КОМПОЗИЦИИ, СОДЕРЖАЩИЕ SACCHAROMYCES BOULARDII И СУПЕРОКСИДДИСМУТАЗУ (SOD) ДЛЯ БОРЬБЫ С ОЖИРЕНИЕМ Российский патент 2016 года по МПК A61K36/64 A61K38/44 A61P3/04 

Настоящее изобретение относится к композициям, применимым в качестве пищевых добавок, содержащим пробиотические дрожжи Saccharomyces boulardii и антиоксидантный фермент супероксиддисмутазу. Композиции по настоящему изобретению являются применимыми для снижения риска развития метаболического синдрома, ассоциированного с ожирением.

Состояние области техники

Ожирение определяют как избыточное содержание жировой ткани и связывают с большим количеством дисфункций, включая сердечно-сосудистые заболевания (CVD) и инсулиннезависимый сахарный диабет (NIDDM).

Распространенность ожирения и избыточной массы тела у взрослых, детей и подростков быстро росла в течение последних 30 лет и продолжает увеличиваться, приводя к высоким социальным затратам.

Ожирение обычно рассматривают как результат комбинации избыточного потребления энергии и малоподвижного образа жизни, но хотя такие факторы, конечно, являются важными, недавно предположили, что субоптимальная кишечная флора также оказывает влияние (Tennyson CA, Friedman G. Curr Opin Endocrinol Diabetes Obes. 2008 Oct; 15(5):422-7), тогда как системные метаболические осложнения связаны со слабовыраженным системным воспалением, которое возникает у лиц с ожирением (Fantuzzi G., J Allergy Clin. Immunol. 2005; 115:911-919, Backhed F, Ding H, Wang T, PNAS 2004; 101:15718-15723).

Более того, было продемонстрировано, что некоторые виды бактерий, такие как бактерии, продуцирующие молочную кислоту, видов L. gasseri, L. casei и L. acidophilus, способны уменьшать набор массы тела у крыс, получающих богатое углеводами питание (Kang JH, Yun SI, Park HO, J Microbiol. 2010 Oct;48(5):712-4. Epub 2010 Nov 3).

В поддержку указанных исследований были описаны продукты, содержащие пробиотические бактерии, принадлежащие к роду Lactobacillus и Bifidobacterium, которые способны предотвращать или лечить метаболические дисфункции, возникающие в результате ожирения (WO 2010146568; WO 2010091992; US 2008267933).

К настоящему времени в добавление к хорошо описанным свойствам пробиотических бактерий множество статей в научной литературе описывают некоторые полезные эффекты в отношении состояния здоровья пробиотических дрожжей, такие как инактивация токсина А Clostridium difficile дрожжами Saccharomyces boulardii (Castagliuolo I, Riegler MF, Valenick L, LaMont JT, Pothoulakis C. - Infect Immun. 1999 Jan; 67(1):302-7) и эффективность Saccharomyces boulardii в профилактике диареи, вызванной лечением антибиотиками или инфекциями, вызванными кишечными патогенами (Surawicz CM, Elmer GW, Speelman P, McFarland LV, Chinn J, van Belle G. - Gastroenterology. 1989 Apr; 96(4):981-8; McFarland LV - World J Gastroenterol. 2010 May 14; 16(18):2202-22).

Фермент супероксиддисмутаза (SOD) при парентеральном введении доказал эффективность при ряде воспалительных заболеваний (Carroll IM, et al. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2007 Oct; 293(4):G729-38; Oku T, et al. Inflamm Bowel Dis. 2006 Jul; 12(7):630-40), снижая образование свободных радикалов и повреждение тканей.

Несмотря на количество и подробности указанных исследований, композицию на основе пробиотических дрожжей, которая способна предотвращать ожирение и связанные с ним расстройства, никогда не исследовали и не предлагали.

Описание изобретения

Настоящее изобретение относится к композиции, содержащей пробиотические дрожжи и антиоксидант, которая является применимой для снижения риска развития ожирения и метаболического синдрома, ассоциированного с ним.

Пробиотические дрожжи, присутствующие в композиции, которая способна снижать риск развития метаболического синдрома, ассоциированного с ожирением, принадлежат к роду Saccharomyces и более предпочтительно к виду Saccharomyces cerevisiae var. boulardii (далее в настоящем описании называемому Sb).

Антиоксидантное вещество, используемое в комбинации с пробиотическими дрожжами Sb, принадлежит к классу антиоксидантных ферментов и более предпочтительно является ферментом супероксиддисмутазой (далее в настоящем описании называемому SOD).

SOD предпочтительно получают в форме, защищенной от разложения в желудке, посредством обычных методик и вспомогательных веществ. Эффективная доза пробиотических дрожжей составляет между 10⁶ и 10⁹ колониеобразующих единиц (КОЕ) на суточное введение, предпочтительно приблизительно 10⁷ КОЕ, тогда как эффективная доза SOD составляет между 1 и 100 мг, предпочтительно между 2 и 50 мг и более предпочтительно между 5 и 20 мг в сутки. Доза приблизительно 10 мг в сутки является особенно предпочтительной.

