). Добавляли 4N раствор НСl в диоксане (4 мл) и реакционную смесь перемешивали в течение ночи. Затем его концентрировали на роторном испарителе. Остаток экстрагировали водой (3x3 мл) и этилацетатом (10 мл). Объединенные водные слои лиофилизировали. Выход 760 мг, 95,1%. Ион, найденный с помощью LCMS: [М+Н]+=418.0.
Стадия е.
К смеси полученного на стадии d продукта (556,2 мг, 1,13 ммоль) и DIPEA (741 мг, 5,7 ммоль) в безводном DMF (3 мл) порциями добавляли п-нитрофенилкарбонат занамивира (1,67 г, 2,26 ммоль, как описано в примере 109) в течение 20 минут. Реакционную смесь перемешивали в течение 1 часа, затем очищали непосредственно с помощью RPLC (30-90% ацетонитрил/вода, используя 0,1% TF А в качестве модификатора). Выход 1,35 г, 74%. Ион, найденный с помощью LCMS: [(М+2Н)/2]+=807.9.
Стадия f.
Продукт, полученный на стадии-е (1,35 г, 0,836 ммоль) растворяли в TFA (5 мл). Реакционную смесь нагревали при 30°С в течение 1 часа, ее очищали непосредственно с помощью RPLC (0-35% ацетонитрил/вода, используя 0,1% TFA в качестве модификатора). Выход 1,00 г, 82,9%. Ионы, найденные с помощью LCMS: [(М+2Н)/2]+=607.8.
Стадия g.
Продукт, полученный на стадии f (1,00 г, 0,693 ммоль), растворяли в МеОН (12 мл), затем охлаждали на бане с ледяной водой. Затем его обрабатывали раствором моногидрата LiOH (286 мг, 6,6 ммоль) в воде (9 мл). Полученную смесь перемешивали в течение ночи и затем подкисляли 4N раствором НСl в диоксане (2 мл). После удаления органических растворителей на роторном испарителе остаток очищали препаративной HPLC (Isco ACCQ Prep, Luna 5 мкм C18(2), 100 Å, LC колонка 100 мм × 30 мм; градиент: 0% ацетонитрил/вода в течение 2 мин, затем 0-15% ацетонитрил/вода в течение 12 минут, затем изократический режим при 15% ацетонитрила в течение 10 минут с использованием 0,1% TFA). Выход 275,9 мг, 29,2%. Ионы, найденные с помощью LCMS: [(М+2Н)/2]+=567.8, [(М+3Н)/3]+=378.9.
Пример 111. Синтез конъюгата 31
В стерильную центрифужную пробирку объемом 15 мл загружали аскорбат натрия (68,1 мг, 0,344 ммоль), ТНРТА (14,9 мг, 0,0344 ммоль), дериватизированную алкином малую молекулу (17,5 мг, 0,00953 ммоль, описанную в примере 110) и буфер PBS 7,4 (1 мл). После перемешивания на вортексе для растворения всех компонентов добавляли Peg-4-азидо-Рс (50 мг, 0,0008588 ммоль, описанный в примере 7 SEQ ID No. 18), а затем раствор CuSO4 (2,05 мг, 0,0129 ммоль) в PBS (0,5 мл). Смесь осторожно вращали в течение 20 часов, затем очищали аффинной хроматографией на колонке с белком А с последующей эксклюзионной хроматографией. Анализ Maldi TOF очищенного конечного продукта показал среднюю массу 63586 Да (DAR=3,8). Выход 32,8 мг, выход 66%.
Пример 112. Синтез промежуточного соединения-72
Стадия а.
К раствору N-Вос-1,4-диаминобутана (1,56 г, 8,28 ммоль) в безводном DMF (7 мл) добавляли карбонат натрия (742 мг, 7 ммоль) и 5-(Вос-амино)-1-пентилбромид (1,73 г, 6,5 ммоль). Полученную смесь нагревали при 50°С в течение 24 часов. Затем соль отфильтровывали и фильтрат концентрировали на роторном испарителе. Остаток очищали с помощью RPLC (5-50% ацетонитрил/вода, используя 0,1% TFA в качестве модификатора). Выход 2 г, 63,2%. Ион, найденный с помощью LCMS: [М+Н]+=374.4.
Стадия b.
К раствору пропаргил-PEG-4 -кислота (1,3 г, 5 ммоль) и HATU (2,1 г, 5,5 ммоль) в безводном DMF (6 мл) добавляли DIPEA (1,3 г, 10 ммоль). Через 5 минут реакционную смесь добавляли к продукту, полученному на стадии-а (2 г, 4,1 ммоль), и перемешивали в течение 1 часа. Затем его непосредственно очищали с помощью RPLC (5-80% ацетонитрил/вода, используя 0,1% TFA в качестве модификатора). Выход 2.34 г, 95%. Ион, найденный с помощью LCMS: [М+Н]+=616.4, [М-Воc+Н]+=516.4.
Стадия с.
Продукт, полученный на стадии-b (2,34 г, 3,8 ммоль), растворяли в безводном THF (12 мл). Добавляли 4N раствор НСl в диоксане (10 мл) и реакционную смесь перемешивали в течение ночи. Затем его концентрировали на роторном испарителе. Остаток повторно растворяли в смеси ацетонитрил/вода (1:1, -16 мл) и раствор лиофилизировали. Неочищенный продукт без дополнительной очистки переносили на следующую стадию. Выход 1,91 г, количественный выход. Ион, найденный с помощью LCMS: [М+Н]+=416.4.
Стадия d.
К раствору п-нитропенилкарбоната занамивира (2,25 г, 3,05 ммоль, описанного в примере 109) в безводном DCM (3 мл) порциями добавляли смесь продукта, полученного на стадии-с (610 мг, 1,249 ммоль), и DIPEA (1,05 г, 8,1 ммоль) в безводном DMF (4 мл) в течение 20 минут. После перемешивания в течение 1 часа реакционную смесь концентрировали и очищали с помощью RPLC (30-80% ацетонитрил/вода, используя 0,1% TFA в качестве модификатора). Выход 1,73 г, 85,9%. Ион, найденный с помощью LCMS: [(М+2Н)/2]+=806.8, [(М-Воc+2Н)/2]+=756.8.
Стадия е.
Продукт, полученный на стадии-d (1,73 г, 1,073 ммоль), растворяли в TFA (5 мл). После нагревания раствора при 30°С в течение 3 часов его очищали непосредственно с помощью RPLC (0-35% ацетонитрил/вода, используя 0,1% TFA в качестве модификатора). Выход 1,176 г, 76,1%. Ионы, найденные с помощью LCMS: [(М+2Н)/2]+=606.8, [(М+3Н)/3]+=405.
Стадия f.
Продукт, полученный на стадии-е (1,176 г, 0,817 ммоль), растворяли в МеОН (12 мл) и раствор охлаждали на бане с ледяной водой. Его обрабатывали путем добавления по каплям раствора моногидрата LiOH (344,4 мг, 8,2 ммоль) в воде (9 мл). Полученную смесь перемешивали в течение ночи и затем подкисляли 4N раствором НСl в диоксане (2 мл). После удаления органических растворителей с помощью роторного испарителя остаток очищали препаративной ВЭЖХ (Isco ACCQ prepare, Luna 5 мкм C18 (2) 100 Å LC колонка 100 мм × 30 мм; градиент: 0% ацетонитрил/вода в течение 2 минут, затем 0-15% ацетонитрил/вода в течение 12 минут, затем изократический режим при 15% ацетонитрила в течение 10 минут с использованием 0,1% TFA). Выход 108 мг, 9,7%. Ионы, найденные с помощью LCMS: [(М+2Н)/2]+=566.8, [(М+3Н)/3]+=378.2.
Пример 113. Синтез конъюгата 32
В стерильную центрифужную пробирку объемом 15 мл загружали аскорбат натрия (68,1 мг, 0,344 ммоль), ТНРТА (14,9 мг, 0,0344 ммоль), продукт из примера 112, промежуточное соединение-72 (17,5 мг, 0,00953 ммоль) и PBS 7,4 (1 мл). После перемешивания на вортексе для растворения всех компонентов добавляли азидо-Fc (50 мг, 0,0008588 ммоль, описанный в примере 7 с SEQ ID NO: 4), а затем раствор CuSO4 (2,05 мг, 0,0129 ммоль) в PBS (0,5 мл). Смесь вращали 20 часов. Ее очищали аффинной хроматографией на колонке с белком А с последующей эксклюзионной хроматографией. Анализ Maldi TOF очищенного конечного продукта показал среднюю массу 63588. Да (DAR=3,8). Выход 30,9 мг, выход 62%.
Пример 114. Синтез промежуточного соединения-73
Стадия а.
К раствору п-нитрофенилкарбоната занамивира (698,4 мг, 0,95 ммоль, описанного в примере 109) в безводном DCM (2 мл) добавляли порциями в течение 10 минут смесь центрального линкера пропаргилдиамина (209 мг, 0,426 ммоль, описанного в примере 110) и DIPEA (330,8 мг, 2,56 ммоль) в безводном DMF (2 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа. Затем ее концентрировали и очищали с помощью RPLC (30-85% ацетонитрил/вода, без модификатора TFA). Выход 531 мг, 69,2%. Ионы, найденные с помощью LCMS: [(М+2Н)/2]+=807.8, [(М-Воc+2Н)/2]+=757.8.
Стадия b.
Продукт, полученный на стадии-b (531 мг, 0,329 ммоль), растворяли в DCM (1,5 мл) и TFA (1,5 мл), затем перемешивали при 35°С в течение 3 часов. Его концентрировали и очищали с помощью RPLC (5-30% ацетонитрил/вода, без модификатора TFA). Выход 387 мг, 97,1%. Ионы, найденные с помощью LCMS: [(М+2Н)/2]+=607.6, [(М+3Н)/3]+=405.4.
Стадия с.
Продукт, полученный на стадии-b (121,4 мг, 0,1 ммоль), растворяли в 1,0 М растворе NaCl (3 мл) и ацетонитриле (1 мл). После охлаждения раствора до -8°С (баня с ледяной солью) по каплям добавляли 1,0 М NaOH (0,4 мл, 0,4 ммоль) и реакционную смесь перемешивали при температуре от -14°С до -8°С в течение 6 часов. Затем ее нейтрализовали раствором 4N НСl в диоксане (100 мкл) и непосредственно очищали препаративной HPLC (Isco ACCQ Prep, Luna 5 мкм C18(2) 100 Å LC колонка 100 мм x 30 мм; градиент: 0% ацетонитрила в вода в течение 2 мин, затем от 0% до 17,8% ацетонитрила в воде в течение 12 минут, затем в изократическом режиме при 17,8% ацетонитрила в течение 10 минут с использованием 0,1% TFA). Выход 85,5 мг, 62,8%. Ионы, найденные спомощью LCMS: [(М+2Н)/2]+=567.8, [(М+3Н)/3]+=378.9.
Пример 115. Синтез промежуточного соединения-74
Стадия а.
К раствору N-Вос-2-(2-аминоэтокси)этиламина (1,2 г, 5 ммоль) в безводном DMF (5 мл) добавляли карбонат натрия (691 мг, 5 ммоль) и N-Boc-6-бром-гексиламин (1,4 г, 5 ммоль). Полученную смесь нагревали при 70°С в течение 24 часов. Затем соль отфильтровывали и фильтрат концентрировали на роторном испарителе. Остаток очищали с помощью RPLC (градиент от 5% до 50% ацетонитрила в воде, используя 0,1% TFA в качестве модификатора). Выход 444 мг, 22%. Ион, найденный с помощью LCMS: [М+Н]+=404.3.
Стадия b.
К раствору пропаргил-PEG-4-кислоты (342,6 мг, 1,32 ммоль) и HATU (601,5 мг, 1,58 ммоль) в безводном DMF (2 мл) добавляли DIPEA (258 мг, 2 ммоль). Через 5 минут реакционную смесь добавляли к продукту, полученному на стадии-а (444,3 мг, 0,858 ммоль) и перемешивали в течение 1 часа. Затем ее непосредственно очищали с помощью RPLC (градиент от 5% до 80% ацетонитрила в воде, используя 0,1% TFA в качестве модификатора). Выход 297,1 мг, 53,6%. Ион, найденный с помощью LCMS: [М+Н]+=646.2, [М-Воc+Н]+=546.2.
Стадия с.
Продукт, полученный на стадии-b (297,1 мг, 0,46 ммоль), растворяли в безводном THF (2 мл). Добавляли 4N раствор НСl в диоксане (4 мл) и реакционную смесь перемешивали в течение ночи. Затем ее концентрировали на роторном испарителе и очищали препаративной HPLC (от 5% до 50% ацетонитрила в воде, используя 0,1% TFA в качестве модификатора). Выход 239,6 мг, 77,3%. Ион, найденный с помощью LCMS: [М+Н]+=446.2.
Стадия d.
К раствору п-нитрофенилкарбоната занамивира (523,8 мг, 0,71 ммоль, описанного в примере 2) в безводном DCM (2 мл) добавляли порциями в течение 10 минут смесь продукта, полученного на стадии-с (239,6 мг, 0,356 ммоль) и DIPEA (245,5 мг, 1,9 ммоль) в безводном DMF (2 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа. Затем ее концентрировали и очищали с помощью RPLC (от 30% до 85% ацетонитрила в воде, без модификатора TFA). Выход 553 мг, 96,5%. Ионы, найденные с помощью LCMS: [(М+2Н)/2]+=821.8, [(М-Воc+2Н)/2]+=771.8.
