АМИДЫ N-(2-АМИНОПУРИН-6-ИЛ)-6-АМИНОКАПРОНОВОЙ КИСЛОТЫ, ОБЛАДАЮЩИЕ ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ АКТИВНОСТЬЮ, И СПОСОБ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ Российский патент 2016 года по МПК C07D473/16 A61P35/00 

Изобретение относится к области органической химии, а именно к новым производным пурина, которые обладают противоопухолевой активностью и могут найти применение в медицине.

В 2008 году на всей планете рак унес 7,6 миллиона жизней - такие данные приводит в своем информационном бюллетене за февраль 2012 года ВОЗ. Эта цифра колоссальна: она составляет около 13% всех умерших. По типам рака случаи смерти распределяются неравномерно: рак легких - 18,0%; желудка - 9,7%; печени - 9,1%; толстой кишки - 8,0% [http://www.knigamedika.ru/novoobrazovaniya-onkologiya/statistika-zabolevaemosti-rakom.html#ixzz3KkVMzLeZ].

В связи с этим существует острая необходимость в создании новых средств лечения онкологических заболеваний, в первую очередь наиболее летальных нозологий.

Среди производных пурина найдены соединения, обладающие значительной противоопухолевой активностью. В качестве примера можно назвать вошедшие в клиническую практику 6-меркаптопурин, неларабин и др. Однако в связи с важной ролью пурина и его производных в метаболизме опухолевых клеток, особенно биосинтезе ДНК, поиск новых препаратов на основе пурина, избирательно подавляющих рост опухолевых клеток, активно продолжается в настоящее время.

Задача предлагаемого изобретения - получение новой группы соединений, обладающих противоопухолевой активностью и низкой токсичностью, расширяющей арсенал известных противоопухолевых средств, и разработка способа их получения.

Техническим результатом данного изобретения является создание новой группы химических соединений - амидов N-(2-аминопурин-6-ил)-6-аминокапроновой кислоты общей формулы 1 и разработка способа их получения.

Соединения формулы 1, их физико-химические характеристики, а также способ получения в литературе не описаны.

Наиболее близки по строению к соединениям 1 производные пурина, например, формулы 2,

обладающие способностью ингибировать киназу Aurora A [Bioorg. Med. Chem. Lett. 2008, 18, 3978-3981]. Однако сведения об их противоопухолевой активности в литературе отсутствуют. В литературных источниках не имеется сведений о способах получения соединения 2.

Соединения формулы 1 могут быть получены исходя из индивидуальных (S)- и (R)-энантиомеров аминов формулы 3а-f. В результате ацилирования аминов 3а-f хлорангидридом 6-фталимидокапроновой кислоты синтезированы (S)- и (R)-энантиомеры N-(6-фталимидогексаноил) производных гетероциклических аминов 4a-f. В результате удаления фталоильной защиты гидразинолизом и последующей конденсации с 2-ацетамидо-6-хлорпурином получены конъюгаты 2-ацетамидопурина (R)-конфигурации (5а,с,е) и (S-конфигурации (5b,d,f) (с выходом 62-85%). Щелочной гидролиз ацетамидо-группы в соединениях 5a-f приводит к производным пурина 1a-f.

Общая методика осуществления способа

К раствору соответствующего амина 3а-f (7,0 ммоль) и N,N-диэтиланилина (1,04 г, 7,0 ммоль) в дихлорметане (35 мл) добавляют раствор хлорангидрида 6-фталимидокапроновой кислоты (1,96 г, 7,0 ммоль) в дихлорметане (35 мл). Реакционную массу перемешивают при комнатной температуре в течение 6-48 ч, затем промывают водным раствором HCl (2×50 мл), насыщенным водным раствором NaCl (4×30 мл), водным раствором NaHCO₃ (2×30 мл) и водой (2×30 мл). Органический слой сушат MgSO₄ и упаривают. Остаток очищают флеш-хроматографией на силикагеле (элюент бензол-этилацетат), получая амиды 4a-f (выход 68-90%).

К раствору соответствующего амида 4a-f (5,0 ммоль) в этаноле (30 мл) добавляют гидразин гидрат (0,44 мл, 9,0 ммоль) и кипятят в течение 40-120 мин. Реакционную массу упаривают досуха, к остатку добавляют 2 М HCl (32 мл). Осадок отфильтровывают, фильтрат подщелачивают NaOH до рН 12-13, затем экстрагируют подходящим органическим растворителем (3×30 мл). Органический слой сушат и упаривают. Остаток растворяют в диметилацетамиде (4,8 мл) и добавляют к полученному раствору 2-ацетамидо-6-хлорпурин (0,40 г, 1,9 ммоль) и триэтиламин (0,53 мл, 3,8 ммоль). Реакционную массу нагревают при 90-120°С в течение 12-20 ч, затем выливают в воду и выдерживают при 5-10°С в течение 10-48 ч. Осадок отделяют центрифугированием (8000-15000 об/мин), сушат и перекристаллизовывают из водного этанола, получая конъюгаты 5a-f (выход 62-86%).

К N-[6-(2-ацетамидопурин-6-ил)аминогексаноил]аминам 5a-f (0,90 ммоль) добавляют 1 М NaOH (5,6 мл) и перемешивают при комнатной температуре в течение 36-72 ч. Раствор нейтрализуют 1 М HCl до рН 5-6 и упаривают досуха. Остаток очищают флеш-хроматографией (элюент CHCl₃-МеОН), получая соответствующие N-[6-(2-аминопурин-6-ил)аминогексаноил]амины 1a-f (выход 55-98%).

