СОСТАВ, СОДЕРЖАЩИЙ АНТИТЕЛО Российский патент 2017 года по МПК A61K39/395 C07K16/22 A61K9/00 A61K47/26 A61K47/18 

РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

В заявке заявляется приоритет Предварительной патентной заявки США № 61/288535, поданной 21 декабря 2009 г., содержание которой включено в данное описание посредством ссылки в полном ее объеме для всех целевых назначений.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Данное изобретение относится к стабильному водному фармацевтическому составу, содержащему антитело.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В последние годы достижения в области биотехнологий сделали возможным производство различных белков для фармацевтического применения, используя технологии рекомбинантных ДНК. В силу того, что белки являются более крупными и более комплексными, чем традиционные органические и неорганические лекарственные средства (например, обладают многочисленными функциональными группами в дополнение к комплексной трехмерной структуре), приготовление состава таких белков создает особые проблемы. Для сохранения биологической активности белка состав должен сохранять интактную конформационную целостность по меньшей мере основной последовательности аминокислот данного белка, и, одновременно с этим, защищать многочисленные функциональные группы белка от деградации. Пути деградации белков могут включать химическую нестабильность (например, любой процесс, в котором предусмотрено изменение данного белка в результате образования или расщепления связи, что приводит к образованию нового химического структурного элемента) или физическую нестабильность (например, изменения в структуре высшего порядка белка). Химическая нестабильность может быть результатом деамидирования, рацемизации, гидролиза, окисления, бета-элиминирования или дисульфидного обмена. Физическая нестабильность может быть результатом денатурации, агрегации, преципитации или абсорбции, например. Тремя наиболее распространенными путями деградации белка являются агрегация, деамидирование и окисление белков. Cleland et al. Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 10(4): 307-377 (1993).

Антитела включены в состав белков, используемых для фармацевтического применения. Примером антитела, эффективного для лечения, является антитело, которое связывает анти-VEGF. В данной области существует потребность в водном фармацевтическом составе, содержащем антитело, например, анти-VEGF антитело, которое подходит для терапевтического применения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Данное изобретение обеспечивает стабильные водные фармацевтические составы, содержащие терапевтически эффективное количество антитела, при необходимости, не подверженного предварительной лиофилизации, буфер, поддерживающий значение рН в диапазоне от приблизительно 4,0 до приблизительно 6,0, и, при необходимости, поверхностно-активное вещество, способы получения данного состава и способы применения данного состава.

Один вариант осуществления данного изобретения обеспечивает стабильный водный фармацевтический состав, содержащий терапевтически эффективное количество антитела в аргининовом буфере, рН 4,0-6,0. В некоторых вариантах осуществления данный буфер представляет собой аргинин-ацетатный буфер, pH 4,5-5,5. В некоторых вариантах осуществления данный буфер представляет собой аргинин-ацетатный буфер, pH 4,8-5,4. В некоторых вариантах осуществления данный буфер представляет собой аргинин-ацетатный буфер, pH 5,2. В некоторых вариантах осуществления концентрация ацетата аргинина в данном буфере находится в диапазоне от приблизительно 25 мМ до приблизительно 250 мМ. В некоторых вариантах осуществления концентрация ацетата аргинина в данном буфере находится в диапазоне от приблизительно 50 мМ до приблизительно 250 мМ. В некоторых вариантах осуществления концентрация ацетата аргинина в данном буфере находится в диапазоне от приблизительно 75 мМ до приблизительно 250 мМ. В некоторых вариантах осуществления концентрация ацетата аргинина в данном буфере находится в диапазоне от приблизительно 100 мМ до приблизительно 250 мМ. В некоторых вариантах осуществления концентрация ацетата аргинина в данном буфере находится в диапазоне от приблизительно 120 мМ до приблизительно 240 мМ. В некоторых вариантах осуществления концентрация ацетата аргинина в данном буфере находится в диапазоне от приблизительно 150 мМ до приблизительно 225 мМ. В некоторых вариантах осуществления концентрация ацетата аргинина в данном буфере составляет приблизительно 200 мМ. В некоторых вариантах осуществления данный состав дополнительно содержит поверхностно-активное вещество. В некоторых вариантах осуществления данным поверхностно-активным веществом является полисорбат. В некоторых вариантах осуществления данный полисорбат представляет собой полисорбат 20. В некоторых вариантах осуществления концентрация данного поверхностно-активного вещества находится в диапазоне от 0,0001% до приблизительно 1,0%. В некоторых вариантах осуществления концентрация данного поверхностно-активного вещества находится в диапазоне от приблизительно 0,01% до приблизительно 0,05%. В некоторых вариантах осуществления концентрация данного поверхностно-активного вещества составляет 0,04%. В некоторых вариантах осуществления концентрация данного антитела составляет от приблизительно 10 мг/мл до приблизительно 250 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления концентрация данного антитела составляет от приблизительно 25 мг/мл до приблизительно 200 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления концентрация данного антитела составляет от приблизительно 30 мг/мл до приблизительно 175 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления концентрация данного антитела составляет от приблизительно 50 мг/мл до приблизительно 150 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления концентрация данного антитела составляет от приблизительно 75 мг/мл до приблизительно 125 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления концентрация данного антитела составляет от приблизительно 25 мг/мл до приблизительно 100 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления данное антитело не подвергают предварительной лиофилизации. В некоторых вариантах осуществления, данное антитело связывает VEGF. В некоторых вариантах осуществления данное антитело представляет собой моноклональное антитело. В некоторых вариантах осуществления данное моноклональное антитело является полноразмерным антителом. В некоторых вариантах осуществления данное моноклональное антитело представляет собой антитело IgG1. В некоторых вариантах осуществления данное моноклональное антитело представляет собой гуманизированное антитело. В некоторых вариантах осуществления данное моноклональное антитело представляет собой фрагмент антитела, содержащий антигенсвязывающую область. В некоторых вариантах осуществления данный фрагмент антитела представляет собой фрагмент Fab или F(ab’)2. В некоторых вариантах осуществления данное моноклональное антитело связывает VEGF. В некоторых вариантах осуществления данным антителом является бевацизумаб. В некоторых вариантах осуществления данное моноклональное антитело является склонным к агрегации. В некоторых вариантах осуществления данный буфер представляет собой 200 мМ ацетат аргинина, рН 5,2, данное поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат в количестве приблизительно 0,01-0,1% об./об., и данный состав стабилен при температуре приблизительно 40°С в течение, по меньшей мере, 28 дней. В некоторых вариантах осуществления данный состав является стерильным. В некоторых вариантах осуществления данный состав является стабильным при хранении при приблизительно 40°C в течение, по меньшей мере, 28 дней. В некоторых вариантах осуществления данный состав является водным и предназначен для введения в организм субъекта. В некоторых вариантах осуществления данный состав предназначен для внутривенного (в/в), подкожного (п/к) или внутримышечного (в/м) введения. В некоторых вариантах осуществления данный состав предназначен для в/в введения, и концентрация антитела составляет от приблизительно 10 мг/мл до приблизительно 250 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления данный состав предназначен для в/в введения, и концентрация антитела составляет от приблизительно 25 мг/мл до приблизительно 175 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления данный состав предназначен для в/в введения, и концентрация антитела составляет от приблизительно 50 мг/мл до приблизительно 150 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления данный состав предназначен для в/в введения, и концентрация антитела составляет от приблизительно 75 мг/мл до приблизительно 125 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления данный состав предназначен для п/к введения, и концентрация антитела составляет от приблизительно 10 мг/мл до приблизительно 250 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления данный состав предназначен для п/к введения, и концентрация антитела составляет от приблизительно 25 мг/мл до приблизительно 175 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления данный состав предназначен для п/к введения, и концентрация антитела составляет от приблизительно 50 мг/мл до приблизительно 150 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления данный состав предназначен для п/к введения, и концентрация антитела составляет от приблизительно 75 мг/мл до приблизительно 125 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления данный состав предназначен для в/м введения, и концентрация антитела составляет от приблизительно 10 мг/мл до приблизительно 250 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления данный состав предназначен для в/м введения, и концентрация антитела составляет от приблизительно 25 мг/мл до приблизительно 175 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления данный состав предназначен для в/м введения, и концентрация антитела составляет от приблизительно 50 мг/мл до приблизительно 150 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления данный состав предназначен для в/м введения, и концентрация антитела составляет от приблизительно 75 мг/мл до приблизительно 125 мг/мл.

Другой вариант осуществления данного изобретения обеспечивает изделие, включающее контейнер, в котором хранится стабильная водная фармацевтический состав, содержащий терапевтически эффективное количество антитела, аргинин-ацетатный буфер с рН от приблизительно 4,5 до приблизительно 6,0, и поверхностно-активное вещество. В некоторых вариантах осуществления, концентрация антитела составляет от приблизительно 10 мг/мл до приблизительно 250 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления, концентрация антитела составляет от приблизительно 25 мг/мл до приблизительно 200 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления, концентрация антитела составляет от приблизительно 30 мг/мл до приблизительно 175 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления, концентрация антитела составляет от приблизительно 50 мг/мл до приблизительно 150 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления, концентрация антитела составляет от приблизительно 75 мг/мл до приблизительно 125 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления, концентрация антитела составляет от приблизительно 25 мг/мл до приблизительно 100 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления данное антитело не подвергается предварительной лиофилизации. В некоторых вариантах осуществления данное антитело связывает VEGF. В некоторых вариантах осуществления данное антитело представляет собой моноклональное антитело. В некоторых вариантах осуществления данное моноклональное антитело является полноразмерным антителом. В некоторых вариантах осуществления данное моноклональное антитело представляет собой антитело IgG1. В некоторых вариантах осуществления данное моноклональное антитело представляет собой гуманизированное антитело. В некоторых вариантах осуществления данное моноклональное антитело представляет собой фрагмент антитела, содержащий антигенсвязывающую область. В некоторых вариантах осуществления данный фрагмент антитела представляет собой фрагмент Fab или F(ab’)2. В некоторых вариантах осуществления данное моноклональное антитело связывает VEGF. В некоторых вариантах осуществления данным антителом является бевацизумаб. В некоторых вариантах осуществления данное моноклональное антитело является склонным к агрегации. В некоторых вариантах осуществления концентрация ацетата аргинина в данном буфере находится в диапазоне от приблизительно 25 мМ до приблизительно 250 мМ. В некоторых вариантах осуществления концентрация ацетата аргинина в данном буфере находится в диапазоне от приблизительно 50 мМ до приблизительно 250 мМ. В некоторых вариантах осуществления концентрация ацетата аргинина в данном буфере находится в диапазоне от приблизительно 75 мМ до приблизительно 250 мМ. В некоторых вариантах осуществления концентрация ацетата аргинина в данном буфере находится в диапазоне от приблизительно 100 мМ до приблизительно 250 мМ. В некоторых вариантах осуществления концентрация ацетата аргинина в данном буфере находится в диапазоне от приблизительно 120 мМ до приблизительно 240 мМ. В некоторых вариантах осуществления концентрация ацетата аргинина в данном буфере находится в диапазоне от приблизительно 150 мМ до приблизительно 225 мМ. В некоторых вариантах осуществления концентрация ацетата аргинина в данном буфере составляет приблизительно 200 мМ. В некоторых вариантах осуществления данный аргинин-ацетатный буфер имеет значение рН от приблизительно 4,5 до приблизительно 5,5. В некоторых вариантах осуществления данный аргинин-ацетатный буфер имеет значение рН от приблизительно 4,8 до приблизительно 5,4. В некоторых вариантах осуществления данный аргинин-ацетатный буфер имеет значение рН приблизительно 5,2. В некоторых вариантах осуществления данным поверхностно-активным веществом является полисорбат. В некоторых вариантах осуществления данный полисорбат представляет собой полисорбат 20. В некоторых вариантах осуществления концентрация данного поверхностно-активного вещества находится в диапазоне от 0,0001% до приблизительно 1,0%. В некоторых вариантах осуществления концентрация данного поверхностно-активного вещества находится в диапазоне от приблизительно 0,01% до приблизительно 0,05%. В некоторых вариантах осуществления концентрация данного поверхностно-активного вещества составляет 0,04%. В некоторых вариантах осуществления данный состав является стерильным. В некоторых вариантах осуществления данный состав является стабильным при хранении при приблизительно 40°C в течение, по меньшей мере, 28 дней. В некоторых вариантах осуществления данный состав является водным и предназначен для введения в организм субъекта. В некоторых вариантах осуществления данный состав предназначен для внутривенного (в/в), подкожного (п/к) или внутримышечного (в/м) введения. В некоторых вариантах осуществления данный состав предназначен для в/в введения, и концентрация антитела составляет от приблизительно 10 мг/мл до приблизительно 250 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления данный состав предназначен для в/в введения, и концентрация антитела составляет от приблизительно 25 мг/мл до приблизительно 175 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления данный состав предназначен для в/в введения, и концентрация антитела составляет от приблизительно 50 мг/мл до приблизительно 150 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления данный состав предназначен для в/в введения, и концентрация антитела составляет от приблизительно 75 мг/мл до приблизительно 125 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления данный состав предназначен для п/к введения, и концентрация антитела составляет от приблизительно 10 мг/мл до приблизительно 250 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления данный состав предназначен для п/к введения, и концентрация антитела составляет от приблизительно 25 мг/мл до приблизительно 175 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления данный состав предназначен для п/к введения, и концентрация антитела составляет от приблизительно 50 мг/мл до приблизительно 150 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления данный состав предназначен для п/к введения, и концентрация антитела составляет от приблизительно 75 мг/мл до приблизительно 125 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления данный состав предназначен для в/м введения, и концентрация антитела составляет от приблизительно 10 мг/мл до приблизительно 250 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления данный состав предназначен для в/м введения, и концентрация антитела составляет от приблизительно 25 мг/мл до приблизительно 175 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления данный состав предназначен для в/м введения, и концентрация антитела составляет от приблизительно 50 мг/мл до приблизительно 150 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления данный состав предназначен для в/м введения, и концентрация антитела составляет от приблизительно 75 мг/мл до приблизительно 125 мг/мл.

Следующий вариант осуществления данного изобретения обеспечивает способ стабилизации антитела в водном фармацевтическом составе, посредством смешения фармацевтически эффективного количества антитела, аргинин-ацетатного буфера со значение рН от приблизительно 4,5 до приблизительно 6,0, и поверхностно-активного вещества. В некоторых вариантах осуществления, концентрация антитела составляет от приблизительно 10 мг/мл до приблизительно 250 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления, концентрация антитела составляет от приблизительно 25 мг/мл до приблизительно 200 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления, концентрация антитела составляет от приблизительно 30 мг/мл до приблизительно 175 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления, концентрация антитела составляет от приблизительно 50 мг/мл до приблизительно 150 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления, концентрация антитела составляет от приблизительно 75 мг/мл до приблизительно 125 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления, концентрация антитела составляет от приблизительно 25 мг/мл до приблизительно 100 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления данное антитело не подвергается предварительной лиофилизации. В некоторых вариантах осуществления данное антитело связывает VEGF. В некоторых вариантах осуществления данное антитело представляет собой моноклональное антитело. В некоторых вариантах осуществления данное моноклональное антитело является полноразмерным антителом. В некоторых вариантах осуществления данное моноклональное антитело представляет собой антитело IgG1. В некоторых вариантах осуществления данное моноклональное антитело представляет собой гуманизированное антитело. В некоторых вариантах осуществления данное моноклональное антитело представляет собой фрагмент антитела, содержащий антигенсвязывающую область. В некоторых вариантах осуществления данный фрагмент антитела представляет собой фрагмент Fab или F(ab’)2. В некоторых вариантах осуществления данное моноклональное антитело связывает VEGF. В некоторых вариантах осуществления данным антителом является бевацизумаб. В некоторых вариантах осуществления данное моноклональное антитело является склонным к агрегации. В некоторых вариантах осуществления концентрация ацетата аргинина в данном буфере находится в диапазоне от приблизительно 25 мМ до приблизительно 250 мМ. В некоторых вариантах осуществления концентрация ацетата аргинина в данном буфере находится в диапазоне от приблизительно 50 мМ до приблизительно 250 мМ. В некоторых вариантах осуществления концентрация ацетата аргинина в данном буфере находится в диапазоне от приблизительно 75 мМ до приблизительно 250 мМ. В некоторых вариантах осуществления концентрация ацетата аргинина в данном буфере находится в диапазоне от приблизительно 100 мМ до приблизительно 250 мМ. В некоторых вариантах осуществления концентрация ацетата аргинина в данном буфере находится в диапазоне от приблизительно 120 мМ до приблизительно 240 мМ. В некоторых вариантах осуществления концентрация ацетата аргинина в данном буфере находится в диапазоне от приблизительно 150 мМ до приблизительно 225 мМ. В некоторых вариантах осуществления концентрация ацетата аргинина в данном буфере составляет приблизительно 200 мМ. В некоторых вариантах осуществления данный аргинин-ацетатный буфер имеет значение рН от приблизительно 4,5 до приблизительно 5,5. В некоторых вариантах осуществления данный аргинин-ацетатный буфер имеет значение рН от приблизительно 4,8 до приблизительно 5,4. В некоторых вариантах осуществления данный аргинин-ацетатный буфер имеет значение рН приблизительно 5,2. В некоторых вариантах осуществления данным поверхностно-активным веществом является полисорбат. В некоторых вариантах осуществления данный полисорбат представляет собой полисорбат 20. В некоторых вариантах осуществления концентрация данного поверхностно-активного вещества находится в диапазоне от 0,0001% до приблизительно 1,0%. В некоторых вариантах осуществления концентрация данного поверхностно-активного вещества находится в диапазоне от приблизительно 0,01% до приблизительно 0,05%. В некоторых вариантах осуществления концентрация данного поверхностно-активного вещества составляет 0,04%. В некоторых вариантах осуществления данный состав является стерильным. В некоторых вариантах осуществления данный состав является стабильным при хранении при приблизительно 40°C в течение, по меньшей мере, 28 дней. В некоторых вариантах осуществления данный состав является водным и предназначен для введения в организм субъекта. В некоторых вариантах осуществления данный состав предназначен для внутривенного (в/в), подкожного (п/к) или внутримышечного (в/м) введения. В некоторых вариантах осуществления данный состав предназначен для в/в введения, и концентрация антитела составляет от приблизительно 10 мг/мл до приблизительно 250 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления данный состав предназначен для в/в введения, и концентрация антитела составляет от приблизительно 25 мг/мл до приблизительно 175 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления данный состав предназначен для в/в введения, и концентрация антитела составляет от приблизительно 50 мг/мл до приблизительно 150 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления данный состав предназначен для в/в введения, и концентрация антитела составляет от приблизительно 75 мг/мл до приблизительно 125 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления данный состав предназначен для п/к введения, и концентрация антитела составляет от приблизительно 10 мг/мл до приблизительно 250 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления данный состав предназначен для п/к введения, и концентрация антитела составляет от приблизительно 25 мг/мл до приблизительно 175 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления данный состав предназначен для п/к введения, и концентрация антитела составляет от приблизительно 50 мг/мл до приблизительно 150 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления данный состав предназначен для п/к введения, и концентрация антитела составляет от приблизительно 75 мг/мл до приблизительно 125 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления данный состав предназначен для в/м введения, и концентрация антитела составляет от приблизительно 10 мг/мл до приблизительно 250 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления данный состав предназначен для в/м введения, и концентрация антитела составляет от приблизительно 25 мг/мл до приблизительно 175 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления данный состав предназначен для в/м введения, и концентрация антитела составляет от приблизительно 50 мг/мл до приблизительно 150 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления данный состав предназначен для в/м введения, и концентрация антитела составляет от приблизительно 75 мг/мл до приблизительно 125 мг/мл.

Еще один вариант осуществления данного изобретения обеспечивает стабильный водный фармацевтический состав, содержащий терапевтически эффективное количество антитела, 200 мМ аргинин-ацетатный буфер со значением рН 5,2 и поверхностно-активное вещество. В некоторых вариантах осуществления, концентрация антитела составляет от приблизительно 10 мг/мл до приблизительно 250 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления, концентрация антитела составляет от приблизительно 25 мг/мл до приблизительно 200 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления, концентрация антитела составляет от приблизительно 30 мг/мл до приблизительно 175 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления, концентрация антитела составляет от приблизительно 50 мг/мл до приблизительно 150 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления, концентрация антитела составляет от приблизительно 75 мг/мл до приблизительно 125 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления, концентрация антитела составляет от приблизительно 25 мг/мл до приблизительно 100 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления данное антитело не подвергается предварительной лиофилизации. В некоторых вариантах осуществления данное антитело связывает VEGF. В некоторых вариантах осуществления данное антитело представляет собой моноклональное антитело. В некоторых вариантах осуществления данное моноклональное антитело является полноразмерным антителом. В некоторых вариантах осуществления данное моноклональное антитело представляет собой антитело IgG1. В некоторых вариантах осуществления данное моноклональное антитело представляет собой гуманизированное антитело. В некоторых вариантах осуществления данное моноклональное антитело представляет собой фрагмент антитела, содержащий антигенсвязывающую область. В некоторых вариантах осуществления данный фрагмент антитела представляет собой фрагмент Fab или F(ab’)2. В некоторых вариантах осуществления данное моноклональное антитело связывает VEGF. В некоторых вариантах осуществления данным антителом является бевацизумаб. В некоторых вариантах осуществления данное моноклональное антитело является склонным к агрегации. В некоторых вариантах осуществления концентрация ацетата аргинина в данном буфере находится в диапазоне от приблизительно 25 мМ до приблизительно 250 мМ. В некоторых вариантах осуществления концентрация ацетата аргинина в данном буфере находится в диапазоне от приблизительно 50 мМ до приблизительно 250 мМ. В некоторых вариантах осуществления концентрация ацетата аргинина в данном буфере находится в диапазоне от приблизительно 75 мМ до приблизительно 250 мМ. В некоторых вариантах осуществления концентрация ацетата аргинина в данном буфере находится в диапазоне от приблизительно 100 мМ до приблизительно 250 мМ. В некоторых вариантах осуществления концентрация ацетата аргинина в данном буфере находится в диапазоне от приблизительно 120 мМ до приблизительно 240 мМ. В некоторых вариантах осуществления концентрация ацетата аргинина в данном буфере находится в диапазоне от приблизительно 150 мМ до приблизительно 225 мМ. В некоторых вариантах осуществления концентрация ацетата аргинина в данном буфере составляет приблизительно 200 мМ. В некоторых вариантах осуществления данный аргинин-ацетатный буфер имеет значение рН от приблизительно 4,5 до приблизительно 5,5. В некоторых вариантах осуществления данный аргинин-ацетатный буфер имеет значение рН от приблизительно 4,8 до приблизительно 5,4. В некоторых вариантах осуществления данный аргинин-ацетатный буфер имеет значение рН приблизительно 5,2. В некоторых вариантах осуществления данным поверхностно-активным веществом является полисорбат. В некоторых вариантах осуществления данный полисорбат представляет собой полисорбат 20. В некоторых вариантах осуществления концентрация данного поверхностно-активного вещества находится в диапазоне от 0,0001% до приблизительно 1,0%. В некоторых вариантах осуществления концентрация данного поверхностно-активного вещества находится в диапазоне от приблизительно 0,01% до приблизительно 0,05%. В некоторых вариантах осуществления концентрация данного поверхностно-активного вещества составляет 0,04%. В некоторых вариантах осуществления данный состав является стерильным. В некоторых вариантах осуществления данный состав является стабильным при хранении при приблизительно 40°C в течение, по меньшей мере, 28 дней. В некоторых вариантах осуществления данный состав является водным и предназначен для введения в организм субъекта. В некоторых вариантах осуществления данный состав предназначен для внутривенного (в/в), подкожного (п/к) или внутримышечного (в/м) введения. В некоторых вариантах осуществления данный состав предназначен для в/в введения, и концентрация антитела составляет от приблизительно 10 мг/мл до приблизительно 250 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления данный состав предназначен для в/в введения, и концентрация антитела составляет от приблизительно 25 мг/мл до приблизительно 175 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления данный состав предназначен для в/в введения, и концентрация антитела составляет от приблизительно 50 мг/мл до приблизительно 150 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления данный состав предназначен для в/в введения, и концентрация антитела составляет от приблизительно 75 мг/мл до приблизительно 125 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления данный состав предназначен для п/к введения, и концентрация антитела составляет от приблизительно 10 мг/мл до приблизительно 250 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления данный состав предназначен для п/к введения, и концентрация антитела составляет от приблизительно 25 мг/мл до приблизительно 175 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления данный состав предназначен для п/к введения, и концентрация антитела составляет от приблизительно 50 мг/мл до приблизительно 150 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления данный состав предназначен для п/к введения, и концентрация антитела составляет от приблизительно 75 мг/мл до приблизительно 125 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления данный состав предназначен для в/м введения, и концентрация антитела составляет от приблизительно 10 мг/мл до приблизительно 250 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления данный состав предназначен для в/м введения, и концентрация антитела составляет от приблизительно 25 мг/мл до приблизительно 175 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления данный состав предназначен для в/м введения, и концентрация антитела составляет от приблизительно 50 мг/мл до приблизительно 150 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления данный состав предназначен для в/м введения, и концентрация антитела составляет от приблизительно 75 мг/мл до приблизительно 125 мг/мл.

В следующем варианте осуществления данное изобретение обеспечивает фармацевтический состав, содержащий: (a) полноразмерное антитело IgG1, восприимчивое к деамидированию или агрегации, в количестве от приблизительно 10 мг/мл до приблизительно 250 мг/мл; (b) аргинин-ацетатный буфер, pH 4,5-6,0; и (c) полисорбат 20 в количестве от приблизительно 0,01% до приблизительно 0,1%. В некоторых вариантах осуществления, концентрация антитела составляет от приблизительно 25 мг/мл до приблизительно 200 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления, концентрация антитела составляет от приблизительно 30 мг/мл до приблизительно 175 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления, концентрация антитела составляет от приблизительно 50 мг/мл до приблизительно 150 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления, концентрация антитела составляет от приблизительно 75 мг/мл до приблизительно 125 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления, концентрация антитела составляет от приблизительно 25 мг/мл до приблизительно 100 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления данное антитело не подвергается предварительной лиофилизации. В некоторых вариантах осуществления данное антитело связывает VEGF. В некоторых вариантах осуществления данное антитело представляет собой бевацизумаб. В некоторых вариантах осуществления данное антитело представляет собой гуманизированное антитело. В некоторых вариантах осуществления концентрация ацетата аргинина в данном буфере находится в диапазоне от приблизительно 25 мМ до приблизительно 250 мМ. В некоторых вариантах осуществления концентрация ацетата аргинина в данном буфере находится в диапазоне от приблизительно 50 мМ до приблизительно 250 мМ. В некоторых вариантах осуществления концентрация ацетата аргинина в данном буфере находится в диапазоне от приблизительно 75 мМ до приблизительно 250 мМ. В некоторых вариантах осуществления концентрация ацетата аргинина в данном буфере находится в диапазоне от приблизительно 100 мМ до приблизительно 250 мМ. В некоторых вариантах осуществления концентрация ацетата аргинина в данном буфере находится в диапазоне от приблизительно 120 мМ до приблизительно 240 мМ. В некоторых вариантах осуществления концентрация ацетата аргинина в данном буфере находится в диапазоне от приблизительно 150 мМ до приблизительно 225 мМ. В некоторых вариантах осуществления концентрация ацетата аргинина в данном буфере составляет приблизительно 200 мМ. В некоторых вариантах осуществления данный аргинин-ацетатный буфер имеет значение рН от приблизительно 4,5 до приблизительно 5,5. В некоторых вариантах осуществления данный аргинин-ацетатный буфер имеет значение рН от приблизительно 4,8 до приблизительно 5,4. В некоторых вариантах осуществления данный аргинин-ацетатный буфер имеет значение рН приблизительно 5,2. В некоторых вариантах осуществления концентрация полисорбата 20 составляет от приблизительно 0,01% до приблизительно 0,05%. В некоторых вариантах осуществления концентрация полисорбата 20 составляет 0,04%. В некоторых вариантах осуществления данный состав является стерильным. В некоторых вариантах осуществления данный состав является стабильным при хранении при приблизительно 40°C в течение, по меньшей мере, 28 дней. В некоторых вариантах осуществления данный состав является водным и предназначен для введения в организм субъекта. В некоторых вариантах осуществления данный состав предназначен для внутривенного (в/в), подкожного (п/к) или внутримышечного (в/м) введения. В некоторых вариантах осуществления данный состав предназначен для в/в введения, и концентрация антитела составляет от приблизительно 10 мг/мл до приблизительно 250 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления данный состав предназначен для в/в введения, и концентрация антитела составляет от приблизительно 25 мг/мл до приблизительно 175 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления данный состав предназначен для в/в введения, и концентрация антитела составляет от приблизительно 50 мг/мл до приблизительно 150 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления данный состав предназначен для в/в введения, и концентрация антитела составляет от приблизительно 75 мг/мл до приблизительно 125 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления данный состав предназначен для п/к введения, и концентрация антитела составляет от приблизительно 10 мг/мл до приблизительно 250 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления данный состав предназначен для п/к введения, и концентрация антитела составляет от приблизительно 25 мг/мл до приблизительно 175 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления данный состав предназначен для п/к введения, и концентрация антитела составляет от приблизительно 50 мг/мл до приблизительно 150 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления данный состав предназначен для п/к введения, и концентрация антитела составляет от приблизительно 75 мг/мл до приблизительно 125 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления данный состав предназначен для в/м введения, и концентрация антитела составляет от приблизительно 10 мг/мл до приблизительно 250 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления данный состав предназначен для в/м введения, и концентрация антитела составляет от приблизительно 25 мг/мл до приблизительно 175 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления данный состав предназначен для в/м введения, и концентрация антитела составляет от приблизительно 50 мг/мл до приблизительно 150 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления данный состав предназначен для в/м введения, и концентрация антитела составляет от приблизительно 75 мг/мл до приблизительно 125 мг/мл.