Стадия е.
Продукт, полученный на стадии d (553 мг, 0,343 ммоль), растворяли в DCM (1,5 мл) и TFA (1,5 мл), затем перемешивали при 35°С в течение 3 часов. Его концентрировали и очищали с помощью RPLC (от 5% до 30% ацетонитрила в воде, без модификатора TFA). Выход 424,6 мг, 99,6%. Ионы, найденные с помощью LCMS: [(М+2Н)/2]+=621.6, [(М+3Н)/3]+=415.0.
Стадия f.
Продукт, полученный на стадии-е (424,6 мг, 0342 ммоль) растворяли в 1,0 М растворе NaCl (4 мл) и ацетонитриле (4 мл). После охлаждения раствора до -11°С (баня с ледяной солью) по каплям добавляли 1,0 М NaOH (1,53 мл, 1,53 ммоль) и реакционную смесь перемешивали при температуре от -14°С до -8°С в течение 6 часов. Затем реакционную смесь гасили 4N НСl в растворе диоксана (375 мкл) и непосредственно очищали препаративной HPLC (Isco ACCQ Prep, Luna 5 мкм С 18(2) 100 Å ЖХ колонка 100 мм × 30 мм; градиент: 0% ацетонитрила в воде в течение 2 мин, затем от 0% до 20,9% ацетонитрила в воде в течение 13,6 мин, затем в изократическом режиме при 20,9% ацетонитрила в течение 10 мин с использованием 0,1% TFA). Выход 439 мг, 92,3%. Ионы, найденные с помощью LCMS: [(М+2Н)/2]+=581.8, [(М+3Н)/3]+=388.2.
Пример 116. Синтез промежуточного соединения-75
Стадия а.
Смесь трет-бутил (4-оксобутил)карбамата (850 мг, 4,54 мг) и трет-бутил N-{2-[2-(2-аминоэтокси)этокси]этил}карбамата (1,99 г, 8 ммоль) растворяли в DCM (30 мл) и сушили над Na2SO4. После фильтрации и концентрирования остаток повторно растворяли в безводном DCM (20 мл). Добавляли уксусную кислоту (641 мг, 11 ммоль), а затем порциями триацетоксиборгидрид натрия (3,4 г, 16 ммоль) в течение 1 часа. Реакционную смесь перемешивали в течение ночи, затем гасили АсОН (3 мл) и МеОН (10 мл). Смесь фильтровали, и фильтрат концентрировали роторным испарением и очищали с помощью RPLC (от 5% до 45% ацетонитрила в воде). Выход 618 мг, 32,5%. Ион, найденный с помощью LCMS: [М+Н]+=420.4.
Стадия b.
Это соединение получали аналогично продукту, полученному на стадии-b из примера 115. Ионы, найденные с помощью LCMS: [М+Н]+=662.4, [М-Воc+Н]+=562.4.
Стадия с.
Это соединение получали аналогично продукту, полученному на стадии-с из примера 115. Ионы, найденные с помощью LCMS: [М+Н]+=462.4.
Стадия d.
Это соединение получали аналогично продукту, полученному на стадии-d из примера 115. Ионы, найденные с помощью LCMS: [(М+2Н)/2]+=829.8, [(М-Воc+2Н)/2]+=779.8.
Стадия е.
Это соединение получали аналогично продукту, полученному на стадии-е из примера 115. Ионы, найденные с помощью LCMS: [(М+2Н)/2]+=629.8, [(М+3Н)/3]+=420.2.
Стадия f.
Это соединение получали аналогично продукту, полученному на стадии-f из примера 115. Ионы, найденные с помощью LCMS: [(М+2Н)/2]+=598.8, [(М+3Н)/3]+=393.6.
Пример 117. Синтез промежуточного соединения-76
Стадия а.
К раствору N-Boc-peg-1 тозилата (1,54 г, 4,28 ммоль, описанного в примере 110) в безводном THF (8 мл) добавляли трет-бутил N-2{2-[2-(2-аминоэтокси)этокси]этил}-карбамат (1,59 г, 6,42 ммоль) и карбонат натрия (453,7 мг, 4,28 ммоль). Полученную смесь нагревали при 50°С в течение 24 часов. Твердое вещество фильтровали и промывали ацетонитрилом. Фильтрат концентрировали и очищали с помощью RPLC (100 г, от 5% до 90% ацетонитрила в воде). Выход 1,15 г, 61,7%. Ион, найденный с помощью LCMS: [М+Н]+=436.4.
Стадия b.
Это соединение получали аналогично продукту, полученному на стадии-b из примера 115. Ионы, найденные с помощью LCMS: [М+Н]+=678.2, [М-Воc+Н]+=578.2.
Стадия с.
Это соединение получали аналогично продукту, полученному на стадии-с из примера 115. Ионы, найденные с помощью LCMS: [М+Н]+=478.2.
Стадия d.
Это соединение получали аналогично продукту, полученному на стадии-d из примера 115. Ионы, найденные с помощью LCMS: [(М+2Н)/2]+=837.6, [(М-Воc+2Н)/2]+=767.8.
Стадия е.
Это соединение получали аналогично продукту, полученному на стадии-е из примера 115. Ионы, найденные с помощью LCMS: [(М+2Н)/2]+=637.5, [(М+3Н)/3]+=425.6.
Стадия f.
Это соединение получали аналогично продукту, полученному на стадии-f из примера 115. Ионы, найденные с помощью LCMS: [(М+2Н)/2]+=597.8, [(М+3Н)/3]+=399.0.
Пример 118. Синтез промежуточного соединения-67
Стадия а.
Полученный ранее исходный продукт эфир-занамивир-кислота (0,90 г, 1,43 ммоль, описанный в примере 22) и N-метилморфолин (0,23 мл, 2,14 ммоль) растворяли в THF (35 мл) и охлаждали до 0°С (баня с ледяной водой) в атмосфере азота.
Изо бутил хлорформиат (0,24 мл, 1,85 ммоль, в 2 мл DCM) добавляли по каплям с помощью шприца в течение периода, составляющего 5 минут. Смесь перемешивали при 0°С в течение 30 минут, затем 15 минут при температуре окружающей среды, а затем охлаждали до 0°С и по каплям добавляли боргидрид натрия (540 мг, 14,3 ммоль, растворенный в 5 мл метанола) в течение 5 минут. Реакционную смесь перемешивали в течение 15 минут, после чего весь исходный продукт был израсходован (по данным LC/MS). Несколько капель (~1 мл) ледяной уксусной кислоты добавляли для подкисления смеси (рН ~5). Смесь разбавляли этилацетатом и водой, и экстрагировали этилацетатом (3х). Органический слой промывали рассолом, органические экстракты сушили над сульфатом натрия и концентрировали на роторном испарителе. Неочищенный материал очищали хроматографией на силикагеле, сначала сушили на целите, а затем элюировали 0-10% метанолом в DCM в течение 30 минут. Выход 0,66 г, 75%. Ион, найденный с помощью LCMS: [М+Н]+=617.2.
Стадия b.
К перемешиваемой смеси продукта, полученного на предыдущей стадии (0,66 г, 1,10 ммоль), в 20 мл DCM добавляли триэтиламин (0,30 мл, 1,3 ммоль). Смесь охлаждали до 0°С (баня с ледяной водой) в атмосфере азота, затем обрабатывали мезилхлоридом (0,15 г, 1,3 ммоль), добавляя по каплям в течение 5 минут с помощью шприца. Ледяную баню удаляли и реакционную смесь перемешивали в течение 45 минут. Реакцию гасили насыщенным водным бикарбонатом натрия, затем экстрагировали DCM (3х). Объединенные органические экстракты промывали рассолом, сушили над сульфатом натрия и концентрировали на роторном испарителе. Выход 0,74 г, 99%. Ион, найденный с помощью LCMS: [М+Н]+=695,2. Промежуточный продукт использовали на следующей стадии без очистки.
Стадия с.
Мезилат из предыдущей стадии (0,74 г, 1,1 ммоль) перемешивали в DMF (5 мл) при 80°С с 3 экв. азида натрия (0,21 г, 3,3 ммоль) в течение 5 часов. Смесь разбавляли водой, экстрагировали DCM (3х). Объединенные органические экстракты промывали рассолом, сушили над сульфатом натрия и концентрировали. Выход 0,67 г, 95%. Ион, найденный с помощью LCMS: [М+Н]+ = 642.4. Азид использовали на следующей стадии без очистки.
Стадия d.
Азид из предыдущей стадии (0,67 г, 1,04 ммоль) перемешивали в метаноле (20 мл) в присутствии катализатора Линдлара (300 мг) в атмосфере газообразного водорода в течение 12 часов. Смесь фильтровали через целит и концентрировали с получением указанного в заголовке соединения в виде прозрачного масла. Амин использовали на следующей стадии без очистки. Выход 0,37 г, 54%, 3 стадии. Ион, найденный с помощью LCMS: [М+Н]+ = 616.2.
Стадия е.
EDC (150 мг, 0,78 ммоль) добавляли к перемешиваемому раствору амина, полученного на предыдущей стадии (370 мг, 0,60 ммоль), пропаргил-peg4-карбоновой кислоты (188 мг, 0,72 ммоль) и триэтиламина (0,100 мл, 0,72 ммоль) в DMF (4 мл). Реакционную смесь перемешивали в течение 2 часов при температуре окружающей среды, затем очищали непосредственно с помощью RPLC (от 10% до 95% ацетонитрила в воде, без модификатора, 30-минутный градиент). Чистые фракции объединяли, лиофилизировали и отправляли непосредственно на следующую стадию. Выход 490 мг, 80%. Ион, найденный с помощью LC/MS: [М+Н]+ = 858.2
Стадия f.
Продукт, полученный на предыдущей стадии (490 мг, 0,57 ммоль), перемешивали в TFA (4 мл) в течение 45 минут, затем концентрировали и подвергали азеотропной перегонке с метанолом (3х) на роторном испарителе. Ион, найденный с помощью LC/MS: [М+Н]+ = 658.2. Остаток перемешивали в смеси 1/1 метанол/вода, содержащей LiOH (43 мг, 1,8 ммоль), в течение 30 минут. Реакцию нейтрализовали несколькими каплями ледяной уксусной кислоты, и объем уменьшали вдвое на роторном испарителе. Неочищенный продукт очищали полупрепаративной HPLC (от 0% до 75% ацетонитрила в воде, 0,1% TFA, 30-минутный градиент). Чистые фракции объединяли и лиофилизировали с получением указанного в заголовке соединения. Выход 105 мг, 29%, 3 стадии. Ион, найденный с помощью LC/MS: [М+Н]+ = 618.2.
Пример 119. Синтез промежуточного соединения-68
Стадия а.
п-Нитрофенилхлорформиат (0,23 г, 1,14 ммоль) добавляли к перемешиваемой смеси первичного спирта (0,47 г, 0,76 ммоль, описанного в примере 118) и триэтиламина (0,21 мл, 1,52 ммоль), растворенных в DCM (15 мл, безводный). Реакционную смесь перемешивали в течение 1 часа, затем добавляли дополнительное количество триметиламина (0,21 мл) и п-нитрофенилхлорформиата (230 мг), и перемешивание продолжали еще в течение часа, после чего смесь разбавляли водой и экстрагировали DCM (3х). Объединенные органические экстракты промывали рассолом и сушили над сульфатом натрия. Растворитель удаляли путем роторного испарения. Неочищенный остаток растворяли в DCM (3 мл), наносили на целит и очищали хроматографией на силикагеле (от 0% до 70% этилацетата в гексанах, 30-минутный градиент). Чистые фракции объединяли и концентрировали с получением указанного в заголовке соединения в виде белого твердого вещества. Выход 525 мг, 88%. Ион, найденный с помощью LCMS: [М+Н]+ = 782.2.
Стадия b.
Триэтиламин (0,14 мл, 0,97 ммоль) добавляли к перемешиваемому раствору пропаргил-peg4-амина (181 мг, 0,78 ммоль) в 1 мл ацетонитрила. Смесь триэтиламин/пропаргил-peg4-амин добавляли к продукту, полученному на предыдущей стадии (510 мг, 0,65 ммоль, в 2 мл ацетонитрила) и перемешивали в течение 1 часа, после чего все исходные продукты были израсходованы. Растворитель удаляли на роторном испарителе. Неочищенный остаток очищали с помощью RPLC (от 20% до 95% ацетонитрила в воде, 30-минутный градиент, без модификатора). Выход 475 мг, 83%. Ион, найденный с помощью LC/MS: [М+Н]+ = 874.2.
Стадия с.