Полученные соединения анализируют следующими методами.

Разработан метод анализа энантиомерного состава конъюгатов 2-аминопурина 1a-f с помощью ВЭЖХ на хиральной неподвижной фазе. Производные 2-аминопурина (R)-ряда (1а,с,е) и (5)-ряда (1b,d,f) получены в оптически чистом виде (ее >99%).

Температуры плавления определяют на приборе SMP3 (Barloworld Scientific, UK). Удельное вращение определяют на поляриметре Perkin Elmer 341. Элементный анализ проводят на анализаторе Perkin Elmer 2400 серии II. Спектры ЯМР ¹Н, ¹⁹F и ¹³С регистрируют на приборе Bruker Avance 500 (рабочая частота 500, 470 и 125 МГц, соответственно) в (CD₃)₂SO с использованием тетраметилсилана и гексафторбензола в качестве внутренних стандартов. Спектры ЯМР регистрируют при температуре 100°С (соединения 1a-f, 4а и 5a-f) или 25°С (соединения 4b-g). Химические сдвиги приведены в миллионных долях (м.д.).

ВЭЖХ анализ соединений 1а и 1b проводят на приборе Agilent 1200 с использованием колонки Kromasil Cellucoat (150×4,6 мм, 5 мкм); скорость потока элюента 0,8 мл/мин, детектирование при 215 нм. ВЭЖХ анализ соединений 1c-f и 5a-f проводят на приборе Agilent 1100 с использованием колонки (S,S)-WHELK-01 (250×4,6 мм, 5 мкм); скорость потока элюента 0,8 мл/мин, детектирование при 215 нм. ВЭЖХ анализ соединений 4a-f проводят на приборе Knauer Smartline-1100 с использованием колонки Chiralcel OD-H (250×4,6 мм, 5 мкм); скорость потока элюента 1,0 мл/мин, детектирование при 220 нм.

Масс-спектры высокого разрешения получают на приборах Bruker maXis Impact HD (соединения 1a, 1b и 5f) и 1200 Infinity с детектором 6540 Accurate-Mass Q-TOF (Agilent Technologies) (соединения 1c-f) (ионизация электрораспылением, режим детектирования положительно заряженных ионов).

Характеристики новых соединений 1a-f, 4a-f, 5a-f приведены в примерах конкретного выполнения.

Примеры конкретного выполнения

Пример 1. Синтез соединения 1а из амина 3а

(3R)-3,4-Дигидро-3-метил-4-(6-фталимидогексаноил)-7,8-дифтор-2H-[1,4]бензоксазин (4а) (стадия 1)

К раствору амина 3а (7,0 ммоль) и N,N-диэтиланилина (1,04 г, 7,0 ммоль) в дихлорметане (35 мл) добавляют раствор хлорангидрида 6-фталимидокапроновой кислоты (1,96 г, 7,0 ммоль) в дихлорметане (35 мл). Реакционную массу перемешивают при комнатной температуре в течение 24 ч, затем промывают 4 М HCl (2×50 мл), насыщенным раствором NaCl (4×30 мл), 5% раствором NaHCO₃ (2×30 мл) и водой (2×30 мл). Органический слой сушат MgSO₄ и упаривают. Остаток очищают флеш-хроматографией на силикагеле (элюент бензол-этилацетат 90:10). Выход 2,31 г (77%). Бесцветное густое масло. [α]_D ²⁰=-68,2 (с 1,0, CHCl₃). Ее >99%. ВЭЖХ (Chiralcel OD-H, н-гексан-iPrOH 5: 1): τ 22,0 мин. Спектр ЯМР ¹Н: δ=1,11 (д, J=6,8 Гц, 3 Н, Me); 1,30-1,38 (м, 2 Н, 2×Н-4 гексаноил); 1,59-1,68 (м, 4 Н, 2×Н-3 и 2×Н-5 гексаноил); 2,42-2,50 (м, 1 Н, Н-2 В гексаноил, перекрывание с сигналом ДМСО); 2,55-2,63 (м, 1 Н, Н-2А гексаноил); 3,58 (т, J=7,0 Гц, 2 Н, 2×Н-6 гексаноил); 4,12 (д. д, J=11,0,2,8 Гц, 1 Н, Н-2 В); 4,31 (д. д, J=11,0, 1,5 Гц, 1 Н, Н-2А); 4,72 (к. д. д, J=6,8, 2,8, 1,5 Гц, 1 Н, Н-3); 6,78-6,85 (м, 1 Н, Н-6); 7,53 (д. д. д, J=9,3, 5,4, 2,5 Гц, 1 Н, Н-5); 7,78-7,83 (м, 4 Н, Phth). Спектр ЯМР ¹⁹F: δ=1,99 (д. д. д, J=20,9, 8,2, 2,5 Гц, 1 F, F-8); 20,08 (д. д. д, J=20,9, 10,1, 5,4 Гц, 1 F, F-7). Спектр ЯМР ¹³С: δ=15,07; 24,20; 25,74; 27,68; 33,23; 37,22; 44,80; 69,80; 106,72 (д, J=17,8 Гц); 119,20 (м); 121,74; 122,89; 131,52; 134,27; 135,65 (д. д, J=9,8, 2,7 Гц); 138,88 (д. д, J=243,3, 15,4 Гц); 146,44 (д. м, J=241,8 Гц); 167,85, 170,82. Найдено: С 64,54; Н 4,99; F 8,82; N 6,28. Вычислено для C₂₃H₂₂F₂N₂O₄ (М 428,43): С 64,48; Н 5,18; F 8,87; N 6,54.

