КОМПОЗИЦИЯ, СОДЕРЖАЩАЯ AKKERMANSIA MUCINIPHILA И ЭКСТРАКТ ЗЕЛЕНОГО ЧАЯ Российский патент 2024 года по МПК A61K35/741 A61K36/82 A61P1/00 A61P3/04 A61P3/06 A61P3/08 A23L33/105 A23L33/135 

Настоящее изобретение относится к композиции, содержащей Akkermansia muciniphila и экстракт зеленого чая. В частности, настоящее изобретение относится к композиции, содержащей Akkermansia muciniphila и экстракт зеленого чая, причем Akkermansia muciniphila является пастеризованной. Композиции по настоящему изобретению полезны для профилактики или лечения нарушения обмена веществ, выбранного из группы, включающей ожирение, метаболический синдром, нарушения, связанные с дефицитом инсулина или резистентностью к инсулину, сахарный диабет, непереносимость глюкозы, нарушение липидного обмена, гипергликемию, дислипидемию, заболевания, связанные с барьерной функцией, включая воспалительное заболевание кишечника, болезнь Крона и язвенный колит, синдром раздраженного кишечника, нарушение сократительной способности кишечника, гиперхолестеринемию и атерогенную дислипидемию и, в частности, ожирение. Кроме того, композиции по изобретению полезны для стимулирования снижения веса, уменьшения висцерального жира или улучшения барьерной функции кишечника.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Ожирение и избыточный вес являются общемировой тенденцией, и, по оценкам, число взрослых, страдающих ожирением, составляет около 600 миллионов человек. Заболевания, связанные с ожирением, такие как, например, диабет, гипертония, патологии сердца и печени, широко распространены. Из-за этих крайне инвалидизирующих патологий ожирение в настоящее время рассматривается в западных странах как одна из важнейших проблем общественного здравоохранения.

Ожирение связано с метаболическими дисфункциями, влияющими, например, на гомеостаз глюкозы и метаболизм липидов. Другим сопутствующим заболеванием является слабовыраженное воспалительное состояние, связанное с более высоким уровнем липополисахаридов (ЛПС) в крови, также называемое метаболической эндотоксемией.

Еще одним сопутствующим заболеванием при ожирении является нарушение или снижение барьерной функции кишечника. Повышенная проницаемость кишечника приводит к транслокации компонентов бактерий и/или микроорганизмов в кровоток и органы, такие как печень или жировая ткань. Воспаление кишечника, ЛПС и бактериальная транслокация также наблюдаются при воспалительных заболеваниях кишечника. Примеры включают болезнь Крона, колит, язвенный колит, боль в кишечнике или колики и другие воспалительные заболевания кишечника. Интересно, что как воспалительные заболевания кишечника, так и заболевания, связанные с ожирением, ассоциируются с изменениями в составе микробиоты кишечника.

Кишечник человека колонизирован разнообразным, сложным и динамичным сообществом микробов, представляющих более 1000 различных видов, которые постоянно взаимодействуют с хозяином. Микробиота кишечника зависит от таких характеристик хозяина, как возраст, пол, генетический фон. Другие факторы включают условия окружающей среды, такие как стресс, лекарства, операции на желудочно-кишечном тракте, инфекционные и токсические агенты и ежедневные изменения в питании.

Кишечная микробиота влияет на развитие ожирения и связанных с ним расстройств, избыточного веса и воспаления кишечника или болей в кишечнике. Дисбиоз микробиоты может еще больше нарушить перекрестные помехи между органами и целостность кишечного барьера, что приведет к симптомам.

Зеленый чай был ранее описан в качестве средства лечения ожирения или гликемии. Например, в статье Кобаяши и др. (2000) (https://pubs.acs.org/doi/pdf/10.102l/jf0006832) раскрыто, что полифенолы зеленого чая ингибируют поглощение глюкозы. Однако композиция, содержащая Akkermansia muciniphila и экстракт зеленого чая, в этом документе не раскрыта.

В заявке WO 2013130773А2 (автор Ли М. Каплан) раскрыт способ изменения относительной численности микробиоты у субъекта, включающий введение субъекту эффективной дозы композиции, состоящей по существу из очищенных Verrucomicmbia, для лечения ожирения и метаболического синдрома.

В заявке WO 2014076246, принадлежащей Лувенскому католическому университету и Вагенингенскому университету раскрыто применение Akkermansia muciniphila для лечения ожирения и связанных с ним расстройств. Однако композиция, содержащая Akkermansia muciniphila и экстракт зеленого чая, в этом документе не раскрыта.

В заявке ЕР3347030, принадлежащей Лувенскому католическому университету и Вагенингенскому университету, раскрыто применение Akkermansia muciniphila для субъекта, нуждающегося в лечении нарушения обмена веществ, причем Akkermansia muciniphila является пастеризованной. Комбинация Akkermansia muciniphila с растительным экстрактом в этом документе не раскрыта.

В статье Уширода 2019 раскрыто увеличение вида Akkermansia в Verrucomicrobiay мышей, получавших питание с высоким содержанием жира, после введения эпигаллокатехин-3-галлата, содержащегося в зеленом чае. Информация доступна в источнике Ужирода и др.., Полифенол зеленого чая (эпигаллокатехин 3-галлат) улучшает дисбиос кишечника и нарушение регуляции желчных кислот в сыворотке у. мышей , получавших питание с высоким содержанием жира; Дж. Клин. Биохим. Hymp.] июль 2019] об 65 [№. 1 [34-46: 10.3164/jcbn.18116 Однако композиция, содержащая Akkermansia muciniphila и экстракт зеленого чая, в этом документе не раскрыта.