Продукт, полученный на предыдущей стадии (475 мг, 0,54 ммоль), перемешивали в TFA (5 мл) в течение 2 часов, а затем концентрировали и подвергали азеотропной перегонке с метанолом (3х) на роторном испарителе. Ион, найденный с помощью LC/MS: [М+Н]+ = 674.2. Остаток перемешивали в смеси 1:1 метанол/вода, содержащей LiOH (49 мг, 1,6 ммоль), в течение 30 минут. Реакцию нейтрализовали ледяной уксусной кислотой, а затем концентрировали путем роторного испарения. Продукт очищали полупрепаративной HPLC (от 0% до 75% ацетонитрила в воде, 0,1% TFA, 30-минутный градиент). Чистые фракции объединяли и лиофилизировали. Выход 204 мг, 59%. Ион, найденный с помощью LCMS: [М+Н]+ = 634.2.
Пример 120. Синтез промежуточного соединения-77
Стадия а.
ΗATU (0,44 г, 1,16 ммоль, в 1,5 мл DMF) по каплям добавляли к перемешиваемому раствору пропаргил-peg4-амина (0,24 г, 1,05 ммоль), бис-Boc-D-орнитина (0,35 г, 1,05 ммоль) и триэтиламина (0,59 мл, 4,21 ммоль) в DMF (2 мл). Реакционную смесь перемешивали в течение 1 часа при температуре окружающей среды, затем очищали непосредственно с помощью RPLC (от 5% до 90% ацетонитрила в воде, 0,1% TFA, 35-минутный градиент). Чистые фракции объединяли и лиофилизировали с получением продукта в виде вязкого прозрачного масла. Ион, найденный с помощью LC/MS: [М+Н]+ = 546.2.
Промежуточное соединение, защищенное Вое, перемешивали в 4N HCl в диоксане (10 мл) в течение 45 минут при температуре окружающей среды. Растворитель удаляли путем роторного испарения, затем полученный остаток растворяли в деионизированной воде (20 мл), замораживали и лиофилизировали с получением продукта в виде прозрачного масла. Выход 310 мг, 70%, 2 стадии. Ион, найденный с помощью LCMS: [М+Н]+ = 346.2.
Стадия b.
Продукт, полученный на предыдущей стадии (96 мг, 0,28 ммоль) и триэтиламин (0,15 мл, 1,11 ммоль) в ацетонитриле (2 мл) добавляли к перемешиваемому раствору п-нитрофенилкарбоната занамивира (435 мг, 0,56 ммоль, описанному в примере 118, в 6 мл ацетонитрила), и перемешивали в течение 12 часов при температуре окружающей среды, затем в течение 2 часов при 80°С. Растворитель удаляли и неочищенный остаток очищали с помощью RPLC (от 10% до 95% ацетонитрила в воде, без модификатора, 35-минутный градиент). Чистые фракции объединяли и концентрировали на роторном испарителе. Ион, найденный с помощью LC/MS: [(М+2Н)/2]+ = 815.8
Этот промежуточный продукт перемешивали в TFA (5 мл) в течение 45 минут, затем концентрировали и сушили под высоким вакуумом. Ион, найденный с помощью LC/MS[(M+2H)/2]+ = 615.8.
Эту соль TFA перемешивали в смеси (1/1) MeOH/DI вода (5 мл), содержащей LiOH (27 мг, 1,11 ммоль), в течение 30 минут при 0°С. Смесь подкисляли (~рН ~ 5) ледяной уксусной кислотой. Метанол удаляли путем роторного испарения и полученный остаток очищали полупрепаративной HPLC (от 5% до 70% ацетонитрила в воде, 0,1% TFA, 35-минутный градиент). Чистые фракции объединяли и лиофилизировали. Выход 35 мг, 11%, 3 стадии. Ион, найденный с помощью LC/MS: [(М+2Н)/2]+ = 575.8.
Пример 121. Синтез промежуточного соединения-78
Стадия а.
Пропаргил-Ρeg4-кислоту (640 мг, 2,46 ммоль), соль диол-HCl (350 мг, 2,46 ммоль), EDC (471 мг, 2,46 ммоль), HOBt (377 мг, 2,46 ммоль) и триэтиламин (249 мг, 2,46 ммоль) перемешивали в DMF (3 мл) при температуре окружающей среды в течение 4 часов. Смесь очищали непосредственно с помощью RPLC (от 0% до 80% ацетонитрила в воде, без модификатора, 35-минутный градиент). Чистые фракции объединяли и концентрировали с получением продукта в виде прозрачного масла. Выход 580 мг, 68%. Ион, найденный с помощью LCMS: [М+Н]+ = 348.4.
Стадия b.
п-Нитрофенилхлорформиат (1,23 г, 1,25 ммоль) добавляли к перемешиваемому раствору продукта, полученного на предыдущей стадии (530 мг, 6,10 ммоль), и триэтиламина (925 мг, 9,15 ммоль) в DCM (25 мл), затем охлаждали, до 0°С в атмосфере азота. Смесь перемешивали в течение 15 минут при 0°С, а затем при комнатной температуре в течение 2 часов. Реакционную смесь разбавляли деионизированной водой и экстрагировали DCM (3 × 20 мл). Объединенные органические экстракты промывали рассолом и сушили над сульфатом натрия. Неочищенный остаток очищали хроматографией на силикагеле (от 10% до 100% этилацетата в гексанах, 25-минутный градиент) с получением продукта в виде белого твердого вещества. Выход 250 мг, 24%. Ион, найденный с помощью LCMS: [М+Н]+ = 678.2.
Стадия с.
Функционализированный амином занамивир (505 мг, 0,82 ммоль, описанный в примере 118) и триэтиламин (0,15 мл, 1,11 ммоль) в ацетонитриле (2 мл) добавляли к перемешиваемому раствору продукта, полученного на предыдущей стадии (220 мг, 0,37 ммоль), в ацетонитриле (10 мл) и перемешивали в течение 4 часов при температуре окружающей среды. Реакционную смесь концентрировали на роторном испарителе. Полученный остаток очищали с помощью RPLC (от 15% до 95% ацетонитрила в воде, без модификатора, 35-минутный градиент). Чистые фракции объединяли и концентрировали на роторном испарителе. Ион, найденный с помощью LC/MS: [(М+2Н)/2]+ = 815.2.
Это промежуточное соединение перемешивали в TFA (5 мл) в течение 45 минут, затем концентрировали и сушили под высоким вакуумом. Ион, найденный с помощью LC/MS: [(М+2Н)/2]+ = 615.2.
Полученную соль TFA перемешивали в смеси (1/1) MeOH/DI вода (5 мл), содержащей LiOH (71 мг, 2,98 ммоль), в течение 30 минут при 0°С. Смесь подкисляли (~ ρΗ ~ 5) ледяной уксусной кислотой. Метанол удаляли на роторном испарителе и очищали полупрепаративной HPLC (от 5% до 70% ацетонитрила в воде, 0,1% TFA, 35-минутный градиент). Чистые фракции объединяли и лиофилизировали. Выход 125 мг, 29% за 3 стадии. Ион, найденный с помощью LC/MS: [(М+2Н)/2]+ = 575.8.
Пример 122. Синтез промежуточного соединения-4а
Стадия а.
Пропаргил-Ρeg4-амин (165 мг, 0,71 ммоль) добавляли к перемешиваемому раствору п-нитрофенилкарбоната занамивира (350 мг, 0,47 ммоль, описанный в примере 109) в ацетонитриле (20 мл). Реакционную смесь перемешивали в течение 1 часа при температуре окружающей среды, затем растворитель удаляли с помощью роторного испарителя. Остаток очищали с помощью RPLC (от 10% до 95% ацетонитрила в воде, без модификатора, 30-минутный градиент). Чистые фракции объединяли и лиофилизировали с получением промежуточного соединения, защищенного boc, в виде белого твердого вещества. Ион, найденный с помощью LCMS: [М+Н]+ = 830.2.
Этот промежуточный продукт перемешивали в TFA (5 мл) при температуре окружающей среды в течение 30 минут. Растворитель удаляли на роторном испарителе и остаток очищали с помощью RPLC (от 10% до 95% ацетонитрила в воде, 0,1% TFA, 30-минутный градиент). Чистые фракции объединяли и лиофилизировали с получением продукта в виде белого твердого вещества. Выход 155 мг, 52%, 2 стадии. Ион, найденный с помощью LCMS: [М+Н]+ = 630.2.
Стадия b.
Продукт, полученный на предыдущей стадии (140 мг, 0,22 ммоль), перемешивали в смеси 1:3 метанол:вода (8 мл), содержащей LiOH (21 мг, 0,89 ммоль), при 0°С в течение 20 минут. Смесь подкисляли несколькими каплями ледяной уксусной кислоты и концентрировали на роторном испарителе. Неочищенный материал очищали полупрепаративной HPLC (от 5% до 95% ацетонитрила в воде, 0,1% TFA, 30-минутный градиент). Чистые фракции объединяли и лиофилизировали с получением продукта в виде белого твердого вещества. Выход 60 мг, 45%. Ион, найденный с помощью LCMS: [М+Н]+ = 590.2.
1H NMR (500 MHz, Methanol-d4) δ 5.86 (d, J=2.6 Hz, 1H), 4.99 (dd, J=9.0, 2.7 Hz, 1H), 4.55 (dd, J=9.7, 2.7 Hz, 1H), 4.38 (dd, J=8.6, 2.6 Hz, 1H), 4.24-4.14 (m, 1H), 4.19 (d, J=2.6 Hz, 2H), 4.02-3.98 (m, 1H), 3.74-3.59 (m, 13H), 3.54 (t, J=5.6 Hz, 2H), 3.52-3.48 (m, 1H), 3.29-3.22 (m, 2H), 2.84 (t, J=2.4 Hz, 1H), 1.96 (s, 3H).
13C NMR (126 MHz, MeOD) δ 172.33, 163.68, 157.54, 156.58, 106.80, 79.23, 75.91, 74.56, 70.18, 70.13, 69.96, 69.87, 69.59, 69.51, 69.14, 68.74, 62.98, 57.67, 51.11, 40.54, 21.37.
Пример 123. Синтез промежуточного соединения-4b
Peg-функционализированное промежуточное соединение (100 мг, 0,13 ммоль, описанное в примере 122), перемешивали в смеси 1:3 метанол:вода (5 мл), содержащей LiOH (12 мг, 0,52 ммоль), при температуре окружающей среды в течение 2 часов. Смесь подкисляли ледяной уксусной кислотой и концентрировали на роторном испарителе. Неочищенный материал очищали с помощью RPLC (5-95% ацетонитрила в деионизированной воде, 0,1% TFA, 30-минутный градиент). Чистые фракции объединяли и лиофилизировали с получением продукта в виде белого твердого вещества. Выход 21 мг, 31%. Ион, найденный с помощью LCMS: [М+Н]+ = 590.2.
1H NMR (Methanol-d4) δ: 5.86 (d, J=2.6 Hz, 1H), 4.48 (dd, J=8.6, 2.7 Hz, 1H), 4.42 (dd, J=9.6, 1.4 Hz, 1H), 4.38 (d, J=12 Hz, 1H), 4.22-4.19 (m, 1H), 4.19 (d, J=2.4 Hz, 2H), 4.16-4.12 (dd, J=11.5, 6 Hz, 1H), 4.09-4.02 (m, 1H), 3.75-3.58 (m, 13H), 3.55 (t, J=5.5 Hz, 2H), 3.33-3.29 (m, 2H), 2.84 (t, J=2.4 Hz, 1H), 2.02 (s, 3H).
13C NMR (126 MHz, MeOD) δ 172.94, 163.82, 157.90, 157.53, 106.80, 79.23, 76.18, 74.55, 70.19, 70.13, 69.96, 69.90, 69.61, 68.96, 68.74, 68.17, 66.69, 57.67, 50.11, 40.43, 21.33.
Пример 124. Общая методика синтеза азидо-Fc.
Получение раствора PEG4-азидо-NHS-сложного эфира (0,050М) в DMF/PBS: 16,75 мг PEG4-азидо-NHS-сложного эфира растворяли в 0,100 мл DMF при 0°С и разбавляли до 0,837 мл путем добавления буфера 1x PBS при 0°С. Этот раствор использовали для получения другого PEG4-азидо-Fc с различными значениями DAR путем корректировки эквивалентов этого раствора PEG4-азидо-NHS-сложного эфира в PBS.
Предварительная обработка h-lgG1-Fc, SEQ ID NO: 48 (107,2 мг в 8,800 мл PBS при рН 7,4, MW ~57891 Да, 1,852 мкмоль): раствор Fc переносили в четыре центрифужных концентратора (30000 MWCO, 15 мл) и разбавляли до 15 мл с помощью буфера x1 PBS, и концентрировали до объема ~1,5 мл. Остаток разбавляли 1:10 в PBS рН 7,4 и снова концентрировали. Эту процедуру промывки повторяли всего четыре раза с последующим разбавлением до 8,80 мл.
Получение PEG4-азидо-Fc: 0,05М PEG4-азидо-NHS-сложного эфира в буфере x1 PBS (0,593 мл, 29,6 мкмоль, 16 эквивалентов) добавляли к раствору h-IgG1-Fc (SEQ ID NO: 48) и смесь встряхивали в течение 2 часов при температуре окружающей среды. Раствор концентрировали с использованием четырех центробежных концентраторов (30000 MWCO, 15 мл) до объема ~1,5 мл. Неочищенную смесь разбавляли 1:10 в PBS рН 7,4 и снова концентрировали. Эту процедуру промывки повторяли всего три раза. Концентрированный Ес-РЕС4-азид разбавляли до 8,80 мл буфером 1x PBS с рН 7,4 и готовили для «клик»-конъюгации. Очищенный продукт количественно оценивали с помощью спектрофотометра Nanodrop™ в УФ и видимой части спектра (используя рассчитанный коэффициент экстинкции, основанный на аминокислотной последовательности h-IgG1). Выход был количественным после очистки.