(3R)-4-[6-(2-Ацетамидопурин-6-ил)аминогексаноил]-3,4-дигидро-3-метил-7,8-дифтор-2H-[1,4]бензоксазин (5а) (стадия 2).

К раствору амида 4а (2,14 г, 5,0 ммоль) в этаноле (30 мл) добавляют гидразин гидрат (0,44 мл, 9,0 ммоль) и кипятят в течение 80 мин. Реакционную массу упаривают досуха, к остатку добавляют 2 М HCl (32 мл). Осадок отфильтровывают, фильтрат нейтрализуют Na₂CO₃ и подщелачивают NaOH до рН 12-13, затем экстрагируют диэтиловым эфиром (3×30 мл). Органический слой сушат NaOH и упаривают. Остаток растворяют в диметилацетамиде (4,8 мл) и добавляют к полученному раствору 2-ацетамидо-6-хлорпурин (0,40 г, 1,9 ммоль) и триэтиламин (0,53 мл, 3,8 ммоль). Реакционную массу нагревают при 100°С в течение 20 ч, затем выливают в воду (50 мл) и выдерживают при 5°С 16 ч. Осадок отделяют центрифугированием (15000 об/мин), сушат и перекристаллизовывают из 95% этанола. Дополнительное количество соединения 5а получают из маточного раствора с помощью флеш-хроматографии на силикагеле (элюент CHCl₃-МеОН от 100:0 до 95:5). Выход 0,61 г (68%). Бесцветный порошок, т.пл. 195-196°С. [α]_D ²⁰=-41,7 (с 1,0, ДМФА). Ее>99%. ВЭЖХ (S,S)-WHELK-01, МеОН-H₂O 80:20): τ 21,8 мин. Спектр ЯМР ¹H: δ=1,10 (д, J=6,9 Гц, 3 Н, Me); 1,35-1,45 (м, 2 Н, 2×Н-4 гексаноил); 1,59-1,72 (м, 4 Н, 2×Н-3 и 2×Н-5 гексаноил); 2,26 (с, 3 Н, Ас); 2,46 (м, 1 Н, Н-2В гексаноил, перекрывание с сигналом ДМСО); 2,60 (д. т, J=15,3, 7,5 Гц, 1 Н, Н-2А гексаноил); 3,55 (м, 2 Н, 2×Н-6 гексаноил); 4,12 (д. д, J=10,9, 2,8 Гц, 1 Н, Н-2 В); 4,32 (д. д, J=10,9, 1,3 Гц, 1 Н, Н-2А); 4,71 (к. д. д, J=6,8, 2,8, 1,5 Гц, 1 Н, Н-3); 6,82 (д. д, J=9,7, 9,7, 8,4 Гц, 1 Н, Н-6); 7,04 (с, 1 Н, NH-6 пурина); 7,56 (д. д. д, J=9,5, 5,4, 2,5 Гц, 1 Н, Н-5); 7,83 (с, 1 Н, Н-8 пурина); 9,05 (с, 1 Н, NH-Ac); 12,37 (уш. с, 1Н, NH-9 пурина). Спектр ЯМР ¹⁹F: δ=1,99 (д. д. д, J=21,0, 8,2, 2,4 Гц, 1 F, F-8); 20,09 (д. д. д, J=20,7, 10,3, 5,4 Гц, 1 F, F-7). Спектр ЯМР ¹³С: δ=14,61; 23,74; 23,97; 25,50; 28,54; 33,03; 39,5 (перекрывание с сигналом ДМСО); 44,43; 69,64; 106,20 (д, J=18,0 Гц); 115,34; 118,73 (м); 121,67; 135,57 (д, J=8,9 Гц); 137,18; 138,64 (д. д, J=244,2, 15,2 Гц); 146,26 (д. д, J=241,9, 9,7 Гц); 150,28; 152,30; 154,28; 168,84; 170,58. Найдено: С 56,06; Н 5,28; F 8,14; N 20,43. Вычислено для C₂₂H₂₅F₂N₇O₃ (473,49): С 55,81; Н 5,32; F 8,02; N 20,71.

(3R)-4-[6-(2-Аминопурин-6-ил)аминогексаноил]-3,4-дигидро-3-метил-7,8-дифтор-2H-[1,4]бензоксазин (1а) (стадия 3)

