Клеточная линия crov Cel муцинозного рака яичников человека, предназначенная для разработки лечения таргетными препаратами Российский патент 2017 года по МПК C12N5/09 

Изобретение относится к области медицинской биотехнологии, онкологии, в частности к получению клеточных линий, предназначенных для разработки лечения таргетными препаратами.

Рак яичников представлен различными типами аденокарцином: муцинозной, серозной и другими. Муцинозный рак яичников является редким типом опухоли, встречающимся в 5-10% случаев [Ouellet V¹, Zietarska М, Portelance L, Lafontaine J, Madore J, Puiffe ML, Arcand SL, Shen Z, Hebert J, Tonin PN, Provencher DM, Mes-Masson AM. / Characterization of three new serous epithelial ovarian cancer cell lines. / BMC Cancer. 2008, May 28; 8:152. doi: 10.1186/1471-2407-8-152]. Лечение муцинозного рака яичников сводится к хирургическому удалению опухоли с целью достижения максимальной циторедукции. Прогноз у больных с муцинозной аденокарциномой яичников, неблагоприятный в сравнении с другими серозными опухолями. У пациенток с распространенными стадиями безрецидивный период составляет от 10,5 до 16,9 мес, а продолжительность жизни варьирует от 14,8 до 45,1 мес, соответственно [Rodriguez IM, Prat J. Mucinous tumors of the ovary: a clinicopathologic analysis of 75 borderline tumors (of intestinal type) and carcinomas. Am J Surg Pathol. 2002; 26:139Y152].

Известны клеточные линии, полученные из асцита у пациенток с эпителиальными опухолями яичника [Alama A, Barbieri F, Favre A, Cagnoli М, Noviello Е, Pedulla F, Viale M, Foglia G, Ragni N. Establishment and characterization of three new cell lines derived from the ascites of human ovarian carcinomas. Gynecol Oncol. 1996; 62:82-88. doi: 10.1006/gyno. 1996.0194. [PubMed] [Cross Ref].

Известны клеточные линии, полученные из опухолей у пациенток в процессе проведения химиотерапии, или клеточные линии, подвергшиеся вирусной трансформации [Van den Berg-Bakker СА, Hagemeijer A, Franken-Postma ЕМ, Smit VT, Kuppen PJ, van Ravenswaay Claasen HH, Cornelisse CJ, Schrier PI. Establishment and characterization of 7 ovarian carcinoma cell lines and one granulosa tumor cell line: growth features and cytogenetics. Int J Cancer. 1993; 53: 613-620. doi: 10.1002/ijc.2910530415. [PubMed]; [Yonamine K, Hayashi K, Iida T. Establishment and characterization of human ovarian clear cell adenocarcinoma cell line (SMOV-2), and its cytotoxity by anticancer agents. Hum Cell. 1999; 12:139-148 [PubMed].

Молекулярно-генетические особенности муцинозного рака яичников характеризуются наличием мутации в гене р53 с гиперэкспрессией K-ras в 43-57% случаев. Мутация р53 является общей для всех подтипов эпителиального рака яичников и сочетается с мутацией K-ras при муцинозном типе [Rechsteiner М, Zimmermann АК, Wild PJ, et al. ТР53 mutations are common in all subtypes of epithelial ovarian cancer and occur concomitantly with KRAS mutations in the mucinous type. Exp Mol Pathol. 2013; 95:235Y241].

Предполагается эволюция муцинозного рака яичников от доброкачественной опухоли до инвазивной аденокарциномы с приобретением свойств высокой степени злокачественности и характерных изменений в гене р53 [Kelemen LE, Kobel М. Mucinous carcinomas of the ovary and colorectum: different organ, same dilemma. Lancet Oncol. 2011; 12:1071Y1080]. Муцинозные аденокарциномы яичников в 18% случаев ассоциированы с амплификацией Her2/neu [Anglesio MS, Kommoss S, Tolcher MC, et al. Molecular characterization of mucinous ovarian tumours supports a stratified treatment approach with HER2 targeting in 19% of carcinomas. J Pathol. 2013; 229:111Y120].

Задачей изобретения является расширение арсенала клеточных линий муцинозного рака яичников человека, предназначенных для разработки лечения таргетными препаратами.

Поставленная задача решается тем, что получена новая клеточная линия crov Cel из первичной опухоли муцинозного рака яичников человека.