В другом варианте осуществления данное изобретение обеспечивает фармацевтический состав, содержащий антитело, которое связывает VEGF, в аргинин-ацетатном буфере со значение рН от приблизительно 4,5 до приблизительно 6,0, и поверхностно-активное вещество. В некоторых вариантах осуществления, концентрация антитела составляет от приблизительно 10 мг/мл до приблизительно 250 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления, концентрация антитела составляет от приблизительно 25 мг/мл до приблизительно 200 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления, концентрация антитела составляет от приблизительно 30 мг/мл до приблизительно 175 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления, концентрация антитела составляет от приблизительно 50 мг/мл до приблизительно 150 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления, концентрация антитела составляет от приблизительно 75 мг/мл до приблизительно 125 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления, концентрация антитела составляет от приблизительно 25 мг/мл до приблизительно 100 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления данное антитело не подвергается предварительной лиофилизации. В некоторых вариантах осуществления данное антитело представляет собой моноклональное антитело. В некоторых вариантах осуществления данное моноклональное антитело является полноразмерным антителом. В некоторых вариантах осуществления данное моноклональное антитело представляет собой антитело IgG1. В некоторых вариантах осуществления данное моноклональное антитело представляет собой гуманизированное антитело. В некоторых вариантах осуществления данное моноклональное антитело представляет собой фрагмент антитела, содержащий антигенсвязывающую область. В некоторых вариантах осуществления данный фрагмент антитела представляет собой фрагмент Fab или F(ab’)2. В некоторых вариантах осуществления данным антителом является бевацизумаб. В некоторых вариантах осуществления данное моноклональное антитело является склонным к агрегации. В некоторых вариантах осуществления концентрация ацетата аргинина в данном буфере находится в диапазоне от приблизительно 25 мМ до приблизительно 250 мМ. В некоторых вариантах осуществления концентрация ацетата аргинина в данном буфере находится в диапазоне от приблизительно 50 мМ до приблизительно 250 мМ. В некоторых вариантах осуществления концентрация ацетата аргинина в данном буфере находится в диапазоне от приблизительно 75 мМ до приблизительно 250 мМ. В некоторых вариантах осуществления концентрация ацетата аргинина в данном буфере находится в диапазоне от приблизительно 120 мМ до приблизительно 240 мМ. В некоторых вариантах осуществления концентрация ацетата аргинина в данном буфере находится в диапазоне от приблизительно 150 мМ до приблизительно 225 мМ. В некоторых вариантах осуществления концентрация ацетата аргинина в данном буфере составляет приблизительно 200 мМ. В некоторых вариантах осуществления данный аргинин-ацетатный буфер имеет значение рН от приблизительно 4,5 до приблизительно 5,5. В некоторых вариантах осуществления данный аргинин-ацетатный буфер имеет значение рН от приблизительно 4,8 до приблизительно 5,4. В некоторых вариантах осуществления данный аргинин-ацетатный буфер имеет значение рН приблизительно 5,2. В некоторых вариантах осуществления данным поверхностно-активным веществом является полисорбат. В некоторых вариантах осуществления данный полисорбат представляет собой полисорбат 20. В некоторых вариантах осуществления концентрация данного поверхностно-активного вещества находится в диапазоне от 0,0001% до приблизительно 1,0%. В некоторых вариантах осуществления концентрация данного поверхностно-активного вещества находится в диапазоне от приблизительно 0,01% до приблизительно 0,05%. В некоторых вариантах осуществления концентрация данного поверхностно-активного вещества составляет 0,04%. В некоторых вариантах осуществления данный состав является стерильным. В некоторых вариантах осуществления данный состав является стабильным при хранении при приблизительно 40°C в течение, по меньшей мере, 28 дней. В некоторых вариантах осуществления данный состав является водным и предназначен для введения в организм субъекта. В некоторых вариантах осуществления данный состав предназначен для внутривенного (в/в), подкожного (п/к) или внутримышечного (в/м) введения. В некоторых вариантах осуществления данный состав предназначен для в/в введения, и концентрация антитела составляет от приблизительно 10 мг/мл до приблизительно 250 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления данный состав предназначен для в/в введения, и концентрация антитела составляет от приблизительно 25 мг/мл до приблизительно 175 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления данный состав предназначен для в/в введения, и концентрация антитела составляет от приблизительно 50 мг/мл до приблизительно 150 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления данный состав предназначен для в/в введения, и концентрация антитела составляет от приблизительно 75 мг/мл до приблизительно 125 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления данный состав предназначен для п/к введения, и концентрация антитела составляет от приблизительно 10 мг/мл до приблизительно 250 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления данный состав предназначен для п/к введения, и концентрация антитела составляет от приблизительно 25 мг/мл до приблизительно 175 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления данный состав предназначен для п/к введения, и концентрация антитела составляет от приблизительно 50 мг/мл до приблизительно 150 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления данный состав предназначен для п/к введения, и концентрация антитела составляет от приблизительно 75 мг/мл до приблизительно 125 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления данный состав предназначен для в/м введения, и концентрация антитела составляет от приблизительно 10 мг/мл до приблизительно 250 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления данный состав предназначен для в/м введения, и концентрация антитела составляет от приблизительно 25 мг/мл до приблизительно 175 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления данный состав предназначен для в/м введения, и концентрация антитела составляет от приблизительно 50 мг/мл до приблизительно 150 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления данный состав предназначен для в/м введения, и концентрация антитела составляет от приблизительно 75 мг/мл до приблизительно 125 мг/мл.

Другой вариант осуществления данного изобретения обеспечивает способ уменьшения агрегации терапевтического моноклонального антитела, включающий составление рецептуры данного антитела в аргинин-ацетатном буфере со значением рН 4,5-6,0. В некоторых вариантах осуществления, концентрация антитела составляет от приблизительно 10 мг/мл до приблизительно 250 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления, концентрация антитела составляет от приблизительно 25 мг/мл до приблизительно 200 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления, концентрация антитела составляет от приблизительно 30 мг/мл до приблизительно 175 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления, концентрация антитела составляет от приблизительно 50 мг/мл до приблизительно 150 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления, концентрация антитела составляет от приблизительно 75 мг/мл до приблизительно 125 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления, концентрация антитела составляет от приблизительно 25 мг/мл до приблизительно 100 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления данное антитело не подвергается предварительной лиофилизации. В некоторых вариантах осуществления данное антитело представляет собой моноклональное антитело. В некоторых вариантах осуществления данное моноклональное антитело является полноразмерным антителом. В некоторых вариантах осуществления данное моноклональное антитело представляет собой антитело IgG1. В некоторых вариантах осуществления данное моноклональное антитело представляет собой гуманизированное антитело. В некоторых вариантах осуществления данное моноклональное антитело представляет собой фрагмент антитела, содержащий антигенсвязывающую область. В некоторых вариантах осуществления данный фрагмент антитела представляет собой фрагмент Fab или F(ab’)2. В некоторых вариантах осуществления данное моноклональное антитело связывает VEGF. В некоторых вариантах осуществления данным антителом является бевацизумаб. В некоторых вариантах осуществления данное моноклональное антитело является склонным к агрегации. В некоторых вариантах осуществления концентрация ацетата аргинина в данном буфере находится в диапазоне от приблизительно 25 мМ до приблизительно 250 мМ. В некоторых вариантах осуществления концентрация ацетата аргинина в данном буфере находится в диапазоне от приблизительно 50 мМ до приблизительно 250 мМ. В некоторых вариантах осуществления концентрация ацетата аргинина в данном буфере находится в диапазоне от приблизительно 75 мМ до приблизительно 250 мМ. В некоторых вариантах осуществления концентрация ацетата аргинина в данном буфере находится в диапазоне от приблизительно 120 мМ до приблизительно 240 мМ. В некоторых вариантах осуществления концентрация ацетата аргинина в данном буфере находится в диапазоне от приблизительно 150 мМ до приблизительно 225 мМ. В некоторых вариантах осуществления концентрация ацетата аргинина в данном буфере составляет приблизительно 200 мМ. В некоторых вариантах осуществления данный аргинин-ацетатный буфер имеет значение рН от приблизительно 4,5 до приблизительно 5,5. В некоторых вариантах осуществления данный аргинин-ацетатный буфер имеет значение рН от приблизительно 4,8 до приблизительно 5,4. В некоторых вариантах осуществления данный аргинин-ацетатный буфер имеет значение рН приблизительно 5,2. В некоторых вариантах осуществления данный состав является стерильным. В некоторых вариантах осуществления данный состав является стабильным при хранении при приблизительно 40°C в течение, по меньшей мере, 28 дней. В некоторых вариантах осуществления данный состав является водным и предназначен для введения в организм субъекта. В некоторых вариантах осуществления данный состав предназначен для внутривенного (в/в), подкожного (п/к) или внутримышечного (в/м) введения. В некоторых вариантах осуществления данный состав предназначен для в/в введения, и концентрация антитела составляет от приблизительно 10 мг/мл до приблизительно 250 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления данный состав предназначен для в/в введения, и концентрация антитела составляет от приблизительно 25 мг/мл до приблизительно 175 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления данный состав предназначен для в/в введения, и концентрация антитела составляет от приблизительно 50 мг/мл до приблизительно 150 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления данный состав предназначен для в/в введения, и концентрация антитела составляет от приблизительно 75 мг/мл до приблизительно 125 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления данный состав предназначен для п/к введения, и концентрация антитела составляет от приблизительно 10 мг/мл до приблизительно 250 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления данный состав предназначен для п/к введения, и концентрация антитела составляет от приблизительно 25 мг/мл до приблизительно 175 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления данный состав предназначен для п/к введения, и концентрация антитела составляет от приблизительно 50 мг/мл до приблизительно 150 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления данный состав предназначен для п/к введения, и концентрация антитела составляет от приблизительно 75 мг/мл до приблизительно 125 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления данный состав предназначен для в/м введения, и концентрация антитела составляет от приблизительно 10 мг/мл до приблизительно 250 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления данный состав предназначен для в/м введения, и концентрация антитела составляет от приблизительно 25 мг/мл до приблизительно 175 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления данный состав предназначен для в/м введения, и концентрация антитела составляет от приблизительно 50 мг/мл до приблизительно 150 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления данный состав предназначен для в/м введения, и концентрация антитела составляет от приблизительно 75 мг/мл до приблизительно 125 мг/мл.

Еще один вариант осуществления данного изобретения обеспечивает готовый продукт, включающий контейнер, в котором хранится любой из составов, описанных здесь.

Еще один вариант осуществления данного изобретения обеспечивает флакон с пробкой, прокалываемой шприцом, содержащий любой из составов, описанных здесь. В некоторых вариантах осуществления данный флакон хранится при температуре около 2-8°C. В некоторых вариантах осуществления данный флакон представляет собой флакон объемом 3 куб.см, 20 куб.см или 50 куб.см.

Другой вариант осуществления данного изобретения обеспечивает емкость из нержавеющей стали, содержащую любой из составов, описанных здесь. В некоторых вариантах осуществления данный состав заморожен.

Следующий вариант осуществления данного изобретения обеспечивает способ получения фармацевтического состава, включающего: (a) приготовление любого из составов, описанных здесь; и (b) оценку физической стабильности, химической стабильности или биологической активности данного антитела в данном составе.

Еще один вариант данного изобретения обеспечивает способ лечения заболевания или нарушения у субъекта, включающий введение одного из составов, описанных здесь, в организм субъекта в количестве, эффективном для лечения данного заболевания или нарушения. В некоторых вариантах осуществления данным заболеванием является злокачественное новообразование. В некоторых вариантах осуществления данное злокачественное новообразование выбрано из рака ободочной и прямой кишки, рака легких, рака молочной железы, рака почки и глиобластомы.

Эти и другие варианты осуществления данного изобретения описаны дополнительно в подробном описании изобретения, которое следует далее.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На Фигуре 1 представлены суммарные уровни агрегации, выявленные в анти-VEGF составах (100 мг/мл), которые хранились до 4 недель при температуре 40°C.

На Фигуре 2 представлены суммарные уровни агрегации, выявленные в анти-VEGF составах (0, 50, 100, и 150 мг/мл).

На Фигуре 3 представлены уровни димеров, выявленные в анти-VEGF составах (100 мг/мл) в сравнении с хранившимися до 4 недель при температуре 40°C.

На Фигуре 4 представлена вязкость анти-VEGF составов при температуре 20°C в виде функции концентрации анти-VEGF (25, 50, 100, 125, 150 или 175 мг/мл).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

I. Определения

Прежде чем приступить к подробному описанию данного изобретения, следует понимать, что это изобретение не ограничивается конкретными составами или биологическими системами, которые могут, безусловно, изменяться. Также следует понимать, что используемая здесь терминология предназначена для описания только конкретных вариантов осуществления, и не предназначена быть ограничивающей. Используемые в этом описании изобретения и прикрепленной формуле изобретения сингулярные формы «a», «an» и «the» включают множественные объекты ссылки, если по контексту четко не определено иным образом. Так, например, ссылка на «молекулу» при необходимости включает комбинацию двух или нескольких таких молекул, и тому подобное.

Термин «фармацевтический состав» относится к составу, который находится в форме, обеспечивающей эффективную биологическую активность данного действующего активного ингредиента, и которая не содержит дополнительных компонентов, которые являются недопустимо токсичными для субъекта, в организм которого данный состав будет вводиться. Такие составы являются стерильными. «Фармацевтически приемлемыми» наполнителями (носители, вспомогательные вещества) являются те, которые обоснованно могут быть введены в организм подвергаемого воздействию млекопитающего, для обеспечения эффективной дозы данного используемого действующего активного ингредиента.

«Стерильный» состав является асептическим или свободным, или практически свободным, от всех живых микроорганизмов и их спор.

Здесь «замороженный» состав представляет собой состав при температуре ниже 0°С. Как правило, данный замороженный состав не является ни сублимированным, ни подверженным предварительной или последующей лиофилизации. В некоторых вариантах осуществления данный замороженный состав содержит замороженное лекарственное вещество (в емкости из нержавеющей стали) или замороженную готовую лекарственную форму (в окончательной компоновке во флаконе).

«Стабильный» состав представляет собой состав, в котором данный белок по существу сохраняет свою физическую стабильность и/или химическую стабильность и/или биологическую активность при хранении. Предпочтительно, данный состав по существу сохраняет свою физическую и химическую стабильность, также как и свою биологическую активность, при хранении. Срок хранения, обычно, выбирается в зависимости от предполагаемого предельного срока хранения данного состава. Различные аналитические способы оценки стабильности белка доступны в данной области, и рассмотрены в Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Pubs. (1991) и Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90 (1993), например. Стабильность может быть оценена при выбранной температуре в течение выбранного периода времени. В некоторых вариантах осуществления данный состав является стабильным при приблизительно 40°C в течение, по меньшей мере, приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 14, 21, 28 или более дней. В некоторых вариантах осуществления данный состав является стабильным при приблизительно 40°C в течение, по меньшей мере, приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или более недель. В некоторых вариантах осуществления данный состав является стабильным при приблизительно 25°C в течение, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6,7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или более месяцев. В некоторых вариантах осуществления данный состав является стабильным при приблизительно 5°C в течение, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6,7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или более месяцев. В некоторых вариантах осуществления данный состав является стабильным при приблизительно -20°C в течение, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6,7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 или более месяцев. В некоторых вариантах осуществления данный состав является стабильным при приблизительно 5°C или -20°C в течение, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6,7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 или более месяцев. Более того, данный состав предпочтительно стабилен после замораживания (до, например, -20°C или -70°C) и оттаивания данного состава, например, после 1, 2, 3, 4 или 5 циклов замораживания и оттаивания. Стабильность может быть оценена качественно и/или количественно различными способами, включающими оценку образования агрегатов (например, используя эксклюзионную хроматографию размеров, путем измерения мутности или посредством визуального контроля); по оценке неоднородности заряда, используя катионообменную хроматографию, капиллярное изоэлектрическое фокусирование (icIEF) или капиллярный зональный электрофорез; анализ амино-концевых или карбокси-концевых последовательностей; масс-спектрометрический анализ; анализ методом электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE) для сравнения редуцированного и интактного антитела; анализ пептидной карты (например, трипсиновый или LYS-C; определение биологической активности или антигенсвязывающей функции данного антитела; и тому подобное. Нестабильность может включать любое из, или несколько: агрегация, деамидирование (например, деамидирование Asn), окисление (например, окисление Met), изомеризация (например, изомеризация Asp), клипирование/гидролиз/фрагментация (например, фрагментация шарнирной области), образование сукцинимида, непарный цистеин (цистеины), удлинение N-конца, процессинг C-конца, различия гликозилирования, и тому подобное.

Белок «сохраняет свою физическую стабильность» в фармацевтическом составе, если нет признаков, или есть очень незначительные, агрегации, преципитации и/или денатурации при визуальной оценке цвета и/или прозрачности, или при оценке посредством рассеяния ультрафиолетового излучения, или посредством эксклюзионной хроматографии размеров.

Белок «сохраняет свою химическую стабильность» в фармацевтическом составе, если данная химическая стабильность в определенный момент времени является такой, что данный белок рассматривается как все еще сохраняющий свою биологическую активность, как определено далее. Химическую стабильность можно определить посредством выявления и количественного определения химически измененных форм данного белка. Химическое изменение может включать изменение размера (например, клипирование), которое можно оценить, используя эксклюзионную хроматографию размеров, SDS-PAGE и/или времяпролетную масс-спектрометрию с лазерной ионизацией и десорбцией из жидкой матрицы (MALDI/TOF MS), например. Другие типы химического изменения включают изменение заряда (например, происходящее в результате деамидирования), что может быть оценено посредством ионообменной хроматографии или icIEF, например.

Антитело «сохраняет свою биологическую активность» в фармацевтическом составе, если данная биологическая активность данного антитела в определенный момент времени находится в пределах приблизительно 10% (в пределах погрешности анализа) от биологической активности, проявляемой в момент времени, когда данный фармацевтический состав был приготовлен, как определено с помощью реакции иммобилизации антигена, например. Другие способы анализа «биологической активности» антител разъясняются далее.

Используемый здесь термин «биологическая активность» моноклонального антитела относится к способности данного антитела связывать антиген. Это дополнительно может включать связывание антитела с антигеном и, в результате, измеримый биологический ответ, который можно измерить in vitro или in vivo. Такая активность может быть антагонистической или агонистической.

«Деамидированное» моноклональное антитело здесь представляет собой такое, в котором его один или несколько остатков аспарагина были дериватизированы, например, до аспарагиновой кислоты или изоаспарагиновой кислоты.

Антитело, являющееся «склонным к деамидированию» представляет собой такое, которое содержит один или несколько остатков, которые, как установлено, склонны к деамидированию.

Антитело, являющееся «склонным к агрегации», представляет собой такое, которое, как установлено, агрегирует с другой молекулой (молекулами) антитела, особенно в условиях замораживания и/или встряхивания.

Антитело, которое является «склонным к фрагментации» представляет собой такое, которое, как обнаружено, расщепляется на два или несколько фрагментов, например, в его шарнирной области.

Под «уменьшением деамидирования, агрегации или фрагментации» подразумевается предотвращение или снижение количества деамидирования, агрегации или фрагментации, в отношении моноклонального антитела, сформулированного в рецептуре при различных значениях рН или в другом буфере.

Данное антитело, которое сформулировано в рецептуре, предпочтительно является по существу беспримесным и желательно по существу гомогенным (например, свободным от загрязняющих белков и тому подобного). «По существу беспримесное» антитело означает состав, содержащий, по меньшей мере, около 90% по массе данного антитела, исходя из общей массы данного состава, предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно 95% по массе. «По существу гомогенное» антитело означает состав, содержащий, по меньшей мере, 99% по массе данного антитела, исходя из общей массы данного состава.

Термин «изотоничный» означает, что данный представляющий интерес состав имеет, по существу, такое же осмотическое давления, как и кровь человека. Изотоничные составы, в большинстве случаев, будут иметь осмотическое давление от приблизительно 250 до 350 мОсм. Изотоничность можно измерить, используя парофазный осмометр или осмометр льдогенераторного типа, например.

Используемый здесь термин «буфер» относится к забуференному раствору, который выдерживает изменения значений рН в результате действия его кислотно-щелочных сопряженных компонентов. Буфер по данному изобретению предпочтительно имеет значение рН в диапазоне от приблизительно 4,5 до приблизительно 7,0,предпочтительно от приблизительно 4,5 до приблизительно 6,5, например, 4,5-6,0, 4,5-5,9, 4,5-5,8, 4,5-5,7, 4,5-5,6, 4,5-5,5, 4,5-5,6, 4,5-5,5, 4,5-5,4, 4,5-5,3, 4,5-5,2, 4,5-5,1, 4,5-5,0, 4,5-4,9, 4,5-4,8, 4,5-4,7 или 4,5-4,6. В одном варианте осуществления данный буфер имеет значение pH 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,8, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9 или 6,0. Примеры буферов, которые будут поддерживать значение рН в этом диапазоне, включают ацетатный, сукцинатный, сукцинатный, глюконатный, гистидиновый, цитратный, глицил-глициновый и буферы других органических кислот.

«Аргининовый буфер» представляет собой буфер, содержащий ионы аргинина. Примеры аргининовых буферов включают ацетат аргинина, хлорид аргинина, фосфат аргинина, сульфат аргинина, сукцинат аргинина, и тому подобное. В одном варианте осуществления данный аргининовый буфер представляет собой ацетат аргинина. В одном варианте осуществления данный аргинин-ацетатный буфер приготовлен посредством титрования L-аргинина (свободное основание, твердый) уксусной кислотой (жидкая). В некоторых вариантах осуществления данный аргининовый буфер имеет значение рН 4,5-6,0, 4,5-5,9, 4,5-5,8, 4,5-5,7, 4,5-5,6, 4,5-5,5, 4,5-5,6, 4,5-5,5, 4,5-5,4, 4,5-5,3, 4,5-5,2, 4,5-5,1, 4,5-5,0, 4,5-4,9, 4,5-4,8, 4,5-4,7 или 4,5-4,6. В одном варианте осуществления данный буфер имеет значение pH 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,8, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9 или 6,0.

Используемый здесь термин «поверхностно-активное вещество» относится к поверхностно-активному компоненту, предпочтительно неионному поверхностно-активному веществу. Примеры поверхностно-активных веществ здесь включают полисорбат (например, полисорбат 20 и полисорбат 80); полоксамер (например, полоксамер 188); Triton; додецилсульфат натрия (SDS); лаурилсульфат натрия; октилгликозид натрия; лаурил-, миристил-, линолеил- или стеарил-сульфобетаин; лаурил-, миристил-, линолеил- или стеарил-саркозин; линолеил-, миристил- или цетил- бетаин; лауроамидопропил-, кокамидопропил-, линоламидопропил-, миристамидопропил-, палмидопропил- или изостеарамидопропил-бетаин (например, лауроамидопропил); миристамидопропил-, палмидопропил- или изостеарамидопропил-диметиламин; натрий метил кокоил- или динатрий метил олеил-таурат; и серии MONAQUAT™ (Mona Industries, Inc., Paterson, N.J.); полиэтилгликоль, полипропилгликоль, и сополимеры этилена и пропиленгликоля (например, Pluronics, PF68 и тому подобное); и тому подобное. В одном варианте осуществления данное поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат 20.

В фармакологическом смысле, в контексте данного изобретения, «терапевтически эффективное количество» антитела означает количество, эффективное для предотвращения или лечения заболевания, для лечения которого данное антитело является действенным. «Заболевание» представляет собой любое состояние, при лечении которого антитело оказывает благотворное воздействие. Это включает хронические и острые нарушения и заболевания, в том числе те патологические состояния, которые предрасполагают млекопитающего к рассматриваемому заболеванию.

«Консервант» представляет собой соединение, которое может быть при необходимости включено в данный состав для существенного снижения в ней действий бактерий, таким образом облегчая производство состава для многоразового использования, например. Примеры возможных консервантов включают октадецилдиметилбензил аммония хлорид, гексония хлорид, бензалкония хлорид (смесь алкилбензилдиметиламминия хлоридов, где алкиловые группы представляют собой длинноцепочечные соединения), и бензетония хлорид. Другие типы консервантов включают ароматические спирты, такие как фенол, бутиловый и бензиловый спирт, алкилпарабены, такие как метил- или пропилпарабен, катехин, резорцин, циклогесанол, 3-пентанол и m-крезол. В одном варианте осуществления данный консервант представляет собой бензиловый спирт.

«Полиол» представляет собой вещество с множественными гидроксильными группами, и включают сахара (восстанавливающие сахара и невосстанавливающие сахара), сахарные спирты и сахарные кислоты. Полиол при необходимости может быть включен в данный состав. В некоторых вариантах осуществления, при этом, полиолы имеют молекулярную массу, которая составляет менее чем приблизительно 600 кДа (например, в диапазоне от приблизительно 120 до приблизительно 400 кДа). «Восстанавливающий сахар» представляет собой такой, в котором содержится полуацетальная группа, которая может восстанавливать металлические ионы, или реагировать ковалентно с лизином или другими аминогруппами в белках, и «невосстанавливающим сахаром» является тот, который не обладает этими свойствами восстанавливающего сахара. Примерами восстанавливающих сахаров являются фруктоза, манноза, мальтоза, лактоза, арабиноза, ксилоза, рибоза, рамноза, галактоза и глюкоза. Невосстанавливающие сахара включают сахарозу, трегалозу, сорбозу, мелизитозу и раффмозу. Примерами сахарных спиртов являются маннит, ксилит, эритрит, треитол, сорбит и глицерин. Что касается сахарных кислот, они включают и его соли металлов. В случае когда требуется, чтобы данный состав был стабилен к замораживанию-оттаиванию, данный полиол предпочтительно представляет собой тот, который не кристаллизуется при температурах затвердевания (например, -20°C), что дестабилизирует данное антитело в данном составе. В некоторых вариантах осуществления невосстанавливающие сахара, такие как сахароза и трегалоза, являются примерами полиолов, где трегалоза более предпочтительна, чем сахароза, в связи со стабильностью раствора трегалозы.

Используемый здесь термин «VEGF» или «VEGF-A», относится к 165-аминокислотному васкулярному эндотелиальному фактору роста клеток человека и родственным 121-, 189-, и 206-аминокислотным васкулярным эндотелиальным факторам роста клеток человека, как описано у Leung et al. (1989) Science 246: 1306, и Houck et al. (1991) Mol. Endocrin, 5: 1806, вместе с их естественными аллельными и процессированными формами. Термин «VEGF» также относится к VEGF видов, не принадлежащих человеческому роду, например, мышей, крыс или приматов. Иногда VEGF определенных видов обозначают терминами, такими как hVEGF для VEGF человека, mVEGF для VEGF мышевидных, и тому подобное. Термин «VEGF» также используют для обозначения процессированных форм полипептида, содержащего аминокислоты с 8 по 109 или 1 по 109 данного 165-аминокислотного васкулярного эндотелиального фактора роста клеток человека. Ссылки на любую такую форму VEGF могут быть определены в настоящей заявке, например, «VEGF (8-109)», «VEGF (1-109)» или «VEGF₁₆₅». Положения аминокислот для «процессированного» нативного VEGF пронумерованы как указано в природной последовательности VEGF. Например, аминокислотное положение 17 (метионин) в процессированном нативном VEGF также является положением 17 (метионин) в нативном VEGF. Процессированный нативный VEGF имеет аффинность связывания с рецепторами KDR и Fit-1, сравнимую с нативным VEGF.