Смесь ацетамида 5а (0,43 г, 0,90 ммоль) и 1 М NaOH (5,6 мл) перемешивают при комнатной температуре в течение 48 ч, затем нейтрализуют 1 М HCl до рН 5-6 и упаривают досуха. Остаток очищают с помощью флеш-хроматографии на силикагеле (элюент CHCl₃-МеОН от 100: 0 до 90: 10). Выход 0,214 г (55%). Бесцветный порошок, т. пл. 110-114°С. [α]_D ²⁰=-42,6 (с 0,7, ДМФА). Ее 99,2%. ВЭЖХ (Kromasil Cellucoat, MeCN-H₂O 25: 75): τ 23,8 мин. Спектр ЯМР ¹Н: δ=1,12 (д, J=6,9 Гц, 3 Н, Me); 1,37-1,42 (м, 2 Н, 2×Н-4 гексаноил); 1,58-1,68 (м, 4 Н, 2×Н-3 и 2×Н-5 гексаноил); 2,45-2,51 (м, 1 Н, Н-2 В гексаноил, перекрывается с сигналом ДМСО); 2,58-2,64 (м, 1 Н, Н-2А гексаноил); 3,48-3,52 (м, 2 Н, 2×Н-6 гексаноил); 4,13 (д. д, J=11,0, 2,8 Гц, 1 Н, Н-2 В); 4,32 (д. д, J=11,0, 1,4 Hz, 1 Н, Н-2А); 4,70-4,76 (м, 1 Н, Н-3); 5,25 (уш. с, 2 Н, NH₂); 6,50 (уш. с, 1 Н, NH-6 гексаноил); 6,84 (д. д. д, J=9,8, 9,8, 8,3 Гц, 1 Н, Н-6); 7,54-7,58 (м, 2 Н, Н-5 и Н-8 пурина); 11,62 (уш. с, 1 Н, Н-9 пурина). Спектр ЯМР ¹⁹F: δ=1,98 (д. д. д, J=21,0, 8,2, 2,2 Гц, 1 F, F-8), 20,05-20,12 (м, 1 F, F-7). Спектр ЯМР ¹³С: δ=14,63; 23,99; 25,51; 28,73; 33,06; 39,5 (перекрывается с сигналом ДМСО); 44,45; 69,52; 106,22 (д, J=18,1 Гц); 112,30; 118,75 (д. д, J=7,8,4,2 Гц); 121,67; 134,79 (м); 135,57 (д. д, J=10,1,3,1 Гц); 138,64 (д. д,7=243,9, 15,4 Гц); 146,26 (д. д, J=242,1, 10,1 Гц); 152,08; 154,34; 159,49; 170,61. Масс-спектр высокого разрешения: вычислено для C₂₀H₂₄F₂N₇O₂ [М+Н]⁺ 432,1954; найдено 432,1953.

Пример 2. Аналогично примеру 1 из соединения 3b получают соединение 1b через промежуточные соединения 4b и 5b.

(3S)-3,4-Дигидро-3-метил-4-(6-фталимидогексаноил)-7,8-дифтор-2H-[1,4]бензоксазин (4b)

Выход 68%. Бесцветное густое масло. [α]_D ²⁰=+67,7 (с 0,9, CHCl₃). Ее >99%. ВЭЖХ (Chiralcel OD-H, н-гексан-iPrOH 5:1): τ 28,5 мин. Спектры ЯМР ¹Н, ¹⁹F и ¹³С идентичны спектрам соединения 4а (Пример 1). Найдено: С 64,34; Н 5,44; F 8,52; N 6,43. Вычислено для C₂₃H₂₂F₂N₂O₄ (М 428,43): С 64,48; Н 5,18; F 8,87; N 6,54.

(3S)-4-[6-(2-Ацетамидопурин-6-ил)аминогексаноил]-3,4-дигидро-3-метил-7,8-дифтор-2H-[1,4]бензоксазин (5b)

Выход 62%. Бесцветный порошок, т.пл. 186-188°С. [α]_D ²⁰ =+42,8 (с 1,0, ДМФА). Ее>99%. ВЭЖХ ((S,S)-WHELK-01, МеОН-Н₂O 80:20): τ 16,2 мин. Спектры ЯМР ¹Н, ¹⁹F и ¹³С идентичны спектрам соединения 5а (Пример 1). Найдено: С 55,62; Н 5,37; F 7,86; N 20,67. Вычислено для C₂₂H₂₅F₂N₇O₃ (473,49): С 55,81; Н 5,32; F 8,02; N 20,71.

(3S)-4-[6-(2-Аминопурин-6-ил)аминогексаноил]-3,4-дигидро-3-метил-7,8-дифтор-2H-[1,4]бензоксазин (1b)

Выход 75%. Бесцветный порошок, т. пл. 109-113°С. [α]_D ²⁰=+43,8 (с 0,3, ДМФА). Ее>99,5%. ВЭЖХ (Kromasil Cellucoat, MeCN-H₂O 25:75): τ 26,9 мин. Спектры ЯМР идентичны спектрам соединения 1а (Пример 1). Масс-спектр высокого разрешения: вычислено для C₂₀H₂₄F₂N₇O₂ [М+Н]⁺ 432,1954; найдено 432,1956.

Пример 3. Аналогично примеру 1 из соединения 3с получают соединение 1 с через промежуточные соединения 4с и 5с.

(2R)-2-Метил-1-(6-фталимидогексаноил)-1,2,3,4-тетрагвдрохинолин (4с)

Выход 90%. Бесцветное масло. [α]_D ²⁰=-192 (с 1,1, CHCl₃). Ее 97%. ВЭЖХ (Chiralcel OD-H, н-гексан-iPrOH-МеОН 20: 0,6: 0,4): τ 30,6 мин. Спектр ЯМР ¹Н: 8=0,99 (д, J=6,5 Гц, 3 Н, Me); 1,13-1,26 (м, 3 Н, 2×Н-4 гексаноил и Н-3В); 1,46-1,55 (м, 4 Н, 2×Н-3 и 2×Н-5 гексаноил); 2,19-2,27 (м, 2 Н, Н-2 В гексаноил и Н-3 А); 2,35-2,50 (м, 2 Н, Н-2А гексаноил и Н-4 В); 2,58 (д. д. д, J=14,8, 5,0, 5,0 Гц, 1 Н, Н-4А); 3,51 (т, J=7,0 Гц, 2 Н, 2×Н-6 гексаноил); 4,62 (м, 1 Н, Н-2); 7,09-7,12 (м, 1 Н, Н-6); 7,17-7,20 (м, 2 Н, Н-5 и Н-7); 7,22-7,27 (м, 1 Н, Н-8); 7,82-7,87 (м, 4 Н, Phth). Спектр ЯМР ¹³С: δ=20,02; 24,66; 25,20; 25,73; 27,61; 32,01; 33,43; 37,18; 47,54; 122,88; 125,09; 125,82; 126,02; 127,30; 128,22; 131,51; 134,27; 134,72 (уш. с); 137,05; 167,81; 171,04. Найдено: С 73,82; Н 6,84; N 7,04. Вычислено для C₂₄H₂₆N₂O₃ (М 390,47): С 73,82; Н 6,71; N 7,17.

