Вакцинный штамм вируса гриппа А/17/Южная Африка/2013/01 (H1N1)pdm09 для производства живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых и для детей Российский патент 2017 года по МПК C12N7/00 A61K39/145 

Изобретение относится к медицинской вирусологии и может быть использовано в здравоохранении для профилактики заболеваемости гриппом среди взрослых и детей с помощью живой гриппозной интраназальной вакцины из штамма вируса гриппа А (семейство Orthomyxoviridae, род Influenzavirus А) A/17/Южная Африка/2013/01 (H1N1)pdm09.

В апреле 2009 года Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) объявила о появлении в циркуляции среди людей нового вируса гриппа A(H1N1)pdm. Новый вирус А/Калифорния/07/2009 (H1N1)pdm имеет генетическое родство по определенным генам с вирусами, вызывающими грипп свиней, птиц и человека, и никогда ранее не циркулировал среди людей. ВОЗ рекомендовала этот вирус как прототип при подготовке пандемической противогриппозной вакцины [World Health Organization. Characteristics of the emergent influenza A(H1N1) viruses and recommendations for vaccine development. http://www.who.int/csr/resources/publications/swineflu/vaccine_recommendations/en/index.html]. Калифорния-подобные вирусы продолжают циркулировать и до настоящего времени рекомендуются ВОЗ для включения в состав гриппозных вакцин. Однако гемагглютинин выделенного в 2009 году вируса гриппа А/Калифорния/07/2009 (H1N1)pdm не стабилен, а сам штамм обладает чрезвычайно низкой иммуногенностью и инфекционной активностью. Калифорния-подобные вирусы, циркулирующие в последнее время, более стабильны, что связано с единичной мутацией Glu-47-Lys в ножке гемагглютинина (НА2), которая влияет также на их инфекционную активность [Cotter CR, Jin Н, Chen Z. A single amino acid in the stalk region of the H1N1pdm influenza virus HA protein affects viral fusion, stability and infectivity. PLoS Pathol. 2014. Vol. 10(1). P.e1003831; Yang H, Chang JC, Guo Z et al. Structural stability of influenza A(H1N1)pdm09 virus hemagglutinins. J. Virol. 2014. Vol. 88(9). P. 4828-4838.].

В связи с вышесказанным, в качестве А/Калифорния/07/2009-подобного вируса был выбран штамм А/Южная Африка/3626/2013 (H1N1)pdm09, НА и NA которого антигенно и генетически сходны с другими пандемически-подобными вирусами, циркулирующими в настоящее время, а его гемагглютинин (НА2) содержит стабилизирующую мутацию Glu-47-Lys, отсутствующую у эталонного вируса А/Калифорния/07/2009.

В результате появления в циркуляции нового, высоко стабильного эпидемического штамма вируса гриппа, А/Южная Африка/3626/2013 (H1N1)pdm09, известный вакцинный штамм А/17/Калифорния/2009/38 (H1N1) - прототип [Ларионова Н.В., Киселева И.В., Александрова Г.И., Руденко Л.Г. Штамм вируса гриппа А/17/Калифорния/2009/38 (H1N1) для производства живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых и детей. Патент РФ №2413765 от 16.09.09. опубл. БИ 2011, №7] - утратил свою актуальность.

ЗАДАЧЕЙ, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является получение антигенно актуального А/Калифорния/07/2009 (H1N1)pdm-no лобного вакцинного штамма живой гриппозной вакцины для взрослых и для детей на основе холодоадаптированного донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) и нового эпидемического вируса А/Южная Африка/3626/2013 (H1N1)pdm09, обладающего стабильностью гемагглютинина и высокой репродуктивной активностью.

Применяемые в настоящее время штаммы для живых гриппозных вакцин получают методом генетической реассортации эпидемически актуальных вирусов с холодоадаптированными штаммами - донорами аттенуации [Александрова Г.И. Применение метода генетической рекомбинации для получения вакцинных штаммов вируса гриппа. Вопросы вирусологии. 1977. №4. С. 387-395].