Пример 125. Синтез конъюгата 34
Раствор азидофункционализир о ванного Fc (40 мг, 2,5 мл, 0,69 мкмоль, описанный в общем получении азидо-Fc, пример 124, SEQ ID No. 18) добавляли в центрифужную пробирку объемом 15 мл, содержащую дериватизированную алкином малую молекулу (6,0 мг, 8,23 мкмоль, промежуточное соединение-67, пример 118). После осторожного перемешивания для растворения всех твердых веществ смесь добавляли к раствору натриевой соли L-аскорбиновой кислоты (54 мг, 0,27 ммоль), сульфата меди(II) (0,88 мг, 5,5 мкмоль) и ВТТА (9,4 мг, 22 ммоль) в буфере PBS при рН 7,4 (1,09 мл). Полученную смесь осторожно вращали в течение ночи. Затем ее очищали аффинной хроматографией на колонке с белком А с последующей эксклюзионной хроматографией (см. Общий протокол очистки конъюгата). Анализ Maldi TOF очищенного конечного продукта показал среднюю массу 64678 Да (DAR=7,2). Выход 24 мг, выход 54%.
Пример 126. Синтез конъюгата 35
Раствор азидо-функционализированного Fc (40 мг, 2,5 мл, 0,69 мкмоль, описанный в общем получении азидо-Fc, пример 124, SEQ ID No. 18) добавляли в центрифужную пробирку объемом 15 мл, содержащую дериватизированную алкином малую молекулу (6,1 мг, 8,23 мкмоль, промежуточное соединение-68, пример 119). После осторожного перемешивания для растворения всех твердых веществ смесь добавляли к раствору натриевой соли L-аскорбиновой кислоты (54 мг, 0,27 ммоль), сульфата меди(II) (0,88 мг, 5,5 мкмоль) и ВТТА (9,4 мг, 22 мкмоль) в буфере PBS при 7,4 (1,09 мл). Полученный раствор осторожно вращали в течение ночи. Затем его очищали аффинной хроматографией на колонке с белком А с последующей эксклюзионной хроматографией (см. Общий протокол очистки конъюгата). Анализ Maldi TOF очищенного конечного продукта показал среднюю массу 64830 Да (DAR=7,3). Выход 23 мг, выход 52%.
Пример 127. Синтез конъюгата 36
Раствор азидо-функционализированного Fc (50 мг, 2,5 мл, 0,86 мкмоль, описанный в общем получении азидо-Fc, пример 124, SEQ ID No. 18) добавляли в центрифужную пробирку объемом 15 мл, содержащую дериватизированную алкином малую молекулу (7,1 мг, 5,2 мкмоль, промежуточное соединение-77, пример 120). После осторожного перемешивания для растворения всех твердых веществ смесь добавляли к раствору натриевой соли L-аскорбиновой кислоты (68 мг, 0,34 ммоль), сульфата меди(II) (1,1 мг, 6,9 мкмоль) и ВТТА (12 мг, 27 мкмоль) в буфере PBS при 7,4 (1,37 мл). Полученную смесь осторожно вращали в течение ночи. Затем ее очищали аффинной хроматографией на колонке с белком А с последующей эксклюзионной хроматографией (см. Общий протокол очистки конъюгата). Анализ Maldi TOF очищенного конечного продукта показал среднюю массу 63300 Да (DAR=3,6). Выход 37 мг, выход 73%.
Пример 128. Синтез конъюгата 37
Раствор азидо-функционализированного Fc (70 мг, 2,5 мл, 1,2 мкмоль, описанный в общем получении азидо-Fc, пример 124, SEQ ID No. 18) добавляли в центрифужную пробирку объемом 15 мл, содержащую дериватизированную алкином малую молекулу (13,3 мг, 9,6 мкмоль, промежуточное соединение 78, пример 121). После осторожного перемешивания для растворения всех твердых веществ смесь добавляли к раствору натриевой соли L-аскорбиновой кислоты (96 мг, 0,48 ммоль), сульфата меди(II) (1,6 мг, 10 мкмоль) и ВТТА (17 мг, 38 ммоль) в буфере PBS при рН 7,4 (1,92 мл). Полученную смесь осторожно встряхивали в течение ночи. Затем ее очищали аффинной хроматографией на колонке с белком А с последующей эксклюзионной хроматографией (см. Общий протокол очистки конъюгата). Анализ Maldi TOF очищенного конечного продукта показал среднюю массу 63574 Да (DAR=3,6). Выход 42 мг, выход 61%.
Пример 129. Синтез конъюгата 33
Получение раствора «клик»-реагента: 0,0050М CuSO4 в буферном растворе PBS: 10,0 мг CuSO4 растворяли в 12,53 мл PBS, затем брали 5,00 мл этого раствора CuSO4 и добавляли 43,1 мг ВТТАА (CAS# 1334179-85-9) и 247,5 мг аскорбата натрия с получением раствора «клик»-реагента (0,0050М CuSO4, 0,020М ВТТАА и 0,25М аскорбат натрия).
К раствору азидо-функционализированного Fc (104,9 мг, 8,60 мл, 18,1 мкмоль; пример 124, SEQ ID NO: 64) в центрифужной пробирке объемом 15 мл добавляли дериватизированную алкином небольшую молекулу (29,7 мг, 19,9 мкмоль, описанную в примере 100, 2,5 эквивалента для каждого азидо на Fc). После осторожного перемешивания для растворения всех твердых веществ смесь обрабатывали раствором «клик»-реагента (4,34 мл) (натриевая соль L-аскорбиновой кислоты, 0,25М, 1086 мкмоль, сульфат меди(II), 0,0050М, 21,7 мкмоль, и ВТТАА 0,020М, 86,9 мкмоль). Полученную смесь осторожно вращали в течение 6 часов при температуре окружающей среды. Ее очищали аффинной хроматографией на колонке с белком А с последующей эксклюзионной хроматографией (см. Общий протокол очистки конъюгата). Анализ Maldi TOF очищенного конечного продукта показал среднюю массу 64550 Да (DAR=4,6). Выход 90,7 мг с чистотой 98%.
Пример 130. Эффективность конъюгата 33 против гриппа B/Brisbane/60/2008 в летальной мышиной модели
Тестируемые препараты оценивали против летальной инфекции гриппа В у самок мышей BALB/c (Jackson Laboratories, возраст 6-8 недель). Контрольный вирус для заражения (B/Brisbane/60/2008) представляет собой адаптированный к мышам изолят, способный вызывать летальные инфекции у мышей. В эксперименте участвовало 10 групп по 5 мышей в каждой группе. В день 0 всех мышей заражали вирусом при 3х LD95 путем интраназальной инокуляции в объеме 50 мкл (приблизительно 1Е5 вируса на мышь) после анестезии изофлураном.
Все группы получали однократное внутривенное введение конъюгата 33 (пример 129), носителя (PBS) или только Fc (hIgG1 Fc) в качестве контроля через два часа после заражения вирусом. Дополнительную группу лечили перорально осельтамивиром (20 мг/кг, 2 раза в сутки в течение 5 дней), начиная через 8 часов после вирусного заражения.
В исследовании оценивали 7 различных концентраций доз конъюгата 33 (10, 3, 1, 0,3, 0,1, 0,03 и 0,01 мг/кг). За мышами наблюдали в течение 2 недель, и животных, у которых потеря веса превышала 20% или которые были признаны умирающими, оценивались как смертность. Также, регистрировали массу тела, чтобы контролировать общее состояние здоровья животных.
Все мыши, обработанные носителем или только Fc в качестве контроля, достигли смертности к 8-му дню, как и ожидалось. Напротив, все мыши, получавшие конъюгат 33, были полностью защищены после получения однократных внутривенных доз от 10 до 0,3 мг/кг на протяжении всего исследования (таблица 48). Напротив, группа, получавшая озельтамивир, привела к выживаемости только 40%, хотя суммарная доза, которую получили эти мыши, составила 200 мг/кг в течение эксперимента. Эффективность конъюгата 33 дополнительно подтверждалась ежедневными измерениями массы тела (таблица 49; данные показаны только до первой смерти в группе). Мыши, получавшие конъюгат 33 в дозе 0,3 мг/кг, продемонстрировали только временную потерю массы тела, достигающую максимум 7%, для одного дня. В совокупности это исследование демонстрирует эффективность конъюгата 33, измеряемую двумя параметрами, указывающими на инфекцию гриппа В (выживаемость и масса тела), против штамма гриппа линии Yamagata.
Пример 131. Характеристика региоизомеров
Промежуточные соединения мономеров и димеров могут быть получены в виде конкретного региоизомера или смеси региоизомеров. В примерах 100-102 показано, как получить региоизомеры промежуточного соединения-7 (С7-С7, пример 100; С7-С9, пример 101; С9-С9, пример 102; оптимизированный С7-С7, пример 103). Описанные в настоящем документе способы могут быть использованы для разделения смесей региоизомеров любого промежуточного соединения, описанного в настоящем документе. В таблице 50 представлена характеристика относительного процентного (%) количества связанных мономеров С7 и С9, и связанных димеров С7-С7, С7-С9 и С9-С9 в ранее описанных способах синтеза промежуточного соединения перед конъюгацией.
Пример 132. Эффективность конъюгата 33, вводимого подкожного, против гриппа A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) в летальной мышиной модели
Конъюгат 33 оценивали против летальной инфекции гриппа IAV H1N1 у самок мышей BALB/c (Charles River Laboratories, 6-8 недель). Контрольный вирус для заражения (A/Puerto Rico/8/1934) представляет собой адаптированный к мышам изолят, способный вызывать летальные инфекции у мышей. В эксперименте участвовало 6 групп по 5 мышей. В день 0 всех мышей заражали вирусом при 3х LD95 путем интраназальной инокуляции в объеме 30 мкл после анестезии смесью кетамин/ксилазин (150 и 10 мг/кг, соответственно). Смертность и массу тела регистрировали ежедневно, и любое животное с потерей веса тела 20% оценивалось как погибшее. Тестируемые группы получали однократное подкожное (SC) лечение конъюгатом 33, контрольным hIgG1-Fc или носителем (PBS) через 2 часа после вирусного заражения. В таблице 51 представлен дизайн исследования.
Как и ожидалось, мыши, получавшие носитель или hIgG1-Fc в качестве контроля, умерли от инфекции на дни 6-7 (таблица 52). Однако мыши, получавшие конъюгат 33, были полностью защищены при уровнях доз 1, 0,3 и 0,1 мг/кг. Смертность для конъюгата 33 наблюдалась только при самой низкой концентрации дозы 0,03 мг/кг.
Эффективность конъюгата 33 дополнительно подтверждали ежедневными измерениями массы тела. Как и ожидалось, мыши, получавшие носитель или hIgG1 Fc, демонстрировали устойчивое снижение массы тела до тех пор, пока она не превысила 20%, после чего они оценивались как смертность (таблица 53).
В отличие от контрольных мышей, те группы, которые получали конъюгат 33 в дозах 1, 0,3 и 0,1 мг/кг, сохраняли здоровую массу тела на протяжении всего исследования и никогда не демонстрировали более чем временное снижение массы тела, составляющее менее 8% (группа, получавшая дозу 0,1 мкг/кг, день 8; таблица 53). По данным измерений выживаемости и массы тела конъюгат 33 продемонстрировал надежную защиту от смертельного заражения вирусом гриппа A/Puerto Rico/8/1934 с помощью однократной подкожной дозы, равной всего лишь 0,1 мг/кг.
Пример 133. Эффективность конъюгата 33 против A/PR/8/1934 (H1N1), нагрузка БОЕ в легких и уровни цитокинов
Исследования эффективности конъюгата 33 проводили на самках мышей BALB/c в возрасте 6-8 недель (Charles River), которым интраназально вводили 3Е2 БОЕ/мышь (3х LD95) адаптированного к мышам вируса гриппа A/PR /8/1934 (H1N1). Конъюгат 33 или человеческий IgG1-Fc в качестве контроля вводили в виде однократной подкожной (SC) дозы через 2 ч после заражения при 0,1-3 мг/кг. Осельтамивир вводили перорально дважды в сутки в течение 4 дней, начиная через 2 часа после инфицирования, в дозе 5 или 50 мг/кг. Балоксавир ре суспендировали в 0,5% метил целлюлозе и вводили перорально дважды в сутки в течение 4 дней, начиная через 2 часа после инфицирования, в дозе 30 мг/кг (таблица 54). Массу тела (BW) регистрировали в течение 4 дней (фиг. 62А-62В). Через 4 дня после инфицирования мышей умерщвляли с помощью СО2 и собирали обе доли легких. Легкие гомогенизировали с помощью 1 мм гранул диоксида кремния в 1 мл PBS с использованием MagNA Lyser (Roche). Гомогенизацию проводили при 6000 об/мин в течение 60 сек и охлаждали на льду в течение 5 мин между циклами. После гомогенизации легких пробирки центрифугировали в течение 10 мин при 600 x g и супернатант переносили в новую пробирку.
