Вакцинный штамм вируса гриппа В/60/Гонконг/2017/5584 (линия Виктория) для производства живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых и для детей Российский патент 2021 года по МПК C12N7/00 A61K39/145 

Изобретение относится к медицинской вирусологии и может быть использовано в практическом здравоохранении для профилактики гриппа среди взрослых и детей с помощью живой гриппозной интраназальной вакцины из штамма вируса гриппа В, семейства Orthomyxoviridae, рода Influenzavirus В, В/60/Гонконг/2017/5584 (линия Виктория).

В циркуляции появились и широкого распространились новые эпидемические штаммы вируса гриппа В, принадлежащие к антигенной линии В/Виктория. Эти штаммы имеют 6 делеций в нуклеотидной последовательности антиген-презентирующего белка гемагглютинина (НА). Делеций привели к появлению вирусов, отличающихся по трем аминокислотным заменам (представители В/Гонконг/286/2017 (V1A.2) и В/Вашингтон/02/2019 (V1A.3). Вследствие делеций у новых вирусов гриппа линии В/Виктория возникли антигенные отличия от ранее циркулировавших вирусов без делеций (как В/Брисбен/60/2008, VIA) или с одной делецией (как В/Колорадо/06/2017, V1A.1).

В связи с этим, известный вакцинный штамм вируса гриппа линии В/Виктория - В/60/Брисбен/08/83 [Ларионова Н.В., Александрова Г.И., Руденко Л.Г. «Штамм вируса гриппа В/60/Брисбен/08/83 для производства живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых и для детей». Патент РФ №2422517, гос. рег. 27.06.2011] - прототип утратил антигенную актуальность и не сможет вызвать защитную реакцию в случае эпидемии гриппа, вызванной новыми разновидностями вируса гриппа В.

Всемирной организацией здравоохранения принято решение о включении в состав противогриппозных вакцин на Южное полушарие для эпидемического сезона 2020 г. и на Северное полушарие для эпидемического сезона 2020/2021 г. вакцинного штамма к вирусу В/Вашингтон/02/2019 (V1A.3) [World Health Organization. WHO Recommendations on the composition of influenza virus vaccines. Recommended composition of influenza virus vaccines for use in the 2020 southern hemisphere influenza season, (электронный ресурс) URL: https://www.who.int/influenza/vaccines/virus/recommendations/2020 south/en/; World Health Organization. WHO Recommendations on the composition of influenza virus vaccines. Recommended composition of influenza virus vaccines for use in the 2020-2021_northern hemisphere influenza season, (электронный ресурс) URL: https://www.who.int/influenza/vaccines/virus/reconimendations/2020-21_north/en/). Однако, следует принимать во внимание также необходимость иметь вакцину к широко циркулирующему вирусу В/Гонконг/286/2017 (V1A.2).

Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является получение вакцинного штамма для живой гриппозной вакцины актуальной антигенной разновидности на основе эпидемического вируса В/Гонконг/286/2017 (V1A.2) (линия Виктория) и безвредного для человека холодоадаптированного донора аттенуации В/СССР/60/69.

Применяемые в настоящее время штаммы для живых гриппозных вакцин получают методом генетической реассортации эпидемически актуальных вирусов с холодоадаптированными донорами аттенуации [Александрова Г.И. Применение метода генетической рекомбинации для получения вакцинных штаммов вируса гриппа. Вопросы вирусологии, 1977. №4. с. 387-395].

Донор аттенуации В/СССР/60/69 - холодоадаптированный (са) и температурочувствительный (ts) штамм вируса гриппа, разрешенный для получения безвредных живых интраназальных вакцин для взрослых и детей [Александрова Г.И. Новое в эпидемиологии и профилактике вирусных инфекций. Л., 1968. С. 66-83]. Донор аттенуации В/СССР/60/69 был получен из эпидемического вируса гриппа В/СССР/69 методом холодовой адаптации [Александрова Г.И., Климов А.И. Живая вакцина против гриппа. СПб.: Наука. 1994. 151 с.], в результате чего он стал безвредным для человека, т.е. приобрел способность бессимптомно размножаться в верхних дыхательных путях привитых лиц, вызывая выработку полноценного противовирусного иммунитета.

Цель реассортации - получить штамм с вакцинной формулой генома 6:2. Гены, кодирующие поверхностные белки вируса гриппа гемагглютинин (НА) и нейраминидазу (NA), наследуются от антигенно актуального циркулирующего эпидемического штамма, а шесть генов, кодирующих внутренние и неструктурные белки (РВ2, РВ1, PA, NP, М, NS) - от безвредного для человека донора аттенуации.