«Биологическая активность VEGF» включает связывание с любым рецептором VEGF или любую сигнальную активность VEGF. Такую как регулирование и нормального, и патологического ангиогенеза и васкулогенеза (Ferrara and Davis-Smyth (1997) Endocrine Rev. 18: 4-25; Ferrara (1999) J. Mol. Med. 77: 527-543); стимулирование эмбрионального васкулогенеза и ангиогенеза (Carmeliet et al. (1996) Nature 380:435-439; Ferrara et al. (1996) Nature 380: 439-442); и регуляция циклической пролиферации кровеносных сосудов в женских половых путях и для роста кости и формирования хряща (Ferrara et al. (1998) Nature Med. 4: 336-340; Gerber et al. (1999) Nature Med. 5: 623-628). Кроме того, что VEGF является ангиогенным фактором в ангиогенезе и васкулогенезе, он, как плейотропный фактор роста, проявляет многочисленные биологические эффекты в других физиологических процессах, таких как, продолжительность существования эндотелиальных клеток, проницаемость сосудов и вазодилатация, моноцитарный хемотаксис и приток кальция (Ferrara and Davis-Smyth (1997), supra и Cebe-Suarez et al. Cell. Mol. Life Sci. 63:601-615 (2006)). Более того, недавние исследования продемонстрировали митогенные эффекты VEGF на некоторые не-эндотелиальные типы клеток, такие как клетки эпителия пигмента сетчатки, клетки протока поджелудочной железы, и шванновские клетки. Guerrin et al. (1995) J. Cell Physiol. 164: 385-394; Oberg-Welsh et al. (1997) Mol. Cell. Endocrinol. 126: 125-132; Sondell et al. (1999) J. Neurosci. 19: 5731-5740.

«Антагонист VEGF» или «VEGF-специфический антагонист» относится к молекуле, способной связывать VEGF, снижая уровни экспрессии VEGF, или нейтрализуя, блокируя, ингибируя, уничтожая, уменьшая или препятствуя биологическим активностям VEGF, в том числе, но не ограничиваясь этим, связывание VEGF с одним или несколькими рецепторами VEGF и VEGF-опосредованный ангиогенез и продолжительность существования эндотелиальных клеток или пролиферация. В качестве VEGF-специфических антагонистов, используемых в способах по данному изобретению, включены полипептиды, которые специфически связывают VEGF, анти-VEGF антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, рецепторные молекулы и производные, которые связываются специфически с VEGF, тем самым изолируя его связывание с одним или несколькими рецепторами, слитые белки (например, VEGF-Trap (Regeneron)), и VEGF₁₂₁-гелонин (Peregrine). VEGF-специфические антагонисты также включают антагонистические варианты полипептидов VEGF, антисмысловые олигомеры, направленные на VEGF, малые молекулы РНК, направленные на VEGF, аптамеры РНК, пептитела, и рибозимы против VEGF. VEGF-специфические антагонисты также включают непептидные малые молекулы, которые связываются с VEGF и способны блокировать, ингибировать, уничтожать, уменьшать или препятствовать биологическим действиям VEGF. Таким образом, термин «действия VEGF» в частности включает VEGF-опосредованные биологические активности VEGF. В некоторых вариантах осуществления данный антагонист VEGF уменьшает или ингибирует уровень экспрессии или биологическую активность VEGF, по меньшей мере, на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или более.

«Анти-VEGF антитело» представляет собой антитело, которое связывается с VEGF с достаточной аффинностью и специфичностью. В некоторых вариантах осуществления, выбранное антитело будет, как правило, иметь достаточную аффинность связывания с VEGF, например, данное антитело может связывать hVEGF со значением K_d в диапазоне между 100 нМ-1 пМ. Аффинности антител могут быть определены, например, с помощью анализа на основе поверхностного плазмонного резонанса (например, анализ BIAcore, описанный в публикации заявки PCT № WO2005/012359); иммуноферментного твердофазного анализа (ELISA); и конкурентных анализов (например, RIA).

В некоторых вариантах осуществления анти- VEGF антитело может быть использовано в качестве терапевтического агента, направленного и препятствующего заболеваниям или состояниям, при которых задействована активность VEGF. Также, данное антитело может быть подвергнуто другим анализам биологической активности, например, с целью оценки его эффективности в качестве терапевтического средства. Такие анализы известны в данной области, и зависят от антигена-мишени и предполагаемого использования для данного антитела. Примеры включают анализ ингибирования HUVEC; анализ ингибирования роста опухолевых клеток (как описано в WO 89/06692, например); анализ антителозависимой клеточноопосредованной цитотоксичности (ADCC) и комплемент-опосредованной цитотоксичности (CDC) (Патент США 5500362); и анализ агонистической активности или анализ гомеопоэза (см. WO 95/27062). Анти-VEGF антитело не будет, как правило, связываться ни с другими гомологами VEGF, такими как VEGF-B или VEGF-C, ни с другими факторами роста, такими как PlGF, PDGF или bFGF. В одном варианте осуществления анти-VEGF антитело представляет собой моноклональное антитело, которое связывается с тем же эпитопом, что и моноклональное анти-VEGF антитело A4.6.1, продуцируемое гибридомой ATCC HB 10709. В другом варианте осуществления, данное анти-VEGF антитело представляет собой гуманизированое анти-VEGF моноклональное антитело, производимое в соответствии с Presta et al. (1997) Cancer Res. 57: 4593-4599, включая, но не ограничиваясь этим, антитело, известное как бевацизумаб (BV; AVASTIN®).

Данное анти-VEGF антитело «Бевацизумаб (BV)», также известное как «rhuMAb VEGF» или «AVASTIN®», представляет собой рекомбинантное гуманизированное анти-VEGF моноклональное антитело, производимое в соответствии с Presta et al. (1997) Cancer Res. 57: 4593-4599. Оно содержит мутированные каркасные области IgG1 человека и антигенсвязывающие гипервариабельные участки из мышиного анти-hVEGF моноклонального антитела A.4.6.1, которое блокирует связывание VEGF с его рецепторами. Приблизительно 93% аминокислотной последовательности Бевацизумаба, в том числе, большинство из каркасных областей, получены из IgG1 человека, и приблизительно 7% данной последовательности происходят из мышиного антитела A4.6.1. Бевацизумаб имеет молекулярную массу приблизительно 149000 дальтон, и является гликозилированным. Бевацизумаб и другие гуманизированные анти-VEGF антитела дополнительно описаны в Патенте США № 6884879, опубликованном 26 Февраля 2005, полное раскрытие которого в явной форме включено здесь посредством ссылки.

Используемый здесь термин «полипептид семейства В20» относится к полипептиду, в том числе антителу, который связывается с VEGF. Полипептиды семейства B20 включают, но не ограничиваются этим, антитела, полученные из последовательности антитела В20, или антитело, полученное из В20, описанное в Публикации США № 20060280747, Публикации США № 20070141065 и/или Публикации США № 20070020267, содержания этих патентных публикаций явным образом включены здесь посредством ссылки. В одном варианте осуществления полипептид семейства В20 представляет собой В20-4.1, как описано в Публикации США № 20060280747, Публикации США № 20070141065 и/или Публикации США № 20070020267. В другом варианте осуществления, полипептид семейства B20 представляет собой B20-4.1.1, описанный в Патентной Заявке США 60/991302, полное описание которой включено здесь в явной форме посредством ссылки.

Используемый здесь термин «полипептид семейства G6» относится к полипептиду, в том числе антителу, который связывается с VEGF. Полипептиды семейства G6 включают, но не ограничиваются этим, антитела, полученные из последовательности антитела G6, или антитело, полученное из G6, описанное в Публикации США № 2006 0280747, Публикации США № 2007 0141065 и/или Публикации США № 2007 0020267. Полипептиды семейства G6, как описано в Публикации США № 2006 0280747, Публикации США № 2007 0141065 и/или Публикации США № 2007 0020267 включают, но не ограничиваются ими, G6-8, G6-23 и G6-31.

Дополнительные антитела см. в Патентах США №№ 7060269, 6582959, 6703020; 6054297; W098/45332; WO 96/30046; WO94/10202; EP 0666868B1; Публикациях Патентных Заявок США №№ 2006009360, 20050186208, 20030206899, 20030190317, 20030203409, и 20050112126; и Popkov et al., Journal of Immunological Methods 288: 149-164 (2004). В некоторых вариантах осуществления другие антитела включают те, которые связываются с функциональным эпитопом на VEGF человека, включающем остатки F17, M18, D19, Y21, Y25, Q89, I91, K101, E103, и C104 или, альтернативно, включающие остатки F17, Y21, Q22, Y25, D63, I83 и Q89.

Другие анти-VEGF антитела также известны, и описаны, например, у Liang et al., J Biol Chem 281, 951-961 (2006).

«Лечение» относится как к терапевтическому лечению, так и к профилактическим или предупредительным мерам. Нуждающиеся в лечении включают тех, кто уже имеет данное заболевание, а также тех, у которых это заболевание должно быть предотвращено.

«Заболевание» представляет собой любое состояние, при котором лечение приносит пользу, включает, но не ограничивается этим, хронические и острые заболевания или нарушения, в том числе те патологические состояния, которые предрасполагают млекопитающего к рассматриваемому заболеванию. Заболевания включают ангиогенные заболевания. Используемый здесь термин «ангиогенные заболевания» относится к любому состоянию в которое вовлечен патологический ангиогенез или патологическая проницаемость сосудов или пропотевание жидкости. Неограничивающие примеры ангиогенных заболеваний, подвергающихся лечению, здесь включают злокачественные и доброкачественные опухоли; не-лейкемические и лимфонеоплазии; и, в частности, опухолевые (раковые) метастазы.

«Патологический ангиогенез» происходит в случае, когда новые кровеносные сосуды растут либо избыточно, либо иным образом несоответственно (например, местоположение, момент времени, степень, или начало процесса ангиогенеза, нежелательное с медицинской точки зрения) при болезненном состоянии, или тогда, когда это является причиной болезненного состояния. В некоторых случаях, интенсивный, неконтролируемый, или другим образом неправильный ангиогенез происходит, когда присутствует рост новых кровеносных сосудов, что способствует ухудшению болезненного состояния, или является причиной развития болезненного состояния. Данные новые кровеносные сосуды могут питать пораженные болезнью ткани, разрушать нормальные ткани, и, в случае рака, данные новые сосуды могут обеспечить выход опухолевых клеток в кровообращение и расселение в других органах (опухолевые метастазы). Примеры заболеваний с участием патологического ангиогенеза включают, но не ограничиваются этим, злокачественное новообразование, в особенности, васкуляризированные солидные опухоли и метастатические опухоли (в том числе, рак толстой кишки, легких (в особенности мелкоклеточный рак легких), или рак предстательной железы), заболевания, вызванные неоваскуляризацией глаза, в особенности, диабетическая слепота, ретинопатии, первичная диабетическая ретинопатия или возрастная дегенерация желтого пятна, хороидальная неоваскуляризация (CNV), диабетический отек желтого пятна, патологическая миопия, болезнь Гиппеля-Линдау, гистоплазмоз глаз, окклюзия центральной вены сетчатки (CRVO), неоваскуляризация роговицы, неоваскуляризация сетчатки и покраснение радужки; псориаз, псориатический артрит, гемангиобластома, например, гемангиома; воспалительные заболевания почек, например, гломерулонефрит, в особенности, мезанглиопролиферативный гломерулонефрит, гемолитико-уремический синдром, диабетическая нефропатия или гипертонический нефросклероз; различные воспалительные заболевания, такие как артрит, в особенности, ревматоидный артрит, воспалительная болезнь кишечника, псориаз, саркоидоз, артериальный артериосклероз и заболевания, развившиеся после трансплантации, эндометриоз или хроническую астму, и другие состояния.

«Патологическая проницаемость сосудов» возникает, когда поток жидкостей, молекул (например, ионы и питательные вещества) и клеток (например, лимфоциты) между сосудистыми и несосудистами участками является избыточным, либо иным образом несоответствующим (например, местоположение, момент времени, степень, или начало процесса ангиогенеза, нежелательное с медицинской точки зрения) при болезненном состоянии, или тогда, когда это является причиной болезненного состояния. Патологическая проницаемость сосудов может привести к избыточному или иным образом несоответствующему «пропотеванию» ионов, воды, питательных веществ или клеток через сосудистую сеть. В некоторых случаях, избыточная, неконтролируемая или иным образом несоответствующая проницаемость сосудов или пропотевание жидкости через сосуды обостряет или индуцирует болезненные состояния, включающие, например, водянку, связанную с опухолями, в том числе, например, опухолями мозга; асциты, связанные со злокачественными новообразованиями; синдром Мейгса; воспалительный процесс в легких; нефротический синдром; выпот в полость перикарда; плевральный выпот; проницаемость, связанную с сердечно-сосудистыми заболеваниями, такими как состояние после инфаркта миокарда и инсультов, и тому подобное. Настоящее изобретение предусматривает лечение тех пациентов, у которых развились, или имеются факторы риска развития, заболевания или нарушения с патологической проницаемостью или пропотеванием.

Термины «клеточно-пролиферативные заболевание» и «пролиферативное заболевание» относятся к заболеваниям, которые связаны с той или иной степенью патологической клеточной пролиферацией. В одном варианте осуществления данным клеточно-пролиферативным заболеванием является злокачественное новообразование. В одном варианте осуществления данным клеточно-пролиферативным заболеванием является опухоль.

Используемый здесь термин «опухоль» относится к росту и пролиферации всех опухолевых клеток, либо злокачественных, либо доброкачественных, и всех предраковых и раковых клеток и тканей. Термины «рак», «раковый», «клеточно-пролиферативное заболевание», «пролиферативное заболевание» и «опухоль» не являются взаимоисключающими, как упоминалось здесь.

Термин «рак» и «раковый» относятся к или описывают физиологическое состояние у млекопитающих, которое обычно характеризуется нерегулируемым клеточным ростом. Примеры рака включают, но не ограничиваются этим, карциному, лимфому, бластому, саркому, и лейкемию или лимфонеоплазию. Более частные примеры таких злокачественных новообразований включают, но не ограничиваются ими, плоскоклеточный рак (например, эпителиальный плоскоклеточный рак), рак легких, в том числе мелкоклеточный рак легких, немелкоклеточный рак легких, аденокарциному легких и плоскоклеточный рак легких, рак перитонеальной полости, печеночно-клеточный рак, рак ЖКТ или рак желудка, в том числе, рак желудочно-кишечного тракта и желудочно-кишечный стромальный рак, рак поджелудочной железы, глиобластому, рак шейки матки, рак яичников, рак печени, рак мочевого пузыря, рак мочевыводящих путей, гепатому, рак молочной железы, рак толстой кишки, рак прямой кишки, рак толстой и прямой кишок, рак эндометрия или матки, карциному слюнных желез, рак почки или почечный рак, рак предстательной железы, рак вульвы, рак щитовидной железы, карциному печени, рак анального канала, рак полового члена, меланому, поверхностно распространяющуюся меланому, меланому типа злокачественного лентиго, акральные лентигинозные меланомы, узловатые меланомы, множественные миеломы и В-клеточную лимфому (в том числе слабо выраженную/фолликулярную неходжкинскую лимфому (NHL); мелкоклеточную лимфоцитарную (SL) NHL; средней степени/фолликулярную NHL; средней степени диффузную NHL; высокодифференцированную иммунобластную NHL; высокодифференцированная лимфобластная NHL; высокодифференцированная мелкоклеточную с нерасщепленным ядром NHL; генерализованную лимфоаденопатию при NHL; лимфому из клеток зоны мантии; СПИД-ассоциированную лимфому; и макроглобулинемию Вальденстрема); хронический лимфолейкоз (CLL); острый лимфобластный лейкоз (ALL); волосатоклеточный лейкоз; хронический миелобластный лейкоз; и лимфопролиферативное заболевание после трансплантации (PTLD), а также патологическую пролиферацию сосудов, связанную с факоматозом, отеком (например, связанным с травмами мозга), синдромом Мейгса, раком головного мозка, а также головы и области шеи, а также связанную с метастазами. В некоторых вариантах осуществления, злокачественные новообразования, поддающиеся лечению антителами по данному изобретению, включают рак молочной железы, рак толстой и прямой кишок, рак прямой кишки, немелкоклеточный рак легких, глиобластому, неходжскинкую лимфому (NHL), рак почки, рак предстательной железы, рак печени, рак поджелудочной железы, саркому мягких тканей, саркому Капоши, карциноидную карциному, рак области головы и шеи, рак яичников, мезотелиому, и множественную миелому. В некоторых вариантах осуществления данное злокачественное новообразование выбрано из: мелкоклеточного рака легких, глиобластомы, нейробластом, меланомы, карциномы молочной железы, рака желудочно-кишечного тракта, рака толстой и прямой кишок (CRC), и печеночно-клеточного рака. Кроме того, в некоторых вариантах осуществления данное злокачественное новообразование выбрано из: немелкоклеточного рака легких, рака толстой и прямой кишок, глиобластомы и рака молочной железы, в том числе, метастатических форм этих злокачественных новообразований.

Термин «противораковая терапия» относится к терапии, применяемой для лечения рака. Примеры противораковых терапевтических агентов включают, но не ограничиваются ими, химиотерапевтические вещества, вещества-ингибиторы роста, цитотоксические средства, вещества, используемые при радиотерапии, противо-ангиогенные вещества, аптотические вещества, противо-тубулиновые вещества, и другие вещества для лечения рака, такие как анти-HER-2 антитела, анти-CD20 антитела, антагонист рецептора эпидермального фактора роста (EGFR) (например, ингибитор тирозинкиназы), ингибитор HER1/EGFR (например, эрлотиниб (Tarceva™), ингибиторы тромбоцитарного фактора роста (например, Gleevec™ (иматиниб мезилат)), ингибитор COX-2 (например, целекосиб), интерфероны, цитокины, антагонисты (например, нейтрализующие антитела), которые связывают одну или несколько из следующих мешеней ErbB2, ErbB3, ErbB4, PDGFR-бета, BlyS, APRIL, BCMA или VEGF рецептор(ы), TRAIL/ Apo2, и другие биологически активные и органические вещества, и тому подобное. Комбинации вышеперечисленного также включены в данное изобретение.

«Ангиогенный фактор или вещество» представляет собой фактор роста или его рецептор, который участвует в стимуляции развития кровеносных сосудов, например, стимулирует ангиогенез, рост эндотелиальных клеток, устойчивость кровеносных сосудов, и/или васкулогенез, и тому подобное. Например, ангиогенные факторы включают, но не ограничиваются этим, VEGF и члены семейства VEGF и их рецепторы (VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGFR1, VEGFR2 и VEGFR3), PlGF, семейство PDGF, семейство фактора роста фибробластов (FGF), лиганды TIE (ангиопоэтины, ANGPT1, ANGPT2), TIE1, TIE2, эфрины, Bv8, дельта-подобный лиганд 4 (DLL4), Del-1, факторы роста фибробластов: кислые (aFGF) и основные (bFGF), FGF4, FGF9, BMP9, BMP10, Фоллистатин, гранулоцитарный колниестимулирующий фактор (G-CSF), GM-CSF, фактор роста гепатоцитов (HGF)/рассеивающий фактор (SF), Интерлейкин-8 (IL-8), CXCL12, лептин, мидкин, нейропилины, NRP1, NRP2, плацентарный фактор роста, тромбоцитарный эндотелиальный фактор роста (PD-ECGF), тромбоцитарный фактор роста, в особенности PDGF-BB, PDGFR-альфа или PDGFR-бета, плейотрофин (PTN), програнулин, пролиферин, трансформирующий фактор роста альфа (TGF-альфа), трансформирующий фактор роста бета (TGF-бета), фактор некроза опухоли альфа (TNF-альфа), Alk1, CXCR4, Notch1, Notch4, Sema3A, Sema3C, Sema3F, Robo4, и тому подобное. Также дополнительно могут быть включены факторы, которые активируют ангиогенез, такие как ESM1 и перлекан. Это также будет включать факторы, которые ускоряют заживление ран, такие как гормон роста, инсулиноподобный фактор роста-I (IGF-I), VIGF, эпидермальный фактор роста (EGF), EGF-подобный домен, комплексный 7 (EGFL7), CTGF и члены его семейства, и TGF-альфа и TGF-бета. См., например, Klagsbrun and D’Amore (1991) Annu. Rev. Physiol. 53: 217-39; Streit and Detmar (2003) Oncogene 22: 3172-3179; Ferrara & Alitalo (1999) Nature Medicine 5(12): 1359-1364; Tonini et al. (2003) Oncogene 22: 6549-6556 (например, в Таблице 1 перечислены известные ангиогенные факторы); и Sato (2003) Int. J. Clin. Oncol. 8: 200-206.

«Анти-ангиогенное вещество» или «ангиогенный ингибитор» относится к веществу с малой молекулярной массой, полинуклеотиду (в том числе, например, ингибируюшая РНК (RNAi или siRNA)), полипептиду, изолированному белку, рекомбинантному белку, антителу или их конъюгатам или слитым белкам, которые ингибируют ангиогенез, васкулогенез или нежелательную проницаемость сосудов, либо напрямую, либо опосредованно. Следует понимать, что анти-ангиогенное вещество включает те вещества, которые связывают и блокируют ангиогенную активность ангиогенного фактора или его рецептора. Например, анти-ангиогенный агент представляет собой антитело или другой антагонист ангиогенному веществу, определенному выше, например, антитела против VEGF-A или рецептора VEGF-A (например, рецептор KDR или рецептор Flt-1), анти-PDGFR ингибиторы, малые молекулы, которые блокируют сигнал рецептора VEGF (например, PTK787/ZK2284, SU6668, SUTENT®/SU11248 (сунитиниб малат), AMG706 или те, которые описаны, например, в Международной патентной заявке WO 2004/113304). Анти-ангиогенные агенты включают, но не ограничиваются ими, следующие агенты: ингибиторы VEGF, такие как VEGF-специфический антагонист, ингибитор EGF, ингибиторы EGFR, Erbitux® (цетуксимаб, ImClone Systems, Inc., Branchburg, N.J.), Vectibix® (панитумумаб, Amgen, Thousand Oaks, CA), ингибиторы TIE2, ингибиторы IGF1R, ингибиторы COX-II (циклооксигеназа II), ингибиторы MMP-2 (матричная металлопротеиназа 2), и ингибиторы MMP-9 (матричная металлопротеиназа 9), CP-547,632 (Pfizer Inc., NY, USA), Акситиниб (Pfizer Inc.; AG- 013736), ZD-6474 (AstraZeneca), AEE788 (Novartis), AZD-2171), VEGF Trap (Regeneron/Aventis), Ваталаниб (также известен как PTK-787, ZK-222584: Novartis & Schering A G), Макуген (пегаптаниб октасодиум, NX-1838, EYE-001, Pfizer Inc./Gilead/Eyetech), IM862 (Cytran Inc. of Kirkland, Wash., USA); и ангиозим, синтетический рибозим от Ribozyme (Boulder, Colo.) и Chiron (Emeryville, Calif.) и их комбинации. Другие ингибиторы ангиогенеза включают тромбоспондин1, тромбоспондин2, коллаген IV и коллаген XVIII. Ингибиторы VEGF раскрыты в Патентах США №№ 6534524 и 6235764, оба включены здесь посредством ссылки в полном их объеме для всех целей.Анти-ангиогенные вещества также включают нативные ингибиторы ангиогенеза, например, ангиостатин, эндостатин, и тому подобное. См., например, Klagsbrun and D’Amore (1991) Annu. Rev. Physiol. 53: 217-39; Streit and Detmar (2003) Oncogene 22: 3172- 3179 (например, в Таблице 3 перечислены анти-ангиогенные средства при лечении злокачественной меланомы); Ferrara & Alitalo (1999) Nature Medicine 5(12): 1359-1364; Tonini et al. (2003) Oncogene 22: 6549-6556 (например, в Таблице 2 перечислены известные анти-ангиогенные факторы); и Sato (2003) Int. J. Clin. Oncol. 8: 200-206 (например, в Таблице 1 перечислены анти-ангиогенные вещества, используемые в клинических испытаниях).

Термин «анти-ангиогенная терапия» относится к терапии, эффективной при ингибировании ангиогенеза, что включает введение в организм анти-ангиогенного вещества.

Используемый здесь термин «цитотоксический агент» относится к веществу, которое ингибирует или воспрепятствует клеточной функции и/или является причиной клеточной гибели или разрушения. Данный термин включает радиоактивные изотопы (например, At²¹¹, I¹³¹, I¹²⁵, Y⁹⁰, Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸, Sm¹⁵³, Bi²¹², P³², Pb²¹² и радиоактивные изотопы Lu), химиотерапевтические вещества (например, метотрексат, адриамицин, алкалоиды барвинка (винкристин, винбластин, этопозид), доксорубицин, мелфалан, митомицин С, хлорамбуцил, даунорубицин или другие интеркалирующие агенты, ферменты или их фрагменты, такие как нуклеолитические ферменты, антибиотики, и токсины, такие как низкомолекулярные токсины или ферментативно активные токсины бактериального, грибкового, растительного или животного происхождения, в том числе их фрагменты и/или варианты, и различные противоопухолевые или противораковые агенты, раскрытые ниже. Другие цитотоксические агенты описаны ниже. Уничтожающие опухолевые клетки агенты вызывают разрушение клеток опухоли.

«Токсин» представляет собой любое вещество, способное оказывать отрицательное воздействие на рост или пролиферацию клетки.