Дрожжи и SOD также можно вводить одновременно, раздельно или последовательно: в таком случае два активных ингредиента не обязательно должны быть объединены в стандартной лекарственной форме и необязательно могут быть использованы в продукте в форме набора, включающего отдельные лекарственные формы для двух активных ингредиентов.

Эффективность пищевой добавки, представляемой настоящим изобретением, оценивали посредством мониторинга физических свойств, таких как масса, накопление абдоминального жира и потребление пищи, и измерения некоторых биохимических параметров, таких как уровень глюкозы в крови и уровень провоспалительных цитокинов.

Эффективность композиции по настоящему изобретению в качестве пищевой добавки исследовали на модели негенетического ожирения у мышей, полученной на самцах мышей линии C57BL/6, которые с возраста 4 недель получали нормальное или высококалорийное питание, дополненное ежедневно Sb и SOD, или отдельно с носителем.

В течение 9-недельного введения пищевой добавки массу тела и потребление пищи оценивали каждую неделю.

В конце периода введения у животных проводили тест на толерантность к глюкозе после голодания в течение ночи; других животных умерщвляли для получения периферической крови, необходимой для количественного определения циркулирующих цитокинов, и измерения накопленного абдоминального жира.

Изобретение описано более подробно в примерах ниже.

Пример 1: Масса тела, потребление пищи и регуляция жировой ткани

С целью оценки эффективности пищевой добавки, состоящей из композиции Sb и SOD, в регуляции физических свойств, на которые влияет ожирение, самцов мышей C57BL/6 (15,2±0,3 г) в возрасте 4 недель делили на рандомизированные группы, которым давали питание с нормальной калорийностью (77% углеводов, 19% белка и 4% жира) или высококалорийное питание (VHF, 21% углеводов, 19% белка и 60% жира) с или без ежедневной добавки, состоящей из 10⁷ КОЕ Sb (вводимой через желудочный зонд) и/или 10 мг SOD, экстрагированного из дрожжей, очищенного и защищенного от разложения в желудке посредством микроинкапсуляции до специфической активности 180000 Ед/г, и включенной в пищу. Однако другие способы защиты от разложения в желудке, такие как покрытие глиадиновой пленкой или другие эквивалентные методики, дают такой же эффект и, следовательно, могут расцениваться равнозначными для целей настоящего изобретения.

Пищу и пищевые добавки вводили непрерывно в течение 9 недель.

Потребление пищи животными (Таблица) и их массу тела отслеживали еженедельно, тогда как накопление висцерального жира оценивали количественно после 9 недель дополненного питания.

В конце экспериментального периода животных умерщвляли, и абдоминальный жир тщательно собирали, взвешивали и затем помещали в формалин для последующих гистологических тестов (Фиг. 2a).

Пищевые добавки с Sb + SOD, но не с Sb отдельно, достоверно снижали увеличение массы тела, ассоциированный с высококалорийным питанием (фиг. 1). Более того, накопление жировой ткани на уровне живота было достоверно снижено у животных, которые получали Sb отдельно, и у животных, которые получали Sb в комбинации с SOD (фиг. 2 и 2a).

Таблица Питание Добавка Потребление пищи на мышь в сутки (г) Потребление калорий на мышь в сутки (ккал) Питание с нормальной калорийностью нет 3,20 10,89 Высококалорийное питание нет 4,76 28,71 Высококалорийное питание Sb 2,00 12,08 Высококалорийное питание Sb + SOD 2,00 12,05

Пример 2: Регуляция биохимических параметров при ожирении

С целью оценки эффективности пищевой добавки, состоящей из композиции Sb и SOD, при метаболических осложнениях, ассоциированных с ожирением после 9 недель эксперимента, описанного в примере 1, мышей подвергали пероральному тесту с нагрузкой глюкозой и исследованию каскада сигналов, индуцированных инсулином в органе-мишени (печень).

Для проведения перорального глюкозотолерантного теста глюкозу крови определяли после 18-часового голодания и перед введением пероральной нагрузки глюкозой (2 мг/г массы тела).

Затем глюкозу крови измеряли каждые 30 минут в течение 120 минут и толерантность к глюкозе рассчитывали как площадь под кривой (AUC) (фиг. 3a и фиг. 3b).

Для оценки функционального состояния каскада сигналов, индуцированного инсулином, нагрузку инсулином вводили мышам интраперитонеально (10 Ед/кг массы тела). В таком случае животных умерщвляли через 5 минут и образцы печени получали и замораживали.

Общий белок экстрагировали из образцов печени и подвергали иммуноблоттинговому исследованию для оценки уровня фосфорилирования белка IRS1 (субстрата инсулинового рецептора 1) (фиг. 4).

В нормальных условиях связь между инсулином и его рецептором вызывает фосфорилирование белка IRS1 на остатке Tyr941, тогда как в случае метаболического синдрома, ассоциированного с ожирением, этот сигнал снижен.