В статье Шена 2018 раскрыто стимулированное эпигаллокатехин-3-галлатом (EGCG) значительное увеличению количества Akkermansia muciniphila, которое эффективно снижает повышенное вследствие питания ожирение, висцеральный жир и резистентность к инсулину. Композиция, содержащая пастеризованную Akkermansia muciniphila и экстракт зеленого чая. в этом документе не раскрыта. Информация доступна в источнике Шен и др.., Лечение ожирения с ломошью регулируемой эпигаллокатехин-3-галлатом лередачи сигналов желчных кислот и его обогащение Akkermansia muciniphila, ФАСЕБ Ж. 2018 Дек; 32(12): 6371-6384, doi: 10.1096/ƒJ/201800370R

В заявке US 2018318323А1, принадлежащей компании Плексус Уорлдуайд, раскрыта модулирующая микробном кишечника композиция, содержащая зеленый чай для стимуляции роста Akkermansia. Однако композиция, содержащая Akkermansia muciniphila и экстракт зеленого чая, в этом документе не раскрыта.

В публикации CN108541953 (автор - Чжан Цинью) раскрыты полифенолы чая в качестве пребиотика для усиления размножения Akkermansia muciniphila в слепой и подвздошной кишках. Композиция, содержащая Akkermansia muciniphila и экстракт зеленого чая, в этом документе не раскрыта.

Однако по-прежнему существует острая необходимость в улучшенных композициях для лечения нарушения обмена веществ, в частности ожирения, и стимулирования снижения веса.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что сочетание Akkermansia muciniphila и экстракта зеленого чая обеспечивает превосходные результаты по снижению веса по сравнению с другими растительными экстрактами и, таким образом, является синергетическим. Это особенно верно, когда Akkermarsia muciniphila является пастеризованной.

Соответственно, первый аспект изобретения представляет собой композицию, содержащую Akkermansia muciniphila и экстракт зеленого чая.

Еще в одном аспекте изобретения Akkermansia muciniphila является пастеризованной.

Еще одним аспектом изобретения является композиция для применения в профилактике или лечении нарушения обмена веществ, выбранного из группы, включающей ожирение, метаболический синдром, нарушения, связанные с дефицитом инсулина или резистентностью к инсулину, сахарный диабет, непереносимость глюкозы, аномальный метаболизм липидов, гипергликемию, дислипидемию, заболевания барьерной функции, включая воспалительное заболевание кишечника, болезнь Крона и язвенный колит, синдром раздраженного кишечника, нарушение сократительной способности кишечника, гиперхолестеринемию, нарушение барьерной функции кишечника и атерогенную дислипидемию.

Еще в одном аспекте изобретения нарушением обмена веществ является ожирение или нарушение барьерной функции кишечника.

Еще в одном аспекте изобретения композиция уменьшает развитие жировой массы, в частности висцеральной жировой ткани, по сравнению с нелеченным субъектом.

Еще в одном аспекте изобретения композиция дополнительно содержит ингредиент или ингредиенты, выбранные из группы, включающей пробиотики, бактерии, дрожжи, микроорганизмы, пребиотики или их комбинации.

Еще в одном аспекте изобретения композиция дополнительно содержит минерал или витамин, или их комбинацию.

Еще в одном аспекте изобретения композиция дополнительно содержит фармацевтически приемлемый носитель или носитель пищевой.

Еще в одном аспекте изобретения композиция вводится перорально.

Еще в одном аспекте изобретения пастеризованную Akkermansia muciniphila вводят в количестве от 1.10⁴ до 1.10¹² клеток в сутки, более предпочтительно от 1.10⁵ до 1.10¹¹ клеток в сутки и еще более предпочтительно от 1.10⁶ до 1.10¹⁰ клеток в сутки, предпочтительно выраженном общим количеством флуоресцентных единиц с использованием проточной цитометрии.

Еще в одном аспекте изобретения экстракт зеленого чая вводят в количестве от 30 мг до 600 мг в день. Еще в одном варианте осуществления экстракт зеленого чая вводят в количестве до 1000 мг или даже 2000 мг в день.

Еще в одном аспекте изобретения зеленый чай содержит 10 или даже менее 5% по массе или более, предпочтительно 50% по массе или более эпигаллокатехина галлата (EGCG).

Еще в одном аспекте изобретения экстракт зеленого чая вводят в количестве, обеспечивающем от 100 до 600 мг EGCG в день. Еще в одном аспекте изобретения экстракт зеленого чая вводят в количестве, обеспечивающем от 200 до 300 мг EGCG в день.

Еще в одном аспекте изобретения композиция представляет собой косметическую композицию, питательную композицию, пищевой продукт, диетическую добавку, лечебное питание или лекарственное средство.

Еще в одном аспекте изобретения композиция дополнительно содержит второй растительный экстракт.

Еще в одном аспекте изобретения второй растительный экстракт выбирают из группы, включающей Aronia melanocarpa, Emblica officinalis, Olea Europa, Citrus bergamia, Vaccinium macrocarpon, Myrciaria dubia, красный азиатский женьшень, Vaccinium oxycoccos, Vaccinium macrocarpon.

Еще одним аспектом изобретения является способ получения композиции по изобретению, включающий следующие этапы:

a. Культивирование клеток рода Akkermansia;

b. Пастеризация культивируемых клеток, полученных на этапе а);

c. Добавление криопротектора и рН-буфера;

d. Лиофилизация пастеризованных клеток этапа с);

e. Смешивание лиофилизированного порошка с экстрактом зеленого чая; и

f. Необязательно изготовление капсул, гелевых капсул или мягких гелевых капсул из смеси этапа е).

Еще один аспект изобретения представляет собой композицию по любому из предшествующих пунктов для стимулирования снижения веса или барьерной функции кишечника у субъекта, нуждающегося в этом.

Еще одним аспектом изобретения является способ лечения или профилактики нарушения обмена веществ у субъекта, нуждающегося в этом, причем способ включает введение субъекту эффективного количества композиции, содержащей Akkermansia muciniphila и экстракт зеленого чая, в частности, без побочных эффектов, ограничивающих лечение. В предпочтительном варианте осуществления Akkermansia muciniphila является пастеризованной.

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

«Лечение» означает уменьшение или облегчение по меньшей мере одного неблагоприятного эффекта или симптома заболевания, нарушения или состояния. Таким образом, этот термин относится как к терапевтическому лечению, так и к профилактическим или превентивным мерам.

«Предотвращение» означает предотвращение в смысле недопущения возникновения или снижения риска заболевания или состояния.

