Вакцинный штамм вируса гриппа В/60/Колорадо/2017/1 (Линия Виктория) для производства живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых и для детей Российский патент 2021 года по МПК C12N7/00 

Изобретение относится к медицинской вирусологии и может быть использовано в практическом здравоохранении для профилактики гриппа среди взрослых и детей с помощью живой гриппозной интраназальной вакцины из штамма вируса гриппа типа В, семейства Orthomyxoviridae, рода Influenzavirus В, Викторианской линии, B/60/Колорадо/ 2017/1.

В результате появления и широкого распространения в циркуляции нового эпидемического штамма вируса гриппа, принадлежащего к антигенной линии В/Виктория - В/Колорадо/06/2017, Всемирной организацией здравоохранения было принято решение о замене состава противогриппозных вакцин в Южном, а затем и в Северном полушариях на 2019 и 2019/2020 эпидемические сезоны, соответственно [World Health Organization. WHO Recommendations on the composition of influenza virus vaccines. Recommended composition of influenza virus vaccines for use in the 2019 southern hemisphere influenza season. URL: https://wvvw.who.int/influenza/vaccines/virus/recommendations/2019_south/en/. World Health Organization. WHO Recommendations on the composition of influenza virus vaccines. Recommended composition of influenza virus vaccines for use in the 2019-2020 northern hemisphere influenza season. URL: https://www.who.int/influenza/vaccines/virus/recommen dations/2019_20_north/en/). В связи с этим, известный вакцинный штамм В/60/Пхукет/2013/26 антигенной линии В/Ямагата - прототип [Киселева И.В., Крутикова Е.В., Дубровина И.А., Кузнецова В.А., Баженова Е.А., Ларионова Н.В., Руденко Л.Г. - Патент РФ №2605926. Опубл. 27.12.2016, Бюлл. №36] - утратил антигенную актуальность, поскольку относится к другой антигенной линии, и вследствие этого не может вызвать защитную реакцию во время эпидемии, вызванной В/Колорадо/06/17-подобными штаммами вируса гриппа.

Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является получение вакцинного штамма для живой гриппозной вакцины актуальной антигенной разновидности на основе эпидемического вируса В/Колорадо/06/17 (линия Виктория) и безвредного для человека холодоадаптированного донора аттенуации В/СССР/60/69.

Применяемые в настоящее время штаммы для живых гриппозных вакцин получают методом генетической реассортации (рекомбинации) эпидемически актуальных вирусов с холодоадаптированными донорами аттенуации [Александрова Г.И. Применение метода генетической рекомбинации для получения вакцинных штаммов вируса гриппа. Вопр. вирусол. 1977. №4. С. 387-395].

Донор аттенуации В/СССР/60/69 - холодоадаптированный (са) и температурочувствительный (ts) штамм вируса гриппа, разрешенный для получения безвредных живых интраназальных вакцин для взрослых и детей [Александрова Г.И. Новое в эпидемиологии и профилактике вирусных инфекций. Л., 1968. С. 66-83]. Донор аттенуации В/СССР/60/69 был получен из эпидемического вируса гриппа В/СССР/69 методом холодовой адаптации [Александрова Г.И., Климов А.И. Живая вакцина против гриппа. СПб.: Наука. 1994. 151 с.], в результате чего он стал безвредным для человека, т.е. приобрел способность бессимптомно размножаться в верхних дыхательных путях привитых лиц, вызывая выработку полноценного противовирусного иммунитета.

Цель реассортации - получить штамм с вакцинной формулой генома 6:2. Гены, кодирующие поверхностные белки вируса гриппа гемагглютинин (НА) и нейраминидазу (NA), наследуются от антигенно актуального циркулирующего эпидемического штамма, а шесть генов, кодирующих внутренние и неструктурные белки (РВ2, РВ1, PA, NP, М, NS) - от безвредного для человека донора аттенуации.

