СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ ТИПА РАКА ЖЕЛУДКА МЕТОДОМ ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКОГО ТЕСТИРОВАНИЯ Российский патент 2024 года по МПК A61B8/06 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к области медицины, а именно к способу, используемому для определения принадлежности карцином желудка к молекулярным подтипам с целью персонификации терапии онкологических пациентов и прогноза выживаемости.

Уровень техники

Рак желудка является одним из наиболее распространенных онкологических заболеваний, занимающим значительное место в структуре заболеваемости и смертности. Выявляемость рака желудка в запущенных стадиях остается высокой (IV стадия) – 40,4%. Примерно у такого же числа больных дальнейшее прогрессирование опухоли наблюдается после лечения. В итоге у 85% больных сразу или в течение 3 лет болезнь переходит в метастатическую форму. Это определяет неблагоприятный прогноз заболевания. В связи с большим количеством генерализованных форм рака желудка пересматриваются диагностические аспекты, в частности подходы классификации.

Первые классификации рака желудка, основанные на данных генетики предложены в 2014 (TCGA) и 2015 (ACRG) годах. Для адаптации молекулярно-генетических классификаций к рутинной практике несколькими группами были предложены их иммунофенотипические аналоги (Gonzales R.S., et al. 2016; Setia N., et al. 2016; Diaz Del Arco C., et al. 2018; Di Pinto F, et al. 2020), однако большинство из них выполнены методом тканевых микрочипов и не учитывают гетерогенность опухоли. Лишь в двух работах авторы использовали полноразмерный операционный материал, но эти исследования выполнены на крайне малой выборке пациентов (58 и 60 случаев соответственно), что не позволяет получить надежных и воспроизводимых результатов.

Из уровня техники известна молекулярно-генетическая классификация Атлас карциномого генома (The Cancer Genome Atlas, TCGA), опубликованная в 2014 году ("Cancer Genome Atlas Research Network. Comprehensive molecular characterization of gastric adenocarcinoma." Nature, 2014, 513(7517): 202-9). Исследователи из группы TCGA изучали образцы от 295 пациентов с раком желудка, не подвергавшихся предоперационной химио- и лучевой терапии, путем проведения полноэкзомного секвенирования, анализа количества копий генов, метилирования ДНК, РНК, микросателитной нестабильности и полногеномного секвенирования (на отдельной выборке опухолей).

Группа TCGA предложила систему, которая подразумевает выделение 4 подтипов рака желудка: подтип позитивный на вирус Эпштейна-Барр (Epstein-Barr virus positive, EBV), подтип с микросателлитной нестабильностью (microsatellite instability, MSI), геномно-стабильный подтип (genomic stability, GS) и хромосомно нестабильный подтип (chromosome instability, CIN) [28]. Опухоли из EBV-подтипа составили 9% от исследованных случаев, и характеризовались высоким уровнем метилирования CpG-островков генома, а также наиболее высокими уровнями гиперметилирования ДНК. Данные результаты согласуются с полученными ранее данными о наличии гиперметилирования ДНК в EBV-позитивных раках желудка. Все образцы из данной группы демонстрировали высокий уровень гиперметилирования промотора гена CDKN2A (p16INK4A), однако при этом гиперметилирование гена MLH1 отсутствовало. Также в данной группе была выявлена наиболее высокая частота мутаций PIK3CA (80%), высокая частота мутаций ARID1A (55%). Мутации TP53 выявлялись редко. Другой интересной особенностью данной группы в контексте таргетной терапии была гиперэкспрессия сигнатур (PD-L)1/2 в комбинации с усиленной экспрессией сигнатур иммунной сигнализации. Второй подтип карцином желудка - подтип с микросателлитной нестабильностью (MSI) характеризовался наличием большого количества разнообразным мутаций. Такие опухоли составили 22% от общего числа образцов. Для данного подтипа характерен высокий уровень метилирования CpG-островков генома, включая гиперметилирование промотора MLH1, в отличие от предыдущего подтипа. Мутационный анализ выявил в данном подтипе 37 мутаций генов, среди которых были TP53, KRAS, PIK3A, ARID1A, в то время как другие подтипы рака желудка демонстрировали мутации лишь в 25 генах. Оставшиеся 69% случаев были разделены на основании наличия большого количества аббераций соматических копий генов на GS-подтип (20%) и CIN-подтип (50%). GS-подтип включал в себя преимущественно раки желудка с диффузной морфологией и наибольшую частоту мутаций гена CDH1, что соответствует диффузному подтипу рака желудка по классификации P. Lauren. В GS-подтипе была повышена частота мутаций гена RHOA (ras homolog family member A) и часто встречался химерный ген CLDN18-ARHGAP, а также повышенная экспрессия генов белков клеточной адгезии. Опухоли подтипа CIN составляли 50% от всех образцов. В данной группе выявлена выраженная анеуплоидия, а также амплификация генов рецепторов тирозинкиназ (RTK), высокая доля мутаций TP53 и преимущественно кишечная морфология. Однако известное решение мало применимо в повседневной клинической практике ввиду большой трудоемкости и дороговизне использованных методов. Также остается неясным возможно ли использование новых молекулярных классификаций для коренных изменений в тактике лечения пациентов и улучшения выживаемости данной группы больных. В классификации TCGA нет данных о связи молекулярных подтипов с классическими гистологическими подтипами рака желудка, не выявлено четкой связи между топографией опухоли и молекулярным подтипом, не получена связь с выживаемостью пациентов.