Донор аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) - холодоадаптированный (са) и температурочувствительный (ts) штамм вируса гриппа, разрешенный для получения безвредных живых интраназальных вакцин для взрослых и детей [Александрова Г.И. Новое в эпидемиологии и профилактике вирусных инфекций. Л., 1968. С. 66-83].

ЦЕЛЬ РЕАССОРТАЦИИ - получить штамм с вакцинной формулой генома 6:2. Гены, кодирующие поверхностные белки вируса гриппа гемагглютинин (НА) и нейраминидазу (NA), наследуются от антигенно актуального циркулирующего эпидемического штамма, а шесть генов, кодирующих внутренние и неструктурные белки (РВ2, РВ1, PA, NP, M, NS), от безвредного донора аттенуации. На основе донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) и нового эпидемического вируса А/Южная Африка/3626/2013 (H1N1)pdm09 был создан актуальный вакцинный штамм A/17/Южная Африка/2013/01 (H1N1)pdm09.

ПОЛУЧЕНИЕ ВАКЦИННОГО ШТАММА. Вакцинный штамм A/17/Южная Африка/2013/01 (H1N1)pdm09 получен методом генетической реассортации эпидемического вируса А/Южная Африка/3626/2013 (H1N1)pdm09 с донором аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) путем одновременного инфицирования в развивающихся куриных эмбрионах (РКЭ), свободных от патогенной флоры (SPF) смесью родительских вирусов в равных инфекционных дозах, с последующей селекцией клонов с заданными свойствами при пониженной до 26°С температуре инкубации в присутствии гипериммунной сыворотки к донору аттенуации. Клоны дополнительно очищены тремя последовательными клонированиями методом предельных разведений в присутствии гипериммунной сыворотки к донору аттенуации при пониженной (26°С) и оптимальной (32°С) температурах инкубации. Чистый клон проверен по фенотипическим характеристикам (ts, са-фенотип) и по формуле генома на соответствие требованиям, предъявляемым к реассортантному вакцинному штамму.

АНТИГЕННАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ВАКЦИННОГО ШТАММА. Изучение антигенных свойств вакцинного штамма A/17/Южная Африка/2013/01 (H1N1)pdm09 показало, что:

- ответственный за антигенную специфичность поверхностный белок вакцинного штамма - гемагглютинин (НА) - в РТГА с гомологичной сывороткой антигенно идентичен эпидемическому вирусу А/Южная Африка/3626/2013 (H1N1)pdm09, поскольку показатели взаимодействия реассортанта A/17/Южная Африка/2013/01 (H1N1)pdm09 и родительского штамма А/Южная Африка/3626/2013 (H1N1)pdm09 с крысиной антисывороткой, полученной к вирусу А/Южная Африка/3626/2013 (H1N1)pdm09, полностью совпадали (табл. 1). Кроме того, перекрестная постановка РТГА вирусов А/Калифорния/07/2009 (H1N1)pdm и А/Южная Африка/3626/2013 (H1N1)pdm09 с соответствующими гипериммунными крысиными сыворотками подтвердила близкое антигенное родство этих вирусов (табл. 1). Секвенирование гемагглютинина также подтвердило его идентичность гемагглютинину родительского вируса А/Южная Африка/3626/2013 (H1N1)pdm09;

- второй ответственный за антигенную специфичность поверхностный белок вакцинного штамма нейраминидаза (NA), идентичен вирусу А/Южная Африка/3626/2013 (H1N1)pdm09 (подтверждено методом секвенирования).