«Эффективное количество» или «терапевтически эффективное количество» относится к уровню или количеству агента, который(ое) нацелен(о) на отсрочку или предотвращение начала нарушения обмена веществ, замедление или прекращение прогрессирования, обострения или ухудшения одного или нескольких симптомов нарушения обмена веществ; вызывает уменьшение симптомов нарушения обмена веществ; снижает тяжесть или частоту нарушения обмена веществ; лечит нарушение обмена веществ или восстанавливает нормальное количество и/или пропорциональное содержание Akkermansia muciniphila в кишечнике субъекта, подлежащего лечению, при этом не вызывая у него существенных негативных или неблагоприятньгх побочных эффектов.

«Akkermansia muciniphila» относится к разрушающим муцин бактериям, идентифицированным Дерриеном (Дерриен и др., 2004. Инг.Ж.. Сист.Эвол. Микробиол. 54:1469-1476). Клетки имеют овальную форму, неподвижны, окрашиваются грамотрицательно.Akkermansia muciniphila также могут называться Akkermansia spp.или Akkermansia-подобными бактериями Относятся к типу Verrucomicmbia. Общепринято, что штаммы, имеющие сходство нуклеотидов около 70%, которое экспериментально определено методом ДНК-ДНК-гибридизации, могут рассматриваться как один и тот же вид - это соответствует средней идентичности нуклеотидов (ANI) примерно 95%.

В одном варианте осуществления Akkermansia muciniphila также содержит фрагменты Akkermansia muciniphila.

«Пастеризованная Akkermansia muciniphila» относится к Akkermansia muciniphila, подвергнутой тепловой обработке. В одном варианте осуществления пастеризованная Akkermansia muciniphila относится к Akkermansia muciniphila, которую нагревали при температуре от 50°С до 100°С в течение по меньшей мере 10 минут.

«ОКФЕ» или «общее количество флуоресцентных единиц» означает количество клеток, определяемое по их флуоресцентной яркости после окрашивания. В предпочтительном варианте ОКФЕ измеряют проточной цитометрией. Например, на первом этапе аликвоты партий биомассы регидратируют в PBS и окрашивают красителем Syto 9 и йодидом пропидия в соответствии с протоколом производителя (набор LIVE/DEAD® BacLight™ Bacterial Viability Kit, компании Термофишер). Затем ОКФЕ можно получить путем анализа окрашенных образцов на проточном цитометре Attune NxT. Обычно ОКФЕ выражают в виде общего количества флуоресцентных единиц на грамм или на мл, предпочтительно на грамм.

«Экстракт зеленого чая» означает любой экстракт листьев или почек растения Camellia sinensis. Экстракт зеленого чая в целом богат полифенолами, в частности эпигаллокатехин-галлатом (EGCG), эпикатехин-галлатом, эпикатехинами и флаванолами. Экстракт зеленого чая может быть получен путем экстракции спиртом или водой, может быть концентрированным или нет, и может быть переработан в жидкость или порошок.

«Пробиотики» относятся к живым микроорганизмам, которые при введении в эффективном количестве оказывают благотворное влияние на здоровье или самочувствие субъекта. В одном варианте осуществления эти преимущества для здоровья связаны с улучшением баланса микробиоты человека или животных в желудочно-кишечном тракте или восстановлением нормальной микробиоты.

«Пребиотик» относится к веществу, такому как, например, вещество, которое может не перевариваться человеком, но которое модулирует состав и/или активность кишечной микробиоты посредством ее метаболизма микроорганизмами в кишечнике, тем самым обеспечивая благоприятное физиологическое воздействие на хозяина.

«Субъект» относится к животному, предпочтительно к млекопитающему, более предпочтительно к человеку или животному.

«Избыточный вес» относится к ситуации субъекта, при которой указанный субъект имеет индекс массы тела (ИМТ) 25 или более. Используемый здесь ИМТ определяется как масса тела человека (в кг), деленная на квадрат его/ее роста (в метрах).

«Ожирение» относится к ситуации субъекта, при которой указанный субъект имеет ИМТ выше или равный 30.

«Фрагмент» может относиться к клеточным компонентам, метаболитам, секретируемым молекулам, везикулам и соединениям, образующимся в результате метаболизма Akkermansia muciniphila и т.п.Фрагменты могут быть получены, например, выделением супернатанта культуры Akkermansia muciniphila или экстракцией клеточных компонентов или клеточных фракций, метаболитов или секретируемых соединений из культуры Akkermansia muciniphila.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Заявитель в данном документе показывает, что после введения композиции, содержащей Akkermansia muciniphila и экстракт зеленого чая наблюдается благоприятное воздействие на метаболизм, как видно из примеров для Akkermansia muciniphila.

Таким образом, настоящее изобретение относится к композиции, содержащей Akkermansia muciniphila и экстракт зеленого чая, для лечения или применения при лечении нарушений обмена веществ у субъекта, нуждающегося в этом лечении.

В данном контексте нарушение обмена веществ представляет собой нарушение, связанное с измененным метаболическим гомеостазом, таким как, например, измененный гомеостаз глюкозы или липидов.

В одном варианте осуществления изобретения указанным нарушением обмена веществ является ожирение.

Примеры других нарушений обмена веществ включают, но не ограничиваются ими, метаболический синдром, нарушения, связанные с дефицитом инсулина или резистентностью к инсулину, сахарный диабет, включая диабет 1 типа или диабет 2 типа, непереносимость глюкозы, нарушение липидного обмена, атеросклероз, гипертонию, преэклампсию, кардиальную патологию, инсульт, неалкогольную жировую болезнь печени, гипергликемию, стеатоз печени, дислипидемию, дисфункцию иммунной системы, связанную с избыточным весом и ожирением, заболевания печени, такие как, например, фиброз, связанный с ожирением, или нарушения функции печени, включая изменения в вырабатывании желчи, воспалительные, иммунные и заболевания, связанные с барьерной функцией, такие как, например, воспалительные заболевания кишечника, в том числе болезнь Крона и язвенный колит, и синдром раздраженного кишечника, сердечно-сосудистые заболевания, высокий уровень холестерина, повышенный уровень триглицеридов, астму, апноэ во сне, остеоартрит, нейродегенерацию, заболевание желчного пузыря, синдром X, воспалительные и иммунные нарушения, атерогенную дислипидемию и рак.