Из уровня техники известна ещё одна молекулярно-генетическая классификация рака желудка, предложенная Азиатской ассоциацией по изучению рака (The Asian Cancer Research Group, ACRG), также выделяет 4 подтипа: a) опухоли с MSI; b) опухоли без MSI и c мутацией в TP53, c) опухоли без MSI и без мутации в TP53 и d) опухоли без MSI, содержащие клетки в состоянии эпителиально-мезенхимальной трансформации (R. Cristescu, J. Lee, et al. (2015). "Molecular analysis of gastric cancer identifies subtypes associated with distinct clinical outcomes." Nat Med 21(5): 449-56). В исследование ACRG вошел материал от 300 пациентов с первичными аденокарциномами желудка и выполнено полногеномное секвенирование (49 случаев), анализ уровня экспрессии генов, целевое секвенирование отдельных генов, исследование числа копий генов. В исследовании ACRG предложена альтернативная молекулярная классификация рака желудка. Предполагается разделять все раки желудка на MSI-подтип, микросателлитно-стабильный подтип с признаками эпителиально-мезенхимной трансформации (MSS/EMT-подтип), микросателлитно-стабильный подтип TP53+ (MSS/TP53+) и микросателлитно-стабильный подтип TP53- (MSS/TP53-). Опухоли MSI-подтипа составили 23% исследованных случаев и характеризовались большим количеством мутаций, причем в 44% образцов из этой группы выявлены мутации ARID1A, а в 42% - мутации фосфоинозитид-3 киназы и гомолога тензина (PTEN), являющихся мишенями для рапамицина (mTOR-сигнальный путь). В данном подтипе часто выявлялись мутации генов KRAS (23%) и ALK (16%). Оставшиеся опухоли, не вошедшие в MSI-подтип, были отнесены к микросателлитно-стабильным (MSS) и разделены на основании наличия экспрессии сигнатур характерных для эпителиально-мезенхимной трансформации (EMT). Опухоли, экспрессировавшие данную сигнатуру были отнесены к подтипу MSS/EMT и составили 15% от общего числа случаев. Данный подтип характеризовался наиболее низким числом мутаций генов (низкой мутационной нагрузкой). Опухоли без ЕМТ-сигнатуры подразделялись на основании активности гена TP53 на MSS/TP53+ и MSS/TP53-. В подтип MSS/TP53+ вошли 26% опухолей, причем данные опухоли чаще всех других были EBV-позитивными. Опухоли подтипа MSS/TP53- составили 36% от общей выборки и характеризовались наибольшей распространенностью мутаций гена TP53.

Подтипы рака желудка, выделенные ACRG, в отличие от подтипов TCGA, имели отличные клинические параметры и характеризовались различиями в выживаемости пациентов. К подтипу MSS/EMT относились опухоли от пациентов более молодого возраста, преимущественно с диффузной морфологией, наихудшей выживаемостью, наиболее высоким риском рецидива, в особенности перитонеальной диссеминации. Опухоли подтипа MSI локализовались преимущественно в антральном отделе желудка, чаще диагностировались на I и II стадиях, имели преимущественно кишечную морфологию, характеризовались наилучшей выживаемостью. При наличии рецидивов опухоли MSI подтипа, также как и MSS/TP53- подтипа, были ассоциированы с более высоким риском возникновения метастазов в печени, в сравнении с MSS/EMT и MSS/TP53+ подтипами. Однако классификация ACRG, также как и TCGA, мало применима в повседневной клинической практике ввиду большой трудоемкости и дороговизне использованных методов. В классификации ACRG получена только частичная связь с выживаемостью пациентов.