«Химиотерапевтический агент» представляет собой химическое соединение, используемое для лечения злокачественного новообразования. Примеры химиотерапевтических агентов включают алкилирующие агенты, такие как тиоптера и циклофосфамид (CYTOXAN®); сульфонаты алкилов, такие как бусульфан, импросульфан и пипосульфан; азиридины, такие как бензодопа, карбоквон, метуредопа и уредопа; этиленимины и метилмеламины, включая альтретамин, триэтиленмеламин, триэтиленфосфорамид, триэтилентиофосфорамид и триметилолмеламин; ацетогенины (в особенности буллатацин и буллатацинон); дельта-9-тетрагидроканнабинол (дронабинол, MARINOL®); бета-лапахон; лапахол; колхицины; бетулиновую кислоту; каптотецин (в том числе синтетический аналог топотекан (HYCAMTIN®), CPT-11 (иринотекан, CAMPTOSAR®), ацетилкаптотецин, скополектин, и 9-аминокаптотецин); бриостатин; каллистатин; СС-1065 (в том числе его синтетические аналоги адозелезин, карзелезин и бизелезин); подофиллотоксин; подофиллиновую кислоту; тенипозид; криптофицины (в частности, криптофицин 1 и криптофицин 8); доластатин; дуокармуцин (в том числе синтетические аналоги KW-2189 и СВ1-ТМ1); элеутеробин; панкратистатин; саркодиктиин; спонгистатин; азотистые иприты, такие как хлорамбуцил, хлорнафазин, холофосфамид, эстрамустин, ифосфамид, мехлоретамин, гидрохлорид мехлоретаминоксида, мелфалан; новембихин, фенестерин, преднимустин, трофосфамид, урацил-аналог иприта; нитрозомочевины, такие как кармустин, хлорозотоцин, фотемустин, ломустин, нимустин и ранимустин; антибиотики, такие как энедииновые антибиотики (например, калихеамицин, в частности калихеамицин гамма 1I и калихеамицин омега I1 (см., например, Nicolaou et al., Angew. Chem. Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)); CDP323, пероральный ингибитор альфа-4 интегрина; динемицин, в том числе динемицин А; эсперамицин; а также неокарциностатиновый хромофор и родственные хромофоры хромопротеиновых энедииновых антибиотиков), алкациномизины, актиномицин, аутрамицин, азасерин, блеомицины, кактиномицин, карабицин, карминомицин, карцинофиллин, хромомицины, дактиномицин, даунорубицин, деторубицин, 6-диазо-5-оксо-L-норлейцин, доксорубицин (в том числе ADRIAMYCIN®, морфолино-доксорубицин, цианоморфолино-доксорубицин, 2-пирролино-доксорубицин, липосомальную форму для инъекций доксорубицина HCl (DOXIL®), липосомальный доксорубицин TLC D- 99 (MYOCET®), пегилированный липосомальный доксорубицин (CAELYX®), и дезоксидоксорубицин), эпирубицин, эзорубицин, идарубицин, марселломицин, митомицины, такие как митомицин С, микофеноловую кислоту, ногаламицин, оливомицины, пепломицин, порфиромицин, пуромицин, квеламицин, родорубицин, стрептонигрин, стрептозоцин, туберцидин, убенимекс, зиностатин, зорубицин; антиметаболиты, такие как метотрексат гемцитабин (GEMZAR®), тегафур (UFTORAL®), капецитабин (XELODA®), эпотилон, и 5-фторурацил (5-FU); комбретастатин; аналоги фолиевой кислоты, такие как деноптерин, метотрексат, птероптерин, триметотрексат; пуриновые аналоги, такие как флударабин, 6-меркаптопурин, тиамиприн, тиогуанин; пиримидиновые аналоги, такие как анцитабин, азацитидин, 6-азауридин, кармофур, цитарабин, дидезоксиуридин, доксифлуридин, эноцитабин, флоксуридин; андрогены, такие как калустерон, дромостанолона пропионат, эпитиостанол, мепитиостан, тестолактон; антиадреналин, такие как аминоглютетимид, митотан, трилостан; пополнители фолиевой кислоты, такие как фролиновая кислота; ацеглатон; альдофосфамидгликозид; аминолевулиновую кислоту; энилурацил; амсакрин; бестрабуцил; бисантрен; эдатраксат; дефофамин; демеколцин; диазиквон; элфорнитин; эллиптиния ацетат; эпотилон; этоглуцид; галлия нитрат; гидроксимочевину; лентинан; лонидаинин; майтансиноиды, такие как майтансин и ансамитоцины; митогуазон; митоксантрон; мопиданмол; нитраэрин; пентостатин; фенамет; пирарубицин; лозоксантрон; 2-этилгидразид; прокарбазин; PSK® полисахаридный комплекс (JHS Natural Products, Eugene, OR); разоксан; ризоксин; сизофиран; спирогерманий; тенуазоновую кислоту; триазиквон; 2,2’,2-трихлортриэтиламин; трихотецены (в частности, токсин Т-2, верракурин А, роридин А и ангуидин); уретан; виндесин (ELDIDINE®, FILDESIN®); дакарбазин; манномустин; митобронитол; митолактол; пипоброман; гацитозин; арабинозид («Ara-C»); циклофосфамид; тиотепа; таксоиды, например паклитаксел (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.),альбумин-сконструированный состав наночастиц паклитаксела (ABRAXANE™) и доксетаксел (TAXOTERE®, Rhône-Poulenc Rorer, Antony, France); хлоранбуцил; 6-тиогуанин; меркаптопурин; метотрексат; платино-содержащие агенты, такие как цисплатин, оксалиплатин (например, ELOXATIN®), и карбоплатин; барвинок, препятствующий полимеризации тубулина для формирования микротрубочек, в том числе винбластин (VELBAN®), винкристин (ONCOVIN®), виндесин (ELDISINE®, FILDESIN®), и винорелбин (NAVELBINE®); этопозид (VP- 16); ифосфамид; митоксантрон; лейковорин; новантрон; эдатрексат; дауномицин; аминоптерин; ибандронат; ингибитор топоизомеразы RFS 2000; дифторметилорнитин (DMFO); ретиноиды, такие как ретиноевая кислота, в том числе бексаротен (TARGRETIN®); бисфосфонаты, такие как хлордронат (например, BONEFOS® или OSTAC®), этидронат (DIDROCAL®), NE-58095, золедроновая кислота/золедронат (ZOMETA®), алендронат (FOSAMAX®), памидронат (AREDIA®), тилудронат (SKELID®) или ризедронат (ACTONEL®); троксацитабин (1,3-диоксолановый аналог нуклеозида цитозина); антисмысловые олигонуклеотиды, в частности олигонуклеотиды, которые ингибируют экспрессию генов в путях передачи сигналов, участвующих в аберрантной пролиферации клеток, таких как, например PKC-альфа, Ralf и H-Ras, рецептор эпидермального фактора роста (EGF-R) (например, эрлотиниб (Tarceva™)); и VEGF-A, который снижает клеточную пролиферацию; вакцины, такие как вакцина THERATOPE® и вакцины, применяемые при генотерапии, например, вакцина ALLOVECTIN®, вакцина LEUVECTIN® и вакцина VAXID®; ингибитор топоизомеразы 1 (например, LURTOTECAN®); rmRH (например, ABARELIX®); BAY439006 (сорафениб; Bayer); SU-1 1248 (сунитиниб, SUTENT®, Pfizer); перифозин, ингибитор COX-2 (например, целекоксиб или эторикоксиб), ингибитор протеосомы (например, PS341); бортезомиб (VELCADE®); CCI-779; типифарниб (R11577); орафениб, ABT510; ингибитор Bcl-2, такой как облимерсен натрий (GENASENSE®); пиксантрон; ингибиторы EGFR; ингибиторы тирозинкиназы; ингибиторы серин-треонин киназы, такие какрапамицин (сиролимус, RAPAMUNE®); ингибиторы фарнезилтрансферазы, такие как лонафарниб (SCH 6636, SARASAR™); и фарамцевтически пригодные соли, кислоты или производные любого из перечисленного выше; а также комбинации двух или нескольких из перечисленного выше, например CHOP, что представляет собой аббревиатуру для комбинированой терапии с использованием циклофосфамида, доксорубицина, винкристина и преднизолона; FOLFOX, аббревиатура для лечебной схемы с использоваием оксалиплатина (ELOXATIN™) в комбинации с 5-FU и лейковорином, и фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные любого из перечисленного выше, а также комбинации двух или нескольких из перечисленного выше.

Химеотерапевтические агенты, как определено здесь, включают «противо-гормональные агенты» или «эндокринные терапевтические средства», чье действие регулирует, снижает, блокирует или ингибирует действие гормонов, которые могут ускорять рост рака. Они сами могут представлять собой гормоны, ввлючающие, но не ограничиваясь этим: анти-эстрогены иселективные модуляторы рецептора эстрогена (SERM), в том числе, например, тамоксифен (включая тамоксифен NOLVADEX®), ралоксифен, дролоксифен, 4-гидрокситамоксифен, триоксифен, кеоксифен, LY117018, онапристон и FARESTON торемифен; ингибиторы ароматазы, которые ингибируют фермент ароматаза, который регулирует продукцию эстрогена в надпочечниках, такие как, например, 4(5)-имидазолы, аминоглутетимид, мегестрол ацетат MEGASE®, экземестан AROMASIN®, форместан, фодрозол, ворозол RIVISOR®, летрозол FEMARA®, и анастрозол ARIMIDEX®; и анти-андрогены, такие как флутамид, нилутамид, бикалутамид, лейпролид и госерелин; а также троксацитабин (1,3-диоксолановый аналог нуклеозида цитозина); антисмысловые олигонуклеотиды, в частности олигонуклеотиды, которые ингибируют экспрессию генов в путях передачи сигналов, участвующих в аберрантной пролиферации клеток, таких как, например PKC-альфа, Ralf и H-Ras; рибозимы, такие как ингибитор экспрессии VEGF (например, рибозим ANGIOZYME®) и ингибитор экспрессии HER2; вакцины, такие как вакцины, применяемые при генотерапии, например, вакцина ALLOVECTIN®, вакцина LEUVECTIN® и вакцина VAXID®; PROLEUKIN® rIL-2; ингибитор топоизомеразы 1 LURTOTECAN®; ABARELIX® rmRH; винорелбин и эсперамицины (см. Патент США № 4675187), и фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные любого из перечисленного выше, а также комбинации двух или нескольких из перечисленного выше.

Используемый здесь термин «агент, ингибирующий рост» относится к соединению или составу, который ингибирует рост клеток либо in vitro, либо in vivo. В одном варианте осуществления, агент, ингибирующий рост, представляет собой антитело, ингибирующее рост, которое предотвращает или снижает пролиферацию клетки, экспрессирующей антиген, с которым данное антитело связывается. В другом варианте осуществления, агент, ингибирующий рост, может представлять собой агент, который значительно снижает процентное содержание клеток в фазе S. Примеры агентов, ингибирующих рост, включают агенты, которые блокируют последовательность клеточного цикла (в месте, отличном от фазы S), такие, как агенты, индуцирующие ингибирование G1 и ингибирование М-фазы. Классические ингибиторы М-фазы включают производные барвинка (винкристин и винбластин), таксаны, и ингибиторы топоизомеразы II, такие как доксорубицин, эпирубицин, даунорубицин, этопозид, и блеомицин. Те агенты, которые ингибируют G1, также распространяются на ингибирование S-фазы, например, агенты, алкилирующие ДНК, такие как тамоксифен, преднизон, дакарбазин, мехлоретамин, цисплатин, метотрексат, 5-фторурацил и ara-C. Дополнительную информацию можно найти в Mendelsohn and Israel, eds., The Molecular Basis of Cancer, Глава 1, называемая «Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs» by Murakami et al. (W.B. Saunders, Philadelphia, 1995), e.g., p. 13. Таксаны (паклитаксель и доцетаксель) являются противораковыми лекарственными средствами, оба полученные из тисового дерева. Доцетаксель (TAXOTERE®, Rhône-Poulenc Rorer), получаемый из европейского тиса, представляет собой полусинтетичесский аналог паклитакселя (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb). Паклитаксель и доцетаксель способствуют сборке микротрубочек из димеров тубулина и стабилизируют микротрубочки, предотвращая деполмирезацию, что в результате приводит к ингибированию митоза в клетках.

Под «лучевой терапией» подразумевают применение направленных гамма-лучей или бета-лучей для причинения достаточного повреждения клетке, таким образом, чтобы ограничить ее способность функционировать нормально или чтобы разрушить данную клетку полностью. Следует иметь в виду, что в данной области существует множество способов для определения дозы и длительности лечения. Стандартная схема лечения представлена как однократное примение и стандартные дозы находятся в диапазоне от 10 до 200 единиц (Грэй) в день.

Термин «млекопитающее» для целей лечения, относится к любому животному, классифицированному как млекопитающее, включая человека, домашних и сельскохозяйственных животных, животных в зоопарках, спортивных животных или домашних любимцев, таких как собаки, лошади, кошки, коровы и тому подобное. Предпочтительно данным млекопитающим является человек.

Термин «антитело» используется здесь в широком смысле и, в частности, включает моноклональные антитела (в том числе полноразмерные моноклональные антитела), поликлональные антитела, мультиспецифические антитела (например, биспецифические антитела), и фрагменты антител, при условии, что они проявляют необходимую биологическую активность.

«Изолированное» антитело представляет собой антитело, которое было идентифицировано и отделено и/или восстановлено от компонентов его естественного окружения. Загрязняющие компоненты его природного окружения представляют собой вещества, которые могут препятствовать исследовательскому, диагностическому или терапевтическому применению данного антитела, и могут включать ферменты, гормоны и другие белковые или небелковые растворенные вещества. В некоторых вариантах осуществления антитело очищено (1) до степени, более чем 95% по массе антитела, как определено, например, с помощью метода Лоури, и в некоторых вариантах осуществления, до степени более чем 99% по массе; (2) до степени, достаточной для получения, по меньшей мере 15 остатков N-концевой или внутренней аминокислотной последовательности, используя, например секвенатор с вращающимся стаканом или (3) до гомогенности при электрофорезе в SDS-PAGE в восстанавливающих или невосстанавливающих условиях, используя, например, окраску Кумасси голубым или серебром. Изолированное антитело включает антитело in situ в рекомбинантных клетках, поскольку, по меньшей мере, один компонент естественного окружения данного антитела не будет присутствовать. Однако, как правило, изолированное тело будет получено с применением, по меньшей мере, одного этапа очистки.

«Нативные антитела» являются обычно гетеротетрамерными гликопротеинами приблизительно 150000 дальтон, состоящими из двух идентичных легких (L) цепей и двух идентичных тяжелых (Н) цепей. Каждая легкая цепь связана с тяжелой цепью одной ковалентной дисульфидной связью, тогда как количество дисульфидных связей варьируется среди тяжелых цепей различных изотипов иммуноглобулинов. Каждая тяжелая и легкая цепь имеет также дисульфидные мостики внутри цепи на регулярных расстояниях друг от друга. Каждая тяжелая цепь имеет на одном конце вариабельный домен (VH), за которым следует ряд константных доменов. Каждая легкая цепь имеет вариабельный домен на одном конце (VL) и константный домен на ее другом конце; константный домен легкой цепи сопоставлен с первым константным доменом тяжелой цепи, а вариабельный домен легкой цепи сопоставлен с вариабельным доменом тяжелой цепи. Считается, что конкретные аминокислотные остатки образуют поверхность раздела между вариабельными доменами легкой цепи и тяжелой цепи.

Термин «константный домен» относится к участку молекулы иммуноглобулина, имеющему более консервативную аминокислотную последовательность по сравнению с другим участком данного иммуноглобулина, вариабельным доменом, который содержит антигенсвязывающий участок. Данный константный домен содержит домены C_H1, C_H2 и C_H3 (собирательно, CH) тяжелой цепи, и домен CHL (или CL) легкой цепи.

«Вариабельная область» или «вариабельный домен» антитела относится к амино-концевым доменам тяжелой или легкой цепи данного антитела. Вариабельный домен тяжелой цепи может называться «VH». Вариабельный домен легкой цепи может называться «VL». Эти домены в большинстве случаев представляют собой наиболее вариабельные части антитела, и содержат антигенсвязывающие участки.

Термин вариабельный относится к тому факту, что некоторые части вариабельных доменов в значительной степени различаются по их последовательности среди антител и используются в связывании и специфичности каждого конкретного антитела в отношении его конкретного антигена. Однако эта вариабельность не распределена равномерно по вариабельным доменам антител. Она сконцентрирована в трех сегментах, называемых гипервариабельными районами (HVR), в вариабельных доменах как легкой цепи, так и тяжелой цепи. Более высококонсервативные части вариабельных доменов называются каркасными районами (FR). Вариабельные домены нативных тяжелой и легкой цепей, каждый, содержат четыре FR, принимающих в значительной степени конфигурацию β-складки, соединенных тремя HVR, которые образуют петли, соединяющие, и в некоторых случаях, образующие часть этой β-структуры. Данные HVR в каждой цепи удерживаются вместе в тесной близости этими FR и с гипервариабельными районами из другой цепи, способствуют образованию антигенсвязывающего сайта антител (см. Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, (1991)). Константные домены не участвуют непосредственно в связывании антитела с антигеном, но проявляют различные эффекторные функции, такие как участие антитела в антителозависимой клеточноопосредованной цитотоксичности.

«Легкие цепи» антител (иммуноглобулинов) из любого вида позвоночного могут быть отнесены к одному из двух явно отличающихся типов, названных каппа (κ) и лямбда (λ), на основании аминокислотных последовательностей их константных доменов.

Используемый здесь термин «изотип» или «подкласс» IgG означает любой из подклассов иммуноглобулинов, определенных по химическим и антигенным характеристикам их константных областей.

В зависимости от аминокислотной последовательности константного домена их тяжелых цепей антитела могут быть отнесены к различным классам. Имеются пять основных классов интактных антител: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, и некоторые из них могут быть дополнительно разделены на подклассы (изотипы), например, IgG₁, IgG₂, IgG₃, IgG₄, IgA₁ и IgA₂. Константные домены тяжелой цепи, которые соответствуют этим различным классам антител, называют α, δ, ε, γ и µ соответственно. Субъединичные структуры и трехмерные конфигурации различных классов иммуноглобулинов хорошо известны и описаны в целом у, например, Abbas et al. Cellular and Mol. Immunology, 4th ed. (W.B. Saunders, Co., 2000). Антитело может представлять собой часть более крупной слитой молекулы, образованной в результате ковалентного или нековалентного соединения данного антитела с одним или несколькими другими белками или пептидами.

Термины «полноразмерное антитело», «интактное антитело» и «цельное антитело» используются здесь взаимозаменяемо для обозначения антитела в его по существу интактной форме, не фрагментов антитела, как определено далее. Данные термины в частности относятся к антителу с тяжелыми цепями, которые содержат область Fc.

«Несвязанное антитело», в целях данного изобретения, представляет собой антитело, которое не конъюгировано с цитотоксической частью молекулы или радиоактивной меткой.

«Фрагменты антител» содержат часть интактного антитела, предпочтительно содержащую его область связывания антигена. Примеры фрагментов антител включают фрагменты Fab, Fab’, F(ab’)₂ и Fv; диатела; линейные антитела; одноцепочечные молекулы антител и мультиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител.

Расщепление папаином антител обеспечивает два идентичных антигенсвязывающих фрагмента, называемых «Fab»-фрагментами, каждый из которых имеет единственный антигенсвязывающий участок, и остальной «Fc»-фрагмент, название которого отражает его способность легко кристаллизоваться. Обработка пепсином обеспечивает F(ab’)₂-фрагмент, который имеет два антигенсвязывающих участка и все еще способен перекрестно связывать антиген.

«Fv» представляет собой минимальный фрагмент антитела, который содержит полный антигенсвязывающий участок. В одном варианте осуществления двухцепочечные виды Fv состоят из димера одного вариабельного домена тяжелой цепи и одного вариабельного домена легкой цепи, находящихся в прочной нековалентной связи. В одноцепочечных Fv (scFv) видах, один вариабельный домен тяжелой цепи и один вариабельный домен легкой цепи могут быть ковалентно связаны посредством гибкого пептидного линкера, так что данные легкая и тяжелая цепи могут быть соединены в аналог «димерной» структуры таковой для двухцепочечных Fv видов. Именно в этой конфигурации данные три HVR каждого вариабельного домена взаимодействуют для определения антигенсвязывающего участка на поверхности VH-VL-димера. Вместе эти шесть HVR сообщают антигенсвязывающую специфичность антителу. Однако даже единственный вариабельный домен (или половина Fv, содержащая только три HVR, специфических в отношении антигена) способен узнавать и связывать антиген, хотя и при более низкой аффинности, чем полный сайт связывания.

Фрагмент Fab содержит вариабельные домены тяжелой и легкой цепей, и также содержит константный домен данной легкой цепи и первый константный домен (CH1) данной тяжелой цепи. Fab’-фрагменты отличаются от Fab-фрагментов добавлением нескольких остатков к карбоксильному концу тяжелой цепи СН1 домена, включая один или несколько остатков цистеина из шарнирной области антитела. Fab’-SH является здесь обозначением Fab’, в котором остаток (остатки) цистеина константных доменов несут свободную тиоловую группу. Фрагменты антитела F(ab’)₂ первоначально были получены в виде пары Fab’-фрагментов, между которыми имеются цистеины шарнирной области. Известны также другие химические сочетания фрагментов антител.

«Одноцепочечные Fv» или «scFv»-фрагменты антител содержат VH- и VL-домены антитела, где эти домены присутствуют в единой полипептидной цепи. Как правило, данный scFv-полипептид дополнительно содержит полипептидный линкер между доменами VH и VL, который позволяет scFv образовывать желаемую структуру для связывания антигена. Для обзора scFv см., например, Pluckthün в The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, 1994). pp. 269-315.

Термин «диатела» относится к фрагментам антител с двумя антигенсвязывающими сайтами, причем эти фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи (VH), соединенный с вариабельным доменом легкой цепи (VL) в одной и той же полипептидной цепи (VH-VL). С использованием линкера, который является слишком коротким, чтобы позволить образование пар между этими двумя доменами на одной и той же цепи, эти домены вынуждены образовывать пары с комплементарными доменами другой цепи и создавать два антигенсвязывающих участка. Диатела могут быть бивалентными или биспецифическими. Диатела описаны более полно, например, в ЕР 404097; WO 1993/11161; Hudson et al., Nat. Med. 9: 129-134 (2003); и Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993). Тритела и тетратела также описаны у Hudson et al., Nat. Med. 9: 129-134 (2003).

Используемый здесь термин «моноклональное антитело» относится к антителу, получаемому из популяции практически гомогенных антител, т.е. составляющие популяцию отдельные антитела одинаковы, за исключением возможных мутаций, например, встречающихся в природе мутаций, которые могут присутствовать в незначительных количествах. Таким образом, определение «моноклональный» указывает на природу данного антитела, не являющегося смесью отдельных антител. В некоторых вариантах осуществления такое моноклональное антитело обычно содержит полипептидную последовательность, которая связывает мишень, где данная связывающаяся с мишенью полипептидная последовательность была получена в результате процесса, включающего отбор единственной связывающейся с мишенью полипептидной последовательности из множества полипептидных последовательностей. Например, данный процесс отбора может представлять собой отбор уникального клона из множества клонов, таких как пул гибридомных клонов, фаговые клоны или клоны рекомбинантной ДНК. Следует понимать, что отобранная последовательность, связывающая мишень, может быть дополнительно изменена, например, для улучшения аффинности к мишени, для гуманизации данной последовательности, связывающей мишень, для улучшения ее продукции в клеточной культуре, для снижения ее иммуногенности in vivo, для получения мультиспецифичного антитела, и тому подобного, и что антитело, содержащее данную измененную последовательность, связывающую мишень, также представляет собой моноклональное антитело по данному изобретению. В отличие от составов поликлональных антител, которые обычно включают различные антитела, направленные против различных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело в составе моноклонального антитела направлено против единственной детерминанты на антигене. В дополнение к их специфичности, составы моноклональных антител имеют преимущество, заключающееся в том, что они, как правило, не загрязнены другими иммуноглобулинами.

Определение «моноклональное» указывает на характер этого антитела, как полученного из по существу гомогенной популяции антител, и не должно расцениваться как требующее получения этого антитела каким-либо конкретным способом. Например, моноклональные антитела для применения в соответствии с данным изобретением могут быть получены различными способами, включающими, например, гибридомный метод (например, Kohler and Milstein, Nature, 256: 495-97 (1975); Hongo et al., Hybridoma, 14 (3): 253-260 (1995), Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual., (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)), методы рекомбинантных ДНК (см., например, Патент США № 4816567), методы фагового дисплея (см., например, Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol Biol 222: 581-597 (1992); Sidhu et al., J. Mol Biol 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol Biol 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); and Lee et al., J. Immunol Methods 284(1-2): 119-132(2004), и методы получения человеческих или подобных человеческим антител у животных, которые имеют локусы части или всех иммуноглобулинов человека или гены, кодирующие последовательности иммуноглобулина человека (см., например, WO 1998/24893; WO 1996/34096; WO 1996/33735; WO 1991/10741; Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature 362: 255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immunol. 7: 33 (1993); Патенты США №№ 5545807; 5545806; 5569825; 5625126; 5633425; и 5661016; Marks et al., Bio/Technology 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368: 812-813 (1994); Fishwiid et al., Nature Biotechnol. 14: 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnol. 14: 826 (1996); и Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995).

В данном изобретении, моноклональные антитела в частности включают «химерные» антитела, в которых часть тяжелой и/или легкой цепи совпадает с или гомологична соответствующим последовательностям в антителах, получаемых из конкретных видов или принадлежащих конкретному классу или подклассу антител, тогда как остальная часть цепи(ей) совпадает с или гомологична соответствующим последовательностям в антителах, получаемых из других видов или принадлежащих другому классу или подклассу антител, а также включают фрагменты таких антител при условии, что они проявляют желаемую биологическую активность(см., например, Патент США № 4816567; и Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855 (1984)). Химерные антитела включают антитела PRIMATIZED®, в которых антигенсвязывающий участок данного антитела получен из антитела, выработанного, например, у макак, иммунизированных представляющим интерес антигеном.

«Гуманизированные» формы не принадлежащих человеку (например, мышиных) антител представляют собой химерные антитела, которые содержат минимальную последовательность, происходящую из не принадлежащего человеку иммуноглобулина. В одном варианте осуществления гуманизированное антитело представляет собой иммуноглобулин человека (антитело-реципиент), в котором остатки HVR данного реципиента заменены остатками HVR из не относящихся к человеку видов (антитело-донор), таких как мышь, крыса, кролик или не являющийся человеком примат, имеющие желаемую специфичность, аффинность и/или емкость. В некоторых случаях остатки FR иммуноглобулина человека заменены соответствующими не принадлежащими человеку остатками. Кроме того, гуманизированные антитела могут содержать остатки, не встречающиеся в антителе-реципиенте или антителе-доноре. Эти модификации могут быть осуществлены для дополнительного улучшения рабочих характеристик антитела. Как правило, гуманизированное антитело содержит практически все из, по меньшей мере, одного, а, как правило, двух вариабельных доменов, в которых все или практически все, гипервариабельные петли соответствуют таковым из не принадлежащего человеку иммуноглобулина, а все или практически все, FR представляют собой таковые из последовательности иммуноглобулина человека. Также гуманизированное антитело необязательно содержит, по меньшей мере, часть константной области иммуноглобулина (Fc), как правило, иммуноглобулина человека. Для дополнительных подробностей см., например, Jones et al., Nature 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332: 323-329 (1988); и Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596 (1992). Также см., например, Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1: 105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23: 1035-1038 (1995); Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5: 428-433 (1994); и Патенты США №№ 6982321 и 7087409.

«Антитело человека» представляет собой антитело, обладающее аминокислотной последовательностью, которая соответствует таковой антитела, вырабатываемого у человека, и/или полученного с использованием любого способа получения антител человека, как описано здесь. Это определение атитела человека в частности исключает гуманизированные антитела, содержащие антигенсвязывающие остатки, не принадлежащие человеку. Антитела человека можно получить, используя различные способы, известные в данной области, в том числе библиотеки фаговых дисплеев. Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581 (1991). Также для получения моноклональных антител человека доступны способы, описанные у Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner et al., J. Immunol, 147(l): 86-95 (1991). Также см. van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol, 5: 368-74 (2001). Антитела человека можно получить посредством введения антигена трансгенным животным, которые были модифицированы для производства таких антител в ответ на введение антигена, но чьи эндогенные локусы были отключены, например, иммунизированные ксеномыши (см., например, Патенты США №№ 6075181 и 6150584, относительно технологии XENOMOUSE™). Также см., например, Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103: 3557-3562 (2006) относительно антител человека, выработанных с помощью технологии гибридом В-клеток человека.

«Видо-зависимое антитело» представляет собой антитело, которое имеет более сильную аффинность связывания к антигену от первого биологического вида млекопитающего, чем оно имеет к гомологу такого антигена от второго биологического вида млекопитающего. Обычно видо-зависимое антитело «связывается специфически» с антигеном человека (например, имеет значение аффинности связывания (Kd) не более чем приблизительно 1×10^-7 M, предпочтительно, не более чем приблизительно 1×10^-8 M и предпочтительно, не более чем приблизительно 1×10^-9 M), но имеет аффинность связывания с гомологом данного антигена от второго вида млекопитающего, не являющегося человеком, которая, по меньшей мере, приблизительно в 50 раз или, по меньшей мере, приблизительно в 500 раз или, по меньшей мере, приблизительно в 1000 раз слабее, чем его аффинность связывания с данным антигеном человека. Видозависимое антитело может быть любым из множества типов антител, как определено выше, но предпочтительно представляет собой гуманизированное антитело или антитело человека.

Используемый здесь термин «гипервариабельный участок», «HVR» или «HV», относится к участкам вариабельного домена антитела, которые гипервариабельны в последовательности и/или формируют структурно определенные петли. В большинстве случаев, антитела содержат шесть HVR; три в VH (H1, H2, H3), и три в VL (L1, L2, L3). В нативных антителах, Н3 и L3 демонстрируют наибольшее разнообразие среди данных шести HVR, и, как полагают, Н3, в частности, играет уникальную роль в присвоении тонкой специфичности антителам. См., например, Xu et al., Immunity 13: 37-45 (2000); Johnson and Wu, in Methods in Molecular Biology 248: 1-25 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003). В действительности, природные камелидные антитела, содержащие только тяжелую цепь, являются функциональными и стабильными в отсутствии легкой цепи. См., например, Hamers-Casterman et al., Nature 363: 446-448 (1993); Sheriff et al., Nature Struct. Biol. 3: 733-736 (1996).

Целый ряд определений HVR используется и охвачен здесь. Классификация гипервариабельных участков (CDR) по Kabat основана на вариабельности последовательностей, и используется чаще всего (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Вместо этого, классификация по Chothia относится, к местоположению структурных петель (Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196: 901- 917 (1987)). AbM HVR представляют собой компромисс между HVR по Kabat и структурными петлями по Chothia, и используются программным обеспечением для моделирования антител Oxford Molecular’s AbM antibody modeling. «Контактные» HVR основаны на анализе доступных комплексных кристаллических структур. Остатки каждого из этих HVR указаны ниже.

HVR могут содержать «протяженные HVR», как следующие: 24-36 или 24-34 (L1), 46-56 или 50-56 (L2) и 89-97 или 89-96 (L3) в VL, и 26-35 (H1), 50-65 или 49-65 (H2) и 93- 102, 94-102 или 95-102 (H3) в VH. Остатки вариабельно домена пронумерованы в соответствии с Kabat et al., supra, для каждого их этих определений.

Остатки «каркасной области» или «FR» представляют собой те остатки вариабельного домена, которые отличаются от остатков HVR, как определено здесь.