Технический результат заявляемого изобретения состоит в том, что получена новая клеточная линия crov Cel муцинозного рака яичников для расширения арсенала клеточных линий, предназначенных для разработки лечения таргетными препаратами.

Полученная клеточная линия обладает стабильными культуральными и морфологическими характеристиками. Хранится во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов ФГУПГосНИИГенетика под номером Н-160.

Родословная клеточной линии crov Cel муцинозного рака яичников человека

Линия клеток получена из опухоли удаленного левого яичника пациентки 53 лет с уточненным гистологическим диагнозом: рак яичников TlcN0M0 муцинозная аденокарцинома, которой до оперативного вмешательства лечение не проводилось. Гистологическое заключение: опухолевое образование левого яичника имеет строение муцинозной цистаденомы с участками разрастания высокодифференцированной муцинозной аденокарциномы.

Заявляемое изобретение иллюстрировано табл. 1-3 и фиг. 1, 2, 3 (а-е):

Табл. 1. Исследование соматических мутаций в 18, 19, 20 и 21 экзонах гена EGFR.

Табл. 2. Исследование соматических мутаций в 12, 13 и 61 кодонах гена KRAS.

Табл. 3. Исследование соматических точковых мутаций в 15 экзоне гена BRAF (V600E) и в гене PIK3C.

Фиг. 1. Муцинозная аденокарцинома левого яичника (гистологический препарат). Окраска гематоксилином и эозином ×200.

Фиг. 2. Клеточная линия crov Cel. Окраска гематоксилином и эозозином ×400.

Фиг. 3(a). Иммуноцитохимическое исследование клеточной линии crov Cel × 400. Окрашивание опухолевых клеток МКА PanCK(АЕ1/AE3).

Фиг. 3(б). Иммуноцитохимическое исследование клеточной линии crov Cel × 400. Окрашивание опухолевых клеток МКА CK7(OV-TL12/30). Выраженная реакция.

Фиг. 3(в). Иммуноцитохимическое исследование клеточной линии crov Cel × 400. Окрашивание опухолевых клеток МКА СК 20, Ks20.8. Присутствует в единичных клетках цитоплазмы опухолевых клеток.

Фиг. 3(г). Иммуноцитохимическое исследование клеточной линии crov Cel × 400. Окрашивание опухолевых клеток МКА р53. Ядерная реакция на белок р53, резко выраженная экспрессия мутантного гена-супрессора р53.

Фиг. 3(д). Иммуноцитохимическое исследование клеточной линии crov Cel × 400. Окрашивание опухолевых клеток МКА ki 67. Ядерная экспрессия ki67 (клон MIB-1) в клетках опухоли (очень высокий индекс пролиферации).

Фиг. 3(e). Иммуноцитохимическое исследование клеточной линии crov Cel × 400. Отрицательные маркеры (реакция muc1, muc2, muc 5AC, CDx2, WT1, CA125).

Получение клеточной линии crov Cel муцинозного рака яичников человека

Опухолевую ткань, полученную хирургическим путем при удалении первичной опухоли яичников (фиг. 1), разделяли механически на фрагменты величиной 2-3 мм³ в среде RPMI-1640, затем получали суспензию клеток. Количество жизнеспособных клеток определяли по стандартной методике в камере Горяева, используя 0,5% раствор трипанового синего в PBS. Полученную суспензию клеток засевали во флаконы и культивировали в течение 4 месяцев. Клетки выращивали в питательной среде RPMI-1640 с 2 мМ L-глутамина, 10% эмбриональной телячьей сывороткой (Hy Clone, США), гентамицином; пируват Na, комплексом витаминов, инсулин-трансферин-селенит, аминокислоты в концентрациях 1:1000 стандартных препаратов, выпускаемых ПАНЭКО (г. Москва). Клетки снимали раствором Версена при комнатной температуре. Стабильно растущая клеточная линия была получена на 15 пассаже.