Из уровня техники известна классификация R. Gonzales с соавт. (R. S. Gonzalez, S. Messing, et al. (2016). "Immunohistochemistry as a surrogate for molecular subtyping of gastric adenocarcinoma." Hum Pathol 56: 16-21), созданная для того чтобы адаптировать молекулярно-генетические классификации к рутинной практике. R. Gonzales с коллегами показали возможность использования ИГХ-маркеров для классифицирования опухолей на CIN (p53) и MSI (белки MMR) и гибридизации in situ для идентификации EBV-ассоциированного подтипа. Исследователи выделили 4 группы опухолей: EBER-позитивные РЖ (7%); микросателлитно-нестабильные РЖ (MLH-негативные), (16%); хромосомно-нестабильные РЖ (p53-позитивные, EBER негативные, сохранный MLH1), (38%); геномно-стабильные (остальные случаи), (38%). Однако, указанная классификация характеризуется низкой достоверностью получаемых результатов, поскольку для анализа использован операционный материал лишь от 58 пациентов, что не позволяет получить статистически значимые результаты. В данной работе не исследованы все потенциальные прогностические маркеры рака желудка, в частности Е-кадгерин, PD-L1, CDX2.

Из уровня техники известна классификация опубликованная F. Di Pinto с соавт (F. Di Pinto, R. Armentano, et al. (2020). "Are Immunohistochemical Markers Useful in Phenotypic Gastric Cancer Classification?" Oncology 98(8): 566-574) в 2020 году. Исследование проведено на 60 случаях с использованием полноразмерного операционного материала и шестью маркерами (MLH-1, p53, HER2, E-cadherin, PD-L1, EBER). Авторы выделили 5 групп рака желудка: EBV-позитивные опухоли (EBV-подтип TCGA), MMR-дефицитные опухоли (MSI подтип TCGA), группа с гиперэкспрессией р53 и/или HER2 (что соответствует хромосомно-нестабильному (CIN) подтипу по классификации TCGA), группа с аберрантной экспрессией Е-кадегрина (что соответствует геномно-стабильному (GS) подтипу по классификации TCGA), а также пятую группу с нормальным паттерном экспрессии всех маркеров. В группу EBV-позитивных опухолей попало два случая, обе опухоли имели диффузный фенотип по P. Lauren и были PD-L1-позитивными. В группу MMR-дефицитных опухолей попало 7 случаев, 2 из которых были PD-L1 позитивными (40%). При этом среди оставшихся MMR-позитивных опухолей экспрессия PD-L1 встречалась лишь в 9,2% случаев. 80% MMR-дефицитных опухолей имели дистальную локализацию и кишечный фенотип по P. Lauren. Различия в экспрессии PD-L1 были статистически значимыми, как и различия в гистологических характеристиках. На этом основании авторы делают вывод о том, что группы EVB-позитивных и MMR-дефицитных опухолей являются кандидатами на таргетную терапию анти-PD-L1 препаратами. Группа с аберрантной экспрессией Е-кадгерина включала 8 случаев, все относились к диффузному фенотипу по P. Lauren, характеризовались большой глубиной инвазии (Т3-Т4) и наличием метастазов в лимфоузлы. В группах с нормальной экспрессией и с гиперэкспрессией р53 и/или HER2 встречались опухоли и с кишечной, и с диффузной морфологией. В данном исследовании авторы подчеркивают важность использования полноразмерных образцов операционного материала от больных раком желудка, а не ТМА. Также авторы указывают, что для определения микросателлитной нестабильности достаточно использовать один маркер (MLH-1) и описывают трудности с интерпретацией экспрессии р53. Однако, при разработке указанной классификации, как и предыдущей, использована маленькая выборка пациентов (60 случаев).

Из уровня техники известны исследования С. Díaz Del Arco (C. Díaz Del Arco, L. Estrada Muñoz, et al. (2018). "Immunohistochemical classification of gastric cancer based on new molecular biomarkers: a potential predictor of survival." Virchows Arch 473(6): 687-695), и E. Birkman (E. M. Birkman, N. Mansuri, et al. (2018). "Gastric cancer: immunohistochemical classification of molecular subtypes and their association with clinicopathological characteristics." Virchows Arch 472(3): 369-382), которые выполнены на крупных выборках пациентов (более 200). С. Díaz Del Arco и соавт. разделили рак желудка на 4 группы: тип 1, микросателлитно-нестабильные РЖ (23.5%); тип 2, E-кадгерин-негативные (6%); тип 3, стабильные (нет гиперэкспрессии р53), (53.5%); тип 4, стабильные (есть гиперэкспрессия р53), (17%). E. Birkman и соавт. выделили 3 группы: EBV-позитивные, микросателлитно-нестабильные РЖ (MSI) и р53-негативные. Однако от каждого пациента исследовался лишь 1 столбик опухоли диаметром по 1 мм. Метод ТМА не учитывает возможную гетерогенность в экспрессии маркеров, что прямо сказывается на интерпретации результатов иммуногистохимического исследования. Это является крупным недостатком данных исследований.