Получение вакцинного штамма. Вакцинный штамм В/60/Колорадо/2017/1 (линия Виктория) получен методом генетической реассортации эпидемического вируса В/Колорадо/06/2017 (линия Виктория) с донором аттенуации В/СССР/60/69 путем одновременного инфицирования развивающихся куриных эмбрионов (РКЭ) смесью родительских вирусов в эквивалентных инфекционных дозах, с последующей трехкратной селекцией клонов с заданными свойствами при пониженной до 26°С температуре инкубации в присутствии антисыворотки к донору аттенуации. Клоны дополнительно очищены тремя последовательными клонированиями методом предельных разведений в присутствии антисыворотки к донору аттенуации при пониженной (26°С) и оптимальной (32°С) температурах инкубации. Чистый клон проверен по фенотипическим характеристикам (ts, ca-фенотип) и по формуле генома на соответствие требованиям, предъявляемым к вакцинным штаммам.

Антигенная характеристика вакцинного штамма.

Изучение антигенных свойств полученного авторами вакцинного штамма В/60/Колорадо/2017/1 (линия Виктория) показало, что:

- ответственный за антигенную специфичность поверхностный белок вакцинного штамма - гемагглютинин (НА) - антигенно идентичен эпидемическому вирусу В/Колорадо/06/2017 (линия Виктория) по данным РТГА с гомологичной сывороткой, поскольку показатели взаимодействия реассортанта В/60/Колорадо/2017/1 и родительского штамма В/Колорадо/06/2017, с крысиной антисывороткой, полученной к эпидемическому вирусу В/Колорадо/06/2017 полностью совпадали (табл. 1), что также подтверждено полногеномным секвенированием;

- второй ответственный за антигенную специфичность поверхностный белок вакцинного штамма - нейраминидаза (NA) - определен методом частичного секвенирования, а также полногеномным секвенированием и идентичен вирусу В/Колорадо/06/2017 (линия Виктория).

Формула генома. Для анализа состава генома полученных реассортантов использовали частичное секвенирование ДНК копий генов [Matyushenko V. et. al. Genotyping assay for differentiation of wild-type and vaccine viruses in subjects immunized with live attenuated influenza vaccine. PLoS One. 2017. Vol. 12 №7. P.e0180497. doi: 10.1371 /journal.pone.0180497].

Формула генома 6:2 соответствует требованиям, предъявляемым к штаммам живой гриппозной вакцины: гены, кодирующие поверхностные белки гемагглютинин (НА) и нейраминидазу (NA) принадлежат эпидемическому родительскому вирусу В/Колорадо/06/2017 (линия Виктория), а гены, кодирующих внутренние и неструктурные белки (РВ2, РВ1, PA, NP, М, NS), принадлежат донору аттенуации В/СССР/60/69. Результаты анализа всех генов вакцинного штамма В/60/Колорадо/2017/1 (линия Виктория) представлены в табл. 2.

Данные, полученные при первичном отборе вакцинного кандидата, были подтверждены его полногеномным секвенированием и показали, что вакцинный штамм В/60/Колорадо/2017/1 (линия Виктория) унаследовал все 6 генов, кодирующих внутренние и неструктурные белки, от донора аттенуации В/СССР/60/69 (табл. 2).

Все кодирующие нуклеотидные и аминокислотные замены, охарактеризованные для донора аттенуации В/СССР/60/69 как ответственные за его аттенуацию, присутствуют во внутренних генах реассортантного штамма В/60/Колорадо/2017/1 (линия Виктория).

Таким образом, полногеномное секвенирование вакцинного штамма В/60/Колорадо/2017/1 (линия Виктория) показало, что он унаследовал от донора В/СССР/60/69 полный набор аттенуирующих мутаций.

Генетическую стабильность кодирующих мутаций вакцинного штамма В/60/Колорадо/2017/1 (линия Виктория) изучали сравнением сохранности кодирующих мутаций до и после пятикратного пассирования вакцинного штамма в куриных эмбрионах с использованием метода частичного секвенирования. Показано, что нуклеотидная последовательность вакцинного штамма В/60/Колорадо/2017/1 (линия Виктория) до и после его пятикратного пассирования, осталась неизменной (табл. 3).