Морфологические признаки клеточной линии crov Cel муцинозного рака яичников человека

Опухолевые клетки преимущественно вытянутой удлиненной формы с одним - тремя отростками цитоплазмы. Встречаются клетки неправильной округлой и лентовидной формы. Клетки располагаются в виде монослоя, группами или мелкими плотными скоплениями с нечеткими границами цитоплазмы. Цитоплазма большинства клеток относительно обильная, базофильная, неравномерно окрашенная, мелкозернистая или пенистая и вакуолизированная, нередко содержит скопления розовых гранул или имеет розовый оттенок. Ядра клеток округлые, овальные полиморфные, различной величины, разнообразные по строению хроматина и интенсивности окраски, содержат увеличенные ядрышки. Хроматин зернистый или глыбчатый, неравномерный. Часто выявляются гигантские одноядерные и многоядерные клетки, митозы. Обнаруживаются клетки, напоминающие перстневидные с бобовидными ядрами и просветлением цитоплазмы около ядра.

На фиг. 2 представлена морфологическая картина клеточной линии crov Cel муцинозного рака яичников человека. Окраска гематоксилином и эозозином ×400. Скопление полиморфных клеток с выраженной атипией ядер и их высокой митотической активностью и наличием большого числа атипичных митозов. На фиг. 3 (а-е) представлено иммуноцитохимическое исследование клеточной линии crov Cel муцинозного рака яичников человека с положительным окрашиванием различными МКА (панцитокератин (PanCK(АЕ1/AE3, фирма DBC); цитокератин 7(CK7(OV-TL12/30, фирма CellMAR) и цитокератин 20(СК 20, Ks20.8, фирма Dako); р53 (фирма BioGenes); кi67 (фирма Dako)) и отрицательными реакциями на mucl (фирма CellMar), muc2 (фирима CellMar), muc 5АС (фирма BioCare), CDx2 (фирма CellMAR), WT1 (6F-Н2, фирма Dako, СА125 (фирма DBS)). Выраженная реакция цитокератина 7 и низкая цитокератина 20 соответствует муцинозной аденокарциноме яичников. В результате данного исследования выявлена низкодифференцированная аденокарцинома яичника.

Кариологическая характеристика клеточной линии crov Cel муцинозного рака яичников человека

Проанализировано 32 метафазы. Число хромосом колеблется от 50 до 74. Модальное число хромосом соответствует триплоидному набору (3n). Встречаются клетки с гексаплоидным (6n) набором хромосом (около 140 хромосом), что соответствует повышенной полиплоидизации в этой культуре. Во всех клетках выявлены множественные структурные перестройки: транслокация двух длинных плеч хромосомы 8 с образованием изохромосомы; транслокация хромосомы 20 и длинного плеча хромосомы 1. Обнаружено несколько дицентрических хромосом. В одну из них вовлечены хромосома 7, хромосома 15, в другую - хромосома 11. Кариотип: 50~74<3n>,XX,-X,i(8)(q10) der(7;?)t(7;?)(q35;?)t(?;?15)(?;?q12),add(9)(q34),add(11)(p15), der(11;?)t(11;?)(p15;?)t(?;?15)(?;?q12),der(20)t(1;20)(q11;q13.3),inc.

Молекулярно-генетическая характеристика клеточной линии crov Cel муцинозного рака яичников человека

Выполнено молекулярно-генетическое исследование - определение соматических мутаций в 18, 19, 20 и 21 экзонах гена EGFR с использованием набора Cobas® EGFR Mutation Test (РУ № ФСЗ 2012/12715): [Myriam Locatelli-Sanchez • Se’bastien Couraud Dominique Arpin • Robert Riou • Pierre-Paul Bringuier Pierre-Jean SouquetRoutine EGFR Molecular Analysis in Non-Small-Cell Lung Cancer Patients is Feasible: Exons 18-21 Sequencing Results of 753 Patients and Subsequent Clinical OutcomesLung (2013) 191:491-499]. (Табл. 1).

Методы: RT-ПЦР (Cobas z 480 Analyzer).

Выполнено молекулярно-генетическое исследование - определение соматических мутаций в 12, 13 и 61 кодонах гена KRAS с использованием набора Cobas® KRAS Mutation Test (РУ № ФСЗ 2012/12715) (Табл. 2).

Выполнено молекулярно-генетическое исследование - определение соматических точковых мутаций («hot points») в 15 экзоне гена BRAF (V600E) и в гене PIK3C.

Методы: Аллель-специфичная гибридизация, биочип и секвенирование.