Наиболее близким к заявляемому является способ классификации, предложенный N.Setia и соавт. (N. Setia, A. T. Agoston, et al. (2016). "A protein and mRNA expression-based classification of gastric cancer." Mod Pathol 29(7): 772-84). В исследовании использованы образцы от 146 пациентов с раком желудка, которые были окрашены следующими маркерами: p53, MLH1, PMS2, MSH2, MSH6, E-cadherin, PD-L1, MUC2, CDX2, CD10, MUC5AC, MUC6, HER2, EBER CISH. N.Setia и соавт. выделили 5 групп EBER-позитивные РЖ (5%); РЖ с дефектом системы MMR (16%); РЖ с аберрантной экспрессией E-кадгерина (21%); РЖ с аберрантной экспрессией p53 expression (51%); РЖ c нормальной экспрессией p53, не вошедшие в другие группы (7%). Группа с аберрантной экспрессией р53 дополнительно разделена на кишечный фенотип (33%, 25/75, MUC2 и/или CD10 позитивные), желудочный фенотип (32%, 24/75, MUC5AC и/или MUC6 позитивные), смешанный фенотип (15%, 11/75, MUC2 и/или CD10 позитивные и MUC5AC и/или MUC6 позитивные), и null-фенотип (20%, 15/75, MUC2, CD10, MUC5AC и MUC6 негативные). Исследование N.Setia и соавт. выполнено методом ТМА, хотя авторы попытались компенсировать гетерогенность опухоли, использую столбики большего диаметра и увеличив их число. Исследование N.Setia и соавт. изобилует большим количеством иммуногистохимических маркеров, чего нельзя сказать об остальных работах. Однако при разработке указанной классификации использован метод ТМА, который не учитывает гетерогенность иммуногистохимического окрашивания опухоли. Авторы не получили связи выделенных подтипов с выживаемостью пациентов.

Технической проблемой, решаемой заявляемым изобретением, является создание способа классификации рака желудка, на основании комплекса морфологических и молекулярно-биологических характеристик, определяющих прогноз рака желудка.

Раскрытие изобретения

Техническим результатом изобретения является улучшение возможностей определения тактики лечения пациентов с раком желудка, определение прогностических и предиктивных характеристик опухоли, повышение точности назначаемой таргетной терапии и прогноза выживаемости (медианы выживаемости):

1. MMR-негативный подтип встречается в 8,1% случаев рака желудка и характеризуется благоприятным прогнозом (медиана 91 мес.).

2. EBER-позитивный подтип встречается в 9% случаев рака желудка, характеризуется благоприятным прогнозом (медиана 64 мес.).

3. Е-кадгерин-аберрантный подтип встречается в 17,1% случаев рака желудка, характеризуется крайне неблагоприятным прогнозом (медиана 16 мес.).

4. CDX2-позитивный подтип встречается в 49,7% случаев рака желудка; характеризуется относительно благоприятным прогнозом (медиана 47 мес.).

5. CDX2-негативный подтип встречается в 16,1% случаев рака желудка, характеризуется неблагоприятным прогнозом (медиана 23 мес.).

Поставленный технический результат достигается способом классификации молекулярных подтипов рака желудка методом иммуногистохимического тестирования, включает следующие этапы:

- иммуногистохимическое исследование полноразмерного операционного материала от больных раком желудка с маркерами микросателлитной нестабильности (MSH2, MSh6, MLH1, PMS2) для выделения MMR-негативного подтипа;

- исследование полноразмерного операционного материала от больных раком желудка с помощью гибридизации in situ с малыми РНК вируса Эпштейна-Барр (EBER) для выделения на втором этапе EBER-позитивного подтипа;

- иммуногистохимическое исследование полноразмерного операционного материала от больных раком желудка с Е-кадгерином для выявления Е-кадгерин-аберрантного подтипа;

- иммуногистохимическое исследование полноразмерного операционного материала от больных раком желудка с маркером CDX2 для разделения пациентов на две группы: с CDX2-позитивным подтипом опухоли и с CDX2-негативным подтипом опухоли;

- дополнительно любые образцы операционного материала рака желудка исследуются с маркерами PD-L1, HER2, CD44, Clau3 для определения возможностей таргетной терапии опухоли.