В одном варианте осуществления гиперхолестеринемия соответствует концентрации холестерина в плазме выше или равной 2 г/л или 5 ммоль/л. Еще в одном варианте осуществления гиперхолестеринемия соответствует отношению концентрации общего холестерина в плазме к концентрации в плазме ЛПВП (холестерина липопротеинов высокой плотности) выше или равному 4,5:1, предпочтительно 5:1.

В одном варианте осуществления пастеризованная Akkermansia muciniphila по изобретению представляет собой нежизнеспособные клетки. Используемый здесь термин «нежизнеспособные клетки» означает клетки, которые не способны к пролиферации. Примеры визуализации или подсчета клеток Akkermansia muciniphila были предоставлены Дерриеном и др. (2008. Прим. Окруж Микробиол. 74:1646-8), Дерриеном и др. (2011. Границы Микробиол. 2:166-175) или Реунаненом и др. (2015. Прим. Окруж Микробиол. 81(11):3655-62).

Композиция по настоящему изобретению может также содержать фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество или носитель пищевой, например, растворители, дисперсионные среды, покрытия, изотонические средства и агенты, замедляющие всасывание, и т.п. Для введения человеку препараты должны соответствовать общим стандартам безопасности и чистоты в соответствии со стандартами Подразделения биопрепаратов Управления по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных препаратов (FDA Office of Biologies).

Настоящее изобретение также относится к лекарственному средству, лечебному питанию, пищевому продукту или пищевой добавке, включающим эффективное количество Akkermansia muciniphila или его фрагмента и экстракт зеленого чая.

Настоящее изобретение также относится к способу лечения или предотвращения нарушения обмена веществ у субъекта, нуждающегося в этом, причем указанный способ включает введение эффективного количества Akkermansia muciniphila или его фрагмента и экстракта зеленого чая субъекту, нуждающемуся в этом.

Еще одним объектом изобретения является способ восстановления нормального пропорционального содержания Akkermansia muciniphila, фрагментов или других активных соединений Akkermansia muciniphila в кишечнике нуждающегося в этом субъекта, причем указанный способ включает введение субъекту эффективного количества Akkermansia muciniphila или его фрагмента и экстракта зеленого чая.

В одном варианте осуществления композицию по изобретению вводят по меньшей мере один раз в неделю, предпочтительно по меньшей мере два раза в неделю, более предпочтительно по меньшей мере три раза в неделю и еще более предпочтительно по меньшей мере четыре раза в неделю. Еще в одном варианте осуществления композицию по изобретению вводят по меньшей мере один раз в день, предпочтительно по меньшей мере два раза в день.

В одном варианте осуществления композицию по изобретению вводят в течение 1 недели, предпочтительно в течение 2,3, 4, 5, 6,7 или 8 недель или более, или даже постоянно.

В одном варианте осуществления композицию по изобретению вводят в течение периода, который длится до тех пор, пока не будет достигнут желаемый результат, например снижение веса, излечение нарушения обмена веществ или снижение уровня холестерина в плазме.

В одном варианте осуществления суточная доза вводимой Akkermansia muciniphila составляет от 1.10² до примерно 1.10¹⁵ ОКФЕ/день, предпочтительно от примерно 1.10⁴ до примерно 1.10¹² ОКФЕ/день, более предпочтительно от примерно 1.10⁵ до примерно 1.10¹¹ ОКФЕ/день и еще более предпочтительно от примерно 1.10⁶ до примерно 1.10¹⁰ ОКФЕ /день.

Еще в одном варианте осуществления суточная доза пастеризованной Akkermansia muciniphila составляет от 1.10⁶ до примерно 1.10¹² клеток/день, предпочтительно от примерно 1.10⁸ до примерно 1.10¹⁰ клеток/день, более предпочтительно от примерно 1.10⁹ до примерно 1.10¹⁰ клеток/день.

Настоящее изобретение также относится к косметическому применению пастеризованной Akkermansia muciniphila или ее фрагмента для стимулирования снижения веса у субъекта.

Таким образом, еще одним объектом изобретения является косметическая композиция, содержащая косметически эффективное количество пастеризованной Akkermansia muciniphila или ее фрагмента и экстракта зеленого чая, и ее применение для стимулирования снижения веса у субъекта. Используемый здесь термин «косметически эффективное количество» относится к количеству косметической композиции, необходимому и достаточному для достижения косметического эффекта, такого как, например, индуцирование снижения веса у субъекта.

В одном варианте осуществления композиция, фармацевтическая композиция, косметическая композиция или лекарственное средство дополнительно содержат дополнительные пробиотические штаммы или виды, такие как, например, бактериальные пробиотические штаммы или виды Еще в одном варианте осуществления дополнительные штаммы являются пастеризованными. Эти пробиотики включают бактерии или грибковые штаммы или виды, предпочтительно штаммы или виды дрожжей. В одном варианте осуществления указанные дополнительные пробиотические штаммы или виды выбраны из тех, которые естественным образом присутствуют в кишечнике субъекта, предпочтительно в кишечнике человека, более предпочтительно в кишечнике здорового человека.

Примеры бактериальных пробиотических штаммов или видов, которые можно использовать в настоящем изобретении, включают, но не ограничиваются ими, Lactobacillus , Lactococcus, Bifidobacterium, Veillonella, Desemzia, Christensenella, Allobaculum, Coprococcus, Collinsella, Cirobacter, Turicibacter,Sutterella,Subdoligranulum,Streptococcus,Sporobacter, Sporacetigenium, Ruminociccus, Roseburia, Proteus, Propionobacterium, Leuconostoc, Weissella, Pediococcus,Streptococcus, Prevotella, Parabacteroides, Papillibacter, Oscillospira, Melissococcus, Dorea, Dialister, Clostridium, Cedesea, Catenibacterum, Butyrivibrio, Buttiaxella, Bulleidia,Bilophila, Bacteroides, Anaerovorax, Anaerostipes, Anaerofilum, Enterobacteriacese, Fermicutes, Atopobium, Alistipes,Acinetobacter,Slackie,Shigella, Shewanella, Serratia, Mahella, Lachnospira, Klebsiella, Idiomarina, Fusobacterium, Faecalibacterium, Eubacterium, Enterococcus, Enterobacter,Eggerthella,Dysosmobacter или Anaerobacterium.