ДЛЯ АНАЛИЗА СОСТАВА ГЕНОМА полученных реассортантов использовали метод частичного секвенирования. Вакцинный штамм A/17/Южная Африка/2013/01 (H1N1)pdm09 унаследовал все 6 генов, кодирующих внутренние и неструктурные белки, от донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2), то есть обладает формулой генома 6:2 (табл. 2). Формула генома 6:2 соответствует требованиям, предъявляемым к штаммам живой гриппозной вакцины: гены, кодирующие поверхностные белки гемагглютинин (НА) и нейраминидазу (NA) принадлежат пандемическому родительскому вирусу А/Южная Африка/3626/2013 (H1N1)pdm09, гены, кодирующие внутренние белки (РВ2, РВ1, PA, NP, М, NS), принадлежат донору аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2).

Все кодирующие нуклеотидные замены, охарактеризованные для донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) в качестве ответственных за его аттенуацию (табл. 3), присутствуют во внутренних генах реассортантного штамма A/17/Южная Африка/2013/01 (H1N1)pdm09. Таким образом, секвенирование генома вакцинного штамма A/17/Южная Африка/2013/01 (H1N1)pdm09 показало генетическую стабильность аттенуирующих мутаций.

В гемагглютинине вакцинного штамма A/17/Южная Африка/2013/01 (H1N1)pdm09 присутствует стабилизирующая аминокислота - лизин - в позиции 47 субъединицы НА2, которая, по данным Yang et. al. [Yang H., Chang J.C., Guo Z. et al. Structural stability of influenza A(H1N1)pdm09 virus hemagglutinins. J. Virol. 2014. Vol. 88(9). P. 4828-4838] и Cotter et. al. [Cotter C.R., Jin H., Chen Z. A single amino acid in the stalk region of the HINlpdm influenza virus HA protein affects viral fusion, stabilityand infectivity. PLoS Pathol 2014. Vol. 10(1). Pe1003831] приводит к повышению стабильности и инфекционности Калифорния-подобных вирусов (Glu-47-Lys).

ОЦЕНКУ ФЕНОТИПИЧЕСКИХ СВОЙСТВ вакцинного штамма A/17/Южная Африка/2013/01 (H1N1)pdm09 проводили путем его параллельного титрования в развивающихся куриных эмбрионах при разных температурах инкубации. Вакцинный штамм A/17/Южная Африка/2013/01 (H1N1)pdm09 обладает выраженным температурочувствительным и холодоадаптированным фенотипом, идентичным фенотипу донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2). Установлено, что вакцинный вирус является температурочувствительным (ts фенотип) - его инфекционная активность при температуре 40°С составила менее 0,7 log₁₀ ЭИД₅₀/МЛ, и холодоадаптированным (са фенотип) - инфекционная активность при пониженной до 26°С температуре инкубации составила 6,5 log₁₀ ЭИД₅₀/МЛ, что свидетельствует о его безвредности для человека, поскольку по этим показателям он идентичен донору аттенуации А/Ленинград/13 4/17/5 7 (H2N2). Все результаты фенотипического анализа представлены в таблице 4.

ГЕНЕТИЧЕСКУЮ СТАБИЛЬНОСТЬ КОДИРУЮЩИХ МУТАЦИЙ вакцинного штамма A/17/Южная Африка/2013/01 (H1N1)pdm09 изучали сравнением сохранности кодирующих мутаций во внутренних генах до и после пятикратного пассирования вакцинного штамма в куриных эмбрионах. Полногеномное секвенирование показало, что нуклеотидная последовательность вакцинного штамма A/17/Южная Африка/2013/01 (H1N1)pdm09 до и после его пятикратного пассирования, осталась неизменной, в том числе, в генах полимеразного комплекса (РВ2, РВ1, РА), ответственных за аттенуирующий фенотип (табл. 3).

Фенотипические характеристики пассажного варианта также не претерпели никаких изменений (табл. 4).

Все вышесказанное подтверждает высокую генетическую стабильность аттенуирующих мутаций вакцинного штамма A/17/Южная Африка/2013/01 (H1N1)pdm09.