Краткое описание чертежей

Изобретение поясняется следующими иллюстративными материалами.

На фиг. 1 представлена схема заявляемого способа.

На фиг. 2 приведены основные характеристики MMR-негативного молекулярного подтипа рака желудка. MMR-негативный подтип встречается в 8,1% случаев рака желудка, чаще включает пациентов старших возрастных групп (медиана 70 лет), с преобладанием женского пола; к нему относятся тубулярные аденокарциномы кишечного типа по P. Lauren, без перстневидных клеток, расположенные в желудке дистально и имеющие блюдцеобразную/чашеподобную макроскопическую форму. Для MMR-негативного подтипа характерна положительная экспрессия MUC2 (р=0,017), CD44 (р=0,01) и PD-L1 (p<0,05), а также повышенная плотность инфильтрации CD8+ клетками по сравнению с CDX2-позитивным (р=0,005) и CD1a+ клетками по сравнению с Е-кадгерин-аберрантным подтипом (р=0,038). MMR-негативный подтип характеризуется благоприятным прогнозом (медиана 91 мес).

На фиг. 3 приведены основные характеристики EBER-позитивного молекулярного подтипа рака желудка. EBER-позитивный подтип встречается в 9% случаев рака желудка, включает пациентов мужского пола; к нему относятся тубулярные аденокарциномы с низкой степенью дифференцировки, без перстневидных клеток, промежуточного подтипа по P. Lauren, расположенные в желудке проксимально. Для EBER-позитивного подтипа характерна нормальная экспрессия р53 (p=0,014), отсутствие повышенной экспрессии CLAU-3 (p<0,05) и MUC-null фенотип (p<0,05), а также положительная экспрессия PD-L1 (p<0,05) и повышенная плотность инфильтрации CD4+, CD8+, CD68+ и СD1a+ клетками по сравнению со всеми остальными подтипами (р=0,000). EBER-позитивный подтип характеризуется благоприятным прогнозом (медиана 64 мес).

На фиг. 4 приведены основные характеристики Е-кадгерин-аберрантного молекулярного подтипа рака желудка. Е-кадгерин-аберрантный подтип встречается в 17,1% случаев рака желудка, чаще включает пациентов женского пола; к нему относятся дискогезивные карциномы и тубулярные аденокарциномы с низкой степенью дифференцировки, с субтотальной/тотальной локализацией, инфильтративно-язвенным и диффузно-инфильтративным ростом рака, более крупными размерами опухолей (более 8 см), диффузного подтипа по P. Lauren. Для Е-кадгерин-аберрантного подтипа характерна аберрантная экспрессия β-катенина (p=0,000). Е-кадгерин-аберрантный подтип характеризуется крайне неблагоприятным прогнозом (медиана 16 мес).

На фиг. 5 приведены основные характеристики CDX2-позитивного молекулярного подтипа рака желудка.CDX2-позитивный подтип встречается в 49,7% случаев рака желудка; к нему относятся опухоли кишечного и промежуточного типа по P. Lauren, расположенные в желудке проксимально и имеющие значимо меньшие размеры. В состав этого подтипа чаще входят папиллярные и муцинозные раки желудка с меньшей глубиной инвазии, без поражения лимфатических узлов и с более низкой клинической стадией. Для CDX2-позитивного подтипа характерна положительная экспрессия MUC2 (p<0,050), CD10 (p=0,019) и MUC-I фенотип (p=0,030). CDX2-позитивный подтип характеризуется относительно благоприятным прогнозом (медиана 47 мес).

На фиг. 6 приведены основные характеристики CDX2-негативного молекулярного подтипа рака желудка. CDX2-негативный подтип встречается в 16,1% случаев рака желудка; к нему относятся опухоли диффузного и промежуточного типа по P. Lauren, расположенные в желудке преимущественно дистально и имеющие значимо более крупные размеры. В состав этого подтипа чаще входят папиллярные карциномы желудка, а также карциномы с большей глубиной инвазии и с более высокой клинической стадией. Для CDX2-негавтиного подтипа характерна положительная экспрессия MUC5АС (p=0,02) и MUC-G фенотип (p=0,045). CDX2-негативный подтип характеризуется неблагоприятным прогнозом (медиана 23 мес).

