Способ фотодинамической терапии локальных очагов инфекции Российский патент 2017 года по МПК A61N5/67 A61K31/409 A61P31/00 

Настоящее изобретение относится к микробиологии и медицине, а более конкретно к способам лечения локальных очагов хронической инфекции.

Проблема борьбы с инфекционными заболеваниями, связанная с возрастающей резистентностью патогенных бактерий, вызывающих хронические заболевания различной локализации, к антибиотикам широкого спектра действия, стала одной из основных проблем современной медицины. Установлено, что имеющие сложную структуру организованные сообщества патогенных бактерий (так называемые бактериальные биопленки) практически не поддаются терапии с помощью антибиотиков и являются причиной не только хронических инфекционных заболеваний (таких как гнойные раны, трофические язвы), но и возникающих тяжелых осложнений в кардиохирургии, урологии и других областях медицины, при которых в организм пациента вводятся медицинские изделия (катетеры, стенты, искусственные клапаны и суставы). Кроме того, установлено, что одной из причин образования почечных камней и камней желчного пузыря, а также до 80% инфекционных рецидивов мочекаменной болезни являются именно бактериальные биопленки [Романова Ю.М. и др. Микробные сообщества на мочевых камнях // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2015. №2. Стр. 20-25].

Сложная инфраструктура и иерархия бактерий в бактериальной биопленке, формирование ею специальных средств жизнеобеспечения и защиты в виде матрикса приводят к тому, что для лечения таких инфекционных поражений дозы антибиотиков надо было бы увеличивать в сотни раз, что выходит за пределы реальных возможностей организма.

Обнаружено, что для инактивации биопленок может быть использована фотодинамическая терапия, причем у бактерий не формируется резистентность к этому способу лечения. Наиболее целесообразно для повышения эффективности фотодинамической инактивации бактерий и биопленок использовать катионные фотосенсибилизаторы, которые позволяют эффективно воздействовать как на грамположительные, так и на грамотрицательные бактерии [Патент РФ №2282647, Патент РФ №2397172]. Возбуждение этих фотосенсибилизаторов осуществляется в спектральном диапазоне 670-770 нм.

Известен способ фотодинамической терапии очагов бактериального поражения [Патент РФ №2282647]. В этом способе осуществляют сенсибилизацию очага бактериального поражения фотосенсибилизатором на основе катионных кватернизованных хлорметилзамещенных фталоцианинов общей формулы МРс(СН₂ Х)_nCl_n (где Рс = остаток фталоцианина C₃₂H₁₆N₈, M=Zn, AlY, n=6÷8, Y=Cl, OH, OSO₃H). Этот способ фотодинамического лечения очагов бактериального поражения выбран в качестве ближайшего аналога.

Недостаток известного способа фотодинамической терапии обусловлен тем, что при значительной инвазии хронического инфекционного поражения в подлежащие ткани возбуждение фотосенсибилизаторов, накопившихся в очаге хронического инфекционного поражения, оказывается неэффективным, как показали исследования авторов, если облучение производится в спектральном диапазоне 670-780 нм. Авторами экспериментально установлено, что продукты жизнедеятельности формирующих биопленки бактерий, в частности возбудителей гнойных раневых инфекций, имеют широкую полосу интенсивного оптического поглощения в спектральном диапазоне 600-780 нм. При облучении таких очагов значительная часть света поглощается продуктами жизнедеятельности бактерий, и, соответственно, не возбуждает молекулы фотосенсибилизатора, вследствие чего эффективность фотодинамического лечения снижается.

В изобретении решается задача повышения эффективности фотодинамической терапии локальных очагов инфекции за счет увеличения доли светового излучения, которая возбуждает находящиеся в тканях молекулы фотосенсибилизатора.

Задача решается тем, что в способе фотодинамической терапии локальных очагов инфекции, включающем сенсибилизацию очагов катионным фотосенсибилизатором и их облучение светом на длине волны поглощения фотосенсибилизатора, используют фотосенсибилизатор с поглощением в спектральном диапазоне 810-850 нм, в качестве фотоактивной субстанции фотосенсибилизатора используют метиловый эфир 13³-N-(N-метилникотинил)бактериопурпуринимида.