Для определения БОЕ супернатанты гомогената легких разбавляли инфекционным буфером в диапазоне от 10-1 до 10-6. 100 мкл разведений вируса добавляли к конфлюэнтному монослою клеток MDCK в 24-луночных планшетах и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре с покачиванием каждые 15 мин. После удаления вируса жидкую среду, содержащую Avicel, добавляли к клеткам MDCK. Клетки инкубировали при 37°С, 5% СО2 в течение 40 часов. После инкубации среду удаляли и клетки окрашивали кристаллическим фиолетовым для подсчета бляшек и рассчитывали количество бляш ко образующих единиц (БОЕ) относительно массы легкого (БОЕ/г легкого).
Для анализа цитокинов супернатанты гомогената легких серийно разводили в 2 раза в 96-луночном планшете. Уровни цитокинов для INF-γ, TNF-α, IL-6, MIP-1α и МСР-1 определяли с помощью ELISA согласно инструкциям производителя (R&D Systems). После летального заражения гриппом в мышиной модели нагрузка БОЕ в легких (фиг. 63А-63В) и уровни цитокинов в легких определяли на 4 день после инфицирования (таблица 55 и таблица 56, соответственно). Конъюгат 33 продемонстрировал дозозависимое log сокращение вирусной нагрузки, которое составило 0,7 при 0,1 мг/кг, 1,88 при 0,3 мг/кг, 3 при 1 мг/кг и 3,8 при 3 мг/кг. Осельтамивир в дозе 5 мг/кг и 50 мг/кг оказал умеренное влияние на вирусную нагрузку, что привело к снижению на 0,86 и 2 log, соответственно. Балоксавир снизил вирусную нагрузку ниже предела обнаружения, 1е2 БОЕ/мл, тем самым снизив вирусную нагрузку на >5,99 log по сравнению с контролем PBS.
Как и ожидалось, не наблюдалось биологически значимой разницы между отрицательными контролями, PBS и hIgG1-Fc.
Конъюгат 33 снижал вирусную нагрузку в зависимости от дозы на 4-й день после заражения гриппом А в мышиной модели (таблица 55, фиг. 64А-64В). Аналогичным образом, конъюгат 33 продемонстрировал дозозависимое кратное снижение уровней цитокинов для TNF-α, IL-6, INF-γ, МСР-1 и MIP-1α (фиг. 65А-65Е, соответственно) по сравнению с неинфицированным контролем на 4-й день после инфицирования вирусом гриппа А в мышиной модели (таблица 56).
Самая высокая испытанная концентрация конъюгата 33 в дозе 3 мг/кг продемонстрировала отсутствие потери веса на протяжении всего периода инфекции, аналогично неинфицированным контрольным мышам (таблица 57).
Пример 134. Эффективность конъюгата 33 против гриппа A (H1N1) в мышиной модели летального тяжелого комбинированного иммунодефицита (SCID)
Тестируемые препараты оценивали против летальной инфекции гриппа А у самок мышей BALB/c scid (Jackson Laboratories, возраст 6-8 недель). Контрольный вирус для заражения (A/Puerto Rico/8/1934) представляет собой адаптированный к мышам изолят, способный вызывать летальные инфекции у мышей. В эксперименте участвовало 11 групп по 5 мышей в каждой. В день 0 всех мышей заражали вирусом при 3х LD95 путем интраназальной инокуляции в объеме 30 мкл (приблизительно 1ЕЗ вируса на мышь) после анестезии смесью кетамин/ксилазин (150 и 10 мг/кг, соответственно).
Группы получали однократное подкожное введение носителя (PBS), контроля hIgG1-Fc или конъюгата 33 (3, 1, 0,3, 0,1, 0,03 мг/кг) через два часа после заражения вирусом. Отдельная группа исследования состояла из 3 групп мышей, получавших балоксавир марбоксил (DC Chemicals, Shanghai, China) перорально два раза в сутки, 1 день; также, начиная через 2 часа после вирусного заражения. За мышами наблюдали в течение 2 недель, и животных, у которых потеря веса превышала 20% или которые были признаны умирающими, оценивали как смертность.
В конце исследования (день 14) мыши, получавшие конъюгат 33, были полностью защищены при всех концентрациях доз от 3 до 0,1 мг/кг (таблица 58). Конъюгат 33 не смог защитить от летального заражения вирусом только при самой низкой тестируемой концентрации 0,03 мг/кг. Как и ожидалось, группы, получавшие носитель или hIgG1-Fc, не были защищены. Мыши, получавшие балоксавир, также были защищены, но при значительно более высоких суммарных дозах 60 и 20 мг/кг, при общей дозе 6 мг/кг только 40% мышей дожили до 14 дня.
Эффективность конъюгата 33 в этой модели тяжелого иммунодефицита также была очевидна на основании массы тела (таблица 59). Самая низкая концентрация конъюгата, обеспечивающая полную защиту на основании показаний смертности, составляла 0,1 мг/кг. При этом уровне дозы наибольшая средняя потеря веса для группы была временной и привела к снижению, составляющему менее 5% (происходящему на 2-й день). Кроме того, различие в массе тела для групп, получавших дозы на уровне 1 и 3 мг/кг, составило менее 2% на 14-й день по сравнению с не инфицированными мышами.
В совокупности эти данные демонстрируют эффективность конъюгата 33 в отношении защиты мышей, подвергшихся летальному заражению, с помощью однократных SC доз конъюгата, составляющих всего лишь 0,1 мг/кг. Это было достигнуто на тяжелой модели иммунодефицита у мышей, полностью лишенных иммунных Т- и В-клеток, которые необходимы для избавления от инфекций гриппа. Эти данные подтверждают применение конъюгата 33 для лечения популяций пациентов с иммунодефицитом.
Пример 135. Эффективность конъюгата 33, вводимого подкожно, против гриппа A/California/07/2009 (H1N1) pdm в летальной мышиной модели
Конъюгат 33 оценивали против летальной инфекции гриппа IAV H1N1 у самок мышей BALB/c (Charles River Laboratories, 6-8 недель). Контрольный вирус для заражения (A/California/07/2009 (H1N1) pdm) представляет собой пандемический изолят, способный вызывать летальные инфекции у мышей. В эксперименте участвовало 6 групп по 5 мышей. В день 0 всех мышей заражали вирусом при 3х LD95 путем интраназальной инокуляции в объеме 30 мкл после анестезии смесью кетамин/ксилазина (150 и 10 мг/кг, соответственно). Смертность и массу тела регистрировали ежедневно, и любое животное с потерей массы тела 20% оценивалось как погибшее.
Тестируемые группы получали однократное подкожное (SC) введение конъюгата 33, контрольного hIgG1-Fc или носителя (PBS) через 2 часа после вирусного заражения. В таблице 60 показан дизайн исследования и уровни доз.
Как и ожидалось, мыши, получавшие носитель или контрольный hIgG1-Fc, умерли от инфекции на дни 6-7 (таблица 61). Однако мыши, получавшие конъюгат 33, были полностью защищены при 1 мг/кг и почти так же при 0,3 (выживаемость 80%). Значительная смертность для конъюгата 33 наблюдалась только при более низких концентрациях доз 0,1 и 0,03 мг/кг.
Эффективность конъюгата 33 дополнительно подтверждали ежедневными измерениями массы тела. Как и ожидалось, мыши, обработанные носителем или hIgG1 Fc, демонстрировали устойчивое снижение массы тела до тех пор, пока она не превысила 20%, после чего их оценивали как смертность (таблица 62).
В отличие от контрольных мышей, мыши, получавшие конъюгат 33 в дозе 1 мг/кг, демонстрировали только временное снижение массы тела приблизительно на 10% с пиком на 3-й день (таблица 62). При измерении выживаемости и массы тела конъюгат 33 продемонстрировал надежную защиту от летального заражения вирусом гриппа A/California/07/2009 (H1N1) pdm с помощью однократного подкожного введения в дозе 1 мг/кг.Активность против клинически значимого пандемического штамма, используемого в этом исследовании, подтверждает полезность конъюгата 33 при лечении серьезных инфекций гриппа.
Пример 136. Эффективность конъюгата 33, вводимого внутривенно (IV), против гриппа A/Puerto Rico/8/1934 (H1N1) в летальной мышиной модели отсроченного лечения
Конъюгат 33 оценивали против летальной инфекции гриппа A (H1N1) у самок мышей BALB/c (Charles River Laboratories, 6-8 недель). Контрольный вирус для заражения (A/Puerto Rico/8/1934) представляет собой адаптированный к мышам изолят, способный вызывать летальные инфекции у мышей. В день 0 всех мышей заражали вирусом при 3х LD95 путем интраназальной инокуляции в объеме 30 мкл после анестезии смесью кетамин/ксилазин (150 и 10 мг/кг, соответственно). Смертность и массу тела регистрировали ежедневно, и любое животное с потерей массы тела 20% оценивалось как смерть.
Дизайн исследования подробно описан в таблице 63 и состоит из нескольких групп. Контрольная группа включает группы, получающие только носитель (PBS) и hIgG1-Fc, которым вводили дозу через 24 часа после вирусного заражения (неинфицированная группа также входила в эту группу). Вторая группа получала осельтамивир, который вводили в дозе, в 4 раза превышающей гуманизированную дозу, с отсрочкой начала лечения на 24, 48 или 72 часа. Последние 3 группы получали конъюгат 33, вводимый в виде однократных внутривенных доз 10, 3 или 1 мг/кг; при этом каждую из них вводили по тому же графику, что и описанная выше группа, получавшая осельтамивир.
Как и ожидалось, носитель и hIgG1-Fc не оказывали защитного воздействия при дозировании через 24 часа после вирусного заражения и приводили к полной смертности к 7-му дню. В наших руках осельтамивир, даже при 4-кратной гуманизированной дозе (суммарная доза 200 мг/кг), был только частично эффективен, когда дозирование было отсрочено на 24 часа (таблица 64; 40% выживаемость). Однако конъюгат 33 был полностью защитным при всех концентрациях (10, 3 и 1 мг/кг) при той же 24-часовой схеме дозирования.
Когда дозирование было острочено на полные 48 часов после заражения вирусом, осельтамивир больше не был эффективен (выживаемость 0%), в то время как конъюгат 33 имел 80% защиту при дозах 10 и 3 мг/кг. Когда дозирование было отсрочено до 72 часов, только доза конъюгата 33, равная 10 мг/кг, продемонстрировала частичную защиту (40%). Эффективность конъюгата 33 также была очевидна на основании ежедневных измерений массы тела (таблица 65). Это было особенно значительным в группах Т+24 часа, где для любой группы, получавшей конъюгат 33, наблюдалось снижение, составляющее менее 3%, которое было временным и возникало в 1-й день. В этом исследовании конъюгат 33 является более эффективным, чем осельтамивир, одобренное лечение для гриппа.
Пример 137. Синтез конъюгата 38 (промежуточное соединение-73), конъюгата 39 (промежуточное соединение-74), конъюгата 40 (промежуточное соединение-75) и конъюгата 41 (промежуточное соединение-76)
В стерильную центрифужную пробирку объемом 15 мл загружали аскорбат натрия (68,3 мг, 0,345 ммоль), ВТТАА (11,9 мг, 0,0276 ммоль), продукт из примеров 114 (промежуточное соединение-73), 115 (промежуточное соединение-74), 116 (промежуточное соединение-75) или 117 (промежуточное соединение-76) (0,00953 ммоль) и PBS 7,4 (1 мл). Реагенты перемешивали на вортексе до гомогенного состояния, затем смешивали с азидо-Fc (50 мг, 0,0008624 ммоль, описанный в примере 124, SEQ ID NO: 64), а затем с раствором CuSO4 (1,1 мг, 0,0069 ммоль) в воде (0,5 мл). Смесь вращали в течение 12 часов, затем очищают аффинной хроматографией на колонке с белком А с последующей эксклюзионной хроматографией. Конъюгаты характеризовали с помощью анализа Maldi TOF (DAR обычно=4,5). Выходы, как правило, составляли 50%.
Пример 138. Синтез промежуточного соединения-79
Стадия а.
Занамавир-эфир-кислота (0,90 г, 1,43 ммоль, пример 31) и N-метилморфолин (0,23 мл, 2,14 ммоль) растворяли в THF (35 мл) и охлаждали до 0°С (баня с ледяной водой) в атмосфере азота. Изо бутил хлорформиат (0,24 мл, 1,85 ммоль, в 2 мл DCM) добавляли по каплям с помощью шприца в течение 5 минут. Смесь перемешивали при 0°С в течение 30 минут, затем в течение 15 минут при температуре окружающей среды, а затем охлаждали до 0°С. По каплям в течение 5 минут добавляли боргидрид натрия (540 мг, 14,3 ммоль, растворенный в 5 мл метанола). Реакционную смесь перемешивали в течение 15 минут, после чего весь исходный материал был израсходован (по данным LC/MS). Несколько капель (~1 мл) ледяной уксусной кислоты добавляли для подкисления смеси (рН ~5). Разбавляли этилацетатом и водой, и экстрагировали этилацетатом (3х). Органический слой промывали рассолом, органические экстракты сушили над сульфатом натрия и концентрировали на роторном испарителе. Неочищенный продукт очищали хроматографией на силикагеле (сначала наносили на целит) (0-10% метанол в DCM, 30 мин). Выход 0,66 г, 75%. Ион, найденный с помощью LCMS: [М+Н]+ = 617.2.