Осуществление изобретения

В исследовании использованы образцы операционного материала от 310 пациентов с верифицированным диагнозом рака желудка, не получавших в предоперационном периоде химио- или лучевую терапию. Критериями исключения были: карцинома in situ, недостаточное количество материала в парафиновых блоках, верифицированный нейроэндокринный рак, лимфома желудка или гастроинтестинальная стромальная опухоль желудка. Возраст пациентов варьировал от 22 до 85 лет (медиана – 63 года). Медиана наблюдения за пациентами составила 83 мес.

Постановку иммуногистохимических реакций осуществляют с помощью стрептавидин-биотиновых полимерных систем визуализации (пример: UltraVision Quanto, Thermo Fisher Scientific, USA) согласно протоколу производителя в автоматическом иммуностейнере. Депарафинирование, регидратацию и демаскировку антигенов выполняют при помощи буферов с различными рН при температуре 95-98°С в течение 20 минут в модуле предобработки (пример PT-Module, Thermo Fisher Scientific, USA). Примеры буферов: Thermo Dewax and HIER Bufer L (pH 6,0), Thermo Dewax and HIER Bufer M (pH 8,0) и Thermo Dewax and HIER Bufer H (pH 9,0). Выбор буфера производился индивидуально для конкретного антитела в соответствии с инструкцией производителя. Время инкубации антител составляет 20-30 минут в соответствии с инструкцией производителя.

Характеристики используемых антител приведены в таблице 1.

Таблица 1.

Наименование маркера Клон Производитель Разведение MSH2 FE-11 Dako/Agilent Technologies, США 1:50 MSH6 EP49 Dako/Agilent Technologies, США RTU MLH1 ES05 Dako/Agilent Technologies, США 1:50 PMS2 EP51 Dako/Agilent Technologies, США 1:40 MUC2 CCP58 Dako/Agilent Technologies, США RTU CDX2 DAK-CDX2 Dako/Agilent Technologies, США RTU MUC5AC CLH2 Dako/Agilent Technologies, США RTU CD10 56C6 Dako/Agilent Technologies, США RTU Е-кадгерин NCH-38 Dako/Agilent Technologies, США 1:100 β-катенин B-Catenin-1 Dako/Agilent Technologies, США 1:200 Claudin 1 Поликлональные кроличьи ab15098 Abcam, Великобритания 1:200 Claudin 3 Поликлональные кроличьи ab15102 Abcam, Великобритания 1:100 Claudin 4 Поликлональные кроличьи Thermo Fisher Scientific, СШA RTU CD44 DF1485 Dako/Agilent Technologies, США 1:25 P53 DO-7 Dako/Agilent Technologies, США RTU PD-L1 SP142 Roche Ventana, USA RTU PD-L1 SP263 Roche Ventana, USA RTU HER2/neu HercepTest Dako/Agilent Technologies, США RTU CD4 4B12 Dako/Agilent Technologies, США 1:40 CD8 C8/144B Dako/Agilent Technologies, США 1:100 CD68 PG-M1 Dako/Agilent Technologies, США RTU CD1a 010 Dako/Agilent Technologies, США 1:50 LMP-1 CS.1-4 Dako/Agilent Technologies, США 1:100

Гибридизация in situ проводится с использованием праймеров к малым вирусным РНК вируса Эпштейна-Барр (пример: INFORM EBER, Roche Ventana, USA) и системы визуализации ISH iVIEW Blue Detection Kit (Roche Ventana, USA). Постановка реакций гибридизации in situ осуществляется с помощью автоматического стейнера (пример: Ventana BenchMark Ultra, Roche Ventana, USA). Реакция считается положительной, если сигнал EBER локализуется в ядре опухолевых клеток, но при этом отсутствует цитоплазматическое окрашивание. При каждой постановке реакций используется положительный контроль в виде тканевого образца EBV-ассоциированной назофарингеальной карциномы.

Постановку реакций с маркером HER2/neu осуществляют с помощью валидированного набора HercepTest (Dako/Agilent Technologies, США) по инструкции производителя. Для определения экспрессии PD-L1 используют антитела производства Roche Ventana, USA клоны SP142 и SP263 и систему детекции OptiView DAB IHC Detection Kit. Постановка реакций с PD-L1 осуществляется с помощью прибора Ventana BenchMark Ultra (Roche Ventana, USA) по стандартному протоколу не позднее чем через 24 часа после изготовления парафиновых срезов.

На фиг. 2-6 приведены основные иммуногистохимические и клинико-морфологические характеристики выделенных молекулярных подтипов рака желудка.