Термины «нумерация остатков вариабельного домена по Kabat» или «нумерация аминокислотной позиции по Kabat», и их вариации, относятся к системе нумерации, используемой для вариабельных доменов тяжелой цепи или вариабельных доменов легкой цепи в обобщенных данных об антителах у Kabat et al., supra. Используя эту систему нумерации, фактическая линейная аминокислотная последовательность может содержать меньшее количество или дополнительные аминокислоты, представляя собой укорочение в или вставки в, FR или HVR данного вариабельного домена. Например, вариабельный домен тяжелой цепи может включать вставку одной аминокислоты (остаток 52а в соответствии с Kabat) после остатка 52 в Н2, и встроенные остатки (например, остатки 82a, 82b, и 82c, и тому подобное, в соответствии с Kabat) после остатка 82 в FR тяжелой цепи. Нумерация остатков по Kabat может быть определена для данного антитела посредством выравнивания областей гомологии последовательности данного антитела со «стандартной» последовательностью, пронумерованной по Kabat.

Система нумерации по Kabat обычно применяется в отношении остатков в вариабельном домене (приблизительно остатки 1-107 в легкой цепи и остатки 1-113 в тяжелой цепи) (например, Kabat et al., Sequences of Immunological Interest. 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). «Система нумерации EU» или «индекс EU» обычно применяется в отношении остатка в константной области тяжелой цепи иммуноглобулина (например, индекс EU, представленный у Kabat et al., supra). «Индекс EU по Kabat» относится к нумерации остатков в антителе IgG1 EU человека.

Выражение «линейные антитела» относится к антителам, описанным у Zapata et al. (1995 Protein Eng, 8(10): 1057-1062). Вкратце, эти антитела содержат пару тандемных сегментов Fd (VH-CH1-VH-CH1), которые, вместе с комлементарными полипептидами легкой цепи, формируют пары антигенсвязывающих областей. Линейные антитела могут быть биспецифическими или моноспецифическими.

Используемый здесь термин «библиотека» относится к множеству последовательностей антител или фрагментов антител (например, полипептиды по данному изобретению), или нуклеиновых кислот, кодирующих эти последовательности, последовательностей, отличающихся комбинацией вариантов аминокислот, которые встроены в эти последовательности в соответствии методам по данному изобретению.

«Фаговый дисплей» представляет собой способ, с помощью которого варианты полипептидов представлены в виде слитых белков с, по меньшей мере, частью белка оболочки на поверхности фага, например, нитевидный фаг, частицы. Утилитарность фагового дисплея заключается в том факте, что большие библиотеки рандомизированных белковых вариантов могут быть быстро и эффективно рассортированы для тех последовательностей, которые связывают антиген-мишень с высокой аффинностью. Дисплей пептидных или белковых библиотек на фаге использовали для скрининга миллионов полипептидов для выявления тех, которые обладают свойствами специфического связывания. Методы поливалентных фаговых дисплеев использовали для обнаружения малых рандомных пептидов и малых белков посредством слияния либо с геном III, либо с геном VIII нитевидного фага. Wells and Lowman (1992) Curr. Opin. Struct. Biol. 3: 355-362, и справочная литература, процитированная там. В моновалентном фаговом дисплее белковая или пептидная библиотека слита с геном III или его частью, и экспрессируется на низких уровнях в присутствии белка гена III дикого типа, так что фаговые частицы отображают одну копию или ни одной, данных слитых белков. Эффекты авидности снижены по сравнению с поливалентным фагом, так что сортировка происходит на основе внутренней авидности лиганда, и используются фагемидные векторы, которые облегчают манипуляции с ДНК. Lowman and Wells (1991) Methods: A companion to Methods in Enzymology 3: 205-0216.

«Фагемид» представляет собой плазмидный вектор, имеющий бактериальную точку начала репликации, например, Co1E1, и копию межгенной области бактериофага. Фагемид можно использовать на любом известном бактериофаге, включая нитевидные бактериофаги и лямбдообразные бактериофаги. Данная плазмида, в большинстве случаев, также содержит селектируемый маркер устойчивости к антибиотику. Сегменты ДНК, клонированной в эти векторы, могут быть размножены в виде плазмид. Когда клетки, несущие эти векторы, обеспечены всеми генами, необходимыми для производства фаговых частиц, характер репликации изменяется на репликацию по механизму катящегося колеса, для выработки копий одной цепи плазмидной ДНК и упаковки фаговых частиц. Фагемид может формировать инфекционные и неинфекционные фаговые частицы. Этот термин включает фагемиды, которые содержат ген белка оболочки фага или его фрагмент, связанный с геном гетерологичного полипептида в виде генного слияния, так что данный гетерологичный полипептид представлен на поверхности данной фаговой частицы.

II. Способы осуществления данного изобретения

Данное изобретение относится к стабильному водному составу, содержащему антитело. Данное антитело в данном составе получено с использованием доступных в данной области способов получения антител, иллюстративные способы описаны более подробно в последующих разделах.

Данное антитело нацелено против представляющего интерес антигена. Предпочтительно данный антиген представляет собой биологически важный полипептид, и введение данного антитела в организм млекопитающего, страдающего заболеванием, может привести в результате к терапевтической пользе для данного млекопитающего. Тем не менее, также рассматриваются антитела, направленные против неполипептидных антигенов.

В случае когда антиген представляет собой полипептид, он может быть трансмембранной молекулой (например, рецептор) или лигандом, например фактор роста. Примеры антигенов включают молекулы, такие как фактор роста эндотелия сосудов (VEGF); ox-LDL; ox-ApoB100; ренин; гормон роста, в том числе гормон роста человека и гормон роста крупного рогатого скота; фактор, стимулирующий выделение гормона роста; паратиреоидный гормон; тиреостимулирующий гормон; липопротеины; алфа-1-антитрипсин; А-цепь инсулина; В-цепь инсулина; проинсулин; фолликулостимулирующий гормон; кальцитонин; лютеинизирующий гормон; глюкагон; факторы свертывания крови, такие как фактор VIIIC, фактор IX, тканевой фактор, и фактор Виллебранда; противосвертывающие факторы, такие как Протеин С; предсердный натрийуретический фактор; поверхностно-активное вещество легких; активатор плазминогена, такой как урокиназа или мочевой или тканевой активатор плазминогена (t-PA) человека; бомбезин; тромбин; гемопоэтический фактор роста; фактор некроза опухоли -альфа и -бета; энкефалиназа; RANTES (хемокин, выделяемый Т-клетками при активации); воспалительный белок макрофагов человека (MIP-1 -альфа); сывороточный альбумин, такой как сывороточный альбумин человека; Мюллеров ингибирующий фактор; А-цепь релаксина; В-цепь релаксина; прорелаксин; гонадотропин-ассоциированный пептид мыши; микробный белок, такой как бета-лактамаза; ДНКаза; IgE; цитотоксический Т-лимфоцит ассоциированный антиген (CTLA), такой как CTLA-4; ингибин; активин; рецепторы гормонов или факторов роста; белок A или D; ревматоидные факторы; нейротрофический фактор, такой как нейротрофический фактор, выделенный из головного мозга (BDNF), нейротрофин-3, -4, -5 или -6 (NT-3, NT4, NT-5 или NT-6), или фактор роста нервов, такой как NGF-β; тромбоцитарный фактор роста (PDGF); фактор роста фибробластов, такой как aFGF и bFGF; эпидермальный фактор роста (EGF); трансформирующий фактор роста (TGF), такой как TGF-альфа и TGF-бета, в том числе TGF-β 1, TGF-β 2, TGF-β 3, TGF-β 4 или TGF-β 5; инсулиноподобный фактор роста-I и -II (IGF-I и IGF-II); des(1-3)-IGF-I (мозговой IGF-I), белки, связывающие инсулиноподобный фактор роста; CD-белки, такие как CD3, CD4, CD8, CD19 и CD20; эритропоэтин; остеоиндуктивные факторы; иммунотоксины; костный морфогенетический белок (BMP); интерферон, такой как интерферон-альфа, -бета, и -гамма; колониестимулирующие факторы (CSF), например, M-CSF, GM-CSF, и G-CSF; интерлейкины (IL), например, с IL-1 по IL-10; супероксиддисмутаза; рецепторы T-клетки; поверхностные мембранные белки; комплементзависимый стимулятор гемолиза; вирусный антиген, такой как, например, часть оболочки вируса СПИД; транспортные белки; «хоминг»-рецепторы; аддрессины; регуляторные белки; интегрины, такие как CD11a, CD11b, CD11c, CD18, ICAM, VLA-4 и VCAM; опухолевый специфический антиген, такой как рецептор HER2, HER3 или HER4; и фрагменты любого из вышеперечисленных полипептидов.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения молекулярные мишени для антител, охваченные данным изобретением, включают VEGF. В одном варианте осуществления, данное антитело представляет собой антитело, которое связывается с VEGF человека.

A. Получение данного состава

После получения представляющего интерес антитела (например, способы получения антител, с которыми можно разработать рецептуру, как раскрыто здесь, будут разъяснены ниже, и известны в данной области), фармацевтический состав, содержащий его, готов. В некоторых вариантах осуществления, данное антитело, с которым разрабатывается рецептура, не подвергается предварительной лиофилизации, и представляющий здесь интерес состав является водным составом. В некоторых вариантах осуществления данное антитело представляет собой полноразмерное антитело. В одном варианте осуществления данное антитело в данном составе представляет собой фрагмент антитела, такой как F(ab’)₂, и в этом случае возможно придется решать проблемы, которые могут не проявиться для полноразмерного антитела (например, клипинг данного антитела с Fab). Терапевтически эффективное количество антитела, представленного в данной композиции, определено с учетом требуемого объема дозы и способа(способов) введения, например. Типичные концентрации антитела в данном составе составляют от приблизительно 0,1 мг/мл до приблизительно 250 мг/мл, или от приблизительно 10 мг/мл до приблизительно 200 мг/мл, или от приблизительно 50 мг/мл до приблизительно 175 мг/мл.

Получен водный состав, содержащий данное антитело в рН-забуференном растворе. Буфер по этому изобретению имеет значение рН в диапазоне от приблизительно 4,0 до приблизительно 6,5. В некоторых вариантах осуществления значение рН находится в диапазоне pH 4,25-6,25, или в диапазоне pH 4,5-6,0, или в диапазоне pH 4,75-5,75, или в диапазоне pH 5,0-5,5, или в диапазоне pH 5,1-5,4. В некоторых вариантах осуществления данного изобретения данный состав имеет значение рН 5,2, или около 5,2. Примеры буферов, которые будут контролировать значение рН в пределах этого диапазона, включают ацетат (например аргинин ацетат или натрий ацетат), сукцинат (например, аргинин сукцинат или натрий сукцинат), глюконат, цитрат или любые другие буферы органических кислот и их комбинации. Концентрация данного буфера может быть от приблизительно 1 мМ до приблизительно 600 мМ, в зависимости, например, от данного буфера и необходимой изотоничности данного состава. В некоторых вариантах осуществления данный буфер содержит аргинин в концентрации от 50 мМ до 500 мМ, 75 мМ-400 мМ, 100 мМ-250 мМ, 120 мМ-240 мМ, 150 мМ-225 мМ, или 175 мМ-210 мМ. В некоторых вариантах осуществления данный буфер содержит аргинин в концентрации 200 мМ или приблизительно 200 мМ. В одном варианте осуществления данный буфер представляет собой аргинин ацетат (например, 200 мМ или приблизительно 200 мМ), рН 5,2.

В данный состав, содержащий антитело, при необходимости может быть добавлено поверхностно-активное вещество. Примеры поверхностно-активных веществ включают неионные поверхностно-активные вещества, такие как полисорбаты (например, полисорбаты 20, 80, и тому подобное) или полоксамеры (например, полоксамер 188). Количество добавленного поверхностно-активного вещества таково, что он снижает агрегацию сформулированного антитела и/или сводит к минимуму образование частиц в данном составе и/или снижает абсорбцию. Например, данное поверхностно-активное вещество может присутствовать в данном составе в количестве от приблизительно 0,001% до приблизительно 0,5%, от приблизительно 0,005% до приблизительно 0,2%, от приблизительно 0,01% до приблизительно 0,1%, или от приблизительно 0,02% до приблизительно 0,06%, или от приблизительно 0,03% до приблизительно 0,05%. В некоторых вариантах осуществления данное поверхностно-активное вещество присутствует в данном составе в количестве 0,04% или приблизительно 0,04%. В одном варианте осущетвления, данный состав не содержит поверхностно-активное вещество.

В одном варианте осуществления данный состав содержит определенные выше агенты (например, антитело, буфер и/или поверхностно-активное вещество) и по существу свободен от одного или нескольких консервантов, таких как бензиловый спирт, фенол, m-крезол, хлорбутанол или бензетоний Cl. В другом варианте осуществления консервант может быть включен в состав данного состава, в особенности, если этот состав представляет собой многодозовый состав. Концентрация консерванта может быть в диапазоне от приблизительно 0,1% до приблизительно 2%, предпочтительно от приблизительно 0,5% до приблизительно 1%. Один или несколько других фармацевтически приемлемых носителей, инертных наполнителей или стабилизирующих веществ, таких как описаны в Remington’s Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980), могут быть включены в состав данного состава, при условии, что они не оказывают нежелательного влияния на необходимые характеристики данного состава. Приемлемые носители, наполнители или стабилизаторы являются нетоксичными для реципиентов в используемых дозах и концентрациях, и включают дополнительные буферные вещества; вспомогательные растворители; антиоксиданты, в том числе аскорбиновую кислоту и метионин; хелатирующие агенты, такие как ЭДТА; комплексные соединения металлов (например, комплексы Zn-белок); биоразлагаемые полимеры, такие как полиэстеры; и/или солеобразующие противоионы. Примеры фармацевтически приемлемых носителей дополнительно включают интерстециальные диспергаторы лекарственных средств, такие как растворимые нейтрально-активные гликопротеины гиалуронидазы (sHASEGP), например, растворимые гликопротеины гиалуронидазы РН-20 человека, такой как rHuPH20 (HYLENEX®, Baxter International., Inc.). Некоторые примеры sHASEGP и способы применения, в том числе rHuPH20, описаны в Публикациях Патентов США №№ 2005/0260186 и 2006/0104968. В одном аспекте, sHASEGP находится в сочетании с одним или несколькими дополнительными гликозаминогликанами, такими как хондроитиназы.

Несмотря на то, что различные описания хелатирующих агентов здесь обычно сфокусированы на ЭДТА, следует учитывать, что другие хелаторы ионов металла также охвачены данным изобретением. Хелаторы ионов металлов хорошо известны специалисту в данной области, и включают, но необязательно ограничены ими, аминополикарбоксилаты, ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота), EGTA (этиленгликоль-бис-(бета-аминоэтиловый эфир)-N,N,N’,N’-тетрауксусная кислота), NTA (нитрилтриуксусная кислота), EDDS (этилендиамин дисукцинат), PDTA (1,3-пропилдендиаминтетрауксусная кислота), DTPA (диэтилентриаминпентауксусная кислота), ADA (бета-аланиндиуксусная кислота), MGCA (метилглициндиуксусная кислота), и тому подобное. Кроме того, некоторые варианты осуществления включают хелаторы фосфонатов/фосфоновой кислоты.

Данный состав также может содержать более одного белка, необходимого для конкретного показания для лечения, предпочтительно такие, которые имеют комплементарные действия, что не оказывает негативного влияния на другой белок. Например, если данное антитело является анти-VEGF, оно может быть объединено с другим агентом (например, химиотерапевтическим агентом, анти-неопластическим агентом и анти-ангиогенными агентами).

Составы, предназначенные для применения in vivo, должны быть стерильными. Это легко обеспечить посредством фильтрования через стерильные фильтрующие мембраны, перед, или после приготовления данного состава.

B. Применение данного состава

Данный состав вводится в организм млекопитающего, нуждающегося в лечении антителом, предпочтительно человека, в соответствии с известными способами, такими как внутривенное введение в виде болюса или посредством непрерывного вливания в течение периода времени, внутримышечное введение, внутрибрюшинное введение, внутриспинномозговое введение, подкожное введение, внутрисуставное введение, интрасиновиальное введение, подоболочечное введение, пероральное введение, местное введение или ингаляционный путь введения. В одном варианте осуществления данный состав вводится в организм млекопитающего посредством внутривенного введения. Для таких целей, данный состав можно инъецировать с помощью шприца, или с помощью капельницы, например. В одном варианте осуществления данный состав вводят в организм млекопитающего посредством подкожного введения.

Подходящая доза («терапевтически эффективное количество») данного антитела будет зависеть, например, от подвергающегося лечению состояния, тяжести и течения данного состояния, того, вводится ли данное антитело в профилактических или терапевтических целях, предыдущей терапии, истории болезни данного пациента и реакции на данное антитело, типа применяемого антитела, и усмотрения лечащего врача. Данное антитело подходит для введения в организм пациента однократно или в течение курса лечения, и может быть введено в организм данного пациента в любое время с момента постановки диагноза. Данное антитело может вводиться в качестве монотерапии или в сочетании с другими лекарственными средствами или методами лечения, используемыми для лечения данного состояния.

В качестве общей нормы, данное терапевтически эффективное количество вводимого антитела будет находиться в диапазоне от приблизительно 0,1 до приблизительно 50 мг/кг массы тела пациента, либо однократно, либо в несколько введений, с обычным диапазоном для используемого антитела от приблизительно 0,3 до приблизительно 20 мг/кг, предпочтительно от приблизительно 0,3 до приблизительно 15 мг/кг, ежедневное введение, например. Тем не менее, могут применяться другие режимы дозировки. В одном варианте осуществления данный антагонист представляет собой анти-VEGF антитело, которое вводится в дозе приблизительно 100 или 400 мг каждые 1, 2, 3 или 4 недели, или вводится в дозе приблизительно 1, 3, 5, 7,5, 10, 15 или 20 мг/кг каждые 1, 2, 3 или 4 недели. Данная доза может вводиться как однократная доза или многократная доза (например, 2 или 3 дозы), например в виде вливаний. Прогресс этой терапии легко отслеживать с помощью обычных методов.

C. Получение антитела

(i) Получение антигена

Растворимые антигены или их фрагменты, необязательно соединенные с другими молекулами, могут быть использованы в качестве иммуногенов для выработки антител. Для трансмембранных молекул, таких как рецепторы, фрагменты их (например, внеклеточный домен рецептора) могут быть использованы в качестве данного иммуногена. Альтернативно, клетки, экспрессирующие данную трансмембранную молекулу, могут быть использованы в качестве данного иммуногена. Такие клетки могут быть получены из природного источника (например, линии раковых клеток), или могут представлять собой клетки, которые были трансформированы с помощью рекомбинантных технологий, чтобы экспрессировать данную трансмембранную молекулу. Другие антигены и их формы, пригодные для получения антител, будут очевидны специалисту в данной области.

(ii) Некоторые способы, основанные на использовании антител

Поликлональные антитела предпочтительно наращивают у животных посредством многократных подкожных (п/к) или внутрибрюшинных (в/б) инъекций релевантного антигена и адъюванта. Возможно, будет полезным соединение данного релевантного антигена с белком, который является иммуногенным по отношению к тем видам животных, которые подвергаются иммунизации, например с гемоцианином лимфы улитки, сывороточным альбумином, тиреоглобулином крупного рогатого скота или ингибитором трипсина соевых бобов при использовании бифункционального или дериватизирующего агента, такого как сложный эфир малеимидобензоил сульфосукцинимида (конъюгация происходит посредством цистеиновых остатков), N-гидроксисукцинимид (конъюгация происходит посредством остатков лизина), глутаральдегид, ангидрид янтарной кислоты, SOCl₂, R¹N=C=NR, где R и R¹ представляют собой различные алкильные группы.

Иммунизацию животных проводят с использованием антигена, иммуногенных конъюгатов или их производных, объединяя, например, 100 мкг или 5 мкг белка или конъюгата (для кроликов или мышей соответственно) с 3 объемами полного адъюванта Фрейнда, и осуществляя инъекции полученного раствора внутрикожно в различные участки тела. Через один месяц животных подвергают бустер-иммунизации с использованием 1/5-1/10 исходного количества пептида или конъюгата в полном адъюванте Фрейнда посредством подкожных инъекций в различные участки. Через 7-14 дней осуществляют забор крови у животных и определяют титр антител в полученной сыворотке. Животных подвергают бустер-иммунизации до тех пор, пока титр антител не выйдет на плато. Предпочтительно животных подвергают бустер-иммунизации конъюгатом того же самого антигена, но конъюгированного с другим белком и/или при использовании другого перекрестно-связывающего агента. Конъюгаты также могут быть получены с помощью культуры рекомбинантных клеток в виде слитых белков. Кроме того, для усиления иммунного ответа могут быть использованы агенты, способствующие агрегации, например алюминиевые квасцы.

Моноклональные антитела по данному изобретению могут быть получены с использованием гибридомного способа, впервые описанного у Kohler et al., Nature, 256: 495 (1975), и дополнительно описанного, например, у Hongo et al., Hybridoma, 14 (3): 253-260 (1995), Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual., (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling et al., в: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981), и Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4): 265-268 (2006) в отношении гибридом человек-человек. Дополнительные способы включают те, которые описаны, например, в Патенте США № 7189826 в отношении получения естественных моноклональных антител IgM человека из гибридомных клеточных линий. Метод гибридомы человека (метод Trioma) описан у Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3): 927-937 (2005) и Vollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3): 185-91 (2005).

Различные другие методы гибридом см., например, в США 2006/258841; США 2006/183887 (полностью человеческие антитела), США 2006/059575; США 2005/287149; США 2005/100546; США 2005/026229; и Патенты США №№ 7078492 и 7153507. Примерный протокол получения моноклональных антител с использованием гибридомного способа, описан следующим образом. В одном варианте осуществления, мышь или другое подходящее животное-хозяин, например, хомяка, иммунизируют для того, чтобы вызвать генерацию лимфоцитов, продуцирующих или способных продуцировать антитела, которые специфическим образом связываются с белком, используемым для иммунизации. Антитела наращивают у животных посредством множественных подкожных (п/к) или внутрибрюшинных (в/б) инъекций пептида по данному изобретению или его фрагмента, и адъюванта, такого как монофосфорил липид А (MPL)/трегалоза дикриномиколат (TDM) (Ribi Immunochem. Research, Inc., Hamilton, MT). Полипептид по данному изобретению (например, антиген) или его фрагмент, может быть получен с использованием способов, хорошо известных в данной области, таких как рекомбинантные способы, некоторые из которых дополнительно описаны здесь. Сыворотку крови иммунизированных животных исследуют на присутствие анти-антиген антител, и при необходимости осуществляются бустер-иммунизации. Выделяют лимфоциты животных, вырабатывающих анти-антиген антитела. Альтернативно, лимфоциты могут быть иммунизированы in vitro.

Затем лимфоциты сливают с клетками миеломы при использовании подходящего агента для слияния, такого как полиэтиленгликоль, с получением клеток гибридомы. См., например, Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986). Могут быть использованы клетки миеломы, которые подлежат эффективному слиянию, поддерживают стабильно высокий уровень выработки антитела отобранными антитело-продуцирующими клетками, и являются чувствительными к такой среде, как среда НАТ. Примеры миеломных клеток включают, но не ограничиваются ими, линии миеломы мыши, например, происходящие из опухолей мышей MOPC-21 и MPC-11, которые могут быть получены в центре распределения клеток Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California USA, и клетки SP-2 или X63-Ag8-653, доступные в Американской коллекции типовых культур, Rockville, Maryland USA. Клеточные линии миеломы человека и гетеромиеломные клеточные линии мышь-человек, также были описаны для производства моноклональных антител человека (Kozbor, J. Immunol, 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)).

Полученные таким образом гибридомные клетки высевают и выращивают в подходящей культуральной среде, например, среде, которая содержит одно или более соединений, ингибирующих рост или выживаемость неслитых, родительских клеток миеломы. Например, если родительские клетки миеломы утратили способность синтеза фермента гипоксантин гуанин фосфорибозилтрансферазы (HGPRT или HPRT), в культуральную среду для роста гибридомных клеток обычно добавляют гипоксантин, аминоптерин и тимидин (среда HAT), которые препятствуют росту клеток, дефицитных по HGPRT. Предпочтительно способы бессывороточной культуры гибридомных клеток используют для сокращения применения сыворотки, полученной из крови животных, например, эмбриональной бычьей сыворотки, как описано, например, у Even et al., Trends in Biotechnology, 24(3), 105-108 (2006).

Олигопептиды в качестве средств повышения продуктивности культур гибридомных клеток, описаны у Franek, Trends in Monoclonal Antibody Research, 111-122 (2005). В частности, стандартную культуральную среду обогащают некоторыми аминокислотами (аланин, серин, аспарагин, пролин) или фракциями белкового гидролизата, и апоптоз может быть в значительной степени подавлен синтетическими олигопептидами, состоящими из от трех до шести аминокислотных остатков. Данные пептиды представлены в миллимолярных или более высокого порядка, концентрациях.

Культуральная среда, в которой выращивались гибридомные клетки, может быть исследована на наличие моноклональных антител, которые связываются с антителом по данному изобретению. Специфичность связывания моноклональных антител, продуцируемых клетками гибридомы, может быть определена посредством иммунопреципитации или анализа связывания in vitro, например радиоиммунологического анализа (РИА) или иммуноферментного анализа (ELISA). Аффинность связывания данного моноклонального антитела может быть определена, например, с помощью метода Скэтчарда. См., например, Munson et al., Anal. Biochem., 107: 220 (1980).

После идентификации гибридомных клеток, продуцирующих антитела нужной специфичности, аффинности и/или активности, клоны могут быть субклонированы методом серийных разведений и выращены при использовании стандартных методов. См., например, Goding, supra. Подходящие для этих целей среды включает, например, D-MEM или RPMI-1640. Кроме того, гибридомные клетки могут быть выращены in vivo в форме асцитных опухолей в организме животных. Моноклональные антитела, секретируемые субклонами, выделяют из культуральной среды, асцитной жидкости или сыворотки подходящими методами иммунологической очистки, такими как, протеин А-сефароза, гидроксилапатитная хроматография, гель-электрофорез, диализ или аффинная хроматография. Один способ выделения белков из гибридомных клеток описан в США 2005/176122 и Патенте США № 6919436. Данный способ включает применение минимальных солей, таких как, например, лиотропные соли, в процессе связывания, и предпочтительно также использование малых количеств органических сольвентов в процессе элюирования.

(iii) Некоторые способы с использованием скрининга библиотек

Антитела по данному изобретению могут быть получены с использованием комбинаторных библиотек для скрининга антител с желаемой активностью или активностями. Например, множество методов известны в данной области для создания библиотек фаговых дисплеев, и скрининга таких библиотек для выявления антител, обладающих требуемыми характеристиками связывания. Такие методы описаны в общем смысле у Hoogenboom et al. в Methods in Molecular Biology 178: 1-37 (O’Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001). Например, один способ получения представляющих интерес антител осуществляется с использоваием фаговой библиотеки антител, как описано у Lee et al., J. Mol. Biol. (2004), 340(5): 1073-93.

По существу, синтетические клоны антител выбирают в результате скрининга фаговых библиотек, содержащих фаг, который демонстрирует различные фрагменты вариабельной области антигена (Fv), слитых с белком оболочки фага. Такие фаговые библиотеки сортированы посредством аффинной хроматографии против требуемого антигена. Клоны, экспрессирующие фрагменты Fv, способные связываться с требуемым антигеном, абсорбируются на данном антигене, и таким образом отделяются от несвязывающих клонов в данной библиотеке. Данные связывающие клоны затем элюируют с данного антигена, и далее могут быть размножены посредством дополнительных циклов абсорбции на антигене/элюирования с антигена. Любое из антител по данному изобретению может быть получено посредством разработки соответствующей процедуры скрининга антигена для отбора представляющего интерес фагового клона с последующей конструкцией клона полноразмерного антитела, с использованием последовательностей Fv представляющего интерес фагового клона и подходящих последовательностей константной области (Fc), описанных у Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91 -3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3.

В некоторых вариантах осуществления данный антигенсвязывающий домен антитела сформирован из двух вариабельных областей (V) приблизительно 110 аминокислот, по одной из легкой (VL) и тяжелой (VH) цепей, таким образом, что обе представляют три гипервариабельные петли (HVR) или гипервариабельных участка (CDR). Вариабельные домены могут быть функционально выражены на фаге, либо в качестве одноцепочечных Fv (scFv) фрагментов, в которых VH и VL ковалентно связаны посредством короткого гибкого пептида, либо в виде фрагментов Fab, в которых каждый из них слит с константным доменом и взаимодействуют нековалентно, как описано у Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994). Как используется здесь, фаговые клоны, кодирующие scFv и фаговые клоны, кодирующие Fab, в собирательном значении называются «фаговые клоны Fv» или «клоны Fv».

