ШТАММ ВИРУСА ГРИППА В/60/Пхукет/2013/26 ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА ЖИВОЙ ГРИППОЗНОЙ ИНТРАНАЗАЛЬНОЙ ВАКЦИНЫ ДЛЯ ВЗРОСЛЫХ И ДЛЯ ДЕТЕЙ Российский патент 2016 года по МПК C12N7/00 A61K39/145 A61P31/16 

Изобретение относится к медицинской вирусологии и может быть использовано в практическом здравоохранении для профилактики гриппа среди взрослых и детей с помощью живой гриппозной интраназальной вакцины из штамма вируса гриппа типа В, семейства Orthomyxoviridae, рода Influenzavirus В, В/60/Пхукет/2013/26.

В результате появления в циркуляции нового эпидемического штамма вируса гриппа, принадлежащего к антигенной линии Ямагата, - В/Пхукет/3073/2013, известный вакцинный штамм В/60/Висконсин/2010/125 антигенной линии Ямагата - прототип [Баженова Е.А., Ларионова Н.В., Киселева И.В., Дубровина И.А., Руденко Л.Г., Александрова Г.И. Вакцинный штамм вируса гриппа В/60/Висконсин/2010/125. Патент РФ №2545695. Опубл. 27.01.14. БИ №3] - утратил антигенную актуальность и вследствие этого не может вызвать защитную реакцию во время эпидемии, вызванной В/Пхукет/3073/2013-подобными штаммами вируса гриппа.

Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является получение вакцинного штамма для живой гриппозной вакцины актуальной антигенной разновидности на основе эпидемического вируса В/Пхукет/3073/2013. Вакцина должна быть пригодна для взрослых и для детей, то есть соответствовать нормативным требованиям, предъявляемым к вакцинным штаммам Фармакопейной статьей (ФСП: Р N 003224/01-270313) на Ультравак®, вакцину гриппозную аллантоисную живую для интраназального применения для взрослых и для детей.

Для подготовки вакцинного штамма были использованы два родительских вируса гриппа: эпидемический штамм вируса гриппа линии Ямагата - В/Пхукет/3073/2013 и безвредный для человека холодоадаптированный донор аттенуации В/СССР/60/69.

Применяемые в настоящее время штаммы для живых гриппозных вакцин получают методом генетической реассортации эпидемически актуальных вирусов с холодоадаптированными донорами аттенуации [Александрова Г.И. Применение метода генетической рекомбинации для получения вакцинных штаммов вируса гриппа. Вопр. вирусол. 1977. №4. С. 387-395].

Донор аттенуации В/СССР/60/69 - холодоадаптированный (са) и температурочувствительный (ts) штамм вируса гриппа, разрешенный для получения безвредных живых интраназальных вакцин для взрослых и детей [Александрова Г.И. Новое в эпидемиологии и профилактике вирусных инфекций. Л., 1968. С. 66-83]. Донор аттенуации В/СССР/60/69 был получен из эпидемического вируса гриппа В/СССР/69 методом холодовой адаптации [Александрова Г.И., Климов А.И. Живая вакцина против гриппа. СПб.: Наука. 1994. 151 с.], в результате чего он стал безвредным для человека, т.е. приобрел способность бессимптомно размножаться в верхних дыхательных путях привитых лиц, вызывая выработку полноценного противовирусного иммунитета.

Цель реассортации - получить штамм с вакцинной формулой генома 6:2. Гены, кодирующие поверхностные белки вируса гриппа гемагглютинин (НА) и нейраминидазу (NA), наследуются от антигенно актуального циркулирующего эпидемического (пандемического) штамма, а шесть генов, кодирующих внутренние и неструктурные белки (РВ2, РВ1, PA, NP, М, NS), - от безвредного для человека донора аттенуации.