(2R)-1-[6-(2-Ацетамидопурин-6-ил)аминогексаноил]-2-метил-1,2,3,4-тетрагидрохинолин (5с)

Выход 71%. Бесцветный порошок, т. пл. 216-217°С. [α]_D ²⁰=-167 (с 1,0, ДМФА). Ее>99%. ВЭЖХ ((S,S)-WHELK-01, МеОН-H₂O 80:20): τ 20,9 мин. Спектр ЯМР ¹Н: δ=1,00 (д, J=6,5 Гц, 3 Н, Me); 1,26-1,33 (m, 3 Н, 2×Н-4 гексаноил и Н-3В); 1,49-1,62 (м, 4 Н, 2×Н-3 и 2×Н-5 гексаноил); 2,22 (д. т, J=7,5, 5,7 Гц, 1 Н, Н-2В гексаноил / Н-3А); 2,27 (с, 3 H, Ас); 2,30 (д. т, J=15,1, 7,5 Гц, 1 Н, Н-2 В гексаноил / Н-3А); 2,39-2,46 (м, 2 Н, Н-2А гексаноил и Н-4 В); 2,58 (д. т, J=15,1, 5,5 Гц, 1 Н, Н-4А); 3,49 (м, 2 Н, 2×Н-6 гексаноил); 4,68 (т. д, J=6,7, 6,7 Hz, 1 Н, Н-2); 7,03 (уш. с, 1 Н, NH-6 гексаноил); 7,08 (м, 1 Н, Н-6); 7,15 (м, 2 Н, Н-5 и Н-7); 7,22 (м, 1 Н, Н-8); 7,84 (с, 1 Н, Н-8 пурина); 9,08 (с, 1Н, NH-Ac); 12,38 (уш. с, 1 Н, Н-9 пурина). Спектр ЯМР ¹³С: δ=19,35; 23,77; 24,39; 24,57; 25,53; 28,53; 31,36; 33,25; 39,5 (перекрывается с сигналом ДМСО); 46,97; 115,36; 124,49; 125,33; 125,40; 126,85; 133,99; 136,90; 137,23; 137,34; 152,29; 154,20; 168,86; 170,80. Найдено: С 63,30; Н 6,64; N 22,44. Вычислено для C₂₃H₂₉N₇O₂ (435,53): С 63,43; Н 6,71; N 22,51.

(2R)-1-[6-(2-Аминопурин-6-ил)аминогексаноил]-2-метил-1,2,3,4-тетрагидрохинолин (1 с)

Выход 69%. Бесцветный порошок, т.пл. 100-102°С. [α]_D ²⁰=-170 (с 0,7, ДМФА). Ее>99%. ВЭЖХ ((S,S)-WHELK-01, МеОН-H₂O 75:25): τ 25,5 мин. Спектр ЯМР ¹Н: δ=1,00 (д, J=6,5 Гц, 3 Н, Me); 1,25-1,34 (м, 3 Н, Н-3В, 2×Н-4 гексаноил); 1,48-1,60 (м, 4 Н, 2×Н-3 и 2×Н-5 гексаноил); 2,22-2,33 (м, 2 Н, Н-2 В гексаноил и Н-3А); 2,40-2,47 (м, 2 Н, Н-2А гексаноил и Н-4 В); 2,60 (д. д. д, J=15,1, 5,5, 5,5 Гц, 1 Н, Н-4А); 3,42-3,47 (м, 2 Н, 2×Н-6 гексаноил); 4,69 (д. д. к, J=6,8, 6,7, 6,5 Гц, 1 Н, Н-2); 5,31 (уш. с, 2 Н, NH₂); 6,45 (уш. с, 1 Н, NH-6 гексаноил); 7,09 (д. д. д, J=7,8, 7,3, 1,3 Hz, 1 Н, Н-6); 7,14-7,17 (м, 2 Н, Н-5 и Н-7); 7,22 (д. д, J=8,1, 1,3 Hz, 1 Н, Н-8); 7,57 (с, 1 Н, Н-8 пурина); 11,72 (уш. с, 1 Н, Н-9 пурина). Спектр ЯМР ¹³С: δ=19,15; 24,26; 24,39; 25,42; 28,55; 31,17; 33,16; 39,5 (перекрывается с сигналом ДМСО); 46,84; 111,98; 124,32; 125,20; 125,24; 126,73; 133,79; 135,02; 136,88; 151,89; 154,13; 159,07; 170,73. Масс-спектр высокого разрешения: вычислено для C₂₁H₂₈N₇O [М+Н]⁺ 394,2350; найдено 394,2354.

Пример 4. Аналогично примеру 1 из соединения 3d получают соединение 1d через промежуточные соединения 4d и 5d.