Задача решается также тем, что сенсибилизацию осуществляют композицией на основе метилового эфира 13³-N-(N-метилникотинил)бактериопурпуринимида аппликационно.

Задача решается также тем, что сенсибилизацию осуществляют внутривенным введением водной композиции метилового эфира 13³-N-(N-метилникотинил)-бактериопурпуринимида.

Задача решается также тем, что сенсибилизацию осуществляют в течение 60-180 мин.

Задача решается также тем, что в процессе сенсибилизации контролируют интенсивность флуоресценции фотосенсибилизатора, а облучение осуществляют после достижения максимальной интенсивности флуоресценции.

Сущность изобретения поясняется фиг. 1-4, где на фиг. 1 представлены результаты исследований раневой поверхности животных опытной группы (с антибактериальной ФДТ) и контрольной группы (без антибактериальной ФДТ) при аппликационной сенсибилизации, на фиг. 2 представлены данные одного из исследований по изучению зависимости эффективности фотодинамической инактивации биопленок Pseudomonas aeruginosa от дозы облучения, на фиг. 3 - зависимости эффективности фотодинамической инактивации биопленок Pseudomonas aeruginosa от времени инкубации в водной дисперсии на основе метилового эфира 13³-N-(N-метилникотинил)бактериопурпуринимида с концентрацией 1 мМ, на фиг. 4 - результаты исследований раневой поверхности животных опытной группы (с антибактериальной ФДТ) и контрольной группы (без антибактериальной ФДТ) при внутривенном введении.

Предлагаемый способ осуществляют следующим образом.

Локальный очаг инфекции в течение 60-180 мин сенсибилизируют катионным фотосенсибилизатором. В качестве фотосенсибилизатора может быть использована композиция на основе метилового эфира 13³-N-(N-метилникотинил)-бактериопурпуринимида. Сенсибилизацию осуществляют, в зависимости от вида локального очага инфекции, аппликационно либо внутривенным введением фотосенсибилизатора. Сенсибилизацию осуществляют в течение 60-180 мин, контролируя интенсивность флуоресценции фотосенсибилизатора, а после достижения максимальной интенсивности флуоресценции осуществляют облучение излучением, поглощаемым фотосенсибилизатором.

Ниже приведены конкретные примеры осуществления заявляемого изобретения.

Пример 1. Фотодинамическая терапия локальных очагов инфекции. Экспериментальные исследования in vivo проводили на белых мышах линии Balb/C, самцах массой 18-20 г. Использована модель хронической инфекции кожной раны. В эксперименте использовали клинический изолят Staphylococcus aureus. Мышам проводили обезболивание и наносили хирургическую кожную рану размером 1 см на спине. Поверхность раны инфицировали суточной бульонной культурой в объеме 20 мкл. Инокуляция составляла примерно 2⋅10⁷ колониеобразующих единиц (КОЕ). На следующий день формировалась глубокая гнойная рана. Инфицированную раневую поверхность аппликационно сенсибилизировали в течение 1,5 часов наложением стерильной пленочной повязки Tegaderm™, пропитанной 200 мкл водной-кремофорной композицией метилового эфира 13³-N-(N-метилникотинил)бактериопурпуринимида. После этого производили облучение в течение 20 мин длиной волны 825 нм и плотностью мощности 60 мВт/см² (плотность световой дозы около 70 Дж/см²). Клиническая оценка течения раневого процесса у экспериментальных животных производилась с учетом выраженности воспалительных явлений в области раны (отек, количество и характер гнойного отделяемого, сроки отторжения струпа и полного заживления). Результаты исследований раневой поверхности животных опытной группы (с антибактериальной ФДТ) и контрольной группы (без антибактериальной ФДТ) представлены на Фиг. 1.

Пример 2. Фотодинамическая инактивация биопленок грамотрицательных бактерий Pseudomonas aeruginosa.