Получение вакцинного штамма. Вакцинный штамм В/60/Пхукет/2013/26 получен методом генетической реассортации эпидемического вируса В/Пхукет/3073/2013 с донором аттенуации В/СССР/60/69 путем одновременного инфицирования развивающихся куриных эмбрионов (РКЭ) смесью родительских вирусов в эквивалентных инфекционных дозах, с последующей трехкратной селекцией клонов с заданными свойствами при пониженной до 26°С температуре инкубации в присутствии антисыворотки к донору аттенуации. Клоны дополнительно очищены тремя последовательными клонированиями методом предельных разведений в присутствии антисыворотки к донору аттенуации при пониженной (26°C) и оптимальной (32°C) температурах инкубации. Чистый клон проверен по фенотипическим характеристикам (ts-са-фенотип) и по формуле генома на соответствие требованиям, предъявляемым к вакцинным штаммам. Общее число пассажей при подготовке вакцинного штамма составило 6, после чего произведен один дополнительный накопительный пассаж (Е6/Е1).

Для анализа состава генома полученных реассортантов использовали:

(1) реакцию торможения гемагглютинации (РТГА), позволяющую определить принадлежность поверхностного антигена - гемагглютинина (НА) одному из родительских вирусов, то есть установить специфичность вакцинного штамма [Методы определения показателей качества иммунобиологических препаратов для профилактики и диагностики гриппа. МУК 3.3.2.1758-03];

(2) микс-ПЦР анализ ДНК копий генов [Киселева И.В. с соавт. Анализ состава генома штаммов сезонной и пандемической живой гриппозной вакцины. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2011. №4. С. 29-36], основанный на различиях в размерах соответствующих амплифицируемых фрагментов генов донора аттенуации или «дикого» вируса. Для каждого фрагмента генома эпидемического штамма вируса гриппа В/Пхукет/3073/2013 и донора аттенуации В/СССР/60/69 были использованы пары праймеров, специфичных соответственно только для донора аттенуации или только для вируса «дикого» типа [Киселева И.В. с соавт. Анализ состава генома штаммов сезонной и пандемической живой гриппозной вакцины. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2011. №4. С. 29-36] (табл. 1). Таким образом, «да-нет» результаты, регистрируемые в электрофорезе ПЦР-продуктов, позволяют четко установить принадлежность исследуемого гена и оценить степень чистоты вакцинного препарата.

Амплифицированные фрагменты ДНК визуализировали электрофорезом в 1,7%-ном агарозном геле, содержащем 0,5 мкг/мл этидиума бромида. Это позволило четко дифференцировать принадлежность генов исследуемого реассортантного штамма к эпидемическому вирусу гриппа В/Пхукет/3073/2013 или донору аттенуации В/СССР/60/69;

(3) полногеномное секвенирование с использованием набора BigDye Terminator v3.1 и секвенатора 3130x1 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA) в соответствии с инструкциями производителя. Для анализа данных секвенирования использовался программный пакет Lasergene 7.1.

Антигенная характеристика вакцинного штамма. Гемагглютинин (НА) полученного авторами вакцинного штамма В/60/Пхукет/2013/26 в РТГА идентичен эпидемическому вирусу В/Пхукет/3073/2013, антисывороткой к которому полностью нейтрализуется. Микс-ПЦР методом установлено и подтверждено секвенированием, что вакцинный штамм В/60/Пхукет/2013/26 унаследовал нейраминидазу (NA) - от эпидемического вируса В/Пхукет/3073/2013.

Формула генома. Формула генома 6:2 вакцинного штамма В/60/Пхукет/2013/26 подтверждена методом микс-ПЦР с помощью специфических праймеров [Киселева И.В. с соавт. Анализ состава генома штаммов сезонной и пандемической живой гриппозной вакцины. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2011. №4. С. 29-36] и секвенированием, то есть вакцинный штамм В/60/Пхукет/2013/26 унаследовал шесть генов, кодирующих внутренние белки (РВ2, РВ1, PA, NP, М, NS), от донора аттенуации В/СССР/60/69, а гены, кодирующие поверхностные белки (НА, NA) - от эпидемического вируса В/Пхукет/3073/2013. Доказательством получения вакцинного штамма с заданной формулой генома служат результаты микс-ПЦР и секвенирования, приведенные в табл. 2.