(2S)-2-Метил-1-(6-фталимидогексаноил)-1,2,3,4-тетрагидрохинолин (4d)

Выход 80%. Бесцветное масло. [α]_D ²⁰=+201 (с 1,3, CHCl₃). Ее>99%. ВЭЖХ (Chiralcel OD-H, н-гексан-iPrOH-МеОН 20:0,6:0,4): τ 28,2 мин. Спектры ЯМР ¹Н и ¹³С идентичны спектрам соединения 4с (Пример 3). Найдено: С 73,73; Н 6,58; N 6,81. Вычислено для C₂₄H₂₆N₂O₃ (М 390,47): С 73,82; Н 6,71; N 7,17.

(2S)-1-[6-(2-Ацетамидопурин-6-ил)аминогексаноил]-2-метил-1,2,3,4-тетрагидрохинолин (5d)

Выход 85%. Бесцветный порошок, т.пл. 216-217°С. [α]_D ²⁰=+167 (с 1,0, ДМФА). Ее>99%. ВЭЖХ ((S,S)-WHELK-01, МеОН-H₂O 80:20): τ 15,9 мин. Спектры ЯМР ¹Н и ¹³С идентичны спектрам соединения 5с (Пример 3). Найдено: С 63,28; Н 6,85; N 22,48. Вычислено для C₂₃H₂₉N₇O₂ (435,53): С 63,43; Н 6,71; N 22,51.

(2S)-1-[6-(2-Аминопурин-6-ил)аминогексаноил]-2-метил-1,2,3,4-тетрагидрохинолин (1d)

Бесцветный порошок, т.пл. 101-103°С. [α]_D ²⁰=+165 (с 0,7, ДМФА). Ее>99%. ВЭЖХ ((S,S)-WHELK-01, МеОН-H₂O 75:25): τ 19,0 мин. Спектры ЯМР идентичны спектрам соединения 1с (Пример 3). Масс-спектр высокого разрешения: вычислено для C₂₁H₂₈N₇O [М+Н]⁺ 394,2350; найдено 394,2351.

Пример 5. Аналогично примеру 1 из соединения 3е получают соединение 1е через промежуточные соединения 4е и 5е.

(2R)-2-Метил-1-(6-фталимидогексаноил)-6-фтор-1,2,3,4-тетрагидрохинолин (4е)

Выход 89%. Бесцветное масло. [α]_D ²⁰=-172 (с 0,8, CHCl₃). Ее 99%. ВЭЖХ (Chiralcel OD-H, н-гексан-iPrOH-МеОН 10:0,8:0,2): τ 21,8 мин. Спектр ЯМР ^lH: δ=0,98 (д, J=6,5 Гц, 3 Н, Me); 1,13-1,22 (м, 3 Н, 2×Н-4 гексаноил и Н-3В); 1,45-1,54 (м, 4 Н, 2×Н-3 и 2×Н-5 гексаноил); 2,15-2,27 (м, 2 Н, Н-2 В гексаноил и Н-3А); 2,35-2,50 (м, 2 Н, Н-2^а гексаноил и Н-4 В); 2,56-2,63 (м, 1 Н, Н-4А); 3,51 (т, J=7,0 Гц, 2 Н, 2×Н-6 гексаноил); 4,61 (м, 1 Н, Н-2); 7,00 (м, 1 Н, Н-7); 7,07 (м, 1 Н, Н-5); 7,30 (уш. с, 1 Н, Н-8); 7,85 (м, 4 Н, Phth). Спектр ЯМР ¹⁹F: δ=45,43 (уш. с, F-6). Спектр ЯМР ¹³С: δ=19,88; 24,56; 25,23; 25,72; 27,62; 31,52; 33,31; 37,17; 47,48; 95,34; 112,60 (д, J=22,2 Гц); 113,88 (д, J=22,4 Гц); 122,88; 127,56 (д, J=8,5 Гц); 131,51; 133,23; 134,26; 159,18 (д, J=243,0 Гц); 167,80; 170,99. Найдено: С 70,40; Н 6,13; F 4,28; N 6,61. Вычислено для C₂₄H₂₅FN₂O₃ (М 408,47): С 70,57; Н 6,17; F 4,65; N6,86.

(2R)-1-[6-(2-Ацетамидопурин-6-ил)аминогексаноил]-2-метил-6-фтор-1,2,3,4-тетрагидрохинолин (5е)

Выход 74%. Бесцветный порошок, т. пл. 200-202°С. [α]_D ²⁰=-137 (с 1,0, ДМФА). Ее>99%. ВЭЖХ ((S,S)-WHELK-01, МеОН-H₂O 80:20): τ 20,4 мин. Спектр ЯМР ¹H: δ=0,99 (д, J=6,5 Гц, 3 Н, Me); 1,27-1,34 (м, 3 Н, 2×Н-4 гексаноил и Н-3В); 1,51-1,60 (м, 4 Н, 2×Н-3 и 2×Н-5 гексаноил); 2,26 (с, 3 Н, Ас); 2,19-2,31 (м, 2 Н, Н-2 В гексаноил и Н-3А); 2,39-2,49 (м, 2 Н, Н-2А гексаноил и Н-4 В); 2,61 (д. д. д, J=15,3, 5,6, 5,6 Гц, 1 Н, Н-4А); 3,50 (м, 2 Н, 2×Н-6 гексаноил); 4,67 (д. т, J=6,6, 6,6 Гц, 1 Н, Н-2); 6,92-7,05 (м, 3 Н, NH-6 гексаноил, Н-5 и Н-8); 7,26 (д. д, J=8,7, 5,2 Гц, 1 Н, Н-7); 7,82 (с, 1 Н, Н-8 пурина); 9,05 (с, 1 Н, NH-Ac); 12,32 (уш. с, 1 Н, Н-9 пурина). Спектр ЯМР ¹⁹F: δ=45,06 (д. д. д, J=8,2, 5,9, 5,9, F-6). Спектр ЯМР ¹³С: δ=19,19; 23,75; 24,30; 24,59; 25,52; 28,52; 30,88; 33,12; 39,5 (перекрывается с сигналом ДМСО); 46,95; 111,89; 111,98 (д, J=22,6 Гц); 113,35 (д, J=22,4 Гц); 127,01 (д, J=8,4 Гц); 133,05; 136,29 (д, J=7,2 Гц); 137,13; 137,37; 152,28; 154,09; 158,84 (д, J=242,4 Гц); 168,83; 170,75. Найдено С 60,93; Н 6,32; F 3,97; N 21,79. Вычислено для C₂₃H₂₈FN₇O₂ (453,52): С 60,91; Н 6,22; F 4,19; N 21,62.