Получение вакцинного штамма. Вакцинный штамм В/60/Гонконг/2017/5584 (линия Виктория) получен методом генетической реассортации эпидемического вируса В/Гонконг/286/2017 (V1A.2) с донором аттенуации В/СССР/60/69 путем одновременного инфицирования развивающихся куриных эмбрионов (РКЭ) смесью родительских вирусов в эквивалентных инфекционных дозах, с последующей трехкратной селекцией клонов с заданными свойствами при пониженной до 26°С температуре инкубации в присутствии антисыворотки к донору аттенуации. Клоны дополнительно очищены тремя последовательными клонированиями методом предельных разведений в присутствии антисыворотки к донору аттенуации при пониженной (26°С) и оптимальной (32°С) температурах инкубации. Чистый клон проверен по фенотипическим характеристикам (ts, са-фенотип) и по формуле генома на соответствие требованиям, предъявляемым к вакцинным штаммам.

Антигенная характеристика вакцинного штамма.

Изучение антигенных свойств полученного авторами вакцинного штамма В/60/Гонконг/2017/5584 (линия Виктория) показало, что:

а) ответственный за антигенную специфичность поверхностный белок вакцинного штамма - НА - в РТГА с гомологичной сывороткой антигенно идентичен эпидемическому вирусу В/Гонконг/286/2017 (линия Виктория), поскольку показатели взаимодействия реассортанта В/60/Гонконг/2017/5584 (линия Виктория) и родительского штамма В/Гонконг/286/2017 (линия Виктория), с крысиной антисывороткой, полученной к вирусу В/Гонконг/286/2017 (линия Виктория), полностью совпадали (табл. 1), что так же подтверждено полногеномным секвенированием;

б) второй ответственный за антигенную специфичность поверхностный белок вакцинного штамма - нейраминидаза (NA) - проверен методом частичного секвенирования, а также полногеномным секвенированием и идентичен вирусу В/Гонконг/286/2017 (линия Виктория).

Формула генома. Для анализа состава генома полученных реассортантов использовали частичное секвенирование ДНК копий генов [Matyushenko V. et. al. Genotyping assay for differentiation of wild-type and vaccine viruses in subjects immunized with live attenuated influenza vaccine. PLoS One. 2017. Vol. 12 №7. P.e0180497. doi: 10.1371/journal.pone.0180497].

Формула генома 6:2 соответствует требованиям, предъявляемым к штаммам живой гриппозной вакцины, а именно: гены, кодирующие поверхностные белки гемагглютинин (НА) и нейраминидазу (NA) принадлежат эпидемическому родительскому вирусу В/Гонконг/286/2017 (линия Виктория), а гены, кодирующие внутренние и неструктурные белки (РВ2, РВ1, PA, NP, М, NS), принадлежат донору аттенуации В/СССР/60/69. Результаты анализа всех генов вакцинного штамма В/60/Гонконг/2017/5584 (линия Виктория) представлены в табл. 2.

Данные, полученные при первичном отборе вакцинного кандидата, были подтверждены полным секвенированием его генома и показали, что вакцинный штамм В/60/Гонконг/2017/5584 (линия Виктория) унаследовал все 6 генов, кодирующих внутренние и неструктурные белки, от донора аттенуации В/СССР/60/69 (табл. 2).

Все кодирующие нуклеотидные и аминокислотные замены, охарактеризованные для донора аттенуации В/СССР/60/69, как ответственные за его аттенуацию, присутствуют во внутренних генах реассортантного штамма В/60/Гонконг/2017/5584 (линия Виктория). Полное секвенирование его генома показало, что он унаследовал от донора В/СССР/60/69 полный набор аттенуирующих мутаций.

Генетическую стабильность кодирующих мутаций вакцинного штамма В/60/Гонконг/2017/5584 (линия Виктория) изучали сравнением сохранности кодирующих мутаций до и после пятикратного пассирования вакцинного штамма в куриных эмбрионах с использованием метода частичного секвенирования. Показано, что нуклеотидная последовательность вакцинного штамма В/60/Гонконг/2017/5584 (линия Виктория) до и после его пятикратного пассирования, осталась неизменной.

Оценку фенотипических свойств вакцинного штамма В/60/Гонконг/2017/5584 (линия Виктория) проводили путем его параллельного титрования в РКЭ при разных температурах. Штамм обладает выраженным температурочувствительным и холодоадаптированным фенотипом, идентичным фенотипу донора аттенуации В/СССР/60/69. Установлено, что вакцинный штамм является температурочувствительным (ts-фенотип) - его инфекционная активность при температуре 38°С составила ≤1.2 lg ЭИД₅₀/мл, и холодоадаптированным (са-фенотип) - инфекционная активность при пониженной до 26°С температуре инкубации составила 6,2 lg ЭИД₅₀/мл, что свидетельствует о его безвредности для человека, поскольку по этим показателям он идентичен донору аттенуации В/СССР/60/69.

Фенотипические свойства вакцинного штамма В/60/Гонконг/2017/5584 (линия Виктория) не изменились после его пятикратного пассирования при использовании больших заражающих доз, что свидетельствует о генетической стабильности препарата (табл. 3).