Культуру Pseudomonas aeruginosa 32 выращивали в LB-бульоне с аэрацией при 37°С 18 ч до стационарной фазы. Ночную культуру разводили в 100 раз LB-бульоном в объеме 20 мл и стерильно вносили в плоскодонные пластиковые планшеты по 200 мкл в лунку. Крышки «Calgary Device» погружали в лунки и инкубировали при 37°С 18 ч в темноте для образования биопленок.

После инкубации биопленки отмывали от планктонных бактерий, дважды опуская крышки с колышками в плоскодонные планшеты с 180 мкл дистиллированной воды в лунках. Раствор фотосенсибилизатора с концентрацией 1 мМ вносили в плоскодонные пластиковые планшеты по 200 мкл в лунку, а для контроля вносили физиологический раствор. Крышки с колышками «Calgary Device» погружали в планшеты и инкубировали в темноте при 37°С в течение 30, 60 или 90 мин. После инкубации крышки с колышками помещали в плоскодонные пластиковые планшеты с 200 мкл физиологического раствора в лунках для облучения. Дозу облучения изменяли от 0 до 40 Дж/см², изменяя время облучения. Облученные биопленки разрушали методом соникации в ультразвуковой бане в присутствии тающего льда в течение 30 минут. Из полученных суспензий отбирали 30 мкл и готовили шесть десятикратных разведений в физиологическом растворе в плоскодонных пластиковых планшетах и высевали по 20 мкл на чашки с L-агаром, визуально разделенные на 6 секторов, для подсчета жизнеспособных колоний. Подсчет жизнеспособных колоний проводили после инкубации чашек Петри при 37°С в течение 1 суток. Эффективность фотодинамического воздействия определяли по уменьшению количества КОЕ/мл (колониеобразующих единиц/мл) бактерий по сравнению с биопленками, не подвергавшимися облучению.

На Фиг. 2 для иллюстрации приведены данные одного из исследований по изучению зависимости эффективности фотодинамической инактивации биопленок Pseudomonas aeruginosa от дозы облучения. Сенсибилизацию биопленок проводили в водной дисперсии на основе предлагаемого фотосенсибилизатора с концентрацией 1 мМ в течение 60 мин: кривая 2 - количество колониеобразующих единиц в единице объема (КОЕ/мл) после фотосенсибилизации, но без облучения (контроль), кривая 1 - количество КОЕ/мл в облученных лунках).

На Фиг. 3 для иллюстрации приведены данные одного из исследований по изучению зависимости эффективности фотодинамической инактивации биопленок Pseudomonas aeruginosa в лунках 24-луночного планшета от времени сенсибилизации (30, 60 или 90 мин) в водной дисперсии метилового эфира 13³-N-(N-метилникотинил)-бактериопурпуринимида с концентрацией 1 мМ: темные столбики - количество колониеобразующих единиц в единице объема (КОЕ/мл) после без облучения (контроль), светлые столбики - количество КОЕ/мл в облученных лунках (доза облучения 35 Дж/см²). Использованы следующие обозначения: обозначение ФС - сенсибилизация фотосенсибилизатором, время сенсибилизации указано под обозначением; обозначение К - контроль, при котором бактериальная биопленка в течение 90 мин находится в контакте с физиологическим раствором без ФС. Время, плотность мощности и плотность дозы для всех лунок одинаковы.

Пример 3. Фотодинамическая терапия локальных очагов инфекции.

Экспериментальные исследования in vivo проводили на 2 группах белых мышей линии Balb/C, самцах массой 18-20 г. Использована модель хронической инфекции кожной раны. В эксперименте использовали клинический изолят Staphylococcus aureus. Мышам проводили обезболивание и наносили хирургическую кожную рану размером 1 см на спине. Поверхность раны инфицировали суточной бульонной культурой в объеме 20 мкл. Инокуляция составляла примерно 2⋅10⁷ колониеобразующих единиц (КОЕ). На следующий день формировалась глубокая гнойная рана. Инфицированную раневую поверхность сенсибилизировали внутривенным введением водной композиции метилового эфира 13³-N-(N-метилникотинил)бактериопурпуринимида. Контролировали интенсивность флуоресценции метилового эфира 13³-N-(N-метилникотинил)-бактериопурпуринимида в спектральном диапазоне 830-860 нм.