БЕЗВРЕДНОСТЬ ДЛЯ ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ (МЫШЕЙ). Доклинические исследования острой токсичности вакцинного штамма A/17/Южная Африка/2013/01 (H1N1)pdm09 проводили на мышах линии СВА обоего пола в соответствии с Методическими рекомендациями по доклиническим испытаниям новых иммунобиологических препаратов [Методические рекомендации «Доклинические испытания эффективности и безопасности новых иммунобиологических лекарственных препаратов». М.: 2010. 39 с.] и с «Правилами лабораторной практики» [Правила лабораторной практики. Приказ Минздрава РФ №708н от 23.08.20010. http://www.rg.ru/2010/10/22/laboratornaya-praktika-dok.html]. Мышам вводили однократно 0,5 мл вакцинного вируса внутрибрюшинно в дозе 7.0 lg ЭИД₅₀/0.2 мл. Животным контрольной группы вводили физиологический раствор. Ежедневно в течение всего исследования (7 дней) проводился контроль общего состояния каждого животного.

Показана безвредность вакцинного штамма для лабораторных животных при его внутрибрюшинном введении (табл. 5).

Данные физиологического исследования показали, что внутрибрюшинное введение вакцинного штамма не вызывало гибели экспериментальных животных и не приводило к изменению их внешнего вида, поведения, не отражалось на потреблении ими пищи и воды, что свидетельствует о безвредности вакцинного препарата.

Заключение

В результате проведенных доклинических исследований установлено, что заявляемый вакцинный штамм живой гриппозной вакцины A/17/Южная Африка/2013/01 (H1N1)pdm09 характеризуется сочетанием полезных признаков, необходимых вакцинному штамму: антигенной специфичностью эпидемического вируса А/Южная Африка/3626/2013 (H1N1)pdm09, структурой генома 6:2, оптимальной для реассортантных вакцинных штаммов, а также характерной для донора аттенуации температурочувствительностью и холодоадаптированностью и безвредностью для лабораторных животных, что коррелирует с аттенуацией для человека.

Образец паспорта на вакцинный штамм A/17/Южная Африка/2013/01 (H1N1)pdm09 прилагается.

Таким образом, вакцинный штамм A/17/Южная Африка/2013/01 (H1N1)pdm09 по основным биологическим свойствам, изученным в доклинических экспериментах in vitro и in vivo, соответствует требованиям, предъявляемым к вакцинным штаммам Фармакопейной статьей (ФСП: Р N003224/01-270313) на Ультравак^®, вакцину гриппозную аллантоисную живую для интраназального применения для взрослых и для детей.

Полученный штамм A/17/Южная Африка/2013/01 (H1N1)pdm09 депонирован 01.04.2016 г.в Государственную коллекцию вирусов Института вирусологии им. Д.И.Ивановского ФГБУ «ФНИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России (Россия RU, 123098, город Москва, улица Гамалеи, 16) под №2820 и имеет характеристики, представленные в образце паспорте штамма.

ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАММА

Инфекционная активность штамма A/17/Южная Африка/2013/01 (H1N1)pdm09 при репродукции в развивающихся куриных эмбрионах при 32°С в течение 48 часов - 9,3 log₁₀ ЭИД₅₀/мл.

Гемагглютинирующая активность - 1:256.

Штамм проявляет генетическую стабильность фенотипических признаков после 5 пассажей на куриных эмбрионах (при использовании больших заражающих доз).

Полезным свойством вакцинного штамма вируса гриппа A/17/Южная Африка/2013/01 (H1N1)pdm09 является его пригодность для наработки живой гриппозной вакцины. Предлагаемый по изобретению вакцинный штамм вируса гриппа A/17/Южная Африка/2013/01 (H1N1)pdm09 может быть использован для профилактики гриппа как у взрослых, так и у детей с трехлетнего возраста.

