Способ моделирования туберкулеза плевры Российский патент 2024 года по МПК A61B17/00 A61M25/01 A61K9/08 A61K33/14 A61K39/04 A61P43/00 G09B23/28 

Изобретение относится к медицине, а именно к фтизиатрии и торакальной хирургии, и может быть использовано для моделирования туберкулеза плевры в эксперименте.

Частота туберкулеза плевры достоверно неизвестна, так как данное поражение чаще всего является следствием какой-либо формы туберкулеза легких, обычно, диссеминированного процесса. Тем не менее, туберкулез плевры остается одной из самых частых причин развития плеврита, особенно, в развивающихся странах [5, 6, 7]. Диссеминация происходит гематогенно, реже лимфогенно. При туберкулезе плевры определяются гранулемы непосредственно на поверхности висцеральной или париетальной плевры. Воспалительный процесс приводит к экссудации, накоплению серозного либо гнойного выпота в плевральной полости [11, 12]. Именно при данной форме туберкулеза при микроскопии в плевральной жидкости выявляются микобактерии [1, 4, 11]. Несмотря на вторичный характер воспалительных процессов в плевре, они в большинстве случаев определяют тяжесть течения и прогноз основного заболевания и требуют специальных лечебных мер [2]. Проблема туберкулеза плевры также заключается в медленном ответе на лекарственную терапию и риске формирования шварт и фиброзирования подлежащей легочной ткани. Продолжающаяся экссудация требует длительного дренирования, что снижает качество жизни пациентов [12, 13].

Поиск новых способов комбинированной терапии туберкулеза плевры, направленный на непосредственное воздействие на гранулемы, делает актуальным создание модели туберкулезного поражения плевры у лабораторных животных.

Известен способ моделирования ограниченной туберкулезной эмпиемы, при котором у собаки выполняют под общей анестезией послойную торакотомию в VI-ом межреберье, легкое фиксируют вокруг стерильного тампона, обработанного йодолиполом, через 10-14 дней тампон удаляют и в полость инокулируют 25-35 мг микобактерий туберкулеза штамма H37Rv [14].

Способ отличает: 1) высокая травматичность, ввиду необходимости выполнения нескольких хирургических вмешательств под обшей анестезией; 2) отсутствие четких данных в отношении заражающей дозы (количество микобактериальных клеток в 1 мг сухой культуры). Выбор в качестве модельных животных собак существенно ограничивает возможность его использования в связи с высокими материальными затратами на приобретение, содержание животных, выполнение операционных и лечебных процедур.

На сегодняшний день сведения о разработке способов моделирования туберкулеза плевры нами не найдены.

Задачей предлагаемого изобретения является создание экспериментальной воспроизводимой модели туберкулеза плевры.

Поставленная задача решается тем, что лабораторным животным, кроликам, в краевую ушную вену вводят иммунодепрессант инфликсимаб в дозе 10 мг/кг, затем через сутки производят разрез мягких тканей до плевры, после чего в плевральную полость устанавливают катетер, по которому вводят суспензию международного стандартизированного штамма Mycobacterium tuberculosis H37Rv в концентрации 10⁶ микробных клеток в 10 мл физиологического раствора и 40 мл воздуха.

Способ моделирования туберкулеза плевры доступен к воспроизводству за счет обеспечения благоприятных условий для жизнедеятельности микобактерий туберкулеза на фоне иммуносупрессии и открывает возможности для изучения патогенетических, диагностических, лечебных и прогностических аспектов заболевания.

Предлагаемый способ моделирования туберкулезного поражения плевры прост в исполнении, характеризуется малой травматичностью, не требует сложного анестезиологического пособия. Использование таких достаточно крупных лабораторных животных, как кролики, позволяет оценить развитие инфекционного процесса по данным компьютерной томографии, не прибегая к эвтаназии.

В организме кролика с помощью фармакопейного препарата инфликсимаба (ЗАО "БИОКАД" Россия) ингибируют функциональную активность ФИО-альфа (фактора некроза опухоли-альфа). Выбор в качестве модельного объекта кроликов не случаен. По данным ряда исследователей, они проявляют высокую степень чувствительности к М. bovis, но выраженную резистентность к инвазии М. tuberculosis, сходную по основным параметрам с человеческой, что обеспечивается одним из главных регулирующих цитокинов - фактором некроза опухолей (TNF-α) [3]. Он выполняет множество иммунорегуляторных функций, включая раннюю индукцию хемокинов, приводящую к привлечению макрофагов, а также участвует неизвестным пока образом в формировании и устойчивости гранулем, которые помогают контролировать микобактериальные инфекции [8, 9, 10].

Сущность изобретения поясняется чертежами.

Фиг. 1 - Фотография этапа формирования минидоступа в правую плевральную полость.

Фиг. 2 - Фотография установленного в плевральную полость катетера

Фиг. 3 - Фотография ушитой операционной раны после удаления плеврального катетера.

Фиг. 4 - КТ-изображение грудной клетки кролика через 10 дней после операции. Стрелкой указана жидкость в верхних отделах плевральной полости.

