СПОСОБ МОДЕЛИРОВАНИЯ ТУБЕРКУЛЕЗА ЖЕНСКИХ ПОЛОВЫХ ОРГАНОВ Российский патент 2016 года по МПК G09B23/28 

Изобретение относится к медицине, а именно к фтизиатрии, и может быть использовано для моделирования и разработки способов лечения туберкулеза женских половых органов.

Туберкулез женских гениталий - одна из форм экстрагенитального туберкулеза, чаще всего развивается у женщин репродуктивного возраста от 20 до 45 лет [1, 2, 3, 4, 5]. Туберкулез женских гениталий составляет около 5% всех воспалительных заболеваний женской половой сферы [6] с исходом в трубно-перитонеальное бесплодие, частота которого достигает 97% клинических наблюдений [7]. После проведения комплексной противотуберкулезной терапии восстановление фертильности отмечается лишь у 7,2% женщин [8]. В связи с этим поиск надежных способов моделирования туберкулеза женских половых органов для последующей разработки новых методов лечения патологии чрезвычайно актуален.

Известен способ моделирования туберкулеза женских половых органов в экспериментах на кроликах (А.с. 912147. Способ моделирования туберкулеза женских половых органов). При нем производится местное заражение животных культурой микобактерий туберкулеза, которая вводится под слизистую оболочку ампулярного отдела маточной трубы.

Недостатки прототипа:

1. Возможность повторить осуществление способа ставится под сомнение, так как не указаны биологические свойства (вид, вирулентность, чувствительность к противотуберкулезным препаратам) культуры микобактерий, используемой для заражения животных. Некорректно представлен расчет заражающей дозы микобактерий, а именно: не указано количество КОЕ (колониеобразующих единиц) в 1 мг культуры микобактерий туберкулеза.

2. Обеспечить стандартные условия для выполнения технических и патофизиологических этапов предлагаемой авторами модели представляется спорным, поскольку введение расчетной заражающей дозы микобактерий туберкулеза непосредственно под слизистую оболочку маточной трубы под визуальным контролем проблемно и неизбежно сопровождается механической травмой ампулярного отдела с последующим развитием неспецифической воспалительной реакции.

3. Целевая задача моделирования туберкулеза, поставленная авторами в приложении к половым органам, диктует необходимость учитывать анатомические особенности кровообращения в бассейне маточной артерии. В ампулярном отделе маточной трубы, рекомендуемом авторами в качестве зоны местного заражения культурой микобактерий туберкулеза, кровоток минимальный и, соответственно, наименее благоприятные условия для жизнедеятельности аэробных микобактерий туберкулеза.

4. Не позволяет наблюдать в динамике развитие патологического процесса, поскольку контроль за ходом развития туберкулезной инфекции осуществляется только при выведении животных из опыта. Последнее, в свою очередь, не позволяет выбрать тактику лечения и приводит к неоправданному завышению как количества животных, используемых в исследовании, так и финансовых затрат на их приобретение и содержание.

5. Необходимо использовать наркотические анальгетики (промедол 1 мл 1% р-ра на 1 кг) в качестве анестезиологического пособия.

Задачей предлагаемого способа является разработка способа моделирования туберкулеза женских половых органов с возможностью мониторинга развития специфического воспалительного процесса и разработки способов лечения.

Поставленная задача решается за счет того, что кроликам вводят суспензию культуры Mycobacterium tuberculosis Erdman в дозе 10⁷ КОЕ/0,2 мл инъекционной иглой под серозную оболочку левой маточной трубы (не входя в ее просвет) снаружи на расстоянии 5 см от левого маточного рога.

Предлагаемый способ моделирования туберкулеза женских половых органов позволяет:

1. Получить модель локального туберкулезного процесса в женских половых органах, доступную к воспроизводству за счет введения интраоперационно стандартизированной культуры М. tuberculosis Erdman с заданной инфицирующей дозой и обеспечения благоприятных условий для жизнедеятельности аэробных микобактерий туберкулеза за счет выбора зоны с оптимальным кровоснабжением маточной трубы (на расстоянии 5 см от маточного рога), а также улучшения васкуляризации и микроциркуляции маточных труб у эстрогенизированных кроликов.