Секвенирование позволило четко установить принадлежность гена, кодирующего нейраминидазу исследуемого реассортантного вакцинного штамма, к эпидемическому вирусу гриппа В/Пхукет/3073/2013.

Результаты анализа всех генов вакцинного штамма В/60/Пхукет/2013/26 представлены в табл. 2.

Оценку фенотипических свойств вакцинного штамма В/60/Пхукет/2013/26 проводили путем его параллельного титрования в РКЭ при разных температурах. Вакцинный штамм В/60/Пхукет/2013/26 обладает: (1) высокой репродуктивной активностью, реплицируясь в РКЭ при оптимальной температуре инкубации до 8,7 log₁₀ ЭИД₅₀/мл; (2) выраженным температурочувствительным (ts) фенотипом - его инфекционная активность при температуре 38°C составила <0,7 log₁₀ ЭИД₅₀/мл, и (3) холодоадаптированным (са) фенотипом - инфекционная активность при пониженной до 26°C температуре инкубации составила 5,9 log₁₀ ЭИД₅₀/мл. Таким образом, ts/ca фенотип вакцинного штамма В/60/Пхукет/2013/26 идентичен фенотипу донора аттенуации В/СССР/60/69, что свидетельствует о его безвредности для человека.

Фенотипические свойства вакцинного штамма В/60/Пхукет/2013/26 не изменились после его пятикратного пассирования при использовании больших заражающих доз, что свидетельствует о генетической стабильности препарата (табл. 3).

Оценку токсичности (безвредность для лабораторных животных) вакцинного штамма В/60/Пхукет/2013/26 проводили в соответствии с Руководством по доклиническому изучению новых фармакологических веществ [Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ (под общей редакцией Р.У. Хабриева). - М., 2005. - 832 с.], с Методическими рекомендациями по доклиническим испытаниям эффективности и безопасности новых иммунобиологических лекарственных препаратов [Методические рекомендации «Доклинические испытания эффективности и безопасности новых иммунобиологических лекарственных препаратов». - М., - 2010. - 39 с.] и с «Правилами лабораторной практики» [Правила лабораторной практики. Приказ Минздрава РФ №708 н от 23.08.2010. http://docs.cntd.ru/document/901866938].

Изучение острой токсичности препарата при однократном введении вирусного материала с использованием плацебо контроля (физиологический раствор). Морским свинкам подкожно вводили вирус в объеме 5,0 мл вируссодержащей аллантоисной жидкости с титром 8,7 log₁₀ ЭИД₅₀/мл на животное (доза эквивалентна 10 дозам, применяемым для человека) и оценивали выживаемость лабораторных животных. Контрольным животным вводили эквивалентное количество препарата плацебо - физиологический раствор. Каждая экспериментальная группа состояла из 20 морских свинок.

В течение исследования каждое животное осматривалось ежедневно. Осмотр включал в себя оценку общего поведения и общего состояния животных. При введении препарата осмотр проводился через 2 часа после инъекции. Пальпации подлежали места инъекций (для оценки местного раздражающего действия препарата), а также зрительно выявляемые патологические образования.

В результате исследования показано, что однократное введение вакцинного штамма в объеме, максимально возможном для введения животным данного вида, не вызывало гибели экспериментальных животных, изменения внешнего вида, подвижности, поведенческих реакций, потребления пищи и воды (табл. 4).

Изучение подострой токсичности вакцинного штамма при двукратном введении вирусного материала с использованием плацебо контроля (физиологический раствор)

Вакцинный препарат вводили интраназально, ежедневно в течение 2 дней, в объеме 0,5 мл на свинку, по 0,25 мл в каждый носовой ход, доза эквивалентна 1 дозе, применяемой для человека). Контрольным животным вводили физиологический раствор в эквивалентном объеме. Каждая экспериментальная группа состояла из 20 морских свинок. Ежедневно в течение всего исследования проводился контроль общего состояния каждого животного.