Стадия b.
К перемешиваемой смеси спирта (0,66, 1,1 моль, в 20 мл CH2Cl2) добавляли триэтиламин (0,30 мл, 1,3 ммоль). Смесь охлаждали до 0°С (баня с ледяной водой) в 1 атмосфере азота и добавляли по каплям в течение 5 минут с помощью шприца мезилхлорид (150 мг, 1,3 ммоль). Ледяную баню удаляли и реакционную смесь перемешивали в течение 45 минут. Смесь разбавляли насыщенным водным бикарбонатом натрия, экстрагировали DCM (3х). Объединенные органические экстракты промывали рассолом, сушили над сульфатом натрия и концентрировали на роторном испарителе. Ион, обнаруженный с помощью LCMS: [М+Н]+ = 695.2. Промежуточный продукт использовали на следующей стадии без очистки.
Мезилат занамвира перемешивали в DMF при 80°С с 3 экв. азида натрия в течение 5 часов. Смесь разбавляли водой, экстрагировали DCM (3х). Объединенные органические экстракты промывали рассолом, сушили над сульфатом натрия и концентрировали. Ион, найденный с помощью LCMS: [Μ+Н]+ = 695.2. Азид переносили на следующую стадию без очистки.
Азид занамавира (670 мг, 1,04 ммоль) перемешивали в метаноле (20 мл) в присутствии катализатора Линдлара (300 мг) в атмосфере газообразного водорода в течение 12 часов. Смесь фильтровали через целит и концентрировали с получением указанного в заголовке соединения в виде прозрачного масла. Амин переносили на следующую стадию без очистки. Выход 0,37 г, 54%, 3 стадии. Ион, найденный с помощью LCMS: [М+Н]+ = 616.2.
Стадия с.
Метил 3-(бензиламино)пропаноат (1 г, 5,2 ммоль), метил 4-бромбутаноат (1,2 г, 6,2 ммоль) и диизопропилэтиламин (1,34 мл, 7,8 ммоль) перемешивали в DMF (5 мл) при 65°С в течение 4 часов. Большую часть растворителя удаляли с помощью роторного испарителя, и неочищенный материал очищали хроматографией на силикагеле (Isco, от 0 до 9% метанола в DCM, 30-минутный градиент) с получением бензил-защищенного промежуточного соединения в виде прозрачного масла. Бензил-защищенное промежуточное соединение перемешивали в метаноле (20 мл) в атмосфере газообразного водорода при 1 атмосфере в присутствии 20% гидроксида палладия на угле (300 мг) в течение 12 часов. Смесь фильтровали через целит и концентрировали с получением указанного в заголовке соединения в виде прозрачного масла. Выход 0,72 г, 69%. Ион, найденный с помощью LCMS: [М+Н]+ = 204.2.
Стадия d.
Продукт, полученный на стадии-с (0,70 г, 2,16 ммоль), пропаргил-PEG-4-кислоту (0,63 мг, 2,38 ммоль), HATU (1,26 г, 3,24 ммоль) в DMF (2 мл) перемешивали при комнатной температуре с последующим добавлением DIEA (1,15 мл, 6,49 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в течение 2 часов, затем очищали жидкостной хроматографией с обращенной фазой (Isco, от 5% до 50% ацетонитрила в воде с 0,1% TFA в качестве модификатора). Выход 840 мг, 87%. Ион, найденный спомощью LCMS [М+Н]+ = 446.2.
Стадия е.
Раствор продукта, полученного на стадии-d (840 мг, 1,85 ммоль), и LiOH (113,1 мг, 4,72 ммоль) в H2O:MeOH (1:2, 9 мл) перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов. Затем реакционную смесь подкисляли TFA. Полученный раствор концентрировали, затем очищали жидкостной хроматографией с обращенной фазой (Isco, от 0% до 20% ацетонитрила в воде). Выход 454,5 мг, 59%. Ион, найденный с помощью LCMS [М+Н]+ = 418.2.
Стадия f.
К раствору продукта, полученного на стадии-b (334,7 мг, 0,52 ммоль), продукта, полученного на стадии-е (102 мг, 0,24 ммоль), и HATU (273,25 мг, 0,704 ммоль) в безводном DMF (3 мл) при комнатной температуре добавляли DIEA (217 мг, 16,4 ммоль). Полученную смесь перемешивали в течение 1 часа, затем очищали с помощью RPLC (от 20% до 100% метанола в воде без модификатора). Выход 206,5 мг, 55%. Ион, найденный с помощью LCMS [(М+2Н)/2]+ = 806.8.
Стадия g.
Продукт, полученный на стадии-f (206,5 мг, 0,128 ммоль), и TFA (3 мл) в CH2Cl2 (5 мл) перемешивали при комнатной температуре в течение ночи, затем концентрировали при пониженном давлении. Полученный остаток очищали полупрепаративной HPLC (от 0% до 30% ацетонитрила в воде с 0,1% TFA в качестве модификатора). Выход 144,5 мг, 69%. Ион, найденный с помощью LCMS [(М+2Н)/2]+ = 606.8.
Стадия h.
К раствору продукта, полученного на стадии-g (144,5 мг, 0,119 ммоль), в МеОН (9 мл) и воде (3 мл) добавляли LiOH (18 мг, 0,75 ммоль). Полученный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа, затем подкисляли TFA и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали полупрепаративной HPLC (от 0% до 25% ацетонитрила в воде, используя 0,1% TFA в качестве модификатора). Выход 45 мг, 28%. Ионы, найденные с помощью LCMS [(М+2Н)/2]+ = 566.8.
Пример 139. Синтез конъюгата 42
Раствор азидо-функционализированного Fc (50 мг, 5,4 мл, 0,859 мкмоль, пример 124, SEQ ID NO: 18) добавляли в центрифужную пробирку объемом 10 мл, содержащую дер иватизир о ванную алкином малую молекулу (7,87 мг, 0,057 ммоль, пример 138). После осторожного встряхивания для растворения всех твердых веществ смесь добавляли к 3 мл предварительно перемешанного раствора натриевой соли L-аскорбиновой кислоты (0,68 мг, 0,34 ммоль, 0,25М), сульфата меди(II) (1,1 мг, 0,0069 ммоль, 0,005М) и ВТТАА (11,8 мг, 0,027 ммоль, 0,02 М) в буфере PBS при рН 7,4. Полученный раствор осторожно перемешивали в течение ночи. Его очищали аффинной хроматографией на колонке с белком А с последующей эксклюзионной хроматографией (см. Общий протокол очистки конъюгата). Анализ Maldi TOF очищенного конечного продукта показал среднюю массу 63623 Да (DAR 3,8). Выход 36,01 мг, 72%.
Пример 140. Синтез промежуточного соединения-80
Стадия а.
К раствору п-нитрофенилкарбоната занамивира (0,3 г, 0,4 ммоль, пример 103) в безводном дихлорметане (5 мл) добавляли пропаргил-PEG4-метиламин (0,11 г, 0,44 ммоль) и DIPEA (0,14 мл, 1,0 ммоль) в безводном DMF (5 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи, затем концентрировали и очищали флэш-хроматографией, элюируя смесью метанола/дихлорметана с градиентом от 0% до 10%. Выход 0,28 г, 81%. Ионы, найденные с помощью LCMS: (Μ+Н)+ = 858.4, (Μ - Вос)+Н+ = 758.4.
Стадия b.
Продукт, полученный на предыдущей стадии (280 мг, 0,2 ммоль), растворяли в 2 мл МеОН и 2 мл THF, затем обрабатывали раствором гидроксида лития (24 мг, 1 ммоль), растворенным в 2 мл воды. Реакционную смесь перемешивали в течение 10 минут при комнатной температуре, после чего по данным HPLC реакция завершалась. Значение рН реакции доводили до 5-6 с помощью ионообменной смолы Amberlite IRN-77, затем фильтровали для удаления смолы. Неочищенный фильтрат выпаривали до сухого состояния под вакуумом и использовали на следующей стадии без очистки, выход был количественным. Ионы, найденные с помощью LCMS: (Μ+Н)+=844.4, (Μ - Boc+Н)+ = 744.4. Стадия с
Продукт, полученный на стадии-b, растворяли в 2 мл дихлорметана и 2 мл TFA, и перемешивали при комнатной температуре. За ходом реакции следили с помощью LCMS. После завершения реакции (6 ч) раствор выпаривали до сухого состояния и затем растворяли в 2 мл воды и 2 мл ацетонитрила. Полученный раствор перемешивали еще 2 часа при комнатной температуре, при этом анализ LCMS показал полную депротекцию ацетонидных защитных групп. Эту смесь концентрировали и очищали обращенно-фазовой жидкостной хроматографией (RPLC) с использованием жидкостного хроматографа Isco CombiFlash, элюируя градиентом от 5% до 40% ацетонитрила в воде с 0,1% TFA в качестве модификатора. Выход 180 мг, 78,0%. Ионы, найденные с помощью LCMS: (Μ+Н)+ = 604.2.
Пример 141. Данные по стабильности для промежуточного соединения-80 по сравнению с промежуточным соединением-4
Промежуточное соединение-80 (пример 140) и промежуточное соединение-4 (пример 13) солюбилизировали до 10 мг/мл в деионизированной воде, а затем разбавляли 1:10 в 1X PBS до конечной концентрации 1 мг/мл. Образцы инкубировали при 37°С или 60°С в течение 1 недели. Аликвоту 25 мкл разбавляли в 75 мкл воды для анализа HPLC. Используя Acquity Η-Class UPLC с колонкой Phenomenex Biozen PS-CIS (150x2,1 мм, 1,6 мкм), градиент от 0,1% муравьиной кислоты в воде до 0,1% муравьиной кислоты в ацетонитриле выполняли следующим образом: 5% В в течение 0-1 мин, 5-20% В в течение 1-20 мин. Детектирование осуществляли при 240 нм с использованием детектора с диодной матрицей. Промежуточное соединение-80 демонстрировало деградацию менее 1% за неделю при 60°С, в то время как промежуточное соединение-4 продемонстрировало 15% деградацию за тот же период времени (фиг. 66).
Пример 142. Синтез конъюгата 43
Получение раствора «клик»-реагента: 0,0050М CuSO4 в буферном растворе x1 PBS: 10,0 мг CuSO4 растворяли в 12,53 мл x1 PBS, затем брали 10,00 мл этого раствора CuSO4 и добавляли 86,1 мг ВТТАА и 495,3 мг аскорбата натрия с получением раствора «клик»-реагента (0,0050М CuSO4, 0,020М ВТТАА и 0,25М аскорбат натрия).
Раствор азидо-функционализированного Fc (78,0 мг, 4,535 мл, 1,35 мкмоль; пример 124, SEQ ID NO: 64) добавляли в центрифужную пробирку объемом 15 мл, содержащую дериватизированную алкином небольшую молекулу (13,2 мг, 8,88 мкмоль, промежуточное соединение-80, пример 140). После осторожного перемешивания для растворения всех твердых веществ к смеси добавляли 2,153 мл указанного выше раствора «клик»-реагента (натриевая соль L-аскорбиновой кислоты, 0,25 М, 106,6 мг, 0,538 ммоль, сульфат меди (II) 0,0050 М, 1,72 мг, 0,0107 ммоль, и ВТТАА 0,020М, 18,5 мг, 0,0431 ммоль). Полученную смесь осторожно вращали в течение 6 часов при температуре окружающей среды. Ее очищали аффинной хроматографией на колонке с белком А с последующей эксклюзионной хроматографией (см. Протокол очистки конъюгата). Анализ Maldi TOF очищенного конечного продукта показал среднюю массу 64012 Да (DAR=7,0). Выход 50,3 мг, выход 62%.
Пример 143. Синтез промежуточного соединения-81
Стадия а.
К хорошо перемешиваемому раствору N-Boc-N-Me-глицинола (3,5 г, 20 ммоль) в DMSO (20 мл), охлажденному на бане с ледяной водой, добавляли аллилбромид (3,6 г, 30,0 ммоль) с последующим добавлением тонко измельченного порошка КОН (3,5 г, 30,0 ммоль) в течение 15 минут. Полученный раствор перемешивали в течение ночи при комнатной температуре. Полученную смесь распределяли между 5% водн. НОАс (50 мл) и этилацетатом (200 мл). Органический слой отделяли, промывали рассолом, сушили сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали, затем очищали флэш-хроматографией, элюируя смесью этилацетат/гексан с градиентом от 10% до 80%. Выход продукта 4,1 г, 95%. Ионы, найденные с помощью LCMS: М+Н=216.3.
Стадия b.