(2R)-1-[6-(2-Аминопурин-6-ил)аминогексаноил]-2-метил-6-фтор-1,2,3,4-тетрагидрохинолин (1е)

Выход 98%. Бесцветный порошок, т.пл. 95-100°С. [α]_D ²⁰=-132 (с 0,8, ДМФА). Ее>99%. ВЭЖХ ((S,S)-WHELK-01, МеОН-H₂O 75:25): τ 27,2 мин. Спектр ЯМР ¹Н: δ=1,00 (д, J=6,5 Гц, 3 Н, Me); 1,27-1,36 (м, 3 Н, Н-3В и 2×Н-4 гексаноил); 1,51-1,60 (м, 4 Н, 2×Н-3 и 2×Н-5 гексаноил); 2,20-2,32 (м, 2 Н, Н-2В гексаноил и Н-3А); 2,40-2,47 (м, 2 Н, Н-2 А гексаноил и Н-4 В); 2,62 (д. д. д, J=15,4, 5,6, 5,6 Гц, 1 Н, Н-4А); 3,47 (м, 2 Н, 2×Н-6 гексаноил); 4,68 (д. д. к, J=6,7, 6,6, 6,5 Гц, 1 Н, Н-2); 5,44 (уш. с, 2 Н, NH₂); 6,69 (уш. с, 1 Н, NH-6 гексаноил); 6,92-7,00 (м, 2 Н, Н-5 и Н-7); 7,28 (д. д, J=8,7, 5,2 Гц, 1 Н, Н-8); 7,61 (с, 1 Н, Н-8 пурина); 11,3-12,0 (уш. с, 1 Н, Н-9 пурина). Спектр ЯМР ¹⁹F: δ=45,02-45,08 (м, F-6). Спектр ЯМР ¹³С: δ=19,21; 24,33; 24,62; 25,54; 28,65; 30,90; 33,15; 39,5 (перекрывается с сигналом ДМСО); 46,98; 111,77; 112,01 (д, J=22,6 Гц); 113,37 (д, J=22,6 Гц); 127,04 (д, J=8,8 Гц); 133,08 (д, J=2,5 Гц); 135,33; 136,31 (д, J=7,5 Гц); 151,77; 154,12; 158,86 (д, J=242,7 Гц); 159,04; 170,81. Масс-спектр высокого разрешения: вычислено для C₂₁H₂₇FN₇O [М+Н]⁺ 412,2256; найдено 412,2261.

Пример 6. Аналогично примеру 1 из соединения 3f получают соединение 1f через промежуточные соединения 4f и 5f.

(2S)-2-Метил-1-(6-фталимидогексаноил)-6-фтор-1,2,3,4-тетрагидрохинолин (4f)

Выход 77%. Бесцветное масло. [α]_D ²⁰=+171 (с 1,0, CHCl₃). Ее>99%. ВЭЖХ (Chiralcel OD-H, н-гексан-iPrOH-МеОН 10: 0,8: 0,2): τ 19,6 мин. Спектры ЯМР ¹Н, ¹⁹F и ¹³С идентичны спектрам соединения 4е (Пример 5). Найдено: С 70,45; Н 6,25; F 4,55; N 6,84. Вычислено для C₂₄H₂₅FN₂O₃ (М 408,47): С 70,57; Н 6,17; F 4,65; N 6,86.

(2S)-1-[6-(2-Ацетамидопурин-6-ил)аминогексаноил]-2-метил-6-фтор-1,2,3,4-тетрагидрохинолин (5f)

Выход 86%. Бесцветный порошок, т.пл. 198-201°С. [α]_D ²⁰=+137 (с 1,0, ДМФА). Ее>99%. ВЭЖХ ((S,S)-WHELK-01, МеОН-H₂O 80: 20): τ 16,0 мин. Спектры ЯМР ¹Н, ¹⁹F и ¹³С идентичны спектрам соединения 5е (Пример 5). Масс-спектр высокого разрешения: вычислено для C₂₃H₂₈FN₇O₂ [М+Н]⁺ 454,2361; найдено 454,2363.

(2S)-1-[6-(2-Аминопурин-6-ил)аминогексаноил]-2-метил-6-фтор-1,2,3,4-тетрагидрохинолин (1f)

Выход 70%. Бесцветный порошок, т.пл. 94-98°С. [α]_D ²⁰=+140 (с 0,7, ДМФА). Ее>99%. ВЭЖХ ((S,S-WHELK-01, МеОН-H₂O 75:25): τ 21,7 мин. Спектры ЯМР идентичны спектрам соединения 1е (Пример 5). Масс-спектр высокого разрешения: вычислено для C₂₁H₂₇FN₇O [М+Н]⁺ 412,2256; найдено 412,2258.