Оценку фенотипических свойств вакцинного штамма В/60/Колорадо/2017/1 (линия Виктория) проводили путем его параллельного титрования в РКЭ при разных температурах. Вакцинный штамм В/60/Колорадо/2017/1 обладает выраженным температурочувствительным и холодоадаптированным фенотипом, идентичным фенотипу донора аттенуации В/СССР/60/69. Установлено, что вакцинный вирус является температурочувствительным (ts фенотип) - его инфекционная активность при температуре 38°С составила ≤1,2 lg ЭИД₅₀/мл, и холодоадаптированным (ca фенотип) - инфекционная активность при пониженной до 26°С температуре инкубации составила 7,0 lg ЭИД₅₀/мл, что свидетельствует о его безвредности для человека, поскольку по этим показателям он идентичен донору аттенуации В/СССР/60/69.

Фенотипические свойства вакцинного штамма В/60/Колорадо/2017/1 (линия Виктория) не изменились после его пятикратного пассирования в развивающихся куриных эмбрионах при использовании больших заражающих доз, что свидетельствует о генетической стабильности препарата (табл. 3).

Безвредность для мышей. Доклинические исследования острой токсичности вакцинного штамма В/60/Колорадо/2017/1 (линия Виктория) проводили на белых беспородных мышах в соответствии с Руководством по проведению доклинических исследований лекарственных средств [Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств (Иммунобиологические лекарственные препараты); Часть вторая. - М.: Гриф и К, 2012. - 536 с] и с «Правилами надлежащей лабораторной практики» [Правила надлежащей лабораторной практики. Приказ Минздрава РФ №199н от 01.04.2016. https://rg.ru/2016/09/02/minzdrav-prikaz199-site-dok.html].

Мышам вводили однократно одну человеческую дозу, соответствующую 0,5 мл, вакцинного вируса внутрибрюшинно в титре 7,0 lg ЭИД₅₀/мл. Животным контрольной группы вводили внутрибрюшинно фосфатно-солевой буферный раствор (PBS). Ежедневно в течение всего исследования (7 дней) проводился контроль общего состояния каждого животного.

Данные физиологического исследования (подвижность, поведенческие реакции, кинетика массы тела) показали, что внутрибрюшинное введение вакцинного штамма не вызывало гибели экспериментальных животных (табл. 4) и не приводило к изменению их внешнего вида, поведения, не отражалось на потреблении ими пищи и воды, что свидетельствует о безвредности вакцинного препарата.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведенных доклинических исследований установлено, что заявляемый вакцинный штамм живой гриппозной вакцины В/60/Колорадо/2017/1 (линия Виктория) характеризуется сочетанием полезных признаков, необходимых вакцинному штамму: антигенной специфичностью эпидемического вируса В/Колорадо/06/2017 (линия Виктория), структурой генома 6:2, оптимальной для реассортантных вакцинных штаммов, а также характерной для донора аттенуации температурочувствительностью и холодоадаптированностью, что коррелирует с аттенуацией для человека. Штамм аттенуирован и безвреден для мышей.

Все это отражено в прилагаемом ниже Паспорте штамма.

Таким образом, вакцинный штамм В/60/Колорадо/2017/1 (линия Виктория) по основным биологическим свойствам, изученным в доклинических экспериментах in vitro и in vivo, соответствует требованиям, предъявляемым к вакцинным штаммам Фармакопейной статьей (ФСП: Р №003224/01-270313) на Ультравак®, вакцину гриппозную аллантоисную живую для интраназального применения для взрослых и для детей.

Полученный штамм В/60/Колорадо/2017/1 (линия Виктория) депонирован 28.02.2019 в Государственную коллекцию вирусов Института вирусологии им. Д.И. Ивановского ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России под №2901 и имеет характеристики, представленные в паспорте штамма.

ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАММА

Инфекционная активность штамма В/60/Колорадо/2017/1 (линия Виктория) при репродукции в развивающихся куриных эмбрионах при 32°С в течение 72 часов составляет 9.2 log₁₀ ЭИД₅₀/мл.

Гемагглютинирующая активность - 1:512.

Штамм проявляет генетическую стабильность фенотипических признаков после 5 пассажей на куриных эмбрионах (при использовании больших заражающих доз).