Предпочтительными пробиотическими штаммами являются Lactobacillus, Lactococcus, Bifidobacterium, Christensenella, Clostridium, Anaerostipes, Faecalibacterium, Eubacterium, Entercoccus, Enterobacter, Eggerthella,Dysosmobacter или Anaerobacterium.

Примеры штаммов или видов прокариот, которые можно использовать в настоящем изобретении, включают, но не ограничиваются ими,,Archaea, Firmicutes, Verrucomicrobia, Christensenella, Bacteroidetes (такие как, например, Allistipes, Bacteroides;'ovatus, Bacteroides, splachnicus;Bacteroides stercoris, Parabacteroides, Prevotella ruminicola, Porphyromondaceae и родственные роды), Proteobacteria, Betaproteobacteria (такие, как, например, Aquabacterium и Burkholderia), Gammaproteobacteria (такие, как, например, Xanthomonadaceae), Actinobacteria (такие, как, например, Actinomycetaceae и Atopobium), фузобактерии, метанобактерии, спирохеты, фибробактерии, деферрибактерии, Deinococcus, Thermus, цианобактерии, метанобревибактерии, Peptostreptococcus Ruminococcus, Subdolingranulum, Dorea, Bulleidia, Anaerofustis, Gemella, Roseburia, Dialister, Anaerotruncus, Staphylococcus, Micrococcus, пропионобактерии, энтеробактерии, Faecalibacterium, Bacteroides Parabacteroides Prevotella, Eubacteriun, бациллы (такие как, например, Lactobacillus salivarius и родственные виды, Aerococcus, Granulicatella, Streptococcus intermedius и родственные роды и Clostridium (такие как, например, Anaerobutyricum, hallii, Eubacterium limosum, Anaerobutyricum soehngenii;' и родственные роды) и Butyrivibrio.

Примеры грибковых пробиотических штаммов или видов, предпочтительно дрожжевых пробиотических штаммов или видов, которые можно использовать в настоящем изобретении, включают, но не ограничиваются ими, Ascomycetes, Zygomycetes' и Deuteromycetes, предпочтительно из групп Aspergillus, Torulopsis, Zygosaccharomyces, Endomycess, Hyphopichia, Zygosaccharomyces, Bretanomyces, Pichia, Amylomyces, Zygosaccharomyces, Endomycess, Hyphopichia,Zygosaccharomyces, Kluyveromyces, Mucor, Rhizopus, Yarrowia, Endomyces, и/или Penicillium.

В одном варианте осуществления единственным микробным штаммом или видом, предпочтительно бактериальным штаммом или видом, включенным в композицию, фармацевтическую композицию, косметическую композицию или лекарственное средство, является Akkermansia muciniphila.

В одном варианте осуществления композиция, фармацевтическая композиция, косметическая композиция или лекарственное средство состоит из пастеризованной Akkermansia muciniphila.

В одном варианте осуществления композиция, фармацевтическая композиция, косметическая композиция или лекарственное средство дополнительно содержит пребиотик.

Примеры пребиотиков, которые можно использовать в настоящем изобретении, включают, но не ограничиваются ими, инулин и фруктаны инулинового типа, олигофруктозу, бета-глюканы, ксилозу, арабинозу, арабиноксилан, рибозу, галактозу, рамнозу, целлобиозу, фруктозу, лактозу, салицин, сахарозу, глюкозу, эскулин, твин 80, трегалозу, мальтозу, маннозу, меллибиозу, слизь или муцины, раффинозу, фруктоолигосахариды, галактоолигосахариды, аминокислоты, спирты, ферментируемые углеводы и любые их комбинации.

Другие неограничивающие примеры пребиотиков включают водорастворимые производные целлюлозы, водонерастворимые производные целлюлозы, необработанные овсяные хлопья, метамуцил, отруби и любые их комбинации.

Примеры водорастворимых производных целлюлозы включают, но не ограничиваются ими, метилцеллюлозу, метилэтилцеллюлозу, гидроксиэтилцеллюлозу,

этилгидроксиэтилцеллюлозу, катионную гидроксиэтилцеллюлозу, гидроксипропилцеллюлозу, гидроксиэтилметилцеллюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозу и карбоксиметилцеллюлозу.

Композицию по изобретению можно вводить перорально, ректально, с использованием эзофагогастродуоденоскопии, с использованием колоноскопии, с использованием назогастрального или орогастрального зонда.

Композицию можно вводить перорально в виде таблеток, пилюль, капсул, мягких желатиновых капсул, драже с сахарным покрытием или диспергируемых таблеток, шипучих таблеток или других твердых веществ.

Композицию можно вводить перорально в виде жидкости, раствора для питья или липосомы.

В одном варианте осуществления композиция по изобретению дополнительно содержит вспомогательные вещества, разбавитель и/или носители, выбранные с учетом предполагаемого пути введения. Примеры вспомогательных веществ, разбавителей и/или носителей включают, но не ограничиваются ими, воду, фосфатно-солевой буфер, анаэробный фосфатно-солевой буфер, бикарбонат натрия, сок, молоко, йогурт, детскую смесь, молочный продукт, красители, такие как, например, диоксид титана (Е171), диоксид железа (Е172) и бриллиантовый черный BN (Е151); ароматизаторы; загустители, такие как, например, моностеарат глицерина; подсластители; покрывающие вещества, такие как, например, рафинированное рапсовое масло, соевое масло, арахисовое масло, соевый лецитин или рыбий желатин; разбавители, такие как, например, лактоза, моногидрат лактозы или крахмал; связующие вещества, такие как, например, повидон, прежелатинизированный крахмал, смолы, сахароза, полиэтиленгликоль (ПЭГ) 4000 или ПЭГ 6000; разрыхлители, такие как, например, микрокристаллическая целлюлоза или карбоксиметилкрахмал натрия, такой как, например, карбоксиметилкрахмал натрия типа А; смазывающие вещества, такие как, например, стеарат магния; вещество, повышающее текучесть, такое как, например, коллоидный безводный диоксид кремния и т.п.