Спектры генов VH и VL могут быть раздельно клонированы посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР) и рекомбинированы случайным образом в фаговые библиотеки, в которых затем проводят поиск антигенсвязывающих клонов, как описано у Winter et al., Ann. Rev. Immunol, 12: 433-455 (1994). Библиотеки, полученные из иммунизированных источников, обеспечивают высокоаффинные антитела к иммуногену без необходимости создания гибридом. Альтернативно, не подвергнутый какому-либо воздействию спектр может быть клонирован для обеспечения единственного источника антител человека к широкому спектру чужеродных, а также, собственных антигенов, без какой-либо иммунизации, как описано у Griffiths et al., EMBO J 12: 725-734 (1993). Наконец, первичные библиотеки могут быть также созданы синтетически посредством клонирования неперегруппированных сегментов V-гена из стволовых клеток, и используя праймеры для ПЦР, содержащие случайную последовательность для кодирования высоковариабельных областей CDR3, и для осуществления перегруппировки in vitro, как описано у Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol, 227: 381-388 (1992).

В некоторых вариантах осуществления, нитевидные фаги используют для дисплея фрагментов антител посредством слияния с минорным белком оболочки pIII. Данные фрагменты антитела могут быть представлены как одноцепочечные фрагменты Fv, в которых домены VH и VL соединены в одной полипептидной цепи посредством гибкого полипептидного спейсера, например, как описано у Marks et al., J. Mol Biol., 222: 581-597 (1991), или как фрагменты Fab, в которых одна цепь слита с pIII, а другая секретируется в периплазму бактериальной клетки-хозяина, где собирается структура Fab-белок оболочки, которая воспроизводится на поверхности данного фага, в результате вытеснения некоторых из белков оболочки дикого типа, например, как описано у Hoogenboom et al., Nucl. Acids Res., 19: 4133-4137 (1991).

В большинстве случаев, нуклеиновые кислоты, кодирующие фрагменты гена антитела, добывают из иммунных клеток, полученных от человека или животных. Если существует потребность в библиотеке, смещенной в пользу анти-антигенных клонов, данного субъекта иммунизируют антигеном для выработки гуморального иммунного ответа, и клетки селезенки и/или циркулирующие В-клетки другие лимфоциты периферической крови (PBLs), восстанавливают для конструкции библиотеки. В одном варианте осуществления, библиотека фрагментов генов антител человека, смещенная в пользу анти-антигенных клонов, получена в результате выработки анти-антигенного гуморального иммунного ответа у трансгенной мыши, несущей группу функционального гена иммуноглобулина человека (и не имеющей функциональной системы производства эндогенного антитела), так что иммунизация антигеном порождает продукцию В-клетками антител человека против антигена. Получение трансгенных мышей, продуцирующих антитела человека, описано ниже.

Дополнительное увеличение популяций анти-антигенных реактивных клеток может быть достигнуто в результате использования соответствующей процедуры скрининга для выделения В-клеток, экспрессирующих антиген-специфическое мембраносвязанное антитело, например, посредством разделения клеток, используя хроматографию по сродству к антигену или абсорбцию клеток на меченном флуорохромом антигене с последующим клеточным сортингом с возбуждением флуоресценции (FACS).

Альтернативно, использование клеток селезенки и/или В-клеток или других PBL от иммунизированного донора, обеспечивает лучшее отображение возможного спектра антител, и также позволяет сконструировать библиотеку антител, используя любые виды животных (человека или не относящихся к человеку), для которых антиген не является антигенным. Для библиотек, содержащих in vitro конструкции генов антител, стволовые клетки получают от субъекта для обеспечения нуклеиновых кислот, кодирующих неперегруппированные сегменты гена антитела. Представляющие интерес иммунные клетки, могут быть получены от множества видов животных, таких как человек, мыши, крысы, зайцеобразные, волк, псовые, кошачьи, свиньи, коровы, лошади и птицы, и тому подобное.

Нуклеиновые кислоты, кодирующие сегменты гена вариабельной области антитела (в том числе сегменты VH и VL), восстановлены из представляющих интерес клеток, и амплифицированы. В случае перегруппированных VH и VL генных библиотек, необходимую ДНК можно получить в результате выделения геномной ДНК или мРНК из лимфоцитов, с последующей полимеразной цепной реакцией (ПЦР) с использованием праймеров, подобранных к 5’ и 3’ концам перегруппированных генов VH и VL, как описано у Orlandi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 86: 3833-3837 (1989), тем самым получая другой спектр генов V для экспрессии. Гены V могут быть амплифицированы из кДНК и геномной ДНК, с обратными праймерами на 5’ конце экзона, кодирующего зрелый V-домен, и прямыми праймерами, находящимися в пределах J-сегмента, как описано у Orlandi et al. (1989) и у Ward et al., Nature, 341: 544-546 (1989). Однако, для амплификации из кДНК, обратные праймеры также могут находиться в лидерном экзоне, как описано у Jones et al., Biotechnol, 9: 88-89 (1991), и прямые праймеры в пределах константной области, как описано у Sastry et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 86: 5728-5732 (1989). Для обеспечения максимальной комплементарности, в праймеры может быть введена степень вырождения, как описано у Orlandi et al. (1989) или Sastry et al. (1989). В некоторых вариантах, разнообразие библиотек увеличено до максимума в результате использования праймеров для ПЦР, нацеленных на каждое семейство V-гена, с целью амплификации всех доступных комбинаций VH и VL, представленных в образце нуклеиновой кислоты иммунной клетки, например, как описано в способе у Marks et al., J. Mol. Biol, 222: 581-597 (1991), или как описано в способе у Orum et al., Nucleic Acids Res., 21: 4491-4498 (1993). Для клонирования данной амплифицированной ДНК в экспрессирующие векторы, редкие сайты рестрикции могут быть встроены в ПЦР-праймер в виде метки на одном конце, как описано у Orlandi et al. (1989), или посредством дополнительной ПЦР-амплификации с меченным праймером, как описано у Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991).

Спектры синтетически перегруппированных генов V можно получить in vitro из сегментов гена V. Большинство из сегментов VH-генов человека были клонированы и секвенированы (опубликовано у Tomlinson et al., J. Mol. Biol, 227: 776-798 (1992)) и картировано (опубликовано у Matsuda et al., Nature Genet., 3: 88-94 (1993); эти клонированные сегменты (в том числе все основные конформации Н1 и Н2 петли) могут быть использованы для создания разнообразных спектров генов VH с ПЦР-праймерами, кодирующими Н3 петли с другой последовательностью и длиной, как описано у Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol, 227: 381-388 (1992). Спектры VH также можно создать со всеми разнообразными последовательностями, сосредоточенными в длинной петле Н3, одной длины, как описано у Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4457-4461 (1992). Сегменты Vκ и Vλ человека были клонированы и секвенированы (опубликовано у Williams and Winter, Eur. J. Immunol., 23: 1456-1461 (1993)) и могут быть использованы для создания синтетических спектров легкой цепи. Спектры синтетических генов V, основанные на диапазоне изгибов VH VL, и длины L3 и H3, будут кодировать антитела со значительным структурным разнообразием. После амплификации ДНК, кодирующих V-гены, сегменты зародышевой линии V-гена могут быть перегруппированы in vitro в соответствии с методами Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol, 227: 381-388 (1992).

Спектры фрагментов антител могут быть сконструированы посредством объединения вместе спектров генов VH и VL несколькими способами. Каждый спектр может быть создан в разных векторах, и данные векторы рекомбинируют in vitro, например, как описано у Hogrefe et al., Gene, 128: 119-126 (1993), или in vivo с помощью комбинаторной инфекции, например, системой loxP, описанной у Waterhouse et al., Nucl. Acids Res., 21: 2265-2266 (1993). Данный рекомбинационный подход in vivo использует двухцепочечную природу фрагментов Fab, чтобы преодолеть ограничение по размеру библиотеки, продиктованное эффективностью трансформации E.Coli. Не подвергнутые какому-либо воздействию спектры VH и VL клонируют раздельно, один в фагемидный и другой в фаговый вектор. Затем эти две библиотеки объединяют посредством фаговой инфекции фагемид-содержащей бактерии, таким образом каждая клетка содержит другое сочетание, и размер библиотеки ограничен только числом представленных клеток (приблизительно 10¹² клонов). Оба вектора содержат рекомбинационные сигналы in vivo, в силу чего гены VH и VL рекомбинируются в один репликон и совместно упакованы в фаговые вирионы. Эти огромные библиотеки обеспечивают большое число разнообразных антител с хорошей аффинностью (K_d^-1 приблизительно 10⁸ M).

Альтернативно, эти спектры могут быть клонированы в один и тот же вектор последовательно, например, как описано у Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 7978-7982 (1991), или собраны вместе посредством ПЦР и затем клонированы, например, как описано у Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991). ПЦР-сборку также можно использовать для соединения ДНК VH и VL с ДНК, кодирующей гибкий пептидный спейсер, для формирования спектров одноцепочечных Fv (scFv). В еще одной методике, «ПЦР-сборка в клетке» используется для объединения генов VH и VL в пределах лимфоцитов посредством ПЦР, и затем клонирования спектров сцепленных генов, как описано у Embleton et al., Nucl. Acids Res., 20: 3831-3837 (1992).

Антитела, полученные с помощью не подвергавшихся какому-либо воздействию библиотек (естественных или синтетических), могут иметь умеренную аффинность (K_d^-1 приблизительно 10⁶-10⁷ М^-1), но созревание аффинности также можно имитировать in vitro посредством конструкции и повторного отбора из вторичных библиотек, как описано у Winter et al. (1994), supra. Например, могут быть введены мутации случайным образом in vitro, используя полимеразу пониженной точности (опубликовано у Leung et al., Technique, 1: 11-15 (1989)) в способе по Hawkins et al., J. Mol Biol, 226: 889-896 (1992), или в способе по Gram et al., Proc. Natl Acad. Sci USA, 89: 3576-3580 (1992). Кроме того, созревание аффинности можно осуществить посредством видоизменения случайным образом одного или нескольких CDR, например, применяя ПЦР с праймерами, несущими случайную последовательность, перекрывающую представляющий интерес CDR, в отобранных индивидуальных клонах Fv, и скрининга клонов с более высокой аффинностью. В WO 9607754 (опубликовано 14 марта 1996) описан способ индукции мутагенеза в гипервариабельном участке легкой цепи иммуноглобулина для того, чтобы создать библиотеку генов легкой цепи. Другой эффективный подход заключается в рекомбинации доменов VH или VL, отобранных с помощью фагового дисплея со спектром естественных вариантов домена V, полученных от иммунизированных доноров, и проведении скрининга на более высокую аффинность в нескольких циклах перестановки цепи, как описано у Marks et al., Biotechnol, 10: 779-783 (1992). Этот метод делает возможным продукцию антител с аффиностями приблизительно 10^-9 или менее.

Скрининг библиотек может быть выполнен с помощью различных способов, известных в данной области. Например, антиген можно использовать для покрытия лунок адсорбционных планшетов, экспрессирован в клетках-хозяевах, закрепленных на абсорбционных планшетах, или использован в клеточном сортинге, или конъюгирован с биотином для захвата с помощью бусин со стрептавидиновым покрытием, или использован в любом другом способе пэннинга библиотек фаговых дисплеев.

Образцы фаговых библиотек вводят в контакт с иммобилизированным антигеном в условиях, подходящих для связывания, по меньшей мере, части фаговых частиц с данным адсорбентом. Обычно, данные условия, в том числе, значение рН, ионную силу, температуру и тому подобное, выбирают таким образом, чтобы имитировать физиологические условия. Фаги связывают с данной твердой подложкой, отмывают а затем элюируют с помощью кислоты, например, как описано у Barbas et al., Proc. Natl Acad. Sci USA, 88: 7978-7982 (1991), или щелочью, как описано у Marks et al., J. Mol Biol, 222: 581-597 (1991), или в результате антигенной конкуренции, например, в процедуре, схожей с методом антигенной конкуренции Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991). Фаги могут быть обогащены 20-1000 - кратно в одном цикле селекции. Кроме того, обогащенные фаги можно выращивать в бактериальной культуре и подвергать дополнительным циклам селекции.

Эффективность отбора зависит от многих факторов, включающих кинетику диссоциации во время отмывки, и того, могут ли многочисленные фрагменты антител на одном фаге одновременно входить в контакт с антигеном. Антитела с быстрой кинетикой диссоциации (и слабыми аффиностями связывания) могут быть удержаны посредством применения коротких отмывок, мультивалентного фагового дисплея и высокой плотности покрытия антигена в твердой фазе. Высокая плотность не только стабилизирует фаг посредством мультивалентных взаимодействий, но и благоприятствует повторному связыванию фага, который был диссоциирован. Отбор антител с медленной кинетикой диссоциации (и хорошими аффиностями связывания) может быть стимулирован использованием продолжительных отмывок и моновалентного фагового дисплея, как описано у Bass et al., Proteins, 8: 309-314 (1990) и в WO 92/09690, и низкой плотности покрытия антигена, как описано у Marks et al., Biotechnol., 10: 779-783 (1992).

Возможно осуществить отбор между фаговыми антителами с различными аффиностями к антигену, даже с аффиностями, которые незначительно отличаются. Однако случайная мутация отобранного антитела (например, как выполняют в некоторых способах созревания аффинности) скорее всего приведет к образованию множества мутантов, большинство связывающихся с антигеном, и нескольких с более высокой аффинностью. С ограничивающим антигеном, фаг с редкой высокой аффинностью может конкурировать. Для удержания всех мутантов с более высокой аффинностью, фаги можно инкубировать с избытком биотинилированного антигена, но с данным биотинилированным антигеном в концентрации более низкой молярности, чем целевая константа молярной аффинности для антигена. Фаги с высокой аффинностью связывания затем могут быть захвачены на парамагнитные бусины со стрептавидиновым покрытием. Такой «равновесный захват» позволяет провести отбор антител в соответствии с их аффинностями связывания, с чувствительностью, которая обеспечивает выделение мутантных клонов с аффинностью всего в два раза более высокой, из большого избытка фагов с более низкой аффинностями. Условия, используемые при отмывке фагов, связанных с твердой фазой, также можно изменять для распознавания на основе кинетики диссоциации.

Клоны анти-антигена могут быть отобраны на основе активности. В некоторых вариантах осуществления данное изобретение обеспечивает анти-антигенные антитела, которые связываются с живыми клетками, которые естественным образом экспрессируют антиген, или связываются с растворимым антигеном, или антигеном, прикрепленным к другим клеточным структурам. Клоны Fv, соответствующие таким анти-антиген антителам, могут быть отобраны посредством (1) выделения клонов анти-антигена из фаговой библиотеки, как описано выше, и, не обязательно, увеличивая данную выделенную популяцию фаговых клонов в результате выращивания данной популяции в подходящей бактериальном хозяине; (2) отбора антигена и второго белка, против которых требуется блокирующая и неблокирующая активность, соответственно; (3) адсорбции данных анти-антигенных фаговых клонов на иммобилизированном антигене; (4) использования избытка второго белка для элюирования любых нежелательных клонов, которые распознают антигенсвязывающие детерминанты, перекрывающиеся или разделяемые с детерминантами связывания данного второго белка; и (5) элюирования клонов, которые сохраняются абсорбированными после этапа (4). При необходимости, клоны с требуемыми блокирующими/неблокирующими свойствами могут быть дополнительно обогащены посредством повторения селекционных процедур, как описано здесь, один или несколько раз.

ДНК, кодирующую моноклональные антитела, полученные с помощью гибридомы, или Fv-клоны фагового дисплея по данному изобретению, легко изолировать и секвенировать с использованием стандартных процедур (например, используя олигонуклеотидные праймеры, сконструированные для специфической амплификации представляющих интерес кодирующих областей тяжелой и легкой цепи из гибридомной или фаговой ДНК-матрицы). После изолирования, данная ДНК может быть помещена в экспрессирующие векторы, которые затем трансфектируют в клетки-хозяев, такие как клетки E.Coli, клетки COS обезьяны, клетки яичника китайского хомячка (СНО), или клетки миеломы, которые в противном случае не производят белок иммуноглобулина, для достижения синтеза требуемых моноклональных антител в рекомбинантных клетках-хозяевах. Обзор статей о рекомбинантной экспрессии в бактериях ДНК, кодирующей антитело, включает Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol, 5: 256 (1993) и Pluckthun, Immunol. Revs, 130: 151 (1992).

ДНК, кодирующая клоны Fc по данному изобретению, может быть объединена с известными последовательностями ДНК, кодирующими константные области тяжелой цепи и/или легкой цепи (например, подходящие последовательности ДНК могут быть получены в Kabat et al., supra), для создания клонов, кодирующих тяжелую и/или легкую цепь полной или частичной длины. Следует иметь в виду, что константные области любого изотипа можно использовать для этой цели, в том числе константные области IgG, IgM, IgA, IgD, и IgE, и что такие константные области могут быть получены от любых видов животных или человека. Клон Fv, полученный из ДНК вариабельного домена одного вида животного (например, человека), и затем слитый с ДНК константной области другого вида животного, для образования кодирующей последовательности (последовательностей) для «гибридной» полноразмерной тяжелой цепи и/или легкой цепи, включен в используемое здесь определение «химерное» и «гибридное» антитело. В некоторых вариантах осуществления, клон Fv, полученный из ДНК вариабельного домена человека, слит с ДНК константной области человека для образования кодирующей последовательности (последовательностей) для тяжелой и/или легкой цепей человека полной или частичной длины.

ДНК, кодирующая анти-антигенное антитело, полученное из гибридомы по данному изобретению, также может быть модифицирована, например, в результате использования данной кодирующей последовательности константных доменов тяжелой и легкой цепи человека вместо гомологичных последовательностей мыши, полученных из клона гибридомы (например, как в способе Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984)). ДНК, кодирующая антитело или фрагмент, полученный из гибридомы или клона Fc, может быть дополнительно модифицирована в результате ковалентного присоединения к последовательности, кодирующей иммуноглобулин, всех или части из кодирующих последовательностей для неиммуноглобулинового полипептида. Таким образом, получены «химерные» или «гибридные» антитела, которые имеют специфичность связывания антител, полученных из клона Fc или гибридомного клона, по данному изобретению.

(iv) Гуманизированные антитела и антитела человека

Различные способы гуманизирования антител нечеловеческого происхождения известны в данной области. Например, гуманизированные антитела имеют один или более аминокислотных остатков антитела нечеловеческого происхождения, встроенных в антитело человека. Эти аминокислотные остатки антитела нечеловеческого происхождения часто называют "импортными" остатками, которые обычно получают из "импортного" вариабельного домена. Гуманизирование, главным образом, осуществляют при использовании метода, разработанного Winter с соавторами (Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536 (1988)), путем замещения последовательностями CDR грызуна соответствующих последовательностей антитела человека. Соответственно, такие "гуманизированные" антитела представляют собой химерные антитела (патент США № 4816567), в которых по существу меньше, чем интактактный гипервариабельный домен человека замещен соответствующей последовательностью нечеловеческого происхождения. Фактически, гуманизированные антитела обычно представляют собой антитела человека, в которых остатки CDR и, возможно, некоторые остатки FR замещены остатками из аналогичных участков антител грызунов.

Выбор вариабельных доменов как легких, так и тяжелых цепей антител человека, которые будут использованы для получения гуманизированных антител, является чрезвычайно важным для снижения их антигенности. В соответствии с так называемым методом "наилучшей подгонки" последовательность вариабельного домена антитела грызуна скринируют против целой библиотеки известных последовательностей вариабельных доменов антител человека. Последовательность антитела человека, которая наиболее близка к последовательности антитела грызуна по структуре, затем используют в качестве каркасного участка (FR) человеческого происхождения для гуманизированного антитела (Sims et al., J. Immunol., 151: 2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196: 901 (1987)). Другой метод подразумевает использование определенного каркасного участка, происходящего из консенсусной последовательности всех антител человека с определенным типом легких и тяжелых цепей. Одна и та же каркасная последовательность может быть использована для получения нескольких различных гуманизированных антител (Carter et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA, 89: 4285 (1992); Presta et al., J. Immnol, 151: 2623 (1993)).

Кроме того, представляется важным, чтобы антитела были гуманизированы с сохранением высокой аффинности к антигену и обладали другими ценными биологическими свойствами. Для достижения указанной цели, согласно одному варианту осуществления данного способа, гуманизированные антитела получают, анализируя последовательности родительских антител и различные концептуальные продукты гуманизирования при использовании метода трехмерного моделирования родительских и гуманизированных последовательностей. Трехмерные модели иммуноглобулинов являются общедоступными и хорошо известными специалисту в данной области. Компьютерные программы, демонстрирующие возможные трехмерные конформационные структуры выбранных кандидатных последовательностей иммуноглобулинов, также общедоступны. Анализ указанных изображений позволяет оценить вклад данных остатков в функциональные свойства кандидатной последовательности иммуноглобулина, т.е. анализ остатков, которые влияют на способность кандидатного иммуноглобулина связываться с соответствующим антигеном. В этом случае, остатки FR могут быть отобраны и скомбинированы с реципиентными и импортными последовательностями с получением антител, обладающих нужными свойствами, такими как повышенная аффинность к антигену(антигенам)-мишени. В целом, остатки гипервариабельных участков непосредственным и наиболее значимым образом вовлекаются в изменение ангигенсвязывающей активности.

Антитела человека по данному изобретению могут быть сконструированы посредством объединения последовательности (последовательностей) вариабельного домена Fv клона, отобранных из библиотек фаговых дисплеев нечеловеческого происхождения, с известной последовательностью (последовательностями) константной области человека, как описано выше. Альтернативно, моноклональные антитела человека по данному изобретению могут быть получены с использованием метода гибридом. Клеточные линии миеломы человека и гетеромиеломные клеточные линии мышь-человек для производства моноклональных антител человека были описаны, например, у Kozbor J. Immunol, 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); и Boerner et al., J. Immunol, 147: 86 (1991).

Возможно использовать трансгенных животных (например, мышей), которые способны, в результате иммунизации, синтезировать полный спектр антител человека при отсутствии продукции эндогенных иммуноглобулинов. Например было описано, что гомозиготная делеция гена, кодирующего фрагмент, соединяющий участки тяжелых цепей антитела (J_H), в клетках химерной и зародышевой линии у мутантных мышей, приводит в результате к полному ингибированию продукции эндогенных антител. Перенос гена клеток зародышевой линии, кодирующего иммуноглобулин человека, в такие клетки зародышевых линий мутантных мышей, приведет в результате к синтезу антител человека в условиях иммунизации антигеном. См., например, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362: 255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immuno., 7: 33 (1993); и Duchosal et al. Nature 355: 258 (1992).

Генные перетасовки также можно использовать для получения антител человека из нечеловеческих, например антител грызунов, где данное антитело человека имеет схожие аффинность и специфичность с исходным нечеловеческим антителом. В соответствии с этим методом, который также называют «импринтинг эпитопа», вариабельную область либо тяжелой цепи, либо легкой цепи фрагмента нечеловеческого антитела, полученного посредством технологий фагового дисплея, описанных здесь, замещают спектром генов домена V человека, тем самым создавая популяцию scFv нечеловеческой цепи/цепи человека или химеры Fab. Отбор с антигеном позволяет выделить химерные scFv нечеловеческой цепи/цепи человека или Fab, где данная цепь человека восстанавливает антигенсвязывающий центр антигена, разрушенный при перемещении соответствующей нечеловеческой цепи в первичном клоне фагового дисплея, то есть эпитоп обуславливает (запечатлеет) выбор партнерской цепи человека. При повторении данного процесса с целью замены оставшейся цепи нечеловеческого происхождения, получают антитело человека (см. РСТ № WO 93/06213, опубликованную 1 апреля 1993 г.). В отличие от традиционного метода гуманизации антител нечеловеческого происхождения путем прививки CDR, данный метод позволяет получить полностью человеческие антитела, которые не имеют остатков FR или CDR нечеловеческого происхождения.

(v) Фрагменты антител

Фрагменты антител могут быть получены с помощью традиционных способов, таких как ферментативное расщепление, или посредством рекомбинантных технологий. При некоторых условиях существуют преимущества использования фрагментов антител вместо цельных антител. Меньший размер фрагментов делает возможной быструю очистку, и может привести к повышенному доступу к солидным опухолям. Для обзора некоторых фрагментов антител см. Hudson et al. (2003) Nat. Med. 9: 129-134.

Для получения фрагментов антител были разработаны различные технологии. Обычно такие фрагменты получают путем протеолитического расщепления интактных антител (см., например, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24: 107-117 (1992) и Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)). Однако в настоящее время эти фрагменты могут быть получены непосредственно при использовании рекомбинантных клеток-хозяев. Фрагменты антител Fab, Fv и ScFv, все могут быть экспрессированы в, и секретированы из, E. coli, таким образом обеспечивая незатруднительное производство больших количеств этих фрагментов. Фрагменты антител могут быть выделены из антительных фаговых библиотек, описанных выше. Альтернативно, Fab’-SH фрагменты могут быть непосредственно выделены из клеток Е. coli и химическим путем соединены между собой с образованием F(ab’)₂-фрагментов (Carter et al., Bio/Technology 10: 163-167 (1992)). В соответствии с другим подходом F(ab’)₂-фрагменты могут быть выделены непосредственно из культуры рекомбинантных клеток-хозяев. Фрагмент Fab и F(ab’)₂ с повышенным временем полужизни in vivo, содержащие остатки связывающего эпитопа реутилизационного рецептора, описаны в Патенте США № 5869046. Другие методики получения фрагментов антител должны быть понятны специалисту в данной области. В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой одноцепочечный Fv фрагмент (scFv). См. WO 93/16185 и патенты США №№ 5571894 и 5587458. Fv и scFv представляют собой единственные типы с интактными рецепторными зонами, которые свободны от константных областей; таким образом они могут быть подходящими для сниженного неспецифического связывания во время использования in vivo. Слитые белки scFv могут быть сконструированы для получения слияния эффекторного белка либо на амино-, либо на карбокси-конце scFv. См. Antibody Engineering, ed. Borrebaeck, supra. Фрагмент антитела может быть и "линейным антителом", например, описанным в патенте США № 5641870. Такие фрагменты могут быть моноспецифическими или биспецифическими.

(vi) Мультиспецифические антитела

Мультиспецифические антитела имеют специфичность связывания, по меньшей мере, с двумя различными эпитопами, где данные эпитопы происходят, обычно, из различных антигенов. Не смотря на то, что такие молекулы обычно связываются только с двумя различными эпитопами (а именно, биспецифические антитела, BsAbs), антитела с дополнительными специфичностями, такие как триспецифические антитела, заключены в это выражение, когда используется здесь. Биспецифические антитела могут быть получены в виде полноразмерных антител или в виде фрагментов антител (например, биспецифические антитела F(ab’)₂).

Способы получения биспецифических антител известны в данной области. Обычная методика получения полноразмерных биспецифических антител основана на совместной экспрессии двух пар тяжелой и легкой цепей иммуноглобулина, где данные две цепи имеют различную специфичность (Millstein et al., Nature, 305: 537-539 (1983)). Поскольку происходит случайное распределение тяжелой и легкой цепей иммуноглобулина, такие гибридомы (квадромы) продуцируют потенциальную смесь из 10 различных молекул антител, из которых только одна будет иметь нужную биспецифическую структуру. Очистка подходящей молекулы, которая обычно осуществляется с помощью аффинной хроматографии, значительно более сложная и выход продукта низкий. Аналогичные методики описаны в WO 93/08829, и у Trauncker et al., EMBO J., 10: 3655-3659 (1991).

Согласно другому подходу вариабельные домены антител с нужной специфичностью (антигенсвязывающие области) сливают с последовательностями константных доменов иммуноглобулинов. Слияние предпочтительно осуществляют с константными доменами тяжелых цепей, содержащими, по крайней мере, часть шарнирного участка, СН2 и СН3 участки. Желательно получить первый константный участок тяжелой цепи (СН1), содержащий сайт, необходимый для связывания легкой цепи, по крайней мере, в одном из продуктов слияния. ДНК, кодирующую слитую тяжелую цепь иммуноглобулина и, если это необходимо, легкую цепь иммуноглобулина, встраивают в отдельные векторы экспрессии, которыми совместно трансфецируют подходящий организм-хозяин. Это обеспечивает великолепную гибкость применения при коррекции взаимных пропорций данных трех полипептидных фрагментов в вариантах осуществления, когда используются неодинаковые соотношения данных трех полипептидных цепей в данной конструкции, обеспечивает оптимальные выходы. Однако возможно встраивать кодирующие последовательности двух или всех трех полипептидных цепей в один экспрессирующий вектор, когда экспрессируются, по меньшей мере, две полипептидные цепи в эквивалентном соотношении с высоким выходом, или когда соотношения не имеют существенного значения.

В одном варианте осуществления этого подхода, биспецифические антитела состоят из гибридной тяжелой цепи иммуноглобулина, обладающей специфической способностью к связыванию первого антигена на одном плече, и гибридной пары легкой и тяжелой цепей иммуноглобулина (обладающей специфической способностью к связыванию второго антигена) на другом плече. Обнаружено, что такая асимметричная структура обеспечивает более легкое отделение нужной биспецифической конструкции от нежелательных комбинаций иммуноглобулиновых цепей, поскольку присутствие легкой цепи иммуноглобулина только в одной половине биспецифической молекулы обеспечивает легкий путь разделения. Этот подход раскрыт в WO 94/04690. Для более детального ознакомления со способами получения биспецифических антител см., например, Suresh et al., Methods in Enzymology, 121: 210 (1986).