Данные физиологического исследования также показали, что двукратное введение вакцинного штамма не вызывало гибели экспериментальных животных и не приводило к изменению внешнего вида, поведения морских свинок, не отражалось на потреблении ими пищи и воды (табл. 4).

В результате проведенных доклинических исследований установлено, что заявляемый вакцинный штамм живой гриппозной вакцины В/60/Пхукет/2013/26 характеризуется сочетанием полезных признаков, необходимых вакцинному штамму: антигенной специфичностью эпидемического вируса В/Пхукет/3073/2013, структурой генома 6:2, оптимальной для реассортантных вакцинных штаммов, а также характерной для донора аттенуации температурочувствительностью и холодоадаптированностью и безвредностью для лабораторных животных, что коррелирует с аттенуацией для человека.

Образец паспорта на вакцинный штамм В/60/Пхукет/2013/26 прилагается.

Таким образом, вакцинный штамм В/60/Пхукет/2013/26 по своим биологическим свойствам соответствует требованиям, предъявляемым к вакцинным штаммам Фармакопейной статьей (ФСП: Р N 003224/01-270313) на Ультравак^®, вакцину гриппозную аллантоисную живую для интраназального применения для взрослых и для детей.

Полученный штамм В/60/Пхукет/2013/26 депонирован 11.12.2014 под №2808 в Государственную коллекцию вирусов Института вирусологии им. Д.И. Ивановского (ФГБУ «ФНИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России, Россия RU, 123098, г. Москва, ул. Гамалеи, 16) и имеет характеристики, представленные в образце паспорта штамма.

Характеристика штамма

Инфекционная активность штамма В/60/Пхукет/2013/26 при репродукции в развивающихся куриных эмбрионах при 32°C в течение 72 часов - 8,7 log₁₀ ЭИД₅₀/мл.

Гемагглютинирующая активность - 1:64.

Штамм проявляет генетическую стабильность фенотипических признаков после 5 пассажей на куриных эмбрионах (при использовании больших заражающих доз).

Полезным свойством вакцинного штамма вируса гриппа В/60/Пхукет/2013/26 является его пригодность для наработки живой гриппозной вакцины. Предлагаемый по изобретению вакцинный штамм вируса гриппа В/60/Пхукет/2013/26 может быть использован для профилактики гриппа как у взрослых, так и у детей с трехлетнего возраста.

Изобретение относится к вирусологии. Предложен вакцинный штамм В/60/Пхукет/2013/26 - реассортант, полученный методом генетической реассортации эпидемического вируса В/Пхукет/3073/2013 с холодоадаптированным температурочувствительным вирусом В/СССР/60/69 - донором аттенуации, безвредным для людей. Штамм В/60/Пхукет/2013/26 характеризуется температурочувствительностью и холодоадаптированностью и безвредностью для лабораторных животных. Штамм В/60/Пхукет/2013/26 содержит гены, кодирующие поверхностные антигены вируса гемагглютинин (НА) и нейраминидазу (NA), от эпидемического родительского вируса В/Пхукет/3073/2013 и остальные шесть генов, кодирующих внутренние негликозилированные белки, от донора аттенуации В/СССР/60/69. Штамм В/60/Пхукет/2013/26 может быть использован в медицине для профилактики заболеваемости гриппом среди взрослых и детей в составе живой гриппозной интраназальной вакцины. 4 табл.

Штамм вируса гриппа В/60/Пхукет/2013/26, депонированный в Государственную коллекцию вирусов Института вирусологии им. Д.И. Ивановского (ФГБУ «ФНИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России, Россия RU, 123098, г. Москва, ул. Гамалеи, 16) под №2808, используемый для получения живой гриппозной интраназальной гриппозной вакцины для взрослых и для детей.