В одном варианте осуществления композиция по изобретению представляет собой фармацевтическую композицию.

Еще в одном варианте осуществления композиция по изобретению представляет собой пищевую добавку, добавку к напитку, диетическую добавку, питательный продукт, лечебное питание или нутрицевтическую композицию.

Ожирение и связанные с ним нарушения связаны с повышенной проницаемостью кишечника и нарушениями у субъекта выработки слизи, эпителиального барьера, иммунной системы и/или выработки антибактериальных соединений.

Соответственно, композиция по настоящему изобретению может быть использована для снижения проницаемости кишечника, для восстановления нарушенной выработки слизи, для восстановления эпителиального барьера, для восстановления иммунной системы или для восстановления выработки антибактериальных соединений или комбинации этих функций.

Более того, композиция по изобретению может быть полезна для контроля барьерной функции кишечника. Соответственно, еще одним аспектом является способ контроля барьерной функции кишечника, включающий введение эффективного или косметически эффективного количества композиции по изобретению субъекту, нуждающемуся в этом.

В одном варианте осуществления композиция по изобретению регулирует толщину слоя слизи, которая может уменьшаться при ожирении или других нарушениях обмена веществ. Еще в одном варианте осуществления введение композиции по изобретению индуцирует выработку антимикробных пептидов толстой кишки, таких как, например, RegHIgamma. Еще в одном варианте осуществления введение композиции по изобретению индуцирует выработку соединений семейства эндоканнабиноидов, таких как, например, ацилглицеролы, выбранные из группы, включающей 2-олеоилглицерин, 2-пальмитоилглицерин и 2-арахидоноилглицерин. Еще в одном варианте осуществления введение композиции по изобретению регулирует оборот слизи.

В одном варианте осуществления введение композиции по изобретению субъекту повышает ощущение сытости у указанного субъекта. Следовательно, в соответствии с этим вариантом осуществления, способ по изобретению повышает ощущение сытости или уменьшает потребление пищи указанным субъектом, тем самым индуцируя устойчивое снижение веса у указанного субъекта и, тем самым, излечивая нарушения обмена веществ у указанного субъекта, такие как, например, нарушения обмена веществ, связанные с ожирением.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На фиг.1 представлена масса тела на 12-й неделе перорального введения носителя или пастеризованной,A. muciniphila с добавлением или без добавления растительных экстрактов (фиг. 1А и 1 В) на приросте массы тела на 12-й неделе в модели DIO (45 ккал% липидов, 12 недель). ***р<0,001, ****р<0,0001 по сравнению с HFD-носителем; ###р<0,001, ####р<0,001 по сравнению с HFD pAkk (значения р получены с использованием однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) с последующим апостериорным тестом Бонферрони).

На фиг. 2А, 2 В, 3А и 3В проиллюстрировано влияние только пастеризованной Akkermansia muciniphila или в комбинации с растительными экстрактами на массу тела и прирост массы тела в модели DIO (45 ккал% липидов, 12 недель).

На фиг.2 представлено изменение массы тела с течением времени при пероральном введении носителя (кружки) или только пастеризованной A. muciniphila (квадраты), или пастеризованной A.muciniphila с зеленым чаем (треугольники) на приросте массы тела с течением времени в модели DIO (45 ккал% липидов, 12 недель). *р<0,05, **р<0,01, ***р<0,001, ****р<0,0001 по сравнению с HFD-носителем; #р<0,05, ##р<0,01, ####р<0,0001 по сравнению с HFD pAkk. (значения р получены с использованием однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) с последующим апостериорным тестом Бонферрони).

На фиг.3 представлен прирост массы тела с течением времени при пероральном введении носителя (кружки) или только пастеризованной,A. muciniphila. (квадраты) или пастеризованной A. muciniphila с зеленым чаем (треугольники) на приросте массы тела с течением времени в модели DIO (45 ккал% липидов, 12 недель). *р<0,05, **р<0,01, ***р<0,001, ****р<0,0001 по сравнению с HFD-носителем; #р<0,05, ##р<0,01, ####р<0,0001 по сравнению с HFD pAkk. (значения р получены с использованием однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) с последующим апостериорным тестом Бонферрони).

На фиг.4 представлено потребление пищи во время перорального введения носителя или пастеризованной A. muciniphila с добавлением или без добавления зеленого чая во время приема пищи. ***р<0,001, ****р<0,0001 по сравнению с HFD-носителем; ####р<0,0001 по сравнению с HFD pAkk (значения p получены с использованием однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) с последующим апостериорным тестом Бонферрони).

На фиг. 4А, 4В, 4С, 4D и 4Е проиллюстрировано влияние композиции, содержащей пастеризованную Akkermansia muciniphila и экстракт зеленого чая, на барьерную функцию кишечника в модели DIO (45 ккал% липидов, 12 недель).

На фиг. 5 представлена экспрессия генов биомаркеров целостности кишечного барьера в толстой кишке во время перорального введения носителя или пастеризованной,A. muciniphila с добавлением или без добавления зеленого чая на 12-й неделе на различных маркерах целостности кишечного барьера в толстой кишке (ПЦР-анализ кратности изменения по сравнению с группой носителя HFD) (А) экспрессия ZO-1, (В) экспрессия интектина, (С) экспрессия окклюдина, (D) экспрессия клаудина-3. *р<0,05 по сравнению с HFD-носителем; #р<0,05 по сравнению с HFD pAkk. (значения р получены с использованием однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) с последующим апостериорным тестом Бонферрони).

