Реассортантный штамм вируса гриппа RN2/14-human A(H6N2) для определения антител к нейраминидазе при гриппозной инфекции и вакцинации Российский патент 2020 года по МПК C12N7/00 

Изобретение относится к медицинской вирусологии и может быть использовано в здравоохранении для диагностических целей при гриппозной инфекции, а также для оценки иммуногенности при вакцинации гриппозными вакцинами.

Современная эпидемическая ситуация по гриппу характеризуется одновременной циркуляцией сразу нескольких сероподтипов вируса семейства Orthomyxoviridae, рода Influenzavirus: A(H1N1), A(H3N2) и В. По мере создания новых гриппозных вакцин появляется необходимость всесторонней оценки иммуногенности подготовленных препаратов. Традиционно иммуногенность гриппозных вакцин оценивается по формированию после прививки антител к гемагглютинину (НА) в сыворотке крови [Руководство по проведению клинических исследований лекарственных средств (иммунобиологические лекарственные препараты). Часть вторая / Под ред. А.Н. Миронова. - М.: Гриф и К, 2012. - 212 с.]. Однако в отношении живых гриппозных вакцин до сих пор не было показано прямой связи серологической эффективности, которую оценивают по приростам антигемагглютинирующих антител, с высоким уровнем защитной эффективности. Антитела ко второму поверхностному антигену вируса гриппа - нейраминидазе (NA) - также являются одним из факторов защиты против инфекции. Для определения антител к нейраминидазе вируса гриппа ранее применялись реассортантные штаммы на основе вируса гриппа А/лошадь/Прага/1/56(H7N7) с нерелевантным для человека гемагглютинином, содержащие нейраминидазу эпидемических вирусов человека A(H1N1) и A(H3N2) [Вопр. вирусологии. - 1985. - №1. - стр. 35-39]. При этом использовалась реакция ингибирования элюирования вируса с эритроцитов, основанная на блокировании антителами ферментативной активности NA, что препятствовало разрушению агглютинации эритроцитов, вызванной НА вируса гриппа.

Реассортантный штамм RN2/57-human A(H7N2), применяющийся для выявления антител к нейраминидазе подтипа N2 в твердофазной реакции ингибирования сиалидазной активности [Патент РФ 2464312 заявл. 16.06.2011; опубл. 20.10.2012, Бюл. №29], стал неактуален в связи с появлением с 2013 года в человеческой популяции вирусов, несущих НА подтипа Н7 [Tu С. et al. The first case of avian influenza A (H7N9) virus occurring in the autumn season, China//American journal of infection control. - 2014. - T. 42. - №. 2. - C. 212-213.], что может привести к искажению результатов серологических тестов, направленных на выявление антинейраминидазных антител, из-за присутствия в исследуемых образцах сывороток крови также антител к гемагглютинину потенциально пандемических штаммов.

Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является получение реассортантного штамма для определения антител к нейраминидазе подтипа N2 в твердофазной реакции ингибирования нейраминидазной активности.

Цель реассортации - получить штамм, несущий нейраминидазу подтипа N2 для качественного и количественного определение антител к NA подтипа N2 в сыворотках крови.

Получение реассортантного штамма. Реассортант RN2/14-human A(H6N2) получен методом классической генетической реассортации в развивающихся куриных эмбрионах (РКЭ) двух вакцинных штаммов, полученных на основе донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57(Н2Ы2), A/17/серебристая чайка/Сарма/06/887 (H6N1) и А/17/Гонконг/2014/8296 (H3N2), содержащего поверхностные антигены от эпидемического вируса подтипа А/Гонконг/4801/2014 (H3N2), путем одновременного инфицирования развивающихся куриных эмбрионов (РКЭ) смесью родительских вирусов в эквивалентных инфекционных дозах, с последующей селекцией клонов с заданными свойствами при пониженной до 26°С температуре инкубации в присутствии моноклональных антител к анти-Н3 (H3N2) mAb, clone InA246. Клоны дополнительно очищены двумя последовательными клонированием методом предельных разведений в присутствии моноклональных антител к анти-Н3 (H3N2) mAb, clone InA246 (26°С) и оптимальной (32°С) температурах инкубации.