Добавление Sb или Sb + SOD с использованием тех же препаратов и тех же доз, как в примере 1, снижало степень выраженности гипергликемии после нагрузки глюкозой, ассоциированной с ожирением (фиг. 3a и 3b). Совместное введение Sb и SOD вызывало более заметное снижение гипергликемии после нагрузки. Пищевые добавки у мышей с ожирением с Sb и SOD восстанавливали фосфорилирование IRS1 по остатку Tyr941 в ответ на нагрузку глюкозы крови, таким образом, корректируя нечувствительность тканей-мишеней к инсулину (фиг. 4).

Пример 3: Системное воспаление, вызванное ожирением

Для оценки эффективности пищевой добавки, состоящей из композиции Sb и SOD, в отношении системного воспаления, обычного состояния у лиц с ожирением, после 9 недель питания добавками получали образец циркулирующей крови для измерения уровней циркулирующих провоспалительных цитокинов (TNFα) и адипокина (лептин). Анализ проводили в сыворотке с использованием анализа ELISA (фиг. 5 и фиг. 6).

В случае животных с ожирением наблюдали увеличение уровней циркулирующих TNFα и лептина, которые участвовали в развитии системных осложнений. Пищевые добавки с Sb или Sb + SOD с использованием тех же препаратов и тех же доз, как в примере 1, достоверно снижало уровни циркулирующих TNFα и лептина (фиг. 5 и фиг. 6). В частности, уровень в сыворотке лептина, провоспалительного адипокина, происходящего из жировой ткани, участвующего в регуляции потребления пищи, снижался добавками с Sb + SOD с достоверно большей выраженностью даже при сравнении с отдельными добавками Sb и SOD (фиг. 6).

Пример 4: Воспалительное состояние слизистой оболочки кишечника при ожирении

С целью оценки эффективности пищевой добавки, состоящей из композиции Sb и SOD в отношении воспалительного состояния слизистой оболочки, ассоциированного с ожирением, после 9-недельного питания добавками, животных умерщвляли так, чтобы получить сегмент подвздошной кишки. Сегменты кишечника гомогенизировали в фосфатном буфере, к которому добавляли коктейль ингибиторов протеаз для экстракции общего белка. Гомогенат центрифугировали при 13000x об/мин в течение 10 мин при 4°C, и очищенную надосадочную жидкость использовали для количественного определения провоспалительных цитокинов IL1-β и TNF-α посредством анализа ELISA и для количественного определения глутатиона (GSH), наиболее эффективного антиоксидантного натурального соединения. Уровень цитокинов нормализовали относительно уровня общего белка, определяемого при помощи анализа Bradford.

В случае лиц с ожирением повышение уровней IL1-β и TNF-α, которые участвуют в развитии системных осложнений, наблюдали в слизистой оболочке кишечника. Питание добавками с Sb или совместное введение Sb и SOD с использованием тех же препаратов и тех же доз, как в примере 1, вызывало достоверное снижение обоих цитокинов (фиг. 7 и 8). Фиг. 7 и 8 ясно показывают, что только совместное введение Sb и SOD восстанавливает уровни IL1-β и TNF-α в слизистой оболочке кишечника до значений, сравнимых с контрольными мышами.

Глутатион (GSH), который обладает сильной антиоксидантной активностью и который может быть связан с противовоспалительным действием на уровне слизистой оболочки, показал достоверное снижение в подвздошной кишке у животных с ожирением. Его уровень неожиданно увеличивался в случае добавок с Sb + SOD, тогда как добавки Sb или SOD отдельно неэффективны (фиг. 9).

Изобретение относится к фармацевтической промышленности и представляет собой композицию для профилактики или снижения риска развития метаболических дисфункций, связанных с ожирением, содержащую Saccharomyces cerevisiae var boulardii в количестве между 10⁶ и 10⁹ колониеобразующих единиц (КОЕ) на суточное введение и фермент супероксиддисмутазу в количестве между 1 и 100 мг. Изобретение обеспечивает снижение увеличения массы тела, ассоциированной с высококалорийным питанием, заметное снижение гипергликемии после нагрузки глюкозой, снижение уровня лептина, снижение уровня цитокинов IL1-β и TNF-α. 4 з.п. ф-лы. 4 пр., 1 табл., 9 ил.

1. Композиция для профилактики или снижения риска развития метаболических дисфункций, связанных с ожирением, содержащая Saccharomyces cerevisiae var boulardii в количестве между 10⁶ и 10⁹ колониеобразующих единиц (КОЕ) на суточное введение и фермент супероксиддисмутазу в количестве между 1 и 100 мг.

2. Композиция по п. 1, где супероксиддисмутаза находится в форме, защищенной от разложения в желудке.

3. Композиция по п. 1 или 2 в форме набора, подходящая для одновременного, раздельного или последовательного введения.

4. Композиция по п. 1 или 2 для применения в качестве пищевой добавки.

5. Композиция по п. 1 или 2 для применения в снижении набора веса, для уменьшения потребления пищи, для уменьшения накопления жира в организме и для улучшения состояния системного воспаления, связанного с ожирением.