Озон барботировали через раствор соединения, полученного на стадии-а (8,0 г, 37 ммоль) в МеОН (50 мл) и DCM (50 мл) при -78°С до появления светло-голубого цвета. Непрореагировавший озон удаляли путем барботирования кислорода в течение 10 минут перед добавлением NaBH4 (1,6 г, 40 ммоль) небольшой порцией в течение 10 минут. После добавления всего NaBH4 смесь постепенно нагревали до комнатной температуры. Полученный раствор распределяли между этилацетатом (100 мл) и рассолом (50 мл). Органический слой отделяли, промывали рассолом, сушили сульфатом натрия, фильтровали, концентрировали до масла и затем очищали флэш-хроматографией, элюируя смесью этилацетат/дихлорметан с градиентом от 10% до 80%. Выход продукта 5,0 г, 62%. Ионы, найденные с помощью LCMS: М+Н=220.2.
Стадия с.
К раствору продукта (4,4 г, 20 ммоль) из предыдущей стадии и CBr4 (10,0 г, 30,0 ммоль) в DCM (50 мл) при 0°С медленно добавляли PPh3 (8,0 г, 30 ммоль) в течение 15 минут (экзотермическая реакция). Во время добавления внутренняя температура поддерживалась ниже 30°С. После добавления PPh3 реакционную смесь перемешивали в течение ночи при комнатной температуре. Неочищенную реакционную смесь концентрировали до масла, затем очищали нормально-фазовой хроматографией, элюируя градиентом от 10% этилацетата/гексаны до 80% этилацетата/гексаны. Фракции, содержащие капли масла внутри пробирок для сбора, объединяли и концентрировали до бесцветного масла. 4,0 г, 70,5%. Ионы, найденные с помощью LCMS: М+Н=282.1.
Стадия d.
Раствор продукта, полученного на стадии-с (4 г, 14 ммоль), бензиламина (0,60 г, 5,7 ммоль) и K2CO3 (2,35 г, 17 ммоль) в DMF (20 мл) нагревали на масляной бане при 75°С в течение 8 часов. Смесь фильтровали, концентрировали и очищали с помощью RPLC (от 5% ACN/вода до 100% ACN). Выход 2,1 г, 72,7%.
Стадия е.
К раствору продукта, полученного на стадии-d (1,3 г, 2,0 ммоль), растворенного в CHCl3/EtOH (1:20, 20 мл), добавляли 20% Pd(OH)2/C (0,50 г). Реакционную смесь перемешивали в течение ночи под баллоном с водородом при температуре окружающей среды. Реакционную смесь фильтровали через слой целита, затем концентрировали с помощью роторного испарителя и переносили на следующую стадию без дополнительной очистки.
Стадия f.
Продукт, полученный на стадии-е, растворяли в 10 мл DMF, затем обрабатывали пропаргил-PEG4-кислотой (0,52 г, 2,0 ммоль), EDCI (0,6 г, 3,0 ммоль), HOAt (0,45 г, 3 моль) и основанием Хунига (0,7 мл, 5,0 ммоль) при комнатной температуре. Реакционную смесь перемешивали в течение четырех часов, затем концентрировали и очищали с помощью RPLC (от 10% ACN/вода до 60% ACN/вода). Выход 0,43 г, 65% за две стадии. Ионы, найденные с помощью LCMS: [Μ - Boc+Н]+ = 562.4, [М+Н]+ = 662.4.
Стадия g.
Продукт, полученный на стадии-d (70 мг, 0,1 ммоль), обрабатывали TFA (2 мл) в течение 2 часов при комнатной температуре. TFA удаляли на роторном испарителе, а оставшееся масло дополнительно сушили под высоким вакуумом в течение 12 ч с получением желаемого продукта в виде соли бис-TFA. Выход был количественным. Ион, найденный с помощью LCMS: [Μ+Н]+ = 462.4.
Стадия h.
К раствору нитрофенилкарбоната, описанного в примере 109 (0,72 г, 0,95 ммоль), в безводном DMF (5 мл) добавляли смесь диамина, полученного на стадии-g (0,3 г, 0,43 ммоль), добавляли порциями в течение 30 минут) и DIPEA (0,28 мл, 2 ммоль) в безводном DMF (20 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи, затем концентрировали и очищали флэш-хроматографией, элюируя смесью метанол/дихлорметан с градиентом от 0 до 10%. Выход 0,63 г, 86%. Ионы, найденные с помощью LCMS: [(Μ+2Н)/2]+ = 844.4, [(Μ - Вое+2Н)/2]+ = 794.4, [(М - 2 Вос+2Н)/2]+ = 744.4.
Стадия i.
Продукт, полученный на предыдущей стадии (600 мг, 0,35 ммоль), растворяли в 5 мл МеОН и 5 мл THF, затем обрабатывали раствором гидроксида лития (48 мг, 2 ммоль), растворенным в 2 мл воды. Реакционную смесь перемешивали в течение 10 минут при комнатной температуре, после чего анализ ВЭЖХ показал завершение реакции. Значение рН реакционного раствора доводили до 5-6 с помощью ионообменной смолы Amberlite IRN-77, затем фильтровали для удаления смолы. Неочищенный продукт упаривали до сухого состояния на роторном испарителе и использовали на следующей стадии без очистки. Ионы, найденные с помощью LCMS: [(Μ+2Н)/2]+ = 829.9, [(Μ - Вое+2Н)/2]+ = 779.4, [(М - 2 Вос+2Н)/2]+ = 729.4.
Стадия j.
Продукт, полученный на стадии-i, растворяли в 5 мл дихлорметана и 5 мл TFA, и перемешивали при комнатной температуре. За ходом реакции следили с помощью LCMS. После завершения реакции (6 ч) раствор упаривали до сухого состояния и затем растворяли в 4 мл воды и 4 мл метанола. Полученный раствор перемешивали еще 2 часа при комнатной температуре, после чего анализ LCMS показал полную депротекцию ацетонидных защитных групп. Эту смесь концентрировали и очищали обращенно-фазовой жидкостной хроматографией (RPLC) с использованием жидкостного хроматографа Isco CombiFlash, элюируя смесью ацетонитрил/вода с градиентом от 5% до 40% с 0,1% TFA в качестве модификатора. Выход 380 мг, 71,0%. Ионы, найденные с помощью LCMS: [(Μ+2Н)/2]+ = 589.8, [(Μ+3Н)/3]+ = 392.5.
Пример 144. Синтез промежуточного соединения-82
Указанное в заголовке соединение получали аналогично примеру 143, промежуточное соединение-81, где N-Boc-N-Me-глицинол был заменен на N-Boc-N-этил-глицинол на стадии-а. Ионы, найденные с помощью LCMS: [М/2]+1=603.8, [М/3]+1=402.9.
Пример 145. Синтез промежуточного соединения-83
Стадия а.
CBZ-защищенный-амино-peg1-бромид (7,6 г, 25,2 ммоль), бензиламин (1,1 г, 10,1 ммоль) и карбонат калия (2,8 г, 2,8 ммоль) перемешивали в DMF (10 мл) при 60°С в течение 12 часов. Раствор концентрировали на роторном испарителе и очищали хроматографией на силикагеле (0-10% метанол в DCM, 30-минутный градиент) с получением продукта в виде прозрачного вязкого масла. Выход 3,2 г, 57%. Ион, найденный с помощью LC/MS [М+Н]+ = 550.2.
Стадия b.
Продукт, полученный на стадии-а (1,9 г, 3,5 ммоль), растворяли в THF (20 мл) и охлаждали до 0°С в бане с ледяной водой в атмосфере азота. LAH (6,9 мл, 13,8 ммоль, 2М в THF) добавляли по каплям с помощью шприца в течение 10 минут. Смесь перемешивали при нагревании с обратным холодильником в течение 2 часов, затем охлаждали до 0°С в бане с ледяной водой. Добавляли по каплям 1 мл воды с последующим добавлением по каплям 1 мл водного (15% по массе) раствора NaOH. Добавляли 3 мл воды и смесь перемешивали в течение 15 минут, после чего добавляли 2 г сульфата магния. Смесь перемешивали в течение 10 минут, затем фильтровали через целит, промывали 2 дополнительными 10 мл порциями THF и объединенные фильтраты концентрировали на роторном испарителе. Остаток растворяли в ацетонитриле (20 мл), добавляли триэтиламин (1,4 г, 13,8 ммоль) и boc-ангидрид (3,0 г, 13,8 ммоль). Смесь перемешивали в течение 45 минут, концентрировали и очищали обращенно-фазовой HPLC (5-95% ацетонитрила/деионизированная вода, 0,1% TFA модификатор, 30-минутный градиент). Выход 1,4 г, 79%. Ион, найденный с помощью LC/MS [М+Н]+ = 510.2.
Стадия с.
Продукт, полученный на стадии-b (1 г, 1,9 ммоль) этого примера перемешивали в метаноле (25 мл) в присутствии гидроксида палладия (200 мг) в атмосфере водорода в течение 2 часов. Смесь фильтровали через целит и концентрировали с получением продукта в виде прозрачного масла, которое использовали без дополнительной очистки. Выход 0,73 г, 89%. Ион, найденный с помощью LC/MS [М+Н]+ = 420.4.
Стадия d.
Продукт, полученный на стадии-с (0,73 г, 1,7 ммоль), паргил-peg4-тозилат (0,91 г, 2,4 ммоль) и диизопропилэтиламин (0,76 г, 5,9 ммоль) перемешивали в DMF (5 мл) при 85°С в течение 4 часов. Смесь концентрировали на роторном испарителе, затем очищали обращенно-фазовой HPLC (5-95% ацетонитрила/деионизированная вода, 0,1% TFA модификатор, 30-минутный градиент) с получением продукта в виде прозрачного вязкого масла. Выход 0.89 г, 82%. Ион, найденный с помощью LC/MS [М+Н]+ = 634.4.
Стадия е.
Продукт, полученный на стадии-d (0,89 г, 1,4 мл) перемешивали в 4N HCl (в диоксане) в течение 45 минут при температуре окружающей среды. Смесь концентрировали на роторном испарителе и подвергали азеотропной перегонке (3х) с бензолом. Полученный остаток растворяли в деионизированной воде (15 мл), замораживали и лиофилизировали, получая продукт в виде прозрачного масла, бис-HCl-соли. Выход 0,65 г, 91%. Ион, найденный с помощью LC/MS [М+Н}+ = 434.4.
Стадия f.
Остальные четыре стадии синтеза этого соединения были аналогичны тем, которые использовали в синтезе в примере 143, промежуточное соединение-81. Ионы, найденные с помощью LCMS: (М+2Н)/2=575.8
Пример 146. Альтернативный синтез промежуточного соединения-83
Продукт, описанный в примере 145, промежуточное соединение-83, может быть получен альтернативно, используя приведенную выше схему реакции, специалистом в данной области с использованием способов, описанных в этом патенте.
Пример 147. Эксперименты с серийным пассажем для отбора устойчивых вирусов гриппа
Чтобы оценить потенциал развития лекарственно-устойчивых мутантных вирусных штаммов в условиях селективного давления ингибиторов вирусов, были проведены исследования серийных пассажей с конъюгатами 6 и 33 по сравнению с препаратами сравнения осельтамивиром и балоксавиром. Исследования серийных пассажей проводили с использованием клеток А549 или MDCK. Пассажи проводили следующим образом: 150000 клеток А549 или MDCK засевали на лунку (12-луночный планшет) в 500 мкл DMEM, 10% FBS, 1% PS, 1% NaPyr и 1% HEPES, и инкубировали в течение приблизительно 24 часов. Когда клетки достигли примерно 80% конфлюэнтности, их один раз промывали PBS и инкубировали в течение 2 часов в присутствии соединений или только PBS в нормальных условиях культивирования. Концентрации тестируемых препаратов были оптимизированы должным образом для максимального ингибирования вирусов при сохранении достаточного продуцирования вирусов для последующих пассажей. Концентрации исследуемых образцов, использованных в экспериментах с сериным пассажем, показаны на фиг. 67 и 68. Затем клетки инфицировали при MOI 0,01 или 0,05 (клетки MDCK и А549, соответственно; 150 мкл, разведенные в инфекционном буфере) в течение 1 часа при комнатной температуре в буфере, содержащем PBS, бычий альбумин 35% и Ca2+/Mg2+, с последующим удалением инокулята и однократной промывкой клеток DMEM 1% PS, 1% NaPyr и 1% HEPES (без FBS). Затем клетки инкубировали в течение 24 часов в присутствии тестируемых препаратов, разведенных в DMEM 1% PS, 1% NaPyr, 1% HEPES и 1 мкг/мл трипсина, обработанного ТРСК. После инкубации собирали вирусные супернатанты, а клетки и дебрис удаляли центрифугированием (5 мин, 4°С, 1400 × g). Затем супернатанты использовали для:
i. количественного определения титр вируса с помощью анализа бляшек;
ii проведения анализа гемагглютинации, чтобы определить, ускользнул ли вирус от ингибирования соединения;
iii повторного инфицирования только что засеянных клеток А549 или MDCK в присутствии соединений.