Изучение антигенных свойств реассортанта RN2/14-human A(H6N2) показало, что: - ответственный за антигенную специфичность поверхностный гликопротеин штамма - гемагглютинин (НА) - в РТГА с гомологичной сывороткой антигенно идентичен вирусу A/17/серебристая чайка/Сарма/06/887 (H6N1), поскольку показатели взаимодействия реассортанта RN2/14-human A(H6N2) и родительского штамма A/17/серебристая чайка/Сарма/06/887 (H6N1) с крысиной антисывороткой, полученной к вирусу A/17/серебристая чайка/Сарма/06/887 (H6N1) полностью совпадали (табл. 1). Также был проведено секвенирование реассортанта RN2/14-human A(H6N2), которое показало идентичность НА реассортанта и штамма A/17/серебристая чайка/Сарма/06/887 (H6N1).

- второй ответственный за антигенную специфичность поверхностный гликопротеин штамма - нейраминидаза (NA) - проверен методом рестрикционного анализа ДНК копий генов, а также секвенированием и идентичен вирусу А/17/Гонконг/2014/8296 (H3N2).

Для анализа состава поверхностных гликопротеинов полученных реассортантов использовали метод рестрикционного анализа ДНК копий генов. На фиг. 1 представлен пример рестрикционного анализа ДНК гена NA с помощью рестриктазы BstMBI. Дорожки на электрофорезном геле имеют следующее соответствие: 1 - ДНК-маркер (100 bp+1.5 Kb, НПО «СибЭнзим»), 2 - реассортант RN2/14-human A(H6N2), 3 - штамм А/17/Гонконг/2014/8296 (H3N2).

Наличие двух фрагментов ДНК реассортанта RN2/14-human A(H6N2) совпадает с родительским штаммом А/17/Гонконг/2014/8296 (H3N2), что свидетельствует об идентичности генов NA реассортанта RN2/14-human A(H6N2) и штамма А/17/Гонконг/2014/8296 (H3N2).

Данные, полученные при отборе реассортантов, были подтверждены секвенированием и показали, что реассортант RN2/14-human A(H6N2) унаследовал ген НА от A/17/серебристая чайка/Сарма/06/887 (H6N1), a NA от А/17/Гонконг/2014/8296 (H3N2).

Таким образом, представленный реассортантный штамм обладает антигенной специфичностью гемагглютинина вируса A/17/серебристая чайка/Сарма/06/887 (H6N1), что исключает искажение результатов серологических тестов, направленных на выявление антинейраминидазных антител, из-за присутствия в исследуемых образцах сывороток крови также антител к гемагглютинину современных эпидемических и потенциально пандемических штаммов вируса гриппа.

Наличие нейраминидазы вируса гриппа N2 делает возможным применение указанного штамма для выявления антител к нейраминидазе этого подтипа у лиц, перенесших инфекцию или прошедших вакцинацию гриппозными вакцинами.

Выявление антинейраминидазных антител в твердофазной реакции ингибирования нейраминидазной активности (РИНА).

Методика такого выявления основана на определении титра антинейраминидазных ингибирующих антител, представляющего собой величину, обратную разведению тестируемой сыворотки, в котором наблюдается 50%-ное снижение сиалидазной активности NA диагностического штамма RN2/14-human A(H6N2). Сиалидазная активность NA определяется по отношению к высокомолекулярному натуральному субстрату (фетуин), сорбированному на полимерном носителе, с использованием специфически связывающего демаскированные полисахариды пероксидазно-меченного лектина. Диагностичеки достоверным считается двукратный и более прирост титров антител в сыворотке реконвалесцента по сравнению с сывороткой, полученной в острой фазе заболевания, или до и после вакцинации. Пример эксперимента:

Диагностический штамм RN2/14-human A(H6N2) применялся для определения титра антинейраминидазных антител в сыворотке людей после иммунизации сезонной живой гриппозной вакциной «Ультравак®» (АО «НПО «Микроген»). Было исследовано 17 пар сывороток крови людей до иммунизации и спустя 28 дней после иммунизации. Титр антител к нейраминидазе определяли с помощью твердофазной реакции ингибирования нейраминидазной активности (РИНА), титр антител к гемагглютинину определял с помощью реакции торможения гемагглютинации (РТГА). Работа с сыворотками людей одобрена локальным этическим комитетом ФГБНУ «ИЭМ». Протокол 3/17 от 30.11.2017.