Обнаружено, что максимальная интенсивность флуоресценции в инфицированной ране достигается во временном интервале 60-180 мин, при этом фотосенсибилизатор селективно накапливается в инфицированной ране, соотношение между интенсивностями флуоресценции в инфицированной ране и здоровой коже превышает 5. Через 120 минут после введения проводили облучение мышей опытной группы в течение 4 мин излучением с длиной волны 825 нм и плотностью мощности 60 мВт/см² (плотность световой дозы около 14 Дж/см²); мыши контрольной группы не облучались. Клиническая оценка течения раневого процесса у экспериментальных животных производилась с учетом выраженности воспалительных явлений в области раны (отек, количество и характер гнойного отделяемого, сроки отторжения струпа и полного заживления). Результаты исследований раневой поверхности животных опытной группы (с антибактериальной ФДТ) и контрольной группы (без антибактериальной ФДТ) при внутривенном введении представлены на фиг. 4.

Субстанцию метилового эфира 13³-N-(N-метилникотинил)бактериопурпуринимида получали в несколько стадий, включающих получение метилового эфира N-аминобактериопурпуринимида за счет взаимодействия гидразингидрата с бактериопурпурином, полученным из бактериохлорофилла а, и последующего метилирования продукта реакции с помощью диазометана. На второй стадии метиловый эфир N-аминобактериопурпуринимида обрабатывают хлорангидридом никотиновой кислоты и кватернизуют пиридиновый атом азота в ацилированном бактериопурпуринимиде иодметаном, что приводит к заявляемому катионному метиловому эфиру 13³-N-(N-метилникотинил)бактериопурпуринимида с основной полосой поглощения при 827 нм.

Анализ результатов исследований свидетельствует о высокой эффективности фотодинамического лечения инфицированных ран. Время полного заживления инфицированных ран после фотодинамического лечения значительно короче по сравнению со временем заживления инфицированной раны без лечения; антибактериальная ФДТ сокращает время заживления инфицированных ран практически вдвое.

Изобретение относится к микробиологии и медицине и может быть использовано для лечения локальных очагов хронической инфекции. Осуществляют сенсибилизацию очагов инфекции катионным фотосенсибилизатором и их облучение светом на длине волны поглощения фотосенсибилизатора. Используют фотосенсибилизатор с поглощением в спектральном диапазоне 810-850 нм. В качестве фотоактивной субстанции фотосенсибилизатора используют метиловый эфир 13³-N-(N-метилникотинил)бактериопурпуринимида. Способ позволяет повысить эффективность фотодинамического лечения инфицированных ран за счет увеличения доли светового излучения, которая возбуждает находящиеся в тканях молекулы фотосенсибилизатора и не поглощается продуктами жизнедеятельности бактерий. 4 з.п. ф-лы, 4 ил., 3 пр.

1. Способ фотодинамической терапии локальных очагов инфекции, включающий сенсибилизацию очагов катионным фотосенсибилизатором и их облучение светом на длине волны поглощения фотосенсибилизатора, отличающийся тем, что используют фотосенсибилизатор с поглощением в спектральном диапазоне 810-850 нм, в качестве фотоактивной субстанции фотосенсибилизатора используют метиловый эфир 13³-N-(N-метилникотинил)бактериопурпуринимида.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что сенсибилизацию осуществляют композицией на основе метилового эфира 13³-N-(N-метилникотинил)бактериопурпуринимида аппликационно.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что сенсибилизацию осуществляют системным введением водной композиции метилового эфира 13³-N-(N-метилникотинил)бактериопурпуринимида.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что сенсибилизацию осуществляют в течение 60-180 мин.

5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в процессе сенсибилизации контролируют интенсивность флуоресценции фотосенсибилизатора, а облучение осуществляют после достижения максимальной интенсивности флуоресценции.