В соответствии с другим подходом, описанным в WO96/27011, поверхность раздела между парой антительных молекул может быть создана для получения наибольшего процента гетеродимеров, выделяемых из культуры рекомбинантных клеток. Предпочтительная поверхность раздела включает, по меньшей мере, часть С_н3-домена константного участка антитела. Согласно данному методу одну или несколько небольших аминокислотных боковых цепей с поверхности раздела данного первого антитела заменяют на более крупные боковые цепи (например, тирозин или триптофан). Компенсирующие «полости» идентичного или сходного размера с боковой цепью (цепями) большего размера, создают на поверхности раздела со стороны молекулы второго антитела замещением аминокислот с большими боковыми цепями на аминокислоты с боковыми цепями меньшего размера (например, на аланин или треонин). Это позволяет увеличить выход гетеродимеров по отношению к выходу нежелательных конечных продуктов, представляющих собой гомодимеры.

К биспецифическим антителам относятся и перекрестно-связанные гетероконъюгаты антител. Например, одно антитело в таком гетероконъюгате может быть связано с авидином, а другое - с биотином. Такие антитела, например, направляют клетки иммунной системы на нежелательные клетки (патент США № 4676980) и могут использоваться для лечения СПИДа (WO 91/00360, WO 92/200373 и ЕР 03089). Гетероконъюгаты антител могут быть получены при использовании подходящих методов перекрестного связывания. Подходящие агенты для перекрестного связывания хорошо известны в данной области и раскрыты в патенте США № 4676980 наряду с методиками перекрестного связывания.

Способы получения биспецифических антител из фрагментов антител также описаны в литературе. Например, биспецифические антитела могут быть получены путем химического связывания. Brennan et al., Science, 229: 81 (1985) описывают способ, согласно которому интактные антитела расщепляют протеолитически с получением F(ab’)₂-фрагментов. Эти фрагменты восстанавливают в присутствии связывающего дитиол агента арсенита натрия для стабилизации соседних дитиолов и предотвращения образования межмолекулярных дисульфидных связей. Далее Fab’-фрагменты переводят в производные тионитробензоата (TNB). Одно из производных Fab’-TNB затем обратно переводят в Fab’-тиол восстановлением меркаптоэтиламином и смешивают с эквимолярным количеством производного Fab’-TNB с получением биспецифического антитела. Полученные таким образом биспецифические антитела могут использоваться в качестве агентов для селективной иммобилизации ферментов.

Недавний прогресс в данной области обеспечил возможность непосредственного выделения фрагментов Fab’-SH из Е.coli, которые могут быть химическим образом связаны с образованием биспецифических антител. Shalaby et al., J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992) описывают способ получения полностью гуманизированных биспецифических антительных F(ab’)₂ молекул. Каждый Fab’-фрагмент отдельно выделяют из Е.coli и подвергают прямому химическому связыванию in vitro с получением биспецифических антител.

Также описаны различные технологии получения и выделения фрагментов биспецифических антител непосредственно из рекомбинантной клеточной культуры. Например, биспецифические антитела могут быть получены при использовании лейциновых молний. Kostelny et al., J. Immunol., 148(5): 1547-1553 (1992). Лейциновые зипперные пептиды из белков Fos и Jun связывают с Fab’-участками двух различных антител путем слияния генов. Гомодимеры антител затем восстанавливают в шарнирном участке с получением мономеров и далее повторно окисляют до антительных гетеродимеров. Эта методика может использоваться и для получения гомодимеров антител. Технология «диател», описанная Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993), предусматривает альтернативный механизм получения фрагментов биспецифических антител. Эти фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи (V_H), связанный с вариабельным доменом легкой цепи (V_L) с помощью линкера, который является слишком коротким для обеспечения взаимосвязи между двумя доменами одной и той же цепи. Соответственно, домены V_H и V_L одного фрагмента образуют пару с комплементарными доменами V_H и V_L другого фрагмента, формируя антигенсвязывающие области. Известна и другая методика получения фрагментов биспецифических антител при использовании одноцепочечных F_v (s F_v) димеров. См. Gruber et al., J. Immunol., 152: 5368 (1994).

Предусмотрены антитела с более, чем двумя валентностями. Например, можно получить триспецифические антитела. Tuft et al. J. Immunol. 147: 60 (1991).

(vii) Однодоменные антитела

В некоторых вариантах осуществления, антитело по данному изобретению представляет собой однодоменное антитело. Однодоменное антитело представляет собой единственную полипептидную цепь, содержащую весь или часть вариабельного домена тяжелой цепи, или весь или часть вариабельного домена легкой цепи антитела. В некоторых вариантах осуществления однодоменное антитело представляет собой однодоменное антитело человека (Domantis, Inc., Waltham, MA; см., например, Патент США № 6248516 B1). В одном варианте осуществления однодоменное антитело содержит весь или часть вариабельного домена тяжелой цепи антитела.

(viii) Варианты антител

В некоторых вариантах осуществления предусмотрены модификация(ции) аминокислотных последовательностей антител, описанных здесь. Например, может быть целесообразным улучшение аффинности связывания и/или других биологических свойств данного антитела. Варианты аминокислотных последовательностей могут быть получены посредством введения соответствующих изменений в нуклеотидную последовательность, кодирующую данное антитело, или посредством пептидного синтеза. Такие модификации включают, например, делеции, и/или вставки, и/или замены остатков в пределах данных аминокислотных последовательностей данного антитела. Любые комбинации делеции, вставок и замен можно осуществить для достижения конечной конструкции, при условии, что данная конечная конструкция обладает требуемыми характеристиками. Аминокислотные изменения могут быть введены в подвергаемую воздействию аминокислотную последовательность в то время, когда создается данная последовательность.

(ix) Производные антител

Антитела по данному изобретению могут быть далее модифицированы таким образом, чтобы содержать дополнительные небелковые молекулы, которые известны в данной области и легкодоступны. В некоторых вариантах осуществления данные молекулы, подходящие для дериватизации данного антитела, представляют собой водорастворимые полимеры. Неограничивающие примеры водорастворимых полимеров включают, но не ограничиваются ими, полипропиленгликоль (PEG), сополимеры этиленгликоль/пропиленгликоль, карбоксиметилцеллюлозу, декстран, поливиниловый спирт, поливинилпирролидон, поли-1,3-диоксолан, поли-1,3,6-триоксан, сополимер этилен/малеиновый ангидрид, полиаминокислоты (либо гомополимеры, либо случайные сополимеры), и декстран или поли (n-винилпирролидон)полиэтиленгликоль, гомополимеры пропропиленгликоля, сополимеры пролипропиленоксид/этиленоксид, полиоксиэтилированные тиолы (например, глицерин), поливиниловый спирт, и их смеси. Полиэтиленгликоль пропиональдегид может иметь преимущества при производстве вследствие его стабильности в воде. Полимер может быть любой молекулярной массы, и может быть разветвленным или неразветвленным. Количество полимеров, присоединенных к данному антителу, может варьировать, и если присоединено более одного полимера, они могут представлять собой одинаковые или разные молекулы. В большинстве случаев, количество и/или тип полимеров, используемых для дериватизации, могут быть определены с учетом факторов, включающих, но не ограничиваясь ими, конкретные свойства или функции данного антитела, которые будут улучшены, будет ли данное производное антитела применяться в лечении при определенных условиях, и тому подобное.

(x) Векторы, клетки-хозяева и рекомбинантные методы

Антитела также могут быть получены с помощью рекомбинантных методов. Для рекомбинантного производства анти-антигенного антитела, нуклеиновую кислоту, кодирующую данное антитело, изолируют и встраивают в воспроизводимый вектор для дальнейшего клонирования (амплификация ДНК) или для экспрессии. ДНК, кодирующая данное антитело, может быть легко изолирована и секвенирована с использованием общепринятых методов (например, используя олигонуклеотидные зонды, которые способны специфически связываться с генами, кодирующими тяжелую и легкую цепи данного антитела). Доступно множество векторов. Компоненты векторов обычно включают, но не ограничиваются ими, одно или несколько из следующего: сигнальная последовательность, начало репликации, один или несколько генов-маркеров, энхансер, промотор, и последовательность терминации транскрипции.

(a) Сигнальная последовательность

Антитело по настоящему изобретению может быть получено рекомбинантным способом не только непосредственно, но и в виде слитого полипептида с гетерологичным полипептидом, который предпочтительно представляет собой сигнальную последовательность или другой полипептид, имеющий специфический сайт расщепления на N-конце зрелого белка или полипептида. Данная отобранная гетерологичная сигнальная последовательность предпочтительно представляет собой такую, которая распознается и обрабатывается (например, расщепляется сигнальной пептидазой) данной клеткой-хозяином. Для прокариотических клеток-хозяев, которые не распознают и не обрабатывают сигнальную последовательность нативного антитела, данная сигнальная последовательность заменена на прокариотическую сигнальную последовательность, выбранную из, например, группы, имеющей в своем составе лидеры щелочной фосфатазы, пенициллиназы, lpp или термостабильного энтеротоксина II. Для дрожжевой секреции, данная сигнальная последовательность нативного антитела может быть заменена, например, на лидер дрожжевой инвертазы, лидерный фактор (в том числе лидерные α-факторы Saccharomyces и Kluyveromyces), или лидер кислой фосфатазы, лидер глукоамилазы C. albicans, или сигнальную последовательность, описанную в WO 90/13646. Для экспрессии в клетках млекопитающих, доступны сигнальные последовательности млекопитающих, а также вирусные секреторные лидеры, например, сигнальная последовательность gD вируса простого герпеса.

(b) Начало репликации

И экспрессирующие, и клонирующие векторы содержат последовательность нуклеиновой кислоты, которая позволяет данному вектору воспроизводиться в одной или нескольких отобранных клетках-хозяевах. В большинстве случаев, в клонирующих векторах эта последовательность представляет собой ту, которая позволяет данному вектору воспроизводиться независимо в хромосомной ДНК хозяина, и содержит начала репликации или автономно реплицирующиеся последовательности. Такие последовательности хорошо известны для ряда бактерий, дрожжей и вирусов. Начало репликации плазмиды pBR322 пригодно для большинства грамотрицательных бактерий, начало репликации плазмиды 2µ пригодно для дрожжей, и многообразные вирусные начала репликации (SV40, вирус полиомы, аденовирус, VSV или BPV) пригодны для использования в клонирующих векторах в клетках млекопитающих. Как правило, данный компонент начала репликации не является необходимым для экспрессирующих векторов млекопитающих (обычно может быть использовано только начало репликации SV40, потому что содержит ранний промотер).

(c) Селективный ген

Экспрессирующие и клонирующие векторы могут содержать ген селекции, также называемый селектируемым маркером. Типичные гены селекции кодируют белки, которые (а) обеспечивают устойчивость к антибиотикам или другим токсинам, например, ампициллину, неомицину метотрексату или тетрациклину, (b) дополняют ауксотрофные недостаточности, или (с) обеспечивают важные питательные вещества, которые недоступны из комплексной среды, например, ген, кодирующий D-аланинрацемазы для Bacilli.

В одном примере системы селекции используется лекарственное средство для запрета роста клетки-хозяина. Те клетки, которые успешно трансформированы с гетерологичным геном, продуцируют белок, обеспечивающий устойчивость к лекарственному веществу, и вследствие этого выживают в данной системе селекции. Примеры такой доминантной селекции используют неомицин, микофенольную кислоту и гигромицин.

Другим примером подходящих селектируемых маркеров для клеток млекопитающих являются те, которые делают возможной идентификацию клеток, компетентных для поглощения нуклеиновой кислоты, кодирующей антитело, например DHFR, глутаминсинтетаза(GS), тимидинкиназа, металлопротеин-I и -II, предпочтительно гены металлопротеинов приматов, аденозиндеаминаза, орнитиндекарбоксилаза, и тому подобное.

Например, клетки, трансформированные геном DHFR, выявляют в результате культивирования трансформантов в среде для культивирования, содержащей метотрексат (Mtx), конкурирующий антагонист для DHFR. В этих условиях, ген DHFR амплифицируется вместе с любой другой совместно трансформированной нуклеиновой кислотой. Можно использовать линию клеток яичников китайского хомяка (СНО) с дефицитом эндогенной активности DHFR (например, ATCC CRL-9096).

Альтернативно, клетки, трансформированные геном GS, выявляют в результате культивирования трансформантов в среде для культивирования, содержащей L-метионин сульфоксимин (Msx), ингибитор GS. В этих условиях, ген GS амплифицируется вместе с любой другой совместно трансформированной нуклеиновой кислотой. Систему GS отбора/амплификации можно использовать в сочетании с системой DHFR отбора/амплификации, описанной выше.

Альтернативно, клетки-хозяева (в частности клетки-хозяева дикого типа, которые содержат эндогенный DHFR), трансформированные или совместно трансформированные с последовательностями ДНК, кодирующими представляющее интерес антитело, ген DHFR дикого типа, и другой селектируемый маркер, такой как аминогликозид 3’-фосфотрансфераза (APH), могут быть отобраны посредством выращивания в среде, содержащей агент селекции для данного селектируемого маркера, такой как антибиотик аминогликозидного ряда, например, канамицин, неомицин или G418. См. Патент США № 4965199.

Подходящим геном селекции для использования у дрожжей, является ген trp 1, представленный в дрожжевой плазмиде YRp7 (Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979)). Ген trp1 обеспечивает селектируемый маркер для мутантного штамма дрожжей, у которого отсутствует способность расти в присутствии триптофана, например ATCC № 44076 или PEP4-1. Jones, Genetics, 85: 12 (1977). Наличие нарушения trp1 в геноме дрожжевой клетки-хозяина затем обеспечивает эффективную окружающую среду для выявления трансформации по росту в отсутствии триптофана. Схожим образом, штаммы дрожжей с дефицитом Leu2 (ATCC 20622 или 38626) применяются совместно с известными плазмидами, несущими ген Leu2.

В дополнение, векторы, полученные из 1,6 мкм кольцевой плазмиды pKD 1, можно использовать для трансформации дрожжей Kluyveromyces. Альтернативно, экспрессионная система для крупномасштабного производства рекомбинантного телячьего химозина была описана для K. lactis. Van den Berg, Bio/Technology, 8: 135 (1990). Также были раскрыты стабильные мультикопийные экспрессирующие векторы для секреции зрелого рекомбинатного альбумина сыворотки человека промышленными штаммами Kluyveromyces. Fleer et al., Bio /Technology, 9:968-975 (1991).

(d) Промотор

Экспрессирующие и клонирующие векторы, как правило, содержат промотор, который распознается организмом-хозяином и функционально связан с нуклеиновой кислотой, кодирующей антитело. Промоторы, пригодные для использования с прокариотическим организмом-хозяином, включают промотор phoA, промоторные системы β-лактамазы и лактозы, промотор щелочной фосфатазы, промоторную систему триптофана (trp), и гибридные промоторы, такие как промотор tac. Тем не менее, другие известные бактериальные промоторы являются пригодными. Промоторы для использования в бактериальных системах также будут содержать последовательность Шайна-Дальгарно (Ш.Д.), функционально связанную с ДНК, кодирующей антитело.

Промоторные последовательности известны для эукариот. Практически все эукариотические гены имеют АТ-богатую область, расположенную приблизительно в 25-30 основаниях выше участка, с которого начинается транскрипция. Другая последовательность, обнаруженная в 70-80 основаниях выше от начала транскрипции во многих генах, представляет собой область CNCAAT, где N может быть любым нуклеотидом. На 3’-конце большинства эукариотических генов присутствует последовательность ААТААА, которая может быть сигналом для добавления сегмента поли-А к данному 3’-концу данной кодирующей последовательности. Все эти последовательности соответственно встроены в эукариотические экспрессирующие векторы.

Примеры пригодных промоторных последовательностей для использования с дрожжевыми хозяевами включают промоторы для 3-фосфоглицерат киназы или других гликолитических ферментов, таких как энолаза, глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназа, гексокиназа, пируват декарбоксилаза, фосфо-фруктокиназа, глюкоза-6-фосфат изомераза, 3-фосфоглицерат мутаза, пируваткиназа, триозофосфат изомераза, фосфоглюкоза изомераза и глюкокиназа.

Другие дрожжевые промоторы, которые являются индуцируемыми промоторами, имеющими дополнительные преимущества транскрипции, контролируемой условиями выращивания, представляют собой промоторные области для алкогольдегидрогеназы 2, изоцитохрома С, кислой фосфатазы, деструктивных ферментов, связанных с азотистым обменом веществ, металлопротеина, глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы, и ферментов, ответственных за утилизацию мальтозы и галактозы. Подходящие векторы и промоторы для использования в дрожжевой экспрессии, дополнительно описаны в EP 73657. Дрожжевые энхансеры также успешно используются с дрожжевыми промоторами.

Транскрипция антител из векторов в клетках-хозяевах млекопитающих можно контролировать, например, посредством промоторов, полученных из вирусных геномов, таких как вирус полиомы, вирус оспы кур, аденовирус (например, аденовирус 2), вирус папилломы крупного рогатого скота, вирус саркомы птиц, цитомегаловирус, ретровирус, вирус гепатита В, вирус обезьяны 40 (SV40) или из гетерологичных промоторов млекопитающих, например, промотор актина или промотор иммуноглобулина, из промоторов теплового шока, при условии, что такие промоторы являются совместимыми с системами клеток-хозяев.

Ранние и поздние промоторы вируса SV40 удобно получать в виде фрагмента рестрикции SV40, который также содержит начало репликации вируса SV40. Предранний промотор цитомегаловируса человека удобно получать в виде фрагмента рестрикции HindIII E. Система для экспрессии ДНК в млекопитающих-хозяевах, использующая в качестве вектора вирус папилломы крупного рогатого скота, раскрыта в Патенте США № 4419446. Модификация этой системы описана в Патенте США № 4601978. См. также Reyes et al., Nature 297: 598-601 (1982) об экспрессии кДНК β-интерферона человека в клетках мыши под контролем промотора тимидинкиназы из вируса простого герпеса. Альтернативно, в качестве промотора можно использовать длинный концевой повтор вируса саркомы Рауса.

(e) Энхансер

Транскрипция ДНК, кодирующей антитело по этому изобретению, высшими эукариотами зачастую усиливается в результате встраивания энхансерной последовательности в данный вектор. Множество энхансерных последовательностей известно из генов млекопитающих (глобин, эластаза, альбумин, α-фетопротеин и инсулин). Тем не менее, обычно используют энхансер из вирусной эукариотической клетки. Примеры включают энхансер SV40 на позднем участке начала репликации (п.о. 100-270), энхансер раннего промотора цитомегаловируса, энхансер вируса полиомы на позднем участке начала репликации, и энхансеры аденовируса. См. также Yaniv, Nature 297: 17-18 (1982) об энхансерных элементах для активации эукариотических промоторов. Энхансер может быть сплайсирован в данный вектор в положении 5 ‘ или 3’ к данной последовательности, кодирующей антитело, но предпочтительно расположен в 5’-позиции от данного промотора.

(f) Терминация транскрипции

Экспрессирующие векторы, используемые в эукариотических клетках-хозяевах (дрожжи, грибы, насекомые, растения, животные, человек, или ядросодержащие клетки других многоклеточных организмов) также будут содержать последовательности, необходимые для терминации транскрипции и стабилизации мРНК. Такие последовательности обычно доступны в 5’-, изредка 3’, нетранслируемых областях эукариотических или вирусных ДНК или кДНК. Эти области содержат нуклеотидные сегменты, транскрибируемые как полиаденилированные фрагменты в нетранслируемой части мРНК, кодирующей антитело. Один эффективный компонент терминации транскрипции представляет собой область полиаденилирования гормона роста крупного рогатого скота. См. W094/11026 и экспрессирующий вектор, раскрытый там.

(g) Селекция и трансформация клеток-хозяев

Подходящими клетками-хозяевами для клонирования или экспрессии ДНК в векторах являются клетки прокариот, дрожжей и высших эукариот, описанные ранее. Подходящие в этих целях прокариоты включают эубактерии, такие как грамотрицательные или грамположительные организмы, например, Enterobacteriaceae такие как Escherichia, например, E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, например, Salmonella typhimurium, Serratia, например, Serratia marcescans, и Shigella, а так же Bacilli такие как B. subtilis и B. licheniformis (например, B. licheniformis 41Р, раскрытая в DD 266710, опубликованной 12 апреля 1989), Pseudomonas, например P. aeruginosa, и Streptomyces. Одним предпочтительным клонирующим хозяином E. coli является E. coli 294 (ATCC 31446), хотя другие штаммы, такие как E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31537), и E. coli W3110 (ATCC 27325) также пригодны. Эти примеры являются иллюстративными а не ограничивающими.

Полноразмерное антитело, слитые белки антител, и фрагменты антител могут быть получены в бактериях, в частности, когда нет необходимости в гликозилировании и эффекторной функции Fc, например, когда терапевтическое антитело сконъюгировано с цитотоксическим агентом (например, токсин), что само по себе демонстрирует эффективность при разрушении опухолевых клеток. Полноразмерные антитела имеют более продолжительное время полужизни в кровотоке. Производство в E. coli является более быстрым и более рентабельным. Для экспрессии фрагментов антитела и полипептидов бактериями см., например U.S. 5648237 (Carter et. al), U.S. 5789199 (Joly et al), U.S. 5840523 (Simmons et al), в которых описывается область инициации трансляции (TIR) и сигнальные последовательности для оптимизации экспрессии и секреции. См. также Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254, где описывается экспрессия фрагментов антитела в E. coli. После экспрессии, данное антитело может быть выделено из пастообразной клеточной массы E. coli в растворимую фракцию, и может быть очищено с помощью, например, колонки белка А или G, в зависимости от изотипа. Окончательную очистку можно провести схожим образом с процессом для очистки антитела, экспрессируемого, например, в клетках СНО.

В дополнение к прокариотам, эукариотические микроорганизмы, такие как мицелиальные грибы или дрожжи, являются подходящими клонирующими или экспрессирующими хозяевами для векторов, кодирующих антитело. Saccharomyces cerevisiae, или обычные пекарские дрожжи, являются чаще всего используемыми среди низших эукариотических микроорганизмов-хозяев. Тем не менее, ряд других родов, видов и штаммов являются обычно доступными и пригодными здесь, такие как Schizosaccharomyces pombe; микроорганизмы-хозяева Kluyveromyces, такие как, например, K. lactis, K. fragilis (ATCC 12,424), K. bulgaricus (ATCC 16,045), K. wickeramii (ATCC 24,178), K. waltii (ATCC 56,500), K. drosophilarum (ATCC 36,906), K. thermotolerans, и К. marxianus; yarrowia (EP 402,226); Pichia pastoris (EP 183,070); Candida; Trichoderma reesia (EP 244,234); Neurospora crassa; Schwanniomyces, такие как Schwanniomyces occidentalis; и мицелиальные грибы, такие как, например, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium, и Aspergillus, такие как A. nidulans и A. niger. Для обзора, в котором обсуждается использование дрожжей и мицелиальных грибов для производства терапевтических белков, см., например, Gerngross, Nat. Biotech. 22: 1409-1414 (2004).

Могут быть отобраны некоторые грибы и штаммы дрожжей, в которых пути гликозилирования были «гуманизированы», что в результате приводит к продукции антитела с характером гликозилирования частично или полностью соответствующим человеческому. См., например, Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006) (описывается гуманизирование пути гликозилирования в Pichia pastoris); и Gerngross et al., supra.

Подходящие клетки-хозяева для экспрессии гликозилированного антитела, также получают из многоклеточных организмов (беспозвоночные и позвоночные). Примеры клеток беспозвоночных включают клетки растений и насекомых. Были идентифицированы многочисленные штаммы и варианты бакуловируса и соответствующие клетки-хозяева пермиссивных насекомых от таких хозяев, как Spodoptera frugiperda (гусеница), Aedes aegypti (комар), Aedes albopictus (комар), Drosophila melanogaster (плодовая мушка), и Bombyx mori. Различные вирусные штаммы для трансфекции находятся в открытом доступе, например, вариант L-1 Autographa californica NPV и штамм Bm-5 Bombyx mori NPV, и такие вирусы можно использовать в качестве вирусов по данному изобретению, в частности, для трансфекции клеток Spodoptera frugiperda.

В качестве хозяев также можно использовать клетки растительных культур хлопка, кукурузы, картофеля, соевых бобов, петунии, томатов, ряски (Lemnaceae), люцерны (M. truncatula), и табака. См., например, Патенты США №№ 5959177, 6040498, 6420548, 7125978, и 6417429 (описывается технология PLANTIBODIES™ для продукции антител в трансгенных растениях).

Клетки позвоночных можно использовать в качестве хозяев, и размножение клеток позвоночных в культуре (тканевая культура) стало рутинной процедурой. Примеры пригодных клеточных линий млекопитающих в качестве хозяев включают линию CV1 почки обезьяны, трансформированную с помощью SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); линию клеток эмбриональной почки человека (клетки 293 или 293 субклонируют для роста в суспензионной культуре, Graham et al., J. Gen Virol. 36: 59 (1977)); клетки почки новорожденного хомяка (BHK, ATCC CCL 10); клетки Сертоли мыши (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); клетки почки обезьяны (CV1 ATCC CCL 70); клетки почки зеленой африканской мартышки (VERO-76, ATCC CRL-1587); клетки саркомы шейки матки человека (HELA, ATCC CCL 2); клетки почки собаки (MDCK, ATCC CCL 34); клетки печени крыс Buffalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); клетки легких человека (W138, ATCC CCL 75); клетки печения человека (Hep G2, HB 8065); клетки опухоли молочной железы мыши (MMT 060562, ATCC CCL51); клетки TRI (Mather et al., Annals N. Y. Acad. Sci. USA 383: 44-68 (1982)); клетки MRC 5; клетки FS4; и клетки гепатомы человека (Hep G2). Другие пригодные в качестве хозяев клеточные линии млекопитающих, включают клетки яичника китайского хомяка (CHO), в том числе, клетки DHFR^- CHO (Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); и клеточные линии миеломы, такие как NS0 и Sp2/0. Для обзора некоторых клеточных линий-хозяев млекопитающих, пригодных для продукции антител, см., например, Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 255-268.

Клетки-хозяева трансформированы с вышеуказанными экспрессирующими или клонирующими векторами для продукции антител, и культивированы в стандартных питательных средах, модифицированных надлежащим образом для индукции промоторов, отбора трансформантов или амплификации генов, кодирующих необходимые последовательности.

(h) Культивирование клеток-хозяев

Клетки-хозяева, используемые для производства антитела по данному изобретению, можно культивировать в различных средах. Коммерчески доступные среды, такие как Ham F10 (Sigma), минимальная поддерживающая среда ((MEM), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma), и модифицированная по способу Дульбекко среда Игла ((DMEM), Sigma) подходят для культивирования данных клеток-хозяев. Кроме того, любую среду из описанных у Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem 102: 255 (1980), в патентах США №№ 4767704; 4657866; 4927762; 4560655; или 5122469; WO 90/03430; WO 87/00195; или U.S. Patent Re. 30985, можно использовать в качестве среды для культивирования данных клеток-хозяев. Любую из этих сред можно дополнить, при необходимости, гормонами и/или другими факторами роста (такими как инсулин, трансферрин или эпидермальный фактор роста), солями (такими как хлорид натрия, кальция, магния и фосфат), буферами (например, HEPES), нуклеотидами (такими как аденозин и тимидин), антибиотиками (такими как GENTAMYCIN™), следовыми элементами (определенными как неорганические соединения, обычно представленные в конечных концентрациях микромолярного порядка), и глюкозой или равноценным источником энергии. Любые другие необходимые добавки также могут быть включены в соответствующих концентрациях, которые будут понятны специалисту в данной области. Условия культивирования, такие как температура, рН, и тому подобное, представляют собой те, которые использовались с отобранными для экспрессии клетками-хозяевами, и будут очевидны специалисту с обычными навыками в данной области.

(xi) Очистка антитела

Когда используют рекомбинантные технологии, антитело может вырабатываться внутриклеточно, в периплазматическом пространстве, или непосредственно секретироваться в среду. Если антитело вырабатывается внутриклеточно, в качестве первого этапа, дисперсный дебрис, либо клетки-хозяева, либо лизированные фрагменты, удаляют посредством, например, центрифугирования или ультрафильтрации. Carter et al., Bio/Technology 10: 163-167 (1992) описывают процедуру изолирования антител, которые секретированы в переплазматическое пространство E. coli. Вкратце, клеточную пастообразную массу растапливают в присутствии ацетата натрия (pH 3,5), EDTA, и фенилметилсульфонилфторида (PMSF) приблизительно 30 мин. Клеточный дебрис может быть удален посредством центрифугирования. Когда антитело секретируется в среду, супернатанты, полученные в таких экспрессионных системах, обычно сначала концентрируют с помощью коммерчески доступного фильтра для концентрации белка, например, ультрафильтрационной установки Amicon или Millipore Pellicon. Ингибитор протеазы, такой как PMSF, может быть добавлен на любом последующем этапе для ингибирования протеолиза, и антибиотики могут быть добавлены для предотвращения роста случайных загрязняющих примесей.