Биологическая активность

Новые соединения исследованы в лаборатории Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН (ИОГен РАН), г. Москва.

Изучение противоопухолевой активности в опытах in vitro соединений проводились с использованием МТТ-теста на модели линии клеток НТ-29 (карцинома толстой кишки). МТТ-тест основан на способности дегидрогеназ живых клеток восстанавливать неокрашенные формы 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразола (МТТ-реагента) до голубого кристаллического формазана, растворимого в диметилсульфоксиде, с последующей спектрофотометрией. Восстановление клетками нитросинего тетразолия показывает метаболическую активность дегидрогеназ и является адекватным показателем жизнеспособности клеток в культуре, что позволяет оценить специфическую гибель клеток, вызванную тем или иным цитотоксическим агентом.

Все соединения растворяли в ДМСО до концентрации 500 мг/мл. Каждое соединение исследовали в концентрациях от 0,005 до 5 мг/мл в 3 повторностях. Культуру инкубировали при 37°С и 5% СО₂ в течение 72 часов, после чего среду удаляли, в лунки вносили 200 мкл ростовой среды без сыворотки, добавляли 20 мкл готового раствора МТТ (исходная концентрация 5 мг/мл в фосфатном буфере). О жизнеспособности клеток судили по цветной реакции, развивающейся при восстановлении тетразолия в формазан дегидрогеназами митохондрий. Окраску регистрировали на ридере DTX 880 (Multimode Detector) при длине волны возбуждения 595 нм. Оптическую плотность в лунках, где клетки инкубировались только со средой (контроль), принимали за 100%. Индекс цитотоксичности (IC) рассчитывали по формуле:

IC=(K-О)+100%/K,

где К - контроль; О - опыт.

Полученные данные представлены в таблице 1.

В результате экспериментов определены ингибирующие концентрации (IC-50, мкг/мл) конъюгатов 2-аминопурина с энантиомерно чистыми гетероциклическими аминами 1a,c-f (табл. 1). Установлено, что изученные соединения проявили высокую цитотоксическую активность на модели линии клеток НТ-29, для наиболее активного соединения IC-50 менее 1 мкг/мл и отсутствие токсичности в отношении фибробластов эмбриона человека (ФЭЧ) IC-50 более 50 мкг/мл. Как видно из данных, представленных в табл. 1, противоопухолевая активность существенным образом зависит от стереоконфигурации фрагмента гетероциклического амина.

Производные 2-аминопурина общей формулы 1, включающие остатки энантиомерно чистых хиральных гетероциклических аминов и остаток 6-аминокапроновой кислоты в качестве линкера, отличаются высокой противоопухолевой активностью и низкой токсичностью. При этом биологическая активность зависит как от структуры фрагмента гетероциклического амина, так и от стереоконфигурации. Предложен удобный способ получения соединений общей формулы 1 в оптически чистом виде, предусматривающий использование легкодоступных реагентов, отличающийся простотой проведения синтетических операций и высоким выходом на каждой стадии.

Изобретение относится к амидам N-(2-ацетамидопурин-6-ил)-6-аминокапроновой кислоты общей формулы 1, которые обладают высокой противоопухолевой активностью и низкой токсичностью. В общей формуле 1

(1)

(1a) R=Me, R'=H, X=O, Y=Z=F; (1b) R=H, R'=Me, X=O, Y=Z=F; (1c) R=Me, R'=H, X=CH₂, Y=Z=H; (1d) R=H, R'=Me, X=CH₂, Y=Z=H; (1e) R=Me, R'=H, X=CH₂, Y=Z=F; (1f) R=H, R'=Me, X=CH₂, Y=Z=F. Изобретение также относится к способу получения амидов N-(2-аминопурин-6-ил)-6-аминокапроновой кислоты общей формулы (1). Способ заключается в ацилировании соответствующих энантиомерно чистых хиральных гетероциклических аминов общей формулы

где X, Y, Z, R и R′ имеют вышеуказанные значения, хлорангидридом 6-фталимидокапроновой кислоты, удалении фталоильной защитной группы под действием гидразин гидрата, нуклеофильном замещении полученными соединениями атома хлора в 2-ацетамидо-6-хлорпурине с последующим щелочным гидролизом ацетильной группы в полученном продукте. 2 н. и 1 з.п. ф-лы, 1 табл., 6 пр.

1. Амиды N-(2-аминопурин-6-ил)-6-аминокапроновой кислоты общей формулы 1
(1)
где (1a) R=Me, R'=H, X=O, Y=Z=F;
(1b) R=H, R'=Me, X=O, Y=Z=F;
(1c) R=Me, R'=H, X=CH₂, Y=Z=H;
(1d) R=H, R'=Me, X=CH₂, Y=Z=H;
(1e) R=Me, R'=H, X=CH₂, Y=Z=F;
(1f) R=H, R'=Me, X=CH₂, Y=Z=F.

2. Соединения формулы 1 по п. 1, обладающие противоопухолевой активностью.

3. Способ получения амидов N-(2-аминопурин-6-ил)-6-аминокапроновой кислоты по п. 1 путем ацилирования соответствующих энантиомерно чистых хиральных гетероциклических аминов общей формулы

где X, Y, Z, R и R′ имеют вышеуказанные значения, хлорангидридом 6-фталимидокапроновой кислоты, удаления фталоильной защитной группы под действием гидразин гидрата, нуклеофильного замещения полученными соединениями атома хлора в 2-ацетамидо-6-хлорпурине и последующего щелочного гидролиза ацетильной группы в полученном продукте.