Полезным свойством вакцинного штамма вируса гриппа В/60/Колорадо/2017/1 (линия Виктория) является его пригодность для наработки живой гриппозной вакцины. Предлагаемый по изобретению вакцинный штамм вируса гриппа В/60/Колорадо/2017/1 (линия Виктория) может быть использован для профилактики гриппа как у взрослых, так и у детей с трехлетнего возраста.

ПАСПОРТ ВАКЦИННОГО ШТАММА

1 Название штамма: В/60/Колорадо/2017/1

2 ИЭМ идентификационный №: Col/1

3 Серия: №1

4 Сероподтип: линия Виктория, клайд V1A.1 (2 Del)

5 Метод подготовки: классическая реассортация в куриных эмбрионах

6 Родительские вирусы:

6.1 Эпидемический вирус: В/Колорадо/06/2017 (линия Виктория), CDC (Atlanta, USA) ID#3025629447

6.2 Донор аттенуации: В/СССР/60/69

7 Число пассажей в процессе

реассортаци Е8 (совместное заражение, два селективных пассажа, один слепой пассаж, три клонирования и одно накопление)

8 Состав генома: Гены РВ2, РВ1, PA, NP, М и NS от донора аттенуации, НА и NA - от эпидемического вируса (формула генома 6:2)

9 а) Характеристика штамма до лиофильной сушки:

9.1 b) Оптимальные условия репродукции: 32°С, 48 часов

9.2 с) Гемагглютинирующая активность: 1:512 с 1,0% куриными эритроцитами

9.3 d) Инфекционная активность при оптимальной температуре 32°С: 9,2 log₁₀ ЭИД₅₀/мл

9.4 е) ts маркер (температурочувствительность репродукции; инфекционная активность при температуре 38°С): ≤1,2 lg ЭИД₅₀/мл (ts фенотип)

9.5 f) са маркер (холодоустойчивость репродукции; инфекционная активность при температуре 26°С): 7,0 lg ЭИД₅₀/мл (са фенотип)

10 g) Характеристика штамма после лиофильной сушки:

10.1 Дата лиофилизации: 26.04.2018 г.

10.2 а) Объем материала в ампуле: 0.5 мл

10.3 b) Инфекционная активность при оптимальной температуре 32°С: 8,2 lg ЭИД₅₀/мл

10.4 с) Гемагглютинирующая активность: 1:256 с 1,0% куриными эритроцитами

11 d) Антигенная специфичность:

11.1 а) Гемагглютинин: идентичен эпидемическому вирусу В/Колорадо/06/2017 (линия Виктория) по данным секвенирования и РТГА

11.2 b) Нейраминидаза: идентична эпидемическому вирусу В/Колорадо/06/2017 (линия Виктория) по данным секвенирования

12 Токсикологическое

исследование in vivo

(острая токсичность): не токсичен после внутрибрюшинного введения мышам

13 Контроль стерильности: стерилен

Изобретение относится к вирусологии. Предложен штамм вируса гриппа В/60/Колорадо/2017/1 (Линия Виктория). Получен он на основе эпидемического вируса В/Колорадо/06/17 (линия Виктория) и безвредного для человека холодоадаптированного донора аттенуации В/СССР/60/69. Заявленный штамм характеризуется температурочувствительностью и холодоадаптированностью, безвредностью для лабораторных животных. Штамм содержит гены, кодирующие поверхностные белки вируса гриппа гемагглютинин (НА) и нейраминидазу (NA), наследуются от антигенно актуального циркулирующего эпидемического штамма, и остальные шесть генов, кодирующих внутренние и неструктурные белки (РВ2, РВ1, PA, NP, М, NS) от безвредного для человека донора аттенуации. Штамм В/60/Колорадо/2017/1 (Линия Виктория) может быть использован в медицине для профилактики заболеваемости гриппом среди взрослых и детей в составе живой гриппозной интраназальной вакцины. 4 табл.

Штамм вируса гриппа В/60/Колорадо/2017/1 (Линия Виктория), депонированный в Государственную коллекцию вирусов Института вирусологии им. Д.И. Ивановского ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России под №2901, для производства живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых и для детей.