2. Максимально приблизить экспериментальную модель развития специфического процесса к естественному, а также осуществлять прижизненный мониторинг развития и течения специфического воспалительного процесса от момента заражения до эвтаназии каждого животного, включенного в исследование, по результатам кожной пробы - Диаскинтеста (аллерген туберкулезный рекомбинантный, ДСТ), комплекса лабораторных (гематологических и биохимических показателей периферической крови) и лучевых (гистеросальпингография и лапароскопия) исследований.

4. Выбрать тактику лечения.

5. Исключить использование наркотических анальгетиков.

6. Сократить количество экспериментальных животных.

Способ поясняется чертежами, где на: Фиг. 1 - Эритема через 72 часа после внутрикожного введения Диаскинтеста. А - интактный, Б - зараженный кролик; Фиг. 2 - Инфицированная левая маточная труба через 60 дней. А - интактный, Б - зараженный кролик; Фиг. 3 - Гидросальпинкс инфицированной левой маточной трубы через 120 дней. А - интактный, Б - зараженный кролик; Фиг. 4 - Гистеросальпингография. А - интактный кролик, Б - зараженный кролик; Фиг. 5 - Гистологическая картина слизистой оболочки инфицированного маточного рога кролика. Окраска гематоксилином и эозином ×400.

Способ осуществляется следующим образом:

1-й этап - эстрогенизация животных синестролом - вводят 0,1% раствора синэстрола по 0,5 мл внутримышечно через день курсом 4 процедуры в пред- и послеоперационном периодах.

2-й этап - предоперационная подготовка и осуществление хирургического доступа. Выполняется анестезиологическое пособие: внутримышечное введение препарата для анестезии золетила (золозепам + тилетамин Вирбак СА, Франция) в дозе 25 мг/кг и 2% раствора миорелаксанта рометар (Xylazinum, Биовет, Чехия) в объеме 1,0 мл. Положение кролика - «на спине», конечности фиксируются на специальном станке в максимально вытянутом положении. Шерсть на передней брюшной стене выстригается, кожные покровы обрабатываются 5% раствором йода дважды. Операционное поле обкладывается стерильными салфетками. Разрез кожи длиной 5 см производится по средней линии. Передняя брюшная стенка вскрывается послойно. После вскрытия брюшины, маточные трубы и маточные рога выводятся в операционную рану и со всех сторон отгораживаются стерильным материалом от брюшной полости.

3-й этап - приготовление микобактериальной суспензии и инокуляция инфекта. Используют 2-недельный (вторая генерация) стандартный лабораторный вирулентный тест-штамм микобактерий туберкулеза М. tuberculosis Erdman, чувствительный к противотуберкулезным препаратам (из коллекции ФГБУН «Государственного НИИ стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича» ФМБА России). Микобактериальную суспензию готовят экстемпорально в стерильном физиологическом растворе в заданной концентрации - 10 КОЕ/0,2 мл. Для инокуляции суспензии культуры микобактерий туберкулеза в дозе 10⁷ КОЕ/0,2 мл инъекционная игла вводится под серозную оболочку левой маточной трубы снаружи (не входя в ее просвет) в точке, отстоящей от маточного рога на 5 см. В месте введения образуется папула до 0,3 см.

4-й этап - ушивание брюшины непрерывным викриловым швом, наложение отдельных викриловых швов на апоневроз, мышцы и кожу передней брюшной стенки. Обработка послеоперационного шва 5% раствором йода.

5 этап - послеоперационный период. В послеоперационном периоде со 2 по 6 сутки через день продолжается курс эстрогенизации кроликов 0,1% раствором синэстрола (внутримышечно, 0,5 мл), а также профилактика инфекционных осложнений с помощью антибиотиков широкого спектра действия, не обладающих противотуберкулезной активностью (пенициллины, цефалоспорины 1 или 2 поколения, курсом 5 дней).

Оценка развития и активности туберкулезного процесса в женских половых органах подтверждается путем:

- постановки кожной пробы с препаратом "ДИАСКИНТЕСТ®" (аллерген туберкулезный рекомбинантный) при внутрикожном введении препарата в концентрации 2 мкг/мл в количестве 0,1 мл на одну кожную пробу;

- проведения компьютерной томографии легких для исключения генерализации специфического процесса;

- выполнения диагностической лапароскопии;

- исследования взятой из краевой ушной вены крови: подсчет лейкоцитарной формулы, определение СОЭ, белков острой фазы;

- проведения гистеросальпингографии;

- бактериологического исследования биоптатов или гомогенатов серозной оболочки маточного рога и маточной трубы (посев на плотную питательную среду Левенштейна-Йенсена);

- гистологического исследования препаратов стенки маточного рога и маточной трубы.