При исследовании ДНК, выделенной из клеточной линии, в 9 экзоне гена PIK3CA выявлена соматическая миссенс-мутация Е542К (с.1624 G/A), приводящая к аминокислотной замене в 542 кодоне (p.Glu542Lys). Мутация зарегистрирована в международной базе данных (COSMIC, COSM760Id) и ассоциирована с повышенной чувствительностью к терапии ингибиторами mTOR (Табл. 3).

В заявляемой клеточной линии обнаружена типичная мутация в гене PIK3CA, которая по описанным в литературе данным ассоциирована с ответом на блокаду сигнального пути PIK3/AKT/mTOR [Trimpakos, Alex S.; Karapanagiotou, Eleni M.; Saif, M. Wasif; Syrigos, Kostas N. (2009). "The role of mTOR in the management of solid tumors: An overview". Cancer Treatment Reviews 35 (2): 148-59]. Изучение активности mTOR ингибиторов при муцинозном раке яичников может быть дальнейшим перспективным направлением.

Культуральные свойства клеточной линии crov Cel муцинозного рака яичников

Монослойная адгезионная клеточная культура выращивается в пластиковых флаконах. Посевная доза клеток составляет 500 тыс. на поверхность площадью 25 см², кратность рассева 1:2. Клетки культвируют 1 раз в 3 дня. Клетки выращивают в питательной среде RPMI-1640 с 2 мМ L-глутамина, 10% эмбриональной телячьей сывороткой (Hy Clone, США), содержащей антибиотик гентамицин; пируват Na, комплекс витаминов, инсулин-трансферин-селенит, аминокислоты в концентрациях 1:1000 стандартных препаратов, выпускаемых ПАНЭКО (г. Москва). Клетки снимают раствором Версена, при комнатной температуре.

Условия криоконсервации клеточной линии crov Cel муцинозного рака яичников

Среда для культивирования RPMI 1640 с эмбриональной телячьей сывороткой-20%, и DMSO - 10%. Режим замораживания: клетки помещают в пары жидкого азота для постепенного снижения температуры на 1°C в минуту на 24 часа, затем помещают в жидкий азот при температуре минус 196°C. Размораживание проводят при t 37°C. Размороженные клетки осаждают центрифугированием, ресуспендируют в 10 мл ростовой среды RPMI 1640, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки с 2 мМ L-глютамина, и переносят в культуральный флакон площадью 25 см². Жизнеспособность клеток оценивают по включению 0,1% раствора трипанового синего. Жизнеспособность клеток после размораживания составила 90%.

Контаминация клеточной линии crov Cel муцинозного рака яичников

При длительном наблюдении бактерии и грибы в культуре не обнаружены.

Определение антигенов, экспрессированных на клеточной линии crov Cel муцинозного рака яичников человека

Полученная клеточная линия crov Cel, обладающая стабильными культуральными и морфологическими характеристиками, с помощью методов иммунофлюоресценции была исследована на экспрессируемые антигены: антиген гистосовместимости первого класса (HLA-ABC) - положительный; антиген гистосовместимости второго класса (HLA-DR) - отрицательный; лимфоидные антигены: CD3 (Т-клеточный) и CD20 (В-клеточный) - отрицательные; маркеры стволовой клетки: CD34, CD133 - отрицательные; антиген адгезии CD54 - положительный.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению клеточных линий, предназначенных для разработки лечения таргетными препаратами, и может быть использовано в медицине. Клеточная линия crov Cel муцинозного рака яичников человека характеризуется наличием в 9 экзоне гена PIK3CA соматической миссенс-мутации Е542К (с.1624 G/A), приводящей к аминокислотной замене в 542 кодоне (p.Glu542Lys). Мутация зарегистрирована в международной базе данных (COSMIC, COSM760Id) и ассоциирована с повышенной чувствительностью к терапии ингибиторами mTOR. Полученная линия клеток хранится во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов ФГУПГосНИИГенетика под номером Н-160. Изобретение позволяет получить клеточную линию crov Cel муцинозного рака яичников человека, которая обладает стабильными культуральными и морфологическими характеристиками. 8 ил., 3 табл.

Клеточная линия crov Cel муцинозного рака яичников человека, предназначенная для разработки лечения таргетными препаратами, характеризующаяся наличием в 9 экзоне гена PIK3CA соматической миссенс-мутации Е542К (с. 1624 G/A), приводящей к аминокислотной замене в 542 кодоне (p. Glu542Lys), хранится во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов ФГУПГосНИИГенетика под номером Н-160.