В результате исследования был обнаружен статистически значимый (р=0,01) прирост титра антител к нейраминидазе подтипа N2 после вакцинации ЖГВ (фиг. 2).

У 7 из 17 (41%) человек, ответивших на вакцинацию ЖГВ, наблюдался двукратный и более прирост титров антител к нейраминидазе подтипа N2 (фиг. 3). Прирост является статистически значимым - р=0,0001.

Определение гемагглютинин-ингибирующих антител к гемагглютинину подтипа Н3 в сыворотках людей проводилось с помощью РТГА к вакцинному штамму А/17/Гонконг/14/8296 (H3N2). Был выявлен незначительный прирост титров гемагглютинин-ингибирующих антител после вакцинации ЖГВ (фиг. 4). Прирост антител не был статистически значимым - р=0,055. Только у 1 человека из 17 (5,6%) наблюдался четырехкратный и более прирост титров антител к гемагглютинину подтипа Н3.

Заключение

В результате проведенных исследований установлено, что заявляемый диагностический штамм RN2/14-human A(H6N2) характеризуются необходимыми параметрами для диагностического штамма и может быть использован для выявления антинейраминидазных антител у лиц, перенесших инфекцию штаммами вируса гриппа, несущих NA подтипа N2 или прошедших вакцинацию гриппозными вакцинами соответствующих подтипов. Поскольку представленный диагностический реассортантный штамм обладает антигенной специфичностью гемагглютинина нерелевантного для человека вируса A/17/серебристая чайка/Сарма/06/887 (H6N1), его применение исключает искажение результатов серологических тестов, направленных на выявление антинейраминидазных антител, из-за присутствия в исследуемых образцах сывороток крови антител к гемагглютинину современных эпидемических и потенциально пандемических штаммов вируса гриппа.

Штамм депонирован 28.02.2019 в Государственной коллекции вирусов Института вирусологии им. Д.И. Ивановского ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России под №2905 и имеет характеристики, представленные в образце паспорта штамма.

ХАРАКТЕРИСТИКА ПОЛУЧЕННОГО ШТАММА.

Морфология штамма - полиморфная, типичная для вируса гриппа.

Инфекционная активность реассортантного штамма RN2/14-human A(H6N2) при репродукции в развивающихся куриных эмбрионах при 33°С в течение 48 часов - 8,0 lg ЭИД₅₀/ 0,2 мл.

Гемагглютинирующая активность - 1:256.

Паспорт на реассортантный штамм RN2/14-human A(H6N2) прилагается.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой штамм RN2/14-human A(H6N2) активно размножающийся в развивающихся куриных эмбрионах при оптимальной температуре 33°С, что позволяет накапливать вирусный материал для последующей очистки и концентрации. Реассортант унаследовал ген, кодирующий поверхностный антиген вируса гемагглютинин (НА) и шесть генов, кодирующих внутренние и неструктурные белки, от A/17/серебристая чайка/Сарма/06/887 (H6N1), а ген, кодирующий поверхностный антиген вируса нейраминидазу (NA), от А/17/Гонконг/2014/8296 (H3N2). Штамм RN2/14-human A(H6N2) может применяться для выявления антител к нейраминидазе N2 вируса гриппа в сыворотках крови с использованием твердофазной реакции ингибирования нейраминидазной активности. 4 ил.

Штамм вируса гриппа RN2/14-human A(H6N2), депонированный в Государственную коллекцию вирусов Института вирусологии им. Д.И. Ивановского ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России под №2905, для определения антител к нейраминидазе N2 вируса гриппа.