Положительный результат кожного теста ДСТ и повышение величины С-реактивного белка в периферической крови (с 3,86±2,58 мг/л до 6,057±2,83 мг/л, р<0,05) на 30 сутки от момента заражения, а также отсутствие патологических изменений в легких является доказательством развития изолированной формы туберкулезного воспаления в женских половых органах кроликов.

Пример.

Кролику №9 породы шиншилла (пол - самка, исходная масса - 4,2 кг, температура +39,0°C) предварительно проводилась внутримышечная эстрогенизация 0,5 мл 0,1% раствора синестрола с седьмых суток до заражения через день. Накануне заражения проведен биохимический и клинический анализ крови.

С целью обезболивания внутримышечно введены раствор золетила 0,3 мл и раствор Рометара 2% - 1,0 мл. Кролик зафиксирован на станке в положении на спине, конечности - в максимально вытянутом положении. Шерсть на передней брюшной стене выстрижена, кожные покровы обработаны дважды 5% раствором йода. Произведен разрез кожи длиной 5 см по средней линии, послойное вскрытие передней брюшной стенки. Маточные трубы и маточные рога выведены в операционную рану и отгорожены стерильным материалом от брюшной полости. Затем осуществлено введение суспензии микобактерий М. tuberculosis Erdman в дозе 10⁷ КОЕ/0,2 мл под серозную оболочку левой маточной трубы путем ее наружного прокола инъекционной иглой на расстоянии 5 см от маточного рога. В месте введения инфекта визуализируется папула 0,3 см. Брюшина ушита непрерывным викриловым швом, апоневроз, мышцы и кожа передней брюшной стенки - отдельными викриловыми швами. Послеоперационный шов обработан 5% раствором йода.

В раннем послеоперационном периоде животное ежедневно наблюдалось, производился осмотр, взвешивание, эстрогенизация 0,1% раствором 0,5 мл синэстрола со 2 по 6 сутки через день, а также профилактика инфекционных осложнений р-ром цефазолина внутримышечно по 1,5 мл (из расчета 50 тыс. ЕД/кг) в течение 5 дней. В дальнейшем клинический осмотр осуществлялся 1-3 раза в неделю.

Через 30 дней после инокуляции МБТ осуществляли постановку кожной пробы путем внутрикожного введения Диаскинтеста в концентрации 2 мкг/мл в количестве 0,1 мл на одну кожную пробу. Установлено, что в ответ на введение аллергена в области спины у инфицированного кролика регистрировали появление эритемы размером 15,7±3,5 мм, что свидетельствует о наличии сенсибилизации и подтверждает развитие туберкулезного процесса (Фиг. 1). В периферической крови инфицированного кролика определяли увеличение уровня С-реактивного белка в периферической крови (с 3,86±2,58 до 6,057±2,83 мг/л, р<0,05).

Через 60 дней после заражения ревизия брюшной полости с помощью лапароскопической техники показала прогрессирующую отечность, гиперемию и расширение инфицированного левого маточного рога и левой маточной трубы (Фиг. 2). В посевах биоптатов серозной оболочки инфицированного маточного рога определяли рост МБТ. При компьютерной томографии легких у кролика специфические патологические изменения не обнаружены.

При визуальной ревизии брюшной полости через 120 дней после заражения выявляли рыхлые и плоскостные спайки, облитерацию маточных труб с образованием гидросальпинкса в инфицированной левой маточной трубе (Фиг. 3). При гистеросальпингографии кролика №9 отмечена полная задержка выхода контрастного вещества в брюшную полость, что говорит о непроходимости как инфицированной, так и коллатеральной маточных труб (Фиг. 4). Выполнена эвтаназия животного. При макроскопическом осмотре отмечалась деформация левой маточной трубы, облитерация участка в месте инокуляции суспензии культуры МБТ. В других органах грудной и брюшной полости туберкулезных изменений не обнаружено. При гистологическом исследовании в центральных отделах мышечного слоя инфицированного маточного рога сохранялись признаки специфического воспаления в виде единичных продуктивных туберкулезных эпителиодноклеточных гранулем с гигантскими многоядерными клетками со слабо выраженной лимфоплазмоцитарной инфильтрацией (Фиг. 5).