Возможность реализации заявляемого изобретения показана, но не ограничена, в примерах конкретного выполнения.

Пример 1. Пациентка 70 лет обратилась за медицинской помощью по поводу новообразования желудка. На момент постановки диагноза по данным лучевых методов исследования установлена клиническая стадия Т4bN0M0 с наличием инвазии в поджелудочную железу и селезенку.

При патолого-анатомическом исследовании биопсийного материала была выявлена аденокарцинома низкой степени дифференцировки (G3). При иммуногистохимическом исследовании обнаружены признаки MMR-негативного молекулярного подтипа рака желудка: отсутствие экспрессии пары MSH6/MSH2 в опухолевых клетках, а также высокий уровень экспрессии PD-L1.

Учитывая возраст пациентки и наличие сопутствующей патологии, назначена анти-PD1-терапия в монорежиме 1 раз в 3 нед. После второго введения выполнена биопсия опухоли, в материале которой обнаружилась выраженная инфильтрация опухоли лейкоцитами по сравнению первым исследоанием. После 3-го введения анти-PD-1-препарата также выполнена биопсия зоны новообразования — опухолевые клетки отсутствовали, отмечена выраженная лейкоцитарная инфильтрация.

В настоящее время пациентка закончила двухлетний курс анти-PD-1-терапии пембролизумабом и наблюдается в течение 5 мес. При повторных биопсиях зоны поражения желудка опухолевого роста не обнаружено. Прогноз оценивается как благоприятный.

Пример 2. Пациент 60 лет, обратился за медицинской помощью с жалобами на выраженную утомляемость. В общем анализе крови выявлена железодефицитная анемия, в порядке общего обследования выполнено эндоскопическое исследование желудка и обнаружена крупная изъязвленная опухоль. После дополнительных обследований клиническая стадия была определена как Т4aN3bM0.

При гистологическом исследовании биопсийного материала была выявлена низкодифференцированная тубулярная аденокарцинома, промежуточный подтип по P.Lauren. При иммуногистохимическом исследовании не обнаружены признаки MMR-негативного молекулярного подтипа рака желудка: все маркеры микросателлитной нестабильности MSH6, MSH2, MLH1, PMS2 были положительными в опухолевых клетках. На следующем этапе выполнена гибридизация in situ с малыми вирусными РНК вируса Эпштейна-Барр (EBER), которая дала положительный результат. Дополнительно проведено исследование с антителами к PD-L1, выявлена умеренная экспрессия (2 балла, CPS от 1 до 10%).

Учитывая отсутствие сопутствующей патологии решено начать лечение с полихимиотерапии по схеме FLOT. Уровень экспрессии PD-L1 был расценен как низкий, поэтому назначение дополнительной анти-PD1-терапии не проводилось, хотя пациенты с EBER-позитивным подтипом рака желудка согласно данным литературы демонстрируют хороший ответ на иммунотерапию, даже при отсутствии экспрессии PD-L1. Таким образом, схема лечения пациента была назначена без учета молекулярного подтипа рака желудка. После 6 курсов химиотерапии выполнена циторедуктивная операция в объеме гастрэктомии с лимфаденэктомией D2. По результатам послеоперационной гистологии получен лечебный патоморфоз опухоли 1-2 степени, край резекции положительный (R1). В дальнейшем химиотерапия была продолжена, однако пациент скончался через 5 месяцев после операции от прогрессирования болезни. Назначение терапии без учета молекулярного подтипа рака желудка неблагоприятно отражается на клинических исходах пациентов.

Таким образом, с помощью иммуногистохимического метода разработан новый способ молекулярной классификации рака желудка и выделено 5 молекулярных подтипов, различающихся прогностическими и клинико-морфологическими характеристиками (фиг. 1):

- MMR-негативный подтип (тубулярные аденокарциномы кишечного типа по P. Lauren, медиана возраста 70 лет, женский пол, дистальная локализация, экспрессия MUC2, CD44 и PD-L1) с наиболее благоприятным прогнозом (медиана 91 мес).

- EBER-позитивный подтип (тубулярные аденокарциномы промежуточного типа по P. Lauren, мужской пол, проксимальная локализация, нормальная экспрессия p53, MUC-null фенотип, положительная экспрессия PD-L1, повышенная плотность инфильтрации CD4+, CD8+, CD68+ и СD1a+ клетками) с благоприятным прогнозом (медиана 64 мес.).