Фиг. 6: Прирост массы тела после 1 недели лечения. Влияние перорального введения носителя или пастеризованной Akkermansia muciniphila (pAkk) с добавлением или без добавления экстракта зеленого чая на массу тела после 1 недели лечения. &&&& р<0,001 HFD по сравнению с HFD pAkk, **** р<0,0001 HFD по сравнению с HFD+зеленый чай, ####р<0,0001 HFD по сравнению с pAkk+зеленый чай, р<0,05 pAkk по сравнению с pAkk+зеленый чай, § р<0,05 зеленый чай по сравнению с pAkk+зеленый чай. Соответствующие р-значения, получены с использованием двухфакторного дисперсионного анализа (ANOVA) с последующим апостериорным тестом Бонферрони. Другие значимые сравнения не представлены. Соответствующие р-значения, получены с использованием двухфакторного дисперсионного анализа (ANOVA) с последующим апостериорным тестом Бонферрони. Другие значимые сравнения не представлены.

Фиг. 7: Мониторинг массы тела в течение 12 недель лечения. Влияние перорального введения носителя или пастеризованной Akkermansia muciniphila(pAkk), с добавлением или без добавления экстракта зеленого чая, на (А) изменение массы тела с течением времени, (В) изменение прироста массы тела с течением времени. & р<0,05, && р<0,01, &&& р<0,001 HFD носитель по сравнению с HFD pAkk, * р<0,05, **р<0,01, **** р<0,0001 HFD по сравнению с HFD+зеленый чай, # р<0,05, ## р<0,01, ### р<0,001, #### р<0,0001 HFD по сравнению с HFD pAkk+зеленый чай, <0,05, <0,01, <0,001, <0,0001 HFD pAkk по сравнению с HFD pAkk+зеленый чай, $ p<0,05, $ $ p<0,01 HFD, $ $ $ p<0,001, $ $ $ $ p<0,0001 pAkk no сравнению с HFD зеленый чай. Соответствующие р-значения, получены с использованием двухфакторного дисперсионного анализа (ANOVA) с последующим апостериорным тестом Бонферрони.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На фиг. 1, 2, 3, 4 и 5 проиллюстрировано влияние in vivo пастеризованной Akkermansia muciniphila (на фиг. обозначенной как «рАкк») отдельно или в комбинации с растительными экстрактами на массу тела и прирост массы тела мышей, потребление пищи мышами и барьерную функцию кишечника у мышей, получавших диету с высоким содержанием жиров, далее именуемую «HFD».

Девятинедельным самцам мышей C57BL/6J (Лаборатория Чарльз Ривер, л'Арбресль, Франция) после прибытия давали по меньшей мере 5 дней на акклиматизацию. Животных содержали в вентилируемых и хорошо оборудованных клетках (48 см х 37,5 см х 21 см) на протяжении всей экспериментальной фазы. Подстилки в клетках животных меняли один раз в неделю. Мышей содержали группами по 5 животных при нормальном световом цикле (в 19:00 свет выключали), температуре 22±2°С и относительной влажности 50±10%. Ежедневно фиксировали параметры места содержания. Во время фазы акклиматизации стандартную диету (RM1 (Е) 801492, SDS) и водопроводную воду предоставляли без ограничений. Во время экспериментальной фазы (12 недель) предоставляли диету с высоким содержанием жиров 45 ккал% (Research Diet #12451) (группа HFD) и водопроводную воду без ограничений. Мышам ежедневно вводили через пероральный желудочный зонд 180 мкл носителя или только 180 мкл раствора,4. A/ muciniphila, или 180 мкл,4. A. muciniphila ±один растительный экстракт (Бергамот: 125 мг/кг; Женьшень: 50 мг/кг или Зеленый чай: 300 мг/кг) в течение 12 недель получения HFD.

Еженедельно оценивали массу тела, потребление пищи и воды.

Отдельно гомогенизировали проксимальный отдел толстой кишки и из тканей получали полную РНК с использованием реагента TRI Reagent (компании Сигма Олдрич) и набора RNeasy 96 QIAcube НТ (компании Киаген). Количественный анализ полной РНК проводили путем анализа 1 мкл каждого образца в приборе Nanodrop (компании Озиме). Комплементарную ДНК получали путем обратной транскрипции 1 мкг полной РНК с использованием набора RT iScript (компании Биорад). ПЦР в реальном времени проводили с помощью Via7 real-time PCR system и программного обеспечения (прикладная биотехнология) с использованием для обнаружения Мастер-миксов для ПЦР SYBR Green Real-Time (компании Биорад). В качестве гена "домашнего хозяйства" был выбран RPL19. Все образцы брали в двух экземплярах, и данные анализировали в соответствии с методом 2ΔΔСТ. Идентичность и чистоту амплифицированного продукта оценивали путем анализа кривой плавления в конце амплификации.

Единственным из растительных экстрактов, продемонстрировавших превосходные результаты в отношении веса, увеличения веса (фиг. 1, 2 и 3) и барьерной функции кишечника неожиданно оказался зеленый чай в сочетании с пастеризованной Akkermansia muciniphila (фиг. 5). Действительно, прирост массы тела был значительно ниже при использовании комбинации пастеризованной Akkermansia mucinipgila и экстракта зеленого чая, чем при приеме только пастеризованной Akkermansia muciniphila. Эти результаты указывают на усиливающий или синергетический эффект экстракта зеленого чая в сочетании с пастеризованной Akkermansia muciniphila.

Сочетание пастеризованной Akkermansia muciniphila и экстракта зеленого чая также улучшило барьерную функцию с более выраженным влиянием на ЗО-1, интектин, окклюдин и клаудин-3 (см. фиг. 5).

На фиг. 6, 7А и 7 В проиллюстрировано влияние in vivo пастеризованной Akkermansia muciniphila (на фиг. обозначенной как «рАкк») отдельно или в комбинации с зеленым чаем на массу тела или прирост массы тела мышей, получавших диету с высоким содержанием жиров, далее именуемую «HFD».