Безвредность для мышей. Доклинические исследования острой токсичности вакцинного штамма В/60/Гонконг/2017/5584 (линия Виктория) проводили на белых беспородных мышах в соответствии с Методическими рекомендациями по доклиническим испытаниям новых иммунобиологических препаратов [Методические рекомендации «Доклинические испытания эффективности и безопасности новых иммунобиологических лекарственных препаратов». М.: 2010. 39 с] и с «Правилами надлежащей лабораторной практики» [Правила надлежащей лабораторной практик. Приказ Минздрава РФ №199н от 01.04. 2016. https://rg.ru/2016/09/02/minzdrav-prikaz 199-site-dok.html]

Мышам вводили однократно одну человеческую дозу, соответствующую 0.5 мл, вакцинного вируса внутрибрюшинно в дозе 7.0 lg ЭИД₅₀/МЛ. Животным контрольной группы вводили внутрибрюшинно физиологический раствор. Ежедневно в течение всего исследования (7 дней) проводился контроль общего состояния каждого животного.

Данные физиологического исследования (подвижность, поведенческие реакции, изменение массы тела) показали, что внутрибрюшинное введение вакцинного штамма не вызывало гибели экспериментальных животных (табл. 4) и не приводило к изменению их внешнего вида, поведения, не отражалось на потреблении ими пищи и воды, что свидетельствует о безвредности вакцинного препарата.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведенных доклинических исследований установлено, что заявляемый вакцинный штамм живой гриппозной вакцины В/60/Гонконг/2017/5584 (линия Виктория) характеризуется сочетанием полезных признаков, необходимых вакцинному штамму, а именно: антигенной специфичностью эпидемического вируса В/Гонконг/286/2017 (линия Виктория), структурой генома 6:2, оптимальной для реассортантных вакцинных штаммов, а также характерной для донора аттенуации температурочувствительностью и холодоадаптированностью, что коррелирует с аттенуацией для человека. Штамм аттенуирован и безвреден для мышей. Морфология штамма полиморфная, типичная для вируса гриппа. Все это отражено в прилагаемом ниже Паспорте штамма.

Таким образом, вакцинный штамм В/60/Гонконг/2017/5584 (линия Виктория) по основным биологическим свойствам, изученным в доклинических экспериментах in vitro и in vivo, соответствует требованиям, предъявляемым к вакцинным штаммам Фармакопейной статьей (ФСП: Р N003224/01-270313) на Ультравак®, вакцину гриппозную аллантоисную живую для интраназального применения для взрослых и для детей.

Полученный штамм В/60/Гонконг/2017/5584 (линия Виктория) депонирован 11.11.2020 в Государственную коллекцию вирусов Института вирусологии им. Д.И. Ивановского ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России под №2970 и имеет характеристики, представленные в паспорте штамма.

ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАММА

Инфекционная активность штамма В/60/Гонконг/2017/5584 (линия Виктория) при репродукции в развивающихся куриных эмбрионах при 32°С в течение 72 часов - 8,2 lg ЭИД₅₀/мл.

Гемагглютинирующая активность - 1:256.

Штамм проявляет генетическую стабильность фенотипических признаков после 5 пассажей на куриных эмбрионах (при использовании больших заражающих доз).

Полезным свойством полученного вакцинного штамма вируса гриппа является его пригодность для наработки живой гриппозной вакцины. Предлагаемый по изобретению вакцинный штамм вируса гриппа В/60/Гонконг/2017/5584 (линия Виктория) может быть использован для профилактики гриппа как у взрослых, так и у детей с трехлетнего возраста.

Изобретение относится к вирусологии. Представлен вакцинный штамм В/60/Гонконг/2017/5584 (линия Виктория) - реассортант, полученный путем скрещивания «дикого» вируса В/Гонконг/286/2017 (линия Виктория) с холодоадаптированным температурочувствительным вирусом В/СССР/60/69 - донором аттенуации, безвредным для людей. Штамм активно размножается в развивающихся куриных эмбрионах при оптимальной температуре 32°С, характеризуется холодоадаптированностью и температурочувствительностью, а также безвредностью для лабораторных животных. Реассортант унаследовал гены, кодирующие поверхностные антигены вируса - гемагглютинин (НА) и нейраминидазу (NA), от эпидемического родительского вируса, а остальные шесть генов, кодирующих внутренние и неструктурные белки, от донора аттенуации. Таким образом, вакцинный штамм В/60/Гонконг/2017/5584 (линия Виктория) по основным биологическим свойствам, изученным в доклинических экспериментах in vitro и in vivo, соответствует требованиям, предъявляемым к вакцинным штаммам Фармакопейной статьей (ФСП: Р N003224/01-270313) на Ультравак®, вакцину гриппозную аллантоисную живую для интраназального применения для взрослых и для детей. Изобретение может быть использовано в здравоохранении для профилактики заболеваемости гриппом среди взрослых и детей с помощью живой гриппозной интраназальной вакцины из штамма вируса гриппа В/60/Гонконг/2017/5584 (линия Виктория) в случае распространения в человеческой популяции подобных вирусов гриппа. 4 табл.

Вакцинный штамм вируса гриппа В/60/Гонконг/2017/5584 (линия Виктория), депонированный в Государственную коллекцию вирусов Института вирусологии им. Д.И. Ивановского ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России под №2970, для производства живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых и для детей.