- Е-кадгерин-аберрантный подтип (дискогезивные карциномы и низкодифференцированные тубулярные аденокарциномы, субтотальная/тотальная локализация, инфильтративно-язвенный и диффузно-инфильтративный рост, крупные размеры, диффузный подтип по P. Lauren, аберрантная экспрессия β-катенина) с крайне неблагоприятным прогнозом (медиана 16 мес.).

- CDX2-позитивный подтип (аденокарциномы кишечного и промежуточного подтипа по P. Lauren, проксимальная локализация, маленький размер, папиллярные и муцинозные карциномы, положительная экспрессия MUC2, CD10, MUC-I фенотип) и имеет промежуточный прогноз (медиана 47 мес.).

- CDX2-негативный (аденокарциномы промежуточного и диффузного подтипа по P. Lauren, дистальная локализация, крупные размеры, высокая клиническая стадия, положительная экспрессия MUC5AC, MUC-G фенотип) и имеет неблагоприятный прогноз (медиана 23 мес.). CDX2-позитивный и CDX2-негативный подтипы выделены впервые. Целесообразность выделения подтипа, связанного с аберрантной экспрессией р53 и описанного другими авторами, не подтверждена.

Изобретение относится к биотехнологии. Описан способ классификации молекулярных подтипов рака желудка методом иммуногистохимического тестирования предполагает оригинальный алгоритм пошагового иммуногистохимического тестирования рака желудка, включающий панель из следующих маркеров: MSH2, MSH6, MLH1, PMS2, MUC2, CDX2, MUC5AC, CD10, E-кадгерин, β-катенин, Клаудин-1, Клаудин-3, Клаудин-4, CD44, LMP-1, EBER, р53, PD-L1, CD4, CD8, CD68, CD1a. Способ позволяет выделить 5 молекулярных подтипов рака желудка со значимо различимыми клинико-морфологическими и прогностическими характеристиками. Алгоритм предусматривает выделение на первом этапе MMR-негативного подтипа, на втором этапе EBER-позитивного подтипа, далее – Е-кадгерин-аберрантного подтипа, далее CDX2-позитивного подтипа и CDX2-негативного подтипа, поскольку в данном варианте различия между подтипами имеют наибольшую значимость (р=0,001). Изобретение расширяет арсенал средств диагностики рака желудка. 3 з.п. ф-лы, 6 ил., 1 табл., 2 пр.

1. Способ дифференциальной диагностики типа рака желудка методом иммуногистохимического тестирования для определения медианы выживаемости, заключающийся в определении молекулярного подтипа опухоли, включающий проведение иммуногистохимического исследования с использованием панели из следующих маркеров: MSH2, MSH6, MLH1, PMS2, CDX2, E-кадгерин, EBER, и

- при получении отрицательных результатов иммуногистохимической реакции с одной из двух пар маркеров MSH2/MSH6 или MLH1/PMS2 - определяют MMR-негативный тип рака желудка и дают благоприятный прогноз с медианой выживаемости 91 мес.; в случае положительного результата хотя бы с одной парой маркеров проводят реакцию с маркером EBER;

- при получении положительных результатов реакции с EBER определяют EBER-позитивный тип рака желудка и дают благоприятный прогноз с медианой выживаемости 64 мес.; в случае отрицательных результатов проводят реакцию с маркером E-кадгерина;

- при получении цитоплазматической реакции с Е-кадгерином определяют Е-кадгерин-аберрантный тип рака желудка и дают неблагоприятный прогноз с медианой выживаемости 16 мес.; при отсутствии реакции с Е-кадгерином проводят реакцию с CDX2;

- в случае получения положительной иммуногистохимической реакции с CDX2 определяют CDX2-позитивный тип рака желудка и делают благоприятный прогноз с медианой выживаемости 47 мес.;

- при получении отрицательной иммуногистохимической реакции с CDX2 определяют CDX2-негативный подтип и делают неблагоприятный прогноз с медианой выживаемости 23 мес.

2. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что при определении MMR-негативного типа рака желудка, проводят определение экспрессии MUC2, CD44, PD-L1 для определения чувствительности к терапии с целью подбора терапии.

3. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что при выявлении EBER-позитивного подтипа дополнительно проводят определение экспрессии р53, MUC2, CDX2, MUC5AC, CD10, Клаудин-3, PD-L1, CD4, CD8, CD68, CD1a для определения чувствительности к терапии.

4. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что при выявлении Е-кадгерин аберрантного подтипа дополнительно проводят определение экспрессии β-катенина, при получении аберрантной реакции делают вывод о неблагоприятном прогнозе выживаемости.