Девятинедельным самцам мышей C57BL/6J (Лаборатория Чарльз Ривер, л'Арбресль, Франция) после прибытия давали по меньшей мере 5 дней на акклиматизацию. Животных содержали в вентилируемых и хорошо оборудованных клетках (48 см х 37,5 см х 21 см) на протяжении всей экспериментальной фазы. Подстилки в клетках животных меняли один раз в неделю. Мышей содержали группами по 5 животных при нормальном световом цикле (в 19:00 свет выключали), температуре 22±2°С и относительной влажности 50±10%. Ежедневно фиксировали параметры места содержания. Во время фазы акклиматизации стандартную диету (RM1 (Е) 801492, SDS) и водопроводную воду предоставляли без ограничений. Во время экспериментальной фазы (12 недель) предоставляли диету с высоким содержанием жиров 45 ккал% (Research Diet #12451) (группы HFD) и водопроводную воду без ограничений, при этом контрольные мыши получали обычный рацион питания (RM1 (Е) 801492, SDS) (группа NCD).

В начале протокола заказали по 13 мышей на группу, чтобы компенсировать потенциальную смертность, связанную с принудительным кормлением или дракой. Для проведения статистического анализа использовали всех мышей, за исключением группы pAkk и группы pAkk+зеленый чай, в которых мыши, соответственно 3-09 и 5-03, умерли из-за принудительного кормления.

После одной недели лечения HFD+pAkk, HFD+экстракт зеленого чая и HFD+pAkk+зеленый чай показали более низкий прирост массы тела, чем носитель HFD (фиг. 1). Кроме того, комбинация pAkk с зеленым чаем показала повышенную эффективность при значительном снижении прироста массы тела по сравнению с монотерапией (снижение на 1,24 г в комбинации по сравнению с 0,36 и 0,44 г в группе pAkk и ЗЧ соответственно, р<0,05) (фиг. 1). Этот эффект действительно является синергетическим, поскольку комбинация pAkk и зеленого чая дает больший эффект, чем сумма их частей (Вутен и др., 2021).

С течением времени в отношении массы тела или прироста массы тела комбинация pAkk + зеленый чай остается все еще более эффективной, чем pAkk или зеленый чай по отдельности, при этом значительный эффект по приросту массы тела проявляется, начиная со 2-й недели и до конца эксперимента (фиг. 2).

Группа изобретений может быть использована для профилактики или лечения нарушения обмена веществ, выбранного из группы, включающей ожирение, метаболический синдром, нарушения, связанные с дефицитом инсулина или резистентностью к инсулину, сахарный диабет, непереносимость глюкозы, аномальный метаболизм липидов, гипергликемию, дислипидемию, а также заболеваний, связанных с барьерной функцией кишечника, включая воспалительное заболевание кишечника, болезнь Крона и язвенный колит, синдром раздраженного кишечника, нарушение сократительной способности кишечника, гиперхолестеринемию и атерогенную дислипидемию. Предложена композиция, содержащая Akkermansia muciniphila и экстракт зеленого чая. Также предложены способ получения указанной композиции и применение указанной композиции для стимулирования снижения веса у субъекта, нуждающегося в этом. Изобретение обеспечивает превосходные результаты по снижению веса, а также улучшение барьерной функции кишечника. 3 н. и 11 з.п. ф-лы, 7 ил.

1. Композиция для применения в профилактике или лечении нарушения обмена веществ, выбранного из группы, включающей ожирение, метаболический синдром, нарушения, связанные с дефицитом инсулина или резистентностью к инсулину, сахарный диабет, непереносимость глюкозы, аномальный метаболизм липидов, гипергликемию, дислипидемию, а также заболеваний, связанных с барьерной функцией кишечника, включая воспалительное заболевание кишечника, болезнь Крона и язвенный колит, синдром раздраженного кишечника, нарушение сократительной способности кишечника, гиперхолестеринемию и атерогенную дислипидемию, содержащая Akkermansia muciniphila и экстракт зеленого чая.

2. Композиция по п. 1, в которой Akkermansia muciniphila является пастеризованной.

3. Композиция по любому из предшествующих пунктов, в которой нарушение обмена веществ представляет собой ожирение или нарушение барьерной функции кишечника.

4. Композиция по любому из предшествующих пунктов, дополнительно содержащая ингредиент или ингредиенты, выбранные из группы, включающей пробиотики, бактерии, дрожжи, микроорганизмы, пребиотики или их комбинации.

5. Композиция по любому из предшествующих пунктов, дополнительно содержащая минерал или витамин или их комбинацию.

6. Композиция по любому из предшествующих пунктов, дополнительно содержащая фармацевтически приемлемый носитель или носитель пищевой.

7. Композиция по любому из предшествующих пунктов, которую вводят перорально.

8. Композиция по любому из предшествующих пунктов, представляющая собой косметическую композицию, питательную композицию, пищевой продукт, диетическую добавку, лечебное питание или лекарственное средство.

9. Композиция по п. 1, дополнительно содержащая второй растительный экстракт.

10. Композиция по любому из предшествующих пунктов, в которой второй растительный экстракт выбран из группы, включающей Aronia melanocarpa, Emblica officinalis, Olea Europa, Citrus bergamia, Vaccinium macrocarpon, Myrciaria dubia, красный азиатский женьшень, Vaccinium oxycoccos, Vaccinium macrocarpon.

11. Способ получения композиции по любому из предшествующих пунктов, включающий следующие этапы:

a) культивирование клеток рода Akkermansia;

b) пастеризация культивируемых клеток, полученных на этапе а);

c) добавление криопротектора и рН-буфера;

d) лиофилизация пастеризованных клеток этапа с);

e) смешивание лиофилизированного порошка с экстрактом зеленого чая; и

f) необязательно изготовление капсул или гелевых капсул из смеси этапа е).

12. Применение композиции по любому из предшествующих пунктов для стимулирования снижения веса у субъекта, нуждающегося в этом.

13. Применение по п. 12, в котором пастеризованную Akkermansia muciniphila вводят в количестве от 1.10⁴ до 1.10¹² клеток в сутки, более предпочтительно от 1.10⁵ до 1.10¹¹ клеток в сутки и еще более предпочтительно от 1.10⁶ до 1.10¹⁰ клеток в сутки.

14. Применение по пп. 12, 13, в котором экстракт зеленого чая вводят в количестве, обеспечивающем от 100 до 600 мг в день, предпочтительно от 200 до 300 мг в день эпигаллокатехина галлата (EGCG).