Состав антитела, приготовлен из клеток, может быть очищена с помощью, например, гидроксиапатиной хроматографии, хроматографии гидрофобных взаимодействий, гель-электрофореза, диализа и аффинной хроматографии, аффинная хроматография является одним из обычно предпочтительных методов очистки. Возможность применения белка А в качестве аффинного лиганда зависит от типа и изотипа домена Fc любого иммуноглобулина, который присутствует в данном антителе. Белок А можно использовать для очистки антител, которые основаны на γ1, γ2 или γ4 тяжелых цепях человека (Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62: 1-13 (1983)). Применения белка G рекомендуется для все мышиных изотипов и γ3 человека (Guss et al., EMBO J. 5: 15671575 (1986)). Матрикс, на котором закреплен аффинный лиганд, чаще всего представляет собой агарозу, но доступны и другие матриксы. Механически стабильные матриксы, такие как стекло с контролируемым размером пор или поли(дивинилстирол)бензол, обеспечивают более быструю скорость тока, и более короткую продолжительность обработки, по сравнению с агарозой. В случае когда антитело содержит домен CR3, смола Bakerbond ABX™ (J. T. Baker, Phillipsburg, NJ) является пригодной для очистки. Другие технологические приемы для очистки белков, такие как фракционирование на ионообменной колонке, осаждение с помощью этанола, обращенно-фазовая ВЭЖХ, хроматография на силикагеле, на гепарин-SEPHAROSE™, хроматография на ионо- или катионообменной смоле (например, колонка с полиаспартовой кислотой), хроматофокусирование, SDS-PAGE, и осаждение с помощью сульфата аммония, также доступны в зависимости от восстанавливаемого антитела.

В целом, различные методологические приемы для получения антител для использования в научных исследованиях, тестировании и клиническом применении, общеприняты в данной области, в соответствии с вышеописанными методологическими приемами и/или по усмотрению специалиста в данной области, для конкретного представляющего интерес антитела.

D. Отбор биологически активных антител

Антитела, полученные как описано выше, могут быть подвергнуты одному или нескольким испытаниям на «биологическую активность» с целью отбора антитела с полезными свойствами с точки зрения терапевтической перспективы. Может быть проведен скрининг данного антитела на предмет его способности связываться с данным антигеном, против которого его выращивали. Например, для анти-VEGF антитела, как показано в примере ниже, антигенсвязывающие свойства данного антитела можно оценить с помощью анализа, в котором определяется способность связываться с VEGF.

В другом варианте осуществления, данная аффинность данного антитела может быть определена посредством анализа насыщенности связывания; ELISA; и/или конкурентного анализа (например, радиоиммунный анализ), например.

Кроме того, данное антитело может быть подвергнуто анализу других биологических активностей, например, с целью определения его эффективности в качестве терапевтического средства. Такие методы исследования известны в данной области и зависят от антигена-мишени и предполагаемого использования антитела.

Для скрининга антител, которые связываются с определенным эпитопом на представляющем интерес антигене (например, тех, которые блокируют связывание анти-VEGF антитела по примеру с VEGF), может быть проведен рутинный эпитоп-перекрестный конкурентный анализ, такой как описан в Antibodies, A Laboratory Manual., Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988). Альтернативно, эпитопное картирование, например, как описано у Champe et al., J. Biol. Chem. 270: 1388- 1394 (1995), можно провести для определения того, связывается ли данное антитело с представляющим интерес эпитопом.

E. Изделия

В другом варианте осуществления данного изобретения обеспечено изделие, включающее контейнер, в котором находится водный фармацевтический состав по данному изобретению, и, необязательно, предоставляется инструкции по его применению. Подходящие контейнеры включают, например, флаконы, ампулы и шприцы. Данный контейнер может быть сделан из различных материалов, таких как стекло или пластик. Типичный контейнер представляет собой стеклянную ампулу объемом 3-20 куб.см для разового применения. Альтернативно, для составов многократного применения, данный контейнер может представлять собой стеклянную ампулу объемом 3-100 см.куб. Данный контейнер содержит данный состав, и этикетка на контейнере, или связанная с контейнером, может содержать инструкции по применению. Данное изделие может дополнительно включать другие материалы, целесообразные с коммерческой и потребительской точек зрения, в том числе, другие буферы, фильтры, иглы, шприцы и листовки-вкладыши в упаковке с инструкциями по применению.

Данное изобретение будет более понятно, исходя из следующих примеров. Однако эти примеры не должны рассматриваться как ограничивающие диапазон данного изобретения. Все перечисленные источники литературы и патенты включены здесь посредством ссылки.

Данное описание считается достаточным для того, чтобы специалист в данной области применял данное изобретение на практике. Различные модификации данного изобретения, в дополнение к тем, которые показаны и описаны здесь, будут очевидны специалисту в данной области, исходя из вышеприведенного описания, и попадают в диапазон приложенной формулы изобретения. Все процитированные публикации, патенты и патентные заявки включены здесь посредством ссылки в полном их объемы для всех целей.

ПРИМЕРЫ

Следует понимать, что примеры и варианты осуществления, описанные здесь, приведены только в качестве иллюстрации, и что различные модификации или изменения в свете этого будут предложены специалисту в данной области, и они включены объем и сущность данной заявки, и объем приложенной формулы изобретения.

Пример 1: Стабильные жидкие составы анти-VEGF антитела

В этих примерах описывается разработка и проверка устойчивости стабильных жидких составов, содержащих анти-VEGF антитело с концентрациями белка в диапазоне приблизительно 20 мг/мл-200 мг/мл в различных жидких составах, содержащих гистидин, аргинин, ацетат или хлорид натрия. Один миллилитр каждого состава в стеклянных ампулах объемом 3 куб.см. хранили при 40°C и стабильность определяли в 1, 2 и 4 недели. Стабильность анти-VEGF контролировали с помощью нескольких тестов, включающих UV (концентрация и мутность), эксклюзионную хроматографию размеров (SEC) для анализа вариантов размеров, капиллярное изоэлектрическое фокусирование (icIEF) для анализа вариантов заряда, CE-SDS для распределения по размерам, и анализ связывания для определения активности. После четырех недель исследования стабильности, результаты авторов данного изобретения показали, что анти-VEGF является стабильным в 200 мМ аргинин-ацетате, 150 мМ хлориде натрия, 0,04% PS20, pH 5,2.

Стабильность (например, образование агрегатов, вязкость, и тому подобное) анти-VEGF была исследована в различных жидких составах, содержащих гистидин, хлорид натрия, аргинин и ацетат. Стабильность анти-VEGF контролировали с помощью нескольких тестов, включающих эксклюзионную хроматографию размеров (SEC) для анализа формирования агрегатов. Результаты авторов данного изобретения показали, что анти-VEGF является стабильным при значении pH приблизительно 5,2, в аргинин-содержащих буферах.

Состав анти-VEGF был разработан с различными буферами посредством диализа с использованием кассет Slide-a-Lyzer® для получения конечных концентраций, указанных в Таблице 1. Каждый состав был профильтрован в стерильных условиях с помощью 0,22 мкм блок-фильтров Steriflip® и в асептических условиях помещен в стерилизованные в автоклаве флаконы, закупорен и герметизирован. Образцы помещали в температурные условия 2-8°C, 25°C и 40°C, исследования стабильности проводили при выбранных температурах.

Таблица 1
Составы Состав A 51 мМ фосфат натрия, 159 мМ трегалоза, 0,04% PS20,
pH 6,2 B 200 мМ ацетат аргинина, 0,04% PS20, pH 5,2 C 20 мМ ацетат натрия, 240 мМ сахароза, 0,04% PS20, pH 5,2 D 20 мМ хлорид гистидина, 200 мМ хлорид аргинина, 0,04% PS20, pH 5,2

МЕТОДЫ

pH: 200 мкл каждого образца помещали в 1,5 мл пробирки Эппендорфа при температуре окружающей среды и значения рН определяли с помощью рН-метра Thermo Orion, оборудованного полу-микроэлектродом Ross®. Данный рН-метр был откалиброван с использованием стандартных буферных смесей Thermo Orion pH 4,0, 5,0 и 7,0.

Вязкость: Вязкость в условиях сдвига измеряли с помощью реометра Anton Paar Physica MCR300 с конусом 25 мм (CP 25-1), установленным на уровне 0,049 мм. 75 мкл каждого образца нагружали на планшет Peltier при температуре 25°C и измеряли 10 раз с интервалом 100 с при постоянной скорости сдвига 1000 1/с.

Эксклюзионная обменная хроматография размеров (SEC): Эксклюзионную хроматографию размеров проводили для количественного анализа общих уровней агрегации (с беспримесными инъекциями) и уровней медленно-диссоциирующих агрегатов (с разбавленными инъекциями). Разбавленные инъекции были разбавлены с помощью буфера подвижной фазы (0,20 M фосфат калия, 0,25 M хлорид калия, pH 6,2) до 0,5 мг/мл. Все образцы инкубировали при 30°C в течение 24 часов перед анализом. 10 мкл каждого беспримесного образца и 100 мкл каждого разбавленного образца впрыскивали в колонку TSK G3000SWXL, 7,8×300 мм (TOSOHAAS, part no. 08541), используя систему Agilent 1100 HPLC. Данный автоматический аппликатор образцов хранили при 30°C, тогда как температуру в колонке поддерживали на уровне окружающей среды. Скорость потока составляла 0,5 мл/мин, и общее время прохождения для образца составляло 30 минут. Анализ результатов проводили по оптической плотности образца при 280 нм, с помощью HP Chemstation.

Ионообменная хроматография (IEC): Ионообменную хроматографию проводили для количественного анализа заряженных вариантов в образцах, расщепленных карбоксипептидазой В (CpB). Образцы разбавляли до 1 мг/мл с помощью Сольвента А (20 мМ буфер N-(2-ацетамидо)-2-аминоэтансульфоновой кислоты (ACES), pH 6,5), обрабатывали добавлением 1% вес/вес CpB 1 мг/мл, и инкубировали в течение 20 минут при 37°C. 50 мкл каждого образца затем впрыскивали в колонку Dionex ProPac WCX-10, 4,6×250 мм, с использованием системы Agilent 1100 HPLC. Температуру автоматического аппликатора образцов поддерживали на уровне 2-8°C, в то время как температуру колонки поддерживали на уровне 40°C. Скорость потока составляла 0,5 мл/мин при использовании градиента Сольвента А и Сольвента В (200 мМ хлорид натрия в Сольвенте A) в течение 90 минут, как описано в методике испытаний. Анализ результатов проводили по оптической плотности образца при 280 нм, с помощью HP Chemstation.

Анализ мутности: Для контроля мутности оптическую плотность каждого состава измеряли при 350 нм, используя спектрофотометр Agilent 8453 UV-VIS. Анализ всех образцов проводили без разведений, используя кварцевую кювету с длиной пути 1 см.

Анализ стабильности при -20°C и при многократном замораживании: Составы A-D в асептических условиях помещали в минифляги из нержавеющей стали 316 л (15 мл/минифляга). Все образцы хранили при -20°C в течение разных периодов времени (например, 24, 48, 72 или более часов; 4, 5, 6, 7 или более дней; 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или более недель; 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или более месяцев), и постоянно отбирали пробы в асептических условиях в вытяжном шкафу с ламинарным потоком. Кроме того, составы A-D помещали в стеклянные пробирки объемом 6 куб.см., и хранили при -20°C. Каждую пробирку подвергали пяти циклам замораживания-оттаивания и проводили анализ с использованием SEC, IEC и анализа мутности. Цикл замораживание-оттаивание влечет за собой хранение в течение, по меньшей мере, 24 часов при -20°C с последующим хранением при 5°C в течение, по меньшей мере, 24 часов.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В этом исследовании изучалась стабильность (например, образование агрегатов, вязкость, химическая стабильность, и тому подобное) различных концентраций анти-VEGF в составе на основе аргинина. SEC и IEC использовали для контроля стабильности анти-VEGF в условиях стрессового и ускоренного хранения. Агрегация и вязкость анти-VEGF были и измерены и представлены в Таблице 2 ниже, и проиллюстрированы на Фигурах 2 и 4.

Агрегация всех составов при 40°C: Количество всех образованных агрегатов и димеров в каждом анти-VEGF составе после хранения в течение 0, 1, 2, и 4 недель при 40°C было оценено и представлено в Таблицах 3, 4, и 5 ниже, и проиллюстрировано на Фигурах 1 и 3.

Агрегация составов при 25 °C: Количество общей агрегации и образовавшихся димеров в каждом анти-VEGF составе (100 мг/мл) после хранения в течение 0, 2, 4, и 8 недель при 25°C было измерено и представлено в Таблице 6 ниже.

Агрегация составов при 2-8 °C: Количество общей агрегации и образовавшихся димеров в каждом анти-VEGF составе (100 мг/мл) после хранения в течение 0 и 4 недель при 2-8°C было измерено и представлено в Таблице 7 ниже.

Агрегация при различных концентрация аргинина при 40 °C: Количество общей агрегации в каждом анти-VEGF составе при различных концентрациях ацетата аргинина было измерено и представлено в Таблице 8 ниже.

Эффект инертных наполнителей и ионной силы : Эффект различных инертных наполнителей на стабильность анти-VEGF был исследован. Список изученных инертных наполнителей включает фосфат натрия, ацетат аргинина, ацетат натрия и хлорид гистидина. Результаты, полученные авторами изобретения, показали, что составы, содержащие хлорид аргинина и хлорид гистидина, агрегируют быстрее, чем все другие составы.

Стабильность анти-VEGF оценивали в различных буферных условиях. Результаты, полученные в этом исследовании, показали, что анти-VEGF является более стабильным в аргинин-цитратных буферах со значением рН между 4,0 и 6,0. Результаты, полученные при скрининге составов, показали, что анти-VEGF является стабильным и имеет уменьшенное формирование агрегатов и димеров при концентрации белка 100 мг/мл в 200 мМ аргинин-ацетате, 0,04% PS20 при значении pH 5,2.

Изобретение относится к биохимии. Описан фармацевтический состав для лечения ангиогенных заболеваний, содержащий антитело, которое связывается с VEGF, в аргинин ацетатном буфере, рН 4,5-6,0, и поверхностно-активное вещество, где антитело представляет собой бевацизумаб. Изобретение позволяет получать стабильный водный фармацевтический состав, содержащий терапевтически эффективное количество антитела. 6 н. и 64 з.п. ф-лы, 4 ил., 8 табл.

1. Фармацевтический состав для лечения ангиогенных заболеваний, содержащий антитело, которое связывается с VEGF, в аргинин ацетатном буфере, рН 4,5-6,0, и поверхностно-активное вещество, где антитело представляет собой бевацизумаб.

2. Фармацевтический состав по п. 1, где аргинин ацетатный буфер имеет рН 4,5-5,5.

3. Фармацевтический состав по п. 1, где аргинин ацетатный буфер имеет рН 4,8-5,4.

4. Фармацевтический состав по п. 1, где аргинин ацетатный буфер имеет рН 5,2.

5. Фармацевтический состав по любому из пп. 1-4, где концентрация ацетата аргинина в буфере составляет от приблизительно 25 мМ до приблизительно 250 мМ.

6. Фармацевтический состав по любому из пп. 1-4, где концентрация ацетата аргинина в буфере составляет от приблизительно 50 мМ до приблизительно 250 мМ.

7. Фармацевтический состав по любому из пп. 1-4, где концентрация ацетата аргинина в буфере составляет от приблизительно 75 мМ до приблизительно 250 мМ.

8. Фармацевтический состав по любому из пп. 1-4, где концентрация ацетата аргинина в буфере составляет от приблизительно 100 мМ до приблизительно 250 мМ.

9. Фармацевтический состав по любому из пп. 1-4, где концентрация ацетата аргинина в буфере составляет от приблизительно 120 мМ до приблизительно 240 мМ.

10. Фармацевтический состав по любому из пп. 1-4, где концентрация ацетата аргинина в буфере составляет от приблизительно 150 мМ до приблизительно 225 мМ.

11. Фармацевтический состав по любому из пп. 1-4, где концентрация ацетата аргинина в буфере составляет приблизительно 200 мМ.

12. Фармацевтический состав по любому из пп. 1-4, где данное поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат.

13. Фармацевтический состав по п. 12, где данный полисорбат представляет собой полисорбат 20.

14. Фармацевтический состав по любому из пп. 1-4 или 13, где концентрация данного поверхностно-активного вещества находится в пределах от приблизительно 0,0001% до приблизительно 1,0%.

15. Фармацевтический состав по любому из пп. 1-4 или 13, где концентрация данного поверхностно-активного вещества находится в пределах от приблизительно 0,01% до приблизительно 0,05%.

16. Фармацевтический состав по любому из пп. 1-4 или 13, где концентрация данного поверхностно-активного вещества составляет 0,04%.

17. Фармацевтический состав по любому из пп. 1-4 или 13, где концентрация данного антитела составляет от приблизительно 10 мг/мл до приблизительно 250 мг/мл.

18. Фармацевтический состав по любому из пп. 1-4 или 13, где концентрация данного антитела составляет от приблизительно 25 мг/мл до приблизительно 200 мг/мл.

19. Фармацевтический состав по любому из пп. 1-4 или 13, где концентрация данного антитела составляет от приблизительно 50 мг/мл до приблизительно 150 мг/мл.

20. Фармацевтический состав по любому из пп. 1-4 или 13, где концентрация данного антитела составляет от приблизительно 75 мг/мл до приблизительно 125 мг/мл.

21. Фармацевтический состав по любому из пп. 1-4 или 13, где данное антитело не подвергается предварительной лиофилизации.

22. Фармацевтический состав по любому из пп. 1-4 или 13, который является стерильным.

23. Фармацевтический состав по любому из пп. 1-4 или 13, который является стабильным при хранении при приблизительно 40°С в течение по меньшей мере 28 дней.

24. Фармацевтический состав по любому из пп. 1-4 или 13, который является водным и который вводят субъекту.

25. Фармацевтический состав по любому из пп. 1-4 или 13, где данный состав предназначен для внутривенного (в/в), подкожного (п/к) или внутримышечного (в/м) введения.

26. Фармацевтический состав по п. 25, который предназначен для в/в введения, и концентрация антитела составляет от приблизительно 10 мг/мл до приблизительно 250 мг/мл.

27. Фармацевтический состав по п. 26, который предназначен для в/в введения, и концентрация антитела составляет от приблизительно 50 мг/мл до приблизительно 100 мг/мл.

28. Фармацевтический состав по п. 25, который предназначен для п/к введения, и концентрация антитела составляет от приблизительно 25 мг/мл до приблизительно 250 мг/мл.

29. Фармацевтический состав по п. 28, который предназначен для п/к введения, и концентрация антитела составляет от приблизительно 50 мг/мл до приблизительно 100 мг/мл.

30. Фармацевтический состав для лечения ангиогенных заболеваний, содержащий антитело, которое связывается с VEGF, в аргинин ацетатном буфере и поверхностно-активное вещество, где антитело представляет собой бевацизумаб, где концентрация антитела составляет от приблизительно 75 мг/мл до приблизительно 100 мг/мл, аргинин ацетатный буфер имеет рН от 4,8 до 5,4, концентрация ацетата аргинина в буфере составляет от приблизительно 150 мМ до приблизительно 225 мМ, и поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат 20 с концентрацией от приблизительно 0,01 до приблизительно 0,05%.

31. Фармацевтический состав для лечения ангиогенных заболеваний, содержащий антитело, которое связывается с VEGF, в аргинин ацетатном буфере и поверхностно-активное вещество, где антитело представляет собой бевацизумаб, где концентрация антитела составляет от приблизительно 75 мг/мл до приблизительно 100 мг/мл, аргинин ацетатный буфер имеет рН 5,2, концентрация ацетата аргинина в буфере составляет приблизительно 200 мМ, и поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат 20 с концентрацией 0,04%.

32. Фармацевтический состав по любому из пп. 1-4, 13, 26-31, где состав содержится в изделии.

33. Состав по п. 32, где фармацевтический состав содержит антитело, которое связывается с VEGF, в аргинин ацетатном буфере и поверхностно-активное вещество, где антитело представляет собой бевацизумаб, причем концентрация антитела составляет от приблизительно 75 мг/мл до приблизительно 100 мг/мл, аргинин ацетатный буфер имеет рН от 4,8 до 5,4, концентрация аргинин ацетата в буфере составляет от приблизительно 150 мМ до приблизительно 225 мМ, и поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат 20 в концентрации от приблизительно 0,01 до приблизительно 0,05%.

34. Состав по п. 32, где фармацевтический состав содержит антитело, которое связывается с VEGF, в аргинин ацетатном буфере и поверхностно-активное вещество, где антитело представляет собой бевацизумаб, причем концентрация антитела составляет приблизительно 100 мг/мл, аргинин ацетатный буфер имеет рН 5,2, концентрация аргинин ацетата в буфере составляет приблизительно 200 мМ, и поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат 20 в концентрации 0,04%.

35. Способ уменьшения агрегации терапевтического моноклонального антитела, включающий получение состава данного антитела в аргинин ацетатном буфере и поверхностно-активном веществе, где концентрация антитела составляет приблизительно 100 мг/мл, аргинин ацетатный буфер имеет рН 5,2, концентрация аргинин ацетата в буфере составляет приблизительно 200 мМ, и поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат 20 в концентрации 0,04%, и где антитело представляет собой бевацизумаб.

36. Способ уменьшения агрегации терапевтического моноклонального антитела, включающий получение состава данного антитела в аргинин ацетатном буфере, рН 4,5-6,0, где антитело представляет собой бевацизумаб.

37. Способ по п. 36, где аргинин ацетатный буфер имеет рН 4,5-5,5.

38. Способ по п. 36 или 37, где аргинин ацетатный буфер имеет рН 4,8-5,4.

39. Способ по п. 36 или 37, где аргинин ацетатный буфер имеет рН 5,2.

40. Способ по п. 36 или 37, где концентрация ацетата аргинина в буфере составляет от приблизительно 25 мМ до приблизительно 250 мМ.

41. Способ по п. 36 или 37, где концентрация ацетата аргинина в буфере составляет от приблизительно 50 мМ до приблизительно 250 мМ.

42. Способ по п. 36 или 37, где концентрация ацетата аргинина в буфере составляет от приблизительно 75 мМ до приблизительно 250 мМ.

43. Способ по п. 36 или 37, где концентрация ацетата аргинина в буфере составляет от приблизительна 100 мМ до приблизительно 250 мМ.

44. Способ по п. 36 или 37, где концентрация ацетата аргинина в буфере составляет от приблизительно 120 мМ до приблизительно 240 мМ.

45. Способ по п. 36 или 37, где концентрация ацетата аргинина в буфере составляет от приблизительно 150 мМ до приблизительно 225 мМ.

46. Способ по п. 36 или 37, где концентрация ацетата аргинина в буфере составляет приблизительно 200 мМ.

47. Способ по п. 36, где состав дополнительно содержит поверхностно-активное вещество.

48. Способ по п. 47, где поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат.

49. Способ по п. 48, где данный полисорбат представляет собой полисорбат 20.

50. Способ по любому из пп. 47-49, где концентрация данного поверхностно-активного вещества находится в пределах от приблизительно 0,0001% до приблизительно 1,0%.

51. Способ по любому из пп. 47-49, где концентрация данного поверхностно-активного вещества находится в пределах от приблизительно 0,01% до приблизительно 0,05%.

52. Способ по любому из пп. 47-49, где концентрация данного поверхностно-активного вещества составляет 0,04%.

53. Способ по любому из пп. 36, 47-49, где концентрация данного антитела составляет от приблизительно 10 мг/мл до приблизительно 250 мг/мл.

54. Способ по любому из пп. 36, 47-49, где концентрация данного антитела составляет от приблизительно 25 мг/мл до приблизительно 200 мг/мл.

55. Способ по любому из пп. 36, 47-49, где концентрация данного антитела составляет от приблизительно 50 мг/мл до приблизительно 150 мг/мл.

56. Способ по любому из пп. 36, 47-49, где концентрация данного антитела составляет от приблизительно 75 мг/мл до приблизительно 125 мг/мл.

57. Способ по любому из пп. 36, 47-49, где данное антитело не подвергается предварительной лиофилизации.

58. Фармацевтический состав по любому из пп. 1-4, 13, 26-31, где состав содержится во флаконе с пробкой, прокалываемой шприцом.

59. Фармацевтический состав по п. 58, где флакон хранят при температуре приблизительно 2-8°С.

60. Фармацевтический состав по п. 58 или 59, где флакон представляет собой флакон объемом 3 куб.см, 20 куб.см или 50 куб.см.

61. Фармацевтический состав по п. 58 или 59, где фармацевтический состав содержит антитело, которое связывается с VEGF, в аргинин ацетатном буфере и поверхностно-активное вещество, причем концентрация антитела в составе составляет от приблизительно 75 мг/мл до приблизительно 100 мг/мл, аргинин ацетатный буфер имеет рН от 4,8 до 5,4, концентрация аргинин ацетата в буфере составляет от приблизительно 150 мМ до приблизительно 225 мМ, и поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат 20 в концентрации от приблизительно 0,01 до приблизительно 0,05%, и где антитело представляет собой бевацизумаб.

62. Фармацевтический состав по любому из пп. 58 или 59, где фармацевтический состав содержит антитело, которое связывается с VEGF, в аргинин ацетатном буфере и поверхностно-активное вещество, причем концентрация антитела в составе составляет приблизительно 100 мг/мл, аргинин ацетатный буфер имеет рН 5,2, концентрация аргинин ацетата в буфере составляет приблизительно 200 мМ, и поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат 20 в концентрации 0,04%, и где антитело представляет собой бевацизумаб.

63. Фармацевтический состав по любому из пп. 1-4, 13, 26-31, где состав находится внутри емкости.

64. Фармацевтический состав по п. 63, где данный фармацевтический состав является замороженным.

65. Фармацевтический состав по п. 63, где емкость является емкостью из нержавеющей стали, и где фармацевтический состав содержит антитело, которое связывается с VEGF, в аргинин ацетатном буфере и поверхностно-активное вещество, причем концентрация антитела в составе составляет от приблизительно 75 мг/мл до приблизительно 100 мг/мл, аргинин ацетатный буфер имеет рН от 4,8 до 5,4, концентрация аргинин ацетата в буфере составляет от приблизительно 150 мМ до приблизительно 225 мМ, и поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат 20 в концентрации от приблизительно 0,01 до приблизительно 0,05%, и где антитело представляет собой бевацизумаб.

66. Фармацевтический состав по п. 63, где емкость представляет собой емкость из нержавеющей стали, и где фармацевтический состав содержит антитело, которое связывается с VEGF, в аргинин ацетатном буфере и поверхностно-активное вещество, причем концентрация антитела в составе составляет приблизительно 100 мг/мл, аргинин ацетатный буфер имеет рН 5,2, концентрация аргинин ацетата в буфере составляет приблизительно 200 мМ, и поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат 20 в концентрации 0,04%, и где антитело представляет собой бевацизумаб.

67. Способ лечения ангиогенных заболеваний у субъекта, включающий введение фармацевтического состава субъекту в количестве, эффективном для лечения данного заболевания или расстройства, где фармацевтический состав содержит антитело, которое связывается с VEGF, в аргинин ацетатном буфере и поверхностно-активное вещество, где антитело представляет собой бевацизумаб, причем концентрация антитела составляет от приблизительно 75 мг/мл до приблизительно 100 мг/мл, аргинин ацетатный буфер имеет рН от 4,8 до 5,4, концентрация аргинин ацетата в буфере составляет от приблизительно 150 мМ до приблизительно 225 мМ, и поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат 20 в концентрации от приблизительно 0,01 до приблизительно 0,05%.

68. Способ лечения ангиогенных заболеваний у субъекта, включающий введение фармацевтического состава субъекту в количестве, эффективном для лечения данного заболевания или расстройства, где фармацевтический состав содержит антитело, которое связывается с VEGF, в аргинин ацетатном буфере и поверхностно-активное вещество, где антитело представляет собой бевацизумаб, причем концентрация антитела составляет приблизительно 100 мг/мл, аргинин ацетатный буфер имеет рН 5,2, концентрация аргинин ацетата в буфере составляет приблизительно 200 мМ, и поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат 20 в концентрации 0,04%.

69. Способ по п. 67 или 68, где заболевание представляют собой рак.

70. Способ п. 69, где рак представляет собой рак ободочной и прямой кишки, рак легких, рак молочной железы, рак почки или глиобластому.