Фиг. 5 - Микропрепарат париетальной плевры кролика №2 через 4 месяца после инокуляции M. tuberculosis H37Rv в правую плевральную полость в концентрации 10⁶ микробных клеток в 10 мл физиологического раствора и 40 мл воздуха. Кислотоустойчивые бактерии в очаге казеозного некроза (указаны стрелкой). Окраска по Цилю-Нельсену, ув. × 400.

Фиг. 6 - Микропрепарат паренхимы легкого кролика №1 через 4 месяца после инокуляции М. tuberculosis H37Rv в правую плевральную полость в концентрации 10⁶ микробных клеток в 10 мл физиологического раствора и 40 мл воздуха. Формирующийся очаг некроза (а), окруженный валом из эпителиоидных клеток (б) с лимфоидно-лейкоцитарным инфильтратом по периферии. Окраска гематоксилином и эозином, ув. × 100

При разработке способа использовались кролики породы «Советская Шиншилла», приобретенные в федеральном государственном унитарном предприятии «Питомник лабораторных животных «Рапполово» НИЦ «Курчатовский институт», которые до начала исследования содержались в условиях сертифицированного вивария федерального государственного бюджетного учреждения «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт фтизиопульмонологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Предлагаемый способ осуществляется следующим образом.

Кроликам самцам, в возрасте 3 месяцев и массой 3,5 кг, за одни сутки до инфицирования в краевую ушную вену медленно вводили раствор инфликсимаба (в дозе 10 мг/кг) в объеме 10 мл, приготовленного ех tempore на физиологическом растворе.

В условиях операционной кроликов под общей анестезией с использованием ксилазина гидрохлорида в дозе 5,0 мг/кг внутримышечно с последующим (через 20 минут) внутримышечным введением золетила-100 в дозе 15 мг/кг укладывают на левый бок, удаляют шерсть на правом боку от II до VI межреберья, поверхность обрабатывают раствором антисептика (повидон-йод). За час до операции проводят антибиотикопрофилактику с использованием цефазолина (в дозе 50 тыс. ЕД/кг, 1,5 мл внутримышечно). Далее на уровне IV-V межреберья производится разрез кожи длиной 10 мм, разрез межреберных мышц до плевры (Фиг. 1). В месте доступа устанавливают ПВХ-катетер диаметром 12Fr на глубину около 10 мм (Фиг. 2). Далее по дренажу в одном шприце вводят 40 мл воздуха и 10 мл суспензии международного стандартизированного штамма М. tuberculosis H37Rv (получен из Федерального государственного бюджетного учреждения "Научный центр экспертизы средств медицинского применения" Министерства здравоохранения Российской Федерации), приготовленную extempore в день заражения животных и содержащую 10⁶ клеток микобактерий физиологического раствора. После введения инфекта производилось герметичное ушивание мышц с одномоментным удалением катетера, ушивание кожи двумя узловыми швами. Обработка раны раствором повидон-йода (Фиг. 3). В течение 5 дней после инфицирования проводят профилактику инфекционных осложнений с помощью антибиотиков широкого спектра действия, не обладающих противотуберкулезной активностью (пенициллины, цефалоспорины 1 или 2 поколения) курсом 5 дней в средних терапевтических дозах.

Контроль за развитием и течением туберкулезной инфекции у лабораторных животных:

- компьютерная томография (томограф Toshiba Aquilion One) органов грудной клетки до операции (контроль), а также через 10, 20, 30 дней после операции для оценки наличия гидроторакса, утолщения плевры, наличия изменений в легочной паренхиме;

- патоморфологическое исследование, в том числе макроскопическое исследование внутренних органов грудной клетки, гистологическое исследование микропрепаратов легких и плевры при окраске гематоксилином и эозином, а также по методу Циля-Нельсена для обнаружения кислотоустойчивых микобактерий.

- микробиологическое исследование тканей легких и плевры (посевы на плотную среду Финн-II).

При КТ через 3 дня после инфицирования у кроликов наблюдался пневмоторакс, небольшая подкожная эмфизема. Через 10 дней мы визуализировали небольшое количество жидкости в плевральной полости, регресс пневмоторакса. Через 20 дней жидкость имела тенденцию к осумкованию, преимущественно в верхних отделах плевральной полости, с нарастанием количества жидкости. Далее были визуализированы множественные очаги в легких, уменьшение количества жидкости в плевральной полости.

Через 4 месяца после инфицирования выполнена эвтаназия животных путем введения в латеральную вену уха препарата для анестезии золетила в дозе в 5 раз, превышающей терапевтическую.

При макроскопическом обследовании при аутопсии выведенных из эксперимента животных в плевральной полости обнаружены плевропульмональные спайки, округлые белые очаги на поверхности висцеральной и париетальной плевры.

При гистологическом исследовании микропрепаратов плевры и паренхимы легкого выявлены множественные эпителиоидно-клеточные гранулемы с гигантскими многоядерными клетками Лангханса. При окраске по методу Циля-Нельсена обнаруживались множественные длинные тонкие кислотоустойчивые палочки, соответствующие по морфологическим характеристикам М. tuberculosis.