Процесс повторяли для 10 пассажей или до тех пор, пока не наблюдалась резистентность к осельтамивиру и балоксавиру в контроле. Как только повышенные титры в присутствии лекарств обнаруживаются при двух последовательных пассажах, вирусы могут быть очищены от бляшек. После очистки бляшек все 8 сегментов генома можно секвенировать и сравнивать с контрольным вирусом, обработанным PBS, для обнаружения ускользающих мутаций. Сводные данные о двух различных экспериментах с серийным пассажем показаны на фиг. 67 и 68. В эксперименте, представленном на фиг. 67, конъюгат 6 сравнивали с осельтамивиром и балоксавиром с использованием клеток А549, инфицированных A/California/04/09/ H1N1 pdm. Конъюгат 6, балоксавир и осельтамивир использовали в концентрациях 0,5, 0,5 и 200 нМ, соответственно. Для конъюгата 6 в течение 11 пассажей не наблюдалось увеличения титра вируса (что свидетельствует об отсутствии появления устойчивых мутантов), тогда как титры балоксавира и осельтамивира увеличивались до уровней, аналогичных тем, которые наблюдались в контроле PBS после пассажей 5 и 11, соответственно. В эксперименте, представленном на фиг.68, конъюгаты 6 и 33 сравнивали с осельтамивиром и балоксавиром с использованием клеток MDCK, инфицированных A/WSN/1933 H1N1. Конъюгат 6, конъюгат 33, балоксавир и осельтамивир использовали в концентрациях 4 нМ, 2 нМ, 4 нМ и 50 нМ, соответственно. Не наблюдалось увеличения вирусного титра для конъюгатов 6 или 33 в течение 10 пассажей (что свидетельствует об отсутствии появления устойчивых мутантов), в то время как титры балоксавира и осельтамивира увеличились до уровней, аналогичных тем, которые наблюдались в контроле PBS после пассажей 5 и 10, соответственно.
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| ПРОЛЕКАРСТВЕННЫЕ КОМПОЗИЦИИ НА ОСНОВЕ ГИДРОГЕЛЯ ПОПЕРЕЧНО-СШИТОЙ ГИАЛУРОНОВОЙ КИСЛОТЫ И СПОСОБЫ | 2018 |
|
RU2812787C2 |
| ПЕПТИДОМИМЕТИЧЕСКИЕ СОЕДИНЕНИЯ И ИХ КОНЪЮГАТЫ АНТИТЕЛ С ЛЕКАРСТВЕННЫМИ СРЕДСТВАМИ | 2014 |
|
RU2689388C1 |
| АГОНИСТ ГЛЮКОКОРТИКОИДНОГО РЕЦЕПТОРА И ЕГО ИММУНОКОНЪЮГАТЫ | 2017 |
|
RU2745748C2 |
| КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ПРИМЕНЕНИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ МЕТАБОЛИЧЕСКИХ РАССТРОЙСТВ | 2014 |
|
RU2704285C2 |
| АНТИТЕЛА ПРОТИВ СТЕНОЧНОЙ ТЕЙХОЕВОЙ КИСЛОТЫ И ИХ КОНЪЮГАТЫ | 2014 |
|
RU2687044C2 |
| СИСТЕМЫ ДОСТАВКИ С ЗАМЕДЛЕННЫМ ВЫСВОБОЖДЕНИЕМ, СОДЕРЖАЩИЕ БЕССЛЕДНЫЕ ЛИНКЕРЫ | 2018 |
|
RU2772690C2 |
| ПИРРОЛОБЕНЗОДИАЗЕПИНОВЫЕ КОНЪЮГАТЫ АНТИТЕЛО-ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ | 2016 |
|
RU2736725C1 |
| КОНЪЮГАТЫ АНТИ-CD22 АНТИТЕЛО-МАЙТАНСИН И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ | 2016 |
|
RU2744895C2 |
| КОНЪЮГАТЫ СКОНСТРУИРОВАННЫХ АНТИТЕЛ С ЦИСТЕИНОВЫМИ ЗАМЕНАМИ | 2016 |
|
RU2733740C2 |
| КОНЪЮГАТЫ ИНСУЛИНА | 2019 |
|
RU2809189C2 |
Изобретение относится к области биотехнологии. Описана группа изобретений, включающая конъюгат для лечения вирусной инфекции, вызванной вирусом гриппа или парагриппа, или его фармацевтически приемемую соль, применение вышеуказанного конъюгата для лечения вирусной инфекции, вызванной вирусом гриппа или вирусом парагриппа, фармацевтическую композицию для лечения вирусной инфекции, вызванной вирусом гриппа или вирусом парагриппа, содержащую конъюгат или его фармацевтически приемлемую соль, способ лечения субъекта, имеющего вирусную инфекцию, вызванную вирусом гриппа или вирусом парагриппа, и способ профилактического лечения вирусной инфекции, вызванной вирусом гриппа или вирусом парагриппа, у нуждающегося в этом субъекта. Изобретение расширяет арсенал средств для лечения вирусной инфекции, вызванной вирусом гриппа или вирусом парагриппа. 5 н. и 25 з.п. ф-лы, 68 ил., 65 табл., 147 пр.
1. Конъюгат для лечения вирусной инфекции, вызванной вирусом гриппа или вирусом парагриппа, описываемый формулой (D-I):
(D-I)
где каждый А1 и каждый А2 независимо выбран из любой из формул (A-I)-(A-XII):
где R1 выбран из -OH, -NH2, -NHC(=NH)NH2 и -NHC(=NH)NHR6;
R2 и R3, каждый, независимо выбраны из -H, -OH, -F, -Cl и -Br;
R4 выбран из -CO2H, -P(=O)(OH)2, -SO3H;
R5 выбран из -COCH3, -COCF3, -SO2CH3;
X выбран из -O- и -S-;
Y выбран из -O-, -S-, -NR7-, -O(C=O)NR7-, -O(C=S)NR7-, -O(C=O)O-, -O(C=O)-, -NH(C=O)O-, -NH(C=O)-, -NH(C=NH)-, -NH(C=O)NR7-, -NH(C=NH)NR7-, -NH(C=S)NR7-, -NH(C=S)-, -OCH2(C=O)NR7-, -NH(SO2)-, -NH(SO2)NR7-, -OR8-, -NHR8- и -SR8-;
R6 выбран из
R7 выбран из H, (C1-C20)алкила, (C3-C20)циклоалкила, (C3-C20)гетероциклоалкила; (C5-C15)арила и (C2-C15)гетероарила;
R8 выбран из (C3-C20)гетероциклоалкила, (C5-C15)арила и (C2-C15)гетероарила;
каждый E содержит мономер Fc-домена;
n равен 1 или 2;
T представляет собой целое число от 1 до 20,
L представляет собой линкер, ковалентно присоединенный к каждому из E, A1 и A2, где L содержит один или несколько из (C1-C20)алкилена, (C1-C20)гетероалкилена, (C2-C20)алкенилена, (C2-C20)гетероалкенилена, (C2-C20)алкинилена, (C2-C20)гетероалкинилена, (C3-C20)циклоалкилена, (C3-C20)гетероциклоалкилена, (C4-C20)циклоалкенилена, (C4-C20)гетероциклоалкенилена, (C8-C20)циклоалкинилена, (C8-C20)гетероциклоалкинилена, (C5-C15)арилена, (C2-C15)гетероарилена, O, S, NRi, P, карбонила, тиокарбонила, сульфонила, фосфата, фосфорила или имино, где Ri представляет собой H, (C1-C20)алкил, (C1-C20)гетероалкил, (C2-C20)алкенил, (C2-C20)гетероалкенил, (C2-C20)алкинил, (C2-C20)гетероалкинил, (C3-C20)циклоалкил, (C3-C20)гетероциклоалкил, (C4-C20)циклоалкенил, (C4-C20)гетероциклоалкенил, (C8-C20)циклоалкинил, (C8-C20)гетероциклоалкинил, (C5-C15)арил или (С2-C15)гетероарил,
или его фармацевтически приемлемая соль.
2. Конъюгат по п. 1, где L необязательно замещен (C1-C20)алкилом, (C2-C20)алкенилом, (C2-C20)алкинилом, (C5-C15)арилом, C5-C15 алкарилом, (C1-C20)ацилом, (С2-C15)гетероарилом, включающим в общей сложности от одного до десяти гетероатомов, независимо выбранных из группы, состоящей из азота, кислорода и серы; (C1-C20)гетероалкилом, содержащим в сумме от одного до десяти гетероатомов, независимо выбранных из группы, состоящей из азота, кислорода и серы; (C2-C20)гетероалкенилом, содержащим в сумме от одного до десяти гетероатомов, независимо выбранных из группы, состоящей из азота, кислорода и серы; (C2-C20)гетероалкинилом, содержащим от одного до десяти гетероатомов, независимо выбранных из группы, состоящей из азота, кислорода и серы; (С2-C15)гетероалкарилом, содержащим от одного до десяти гетероатомов, независимо выбранных из группы, состоящей из азота, кислорода и серы; галогеном, выбранным из группы, состоящей из F, Cl, Br и I; оксо, циано, нитро, амино, (C1-C20)алкино, гидрокси, (C1-C20)алкокси, (C1-C20)алканоилом, карбонилом, карбамоилом, гуанидинилом, уреидо или амидинильной группой.
3. Конъюгат по п. 1 или 2, где каждый A1 и каждый A2 независимо выбран из любой из формул (A-I) - (A-V):
4. Конъюгат по п. 1, где каждый A1 и каждый A2 независимо выбран из любой из формул (A-VI)-(A-IX):
5. Конъюгат по п. 1, где конъюгат описывается формулой (D-II):
или его фармацевтически приемлемая соль.
6. Конъюгат по п. 1, где конъюгат описывается формулой (D-III):
или его фармацевтически приемлемая соль.
7. Конъюгат по п. 1, где конъюгат описывается формулой (D-IV):
или его фармацевтически приемлемая соль.
8. Конъюгат по п. 1, где конъюгат описывается формулой (D-V):
или его фармацевтически приемлемая соль.
9. Конъюгат по п. 1, где конъюгат описывается формулой (D-VI):
(D-VI)
или его фармацевтически приемлемая соль.
10. Конъюгат по п. 1, где конъюгат описывается формулой (D-VII):
или его фармацевтически приемлемая соль.
11. Конъюгат по п. 1, где конъюгат описывается формулой (D-VIII):
или его фармацевтически приемлемая соль.
12. Конъюгат по п. 1, где конъюгат описывается формулой (D-IX):
или его фармацевтически приемлемая соль.
13. Конъюгат по п. 1, где конъюгат описывается формулой (D-X):
или его фармацевтически приемлемая соль.
14. Конъюгат по любому из пп. 1-13, где L является оксозамещенным.
15. Конъюгат по любому из пп. 1-14, где L содержит не более 250 атомов.
16. Конъюгат по любому из пп. 1-15, где L ковалентно присоединен к атому азота экспонированного на поверхности лизина в Е.
17. Конъюгат по любому из пп. 1-15, где L ковалентно присоединен к атому серы экспонированного на поверхности цистеина в Е.
18. Конъюгат по п. 16 или 17, где n равно 2, и каждый E димеризуется с образованием Fc-домена.
19. Конъюгат по любому из пп. 1-18, где Т равно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10.
20. Применение конъюгата по любому из пп. 1-19 для лечения вирусной инфекции, вызванной вирусом гриппа или вирусом парагриппа.
21. Фармацевтическая композиция для лечения вирусной инфекции, вызванной вирусом гриппа или вирусом парагриппа, содержащая конъюгат по любому из пп. 1-19 или его фармацевтически приемлемую соль и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.
22. Способ лечения субъекта, имеющего вирусную инфекцию, вызванную вирусом гриппа или вирусом парагриппа, включающий введение субъекту эффективного количества конъюгата по любому из пп. 1-19 или композиции по п. 21.
23. Способ профилактического лечения вирусной инфекции, вызванной вирусом гриппа или вирусом парагриппа, у нуждающегося в этом субъекта, включающий введение субъекту эффективного количества конъюгата по любому из пп. 1-19 или композиции по п. 21.
24. Способ по п. 22 или 23, где вирусная инфекция представляет собой вирус гриппа A, B или C, или вирус парагриппа.
25. Способ по любому из пп. 22-24, отличающийся тем, что конъюгат или композицию вводят внутримышечно, внутривенно, внутрикожно, внутриартериально, внутрибрюшинно, внутриочагово, внутричерепно, внутрисуставно, интрапростатически, внутриплеврально, интратрахеально, интраназально, интравитреально, интравагинально, местно, внутриопухолево, перитонеально, подкожно, субконъюнктивально, интравезикулярно, мукозально, внутриперикардиально, внутрипуповинно, внутриглазно, перорально, местно, путем ингаляции, путем инъекции или инфузии.
26. Способ по любому из пп. 22-25, где субъекта лечат вторым терапевтическим агентом.
27. Способ по п. 26, где второй терапевтический агент представляет собой противовирусный агент.
28. Способ по п. 26, где противовирусный агент выбран из осельтамивира, занамивира, перамивира, ланинамивира, амантадина или римантадина.
29. Способ по п. 26, где второй терапевтический агент представляет собой противовирусную вакцину.
30. Способ по п. 29, где противовирусная вакцина вызывает у субъекта иммунный ответ против вируса гриппа A, B или C, или вируса парагриппа.
| WO 2017046625 A1, 23.03.2017 | |||
| WO 2018128826 A1, 12.07.2018 | |||
| US 20170102387 A1, 13.04.2017 | |||
| КОНЪЮГАТЫ, СОДЕРЖАЩИЕ ГИДРОФИЛЬНЫЕ СПЕЙСЕРЫ ЛИНКЕРОВ | 2008 |
|
RU2523909C2 |