ПАСПОРТ ВАКЦИННОГО ШТАММА

1 Название штамма: А/17/Южная Африка/2013/01 2 ИЭМ идентификационный №: SA-01 3 Серия: №1 4 Сероподтип: H1N1pdm09 5 Метод подготовки: реассортация в SPF куриных эмбрионах 6 Родительские вирусы 6.1 Эпидемический вирус: А/Южная Африка/3 626/2013 (H1N1)pdm09 (А/Калифорния/07/2009-подобный), получен из The Francis Crick Institute (Лондон, Великобритания), пассаж в SPF эмбрионах Е1/Е3. 6.2 Донор аттенуации: А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) 7 Число пассажей в процессе реассортации: Е6/Е1 (совместное заражение, два селективных пассажа, три клонирования и одно накопление) 8 Состав генома: Гены РВ2, РВ1, PA, NP, М и NS от донора аттенуации, НА и NA - от эпидемического вируса (формула генома 6:2) 9 Характеристика штамма до лиофильной сушки 9.1 Оптимальные условия репродукции: 32°С, 48 часов 9.2 Гемагглютинирующая активность: 1:256 с 1.0% куриными эритроцитами 9.3 Инфекционная активность при оптимальной температуре 32°С: 9,3 log₁₀ ЭИД₅₀/мл 9.4 ts маркер (температурочувствительность репродукции; инфекционная активность при температуре 40°С): <0,7 lg ЭИД₅₀/мл (ts фенотип) 9.5 са маркер (холодоустойчивость репродукции; инфекционная активность при температуре 26°С): 6,5 lg ЭИД₅₀/мл (са фенотип) 10 Характеристика штамма после лиофильной сушки 10.1 Дата лиофилизации: 11.02.2016 г. 10.2 Объем материала в ампуле: 0,5 мл 10.3 Инфекционная активность при оптимальной температуре 32°С: 8,5 lg ЭИД₅₀/мл 10.4 Гемагглютинирующая активность: 1:128 с 1.0% куриными эритроцитами 11 Антигенная специфичность 11.1 Гемагглютинин: идентичен эпидемическому вирусу А А/Южная Африка/3 626/2013 (H1N1)pdm09 по данным секвенирования и РТГА 11.2 Нейраминидаза: идентична эпидемическому вирусу А/Южная Африка/3 626/2013 (H1N1)pdm09 по данным секвенирования 13 Токсикологическое исследование in vivo (острая токсичность): не токсичен после внутрибрюшинного введения мышам 14 Контроль стерильности: Стерилен (04.03.2016)

Предлагаемое изобретение относится к области медицинской вирусологии. Представленный штамм A/17/Южная Африка/2013/01 (H1N1)pdm09 - реассортант, полученный путем скрещивания «дикого» вируса А/Южная Африка/3626/2013 (H1N1)pdm09 с вирусом А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) - донором аттенуации, безвредным для людей. Штамм живой гриппозной вакцины A/17/Южная Африка/2013/01 (H1N1)pdm09 характеризуется набором признаков: антигенной специфичностью эпидемического вируса A/17/Южная Африка/3626/2013 (H1N1)pdm09, температурочувствительностью и холодоадаптированностью, безвредностью для лабораторных животных, что коррелирует с аттенуацией для человека. Реассортант унаследовал гены, кодирующие поверхностные антигены вируса гемагглютинин (НА) и нейраминидазу (NA), от эпидемического родительского вируса и остальные шесть генов, кодирующих внутренние негликозилированные белки, от донора аттенуации. Штамм может быть использован в практическом здравоохранении для профилактики заболеваемости гриппом среди взрослых и детей. 5 табл.

Штамм вируса гриппа A/17/Южная Африка/2013/01 (H1N1)pdm09, депонированный в Государственную коллекцию вирусов Института вирусологии им. Д.И. Ивановского ФГБУ «ФНИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России под №2820, используемый для получения живой гриппозной интраназальной гриппозной вакцины для взрослых и для детей.