При бактериологическом исследовании ткани легких и плевры получен рост микобактерий туберкулеза на среде Финн-II.

Способ проверен на 4 кроликах-самцах.

Эффективность способа. Время наблюдения составило 4 месяца. Результаты проведенных опытов свидетельствуют, что введение в плевральную полость суспензии микобактерий туберкулеза в условиях пневмоторакса приводит к развитию у лабораторных животных специфических воспалительных изменений в плевре, паренхиме легких, при низком риске осложнений.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет в экспериментальных условиях воспроизводить туберкулезное поражение плевры с использованием малоинвазивного хирургического доступа, а также осуществлять прижизненный мониторинг развития и оценку тяжести течения специфического воспалительного процесса от момента заражения до эвтаназии у конкретного животного, включенного в исследование. Заявляемая модель имеет научно-прикладную ценность для фтизиатрии и торакальной хирургии, поскольку отражает механизм структурно-функциональных изменений на разных этапах развития заболевания и дает возможность корректировать тактику лечения.

Список литературы

1. Карпина Н.Л., Васильева И.А., Скорняков С.Н. Федеральные клинические рекомендации по диагностике и лечению туберкулезного плеврита. Москва, 2014

2. Семенова О.В. Плевриты при туберкулезе легких // Лечебное дело. 2009. №3. С. 4-8.

3. Arrazuria R., Juste R.A. Elguezabal N. Mycobacterial infections in rabbits: From the wild to the laboratory. Transboundary and Emerging Diseases. 2017; 64:P1045-58.

4. Baumann M.H., Nolan R., Petrini M., et al. Pleural tuberculosis in the United States: incidence and drug resistance. Chest. 2007; 131:P1125-32

5. Berger HW, Mejia E. Tuberculous pleurisy. Chest. 1973; 63:P88-92

6. Levine H, Szanto PB, Cugell DW. Tuberculous pleurisy. An acute illness. Arch Intern Med 1968;122:P329-32

7. Light RW. Pleural diseases. 6th ed. Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins, 2013

8. Mezouar S, Diarra I., Roudier J., Desnues B. Tumor Necrosis Factor-Alpha Antagonist Interferes With the Formation of Granulomatous Multinucleated Giant Cells: New Insights Into Mycobacterium tuberculosis Infection. Front. Immunol. 2019; 10:P. 1947.

9. Mohan V.P., Scanga C.A., Yu K., Scott H.M. Effects of tumor necrosis factor alpha on host immune response in chronic persistent tuberculosis: possible role for limiting pathology. Infect. Immun. 2001; 69(3):P.1847-1855.

10. Roach, D.R., Bean A.G., Demangel C., France M.P. TNF regulates chemokine induction essential for cell recruitment, granuloma formation, and clearance of mycobacterial infection. J. Immunol. 2002; 168(9):P.4620-627.

11. Seibert A.F., Haynes J. Jr., Middleton R. et al. Tuberculous pleural effusion. Twenty-year experience. Chest. 1991; 99:P883-6

12. West J.B. Pulmonary pathophysiology.-Baltimore: Williams & Wilkins, 1998:P. 5-13.

13. Zhai K, Lu Y., Shi HZ. Tuberculous pleural effusion. J Thorac Dis. 2016 Jul; 8(7):P486-94

14. Патент №1624504 РФ. Способ моделирования ограниченной туберкулезной эмпиемы плевры / Кагаловский Г.М., Семитко А.П., Сметанин А.Г., Бондарев И.М., Бугаенко С.Е.

Изобретение относится к экспериментальной медицине, а именно к фтизиатрии и торакальной хирургии. Кроликам в краевую ушную вену вводят иммунодепрессант инфликсимаб в дозе 10 мг/кг. Затем через сутки производят разрез мягких тканей до плевры, после чего в плевральную полость устанавливают катетер, по которому вводят суспензию штамма Mycobacterium tuberculosis H37Rv в концентрации 10⁶ микробных клеток в 10 мл физиологического раствора и 40 мл воздуха. Способ позволяет в экспериментальных условиях воспроизводить туберкулезное поражение плевры с использованием малоинвазивного хирургического доступа, что в свою очередь дает возможность осуществлять прижизненный мониторинг развития и оценку тяжести течения специфического воспалительного процесса от момента заражения до эвтаназии у конкретного животного, включенного в исследование. 6 ил. 1 пр.

Способ моделирования туберкулеза плевры, отличающийся тем, что в краевую ушную вену кроликам вводят иммунодепрессант инфликсимаб в дозе 10 мг/кг, затем через сутки производят разрез мягких тканей до плевры, после чего в плевральную полость устанавливают катетер, по которому вводят суспензию, содержащую взвесь штамма Mycobacterium tuberculosis H37Rv в концентрации 10⁶ микробных клеток в 10 мл физиологического раствора и 40 мл воздуха.