Способ применен на 25 (5 из них интактные) половозрелых кроликах-самках. Эффективность способа. Время наблюдения составило 120 дней. Результаты проведенных опытов свидетельствуют, что инокуляция под серозную оболочку левой маточной трубы суспензии стандартного лабораторного вирулентного тест-штамма М. tuberculosis Erdman в дозе 10⁷ КОЕ/0,2 мл при дополнительной эстрогенизации приводит к развитию у подопытных животных на фоне спаечного процесса специфических воспалительных изменений в матке и маточных трубах с облитерацией просвета маточных труб и/или образованием гидросальпинксов.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет воспроизвести в экспериментах на кроликах туберкулезное поражение матки и маточных труб, а также осуществлять прижизненный мониторинг развития и оценку тяжести течения специфического воспалительного процесса от момента заражения до эвтаназии у конкретного животного, включенного в исследование. Это дает возможность разрабатывать тактику лечения туберкулеза женских половых органов на разных этапах развития заболевания.

Список литературы

1. Gatongi D.K., Gitau G., Kay V., Ngwenya S., Lafong C, Hasan A. Female genital tuberculosis // The Obstetrician & Gynaecologist. - 2005. - Vol. 7. P. 75-79.

2. Hatami M. Tuberculosis of the female genital tract in Iran // Arch Iran Med. - 2005. - Vol.8. - P. 32-35.

3. Mondal S.K. Histopathologic analysis of female genital tuberculosis: a fifteen-year retrospective study of 110 cases in eastern India // Turk Patoloji Derg. - 2013. - Vol. 29, 1. - P. 41-5.

4. Mondal S.K., Dutta Т.К. A ten year clinicopathological study of female genital tuberculosis and impact on fertility // JNMA J Nepal Med Assoc. - 2009. - Jan-Mar. - Vol. 48, N173. - P. 52-7.

5. Crochet J.R., Hawkins K.C., Holland D.P., Copland S.D. Diagnosis of pelvic tuberculosis in a patient with tubal infertility // Fertil Steril. - 2011. - Vol. 95. - P. 289.

6. Duggal S., Duggal N., Hans C, Mahajan R.K. Female genital ТВ and HIV co-infection // Indian J Med Microbiol. - 2009. - Vol. 27,4. - P. 361-363.

7. Sharma J.B., Roy K.K., Pushparaj M., Kumar S., Malhotra N., Mittal S. Laparoscopic findings in female genital tuberculosis // Arch Gynecol Obstet. - 2008. - Oct. - Vol. 278, N4. - P. 359-64.

8. Parikh F.R., Nadkarni S.G., Kamat S.A., Naik N., Soonawala S.B., Parikh R.M. Genital tuberculosis-a major pelvic factor causing infertility in Indian women // Fertil Steril. - 1997. - Mar. - Vol. 67, N3. - P. 497-500.

Изобретение относится к медицине, а именно к фтизиатрии, и может быть использовано для моделирования туберкулеза женских половых органов. Для этого кроликам вводят суспензию культуры Mycobacterium tuberculosis Erdman в дозе 10⁷ КОЕ/0.2 мл под серозную оболочку маточной трубы на расстоянии 5 см от маточного рога. При этом до операции проводят эстрогенизацию животного внутримышечным введением 0,1% раствора синэстрола по 0,5 мл через день курсом 4 процедуры. Со 2 по 6 сутки после операции продолжают эстрогенизацию в том же режиме и проводят профилактику инфекционных осложнений с помощью антибиотиков широкого спектра действия, не обладающих противотуберкулезной активностью. Способ позволяет получить модель локального туберкулезного процесса в женских половых органах, доступную к воспроизводству и максимально приближенную к развитию специфического процесса к естественному, а также осуществлять прижизненный мониторинг развития и течения специфического воспалительного процесса и выбирать тактику лечения. 1 пр., 5 ил.

Способ моделирования туберкулеза женских половых органов путем местного заражения кроликов культурой микобактерий туберкулеза, отличающийся тем, что животному вводят суспензию культуры Mycobacterium tuberculosis Erdman в дозе 10⁷ КОЕ/0.2 мл под серозную оболочку маточной трубы на расстоянии 5 см от маточного рога, при этом до операции проводят эстрогенизацию животного внутримышечным введением 0,1% раствора синэстрола по 0,5 мл через день курсом 4 процедуры, а со 2 по 6 сутки после операции продолжают эстрогенизацию в том же режиме и проводят профилактику инфекционных осложнений с помощью антибиотиков широкого спектра действия, не обладающих противотуберкулезной активностью.