ФОТОСЕНСИБИЛИЗАТОР БАКТЕРИОХЛОРИНОВОГО РЯДА ДЛЯ ФОТОДИНАМИЧЕСКОЙ ТЕРАПИИ И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ Российский патент 2020 года по МПК A61K47/60 A61K31/409 A61P35/00 C07D487/22 A61N5/67 

Настоящее изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности, а именно к разработке новых фотосенсибилизаторов для фотодинамической терапии (ФДТ) рака.

Фотодинамическая терапия - метод лечения онкологических заболеваний, основанный на применении светочувствительных веществ - фотосенсибилизаторов и света определенной длины волны (https://ru.wikipedia.org/wiki/Фотодинамическая_терапия).

Фотосенсибилизатор обычно вводится в организм внутривенно, однако возможно аппликационное, либо пероральное применение. Вещества для ФДТ обладают свойством избирательного накопления в опухолях, после чего пораженные ткани облучают светом с длиной волны, соответствующей максимуму поглощения красителя. В качестве источника света в настоящее время используются лазерные установки, позволяющие получать свет определенной длины волны. Поглощение молекулами фотосенсибилизатора квантов света в присутствии кислорода приводит к фотохимической реакции, в результате которой молекулярный триплетный кислород превращается в синглетный, а также образуется большое количество высокоактивных радикалов. Синглетный кислород и радикалы вызывают в клетках опухоли некроз и апоптоз (два варианта гибели клеток). ФДТ также приводит к нарушению питания и гибели опухоли за счет повреждения ее микрососудов [Улащик B.C. Фотодинамическая терапия - технология XXI века // Физиотерапия, бальнеология и реабилитация: журнал. - 2013. - №1. - С. 36-43.].

В настоящее время в клинике применяются фотосенсибилизаторы различных классов (порфирины и их металлокомплексы, хлорины, бензопорфирины, фталоцианины и др.). Особый интерес представляют природные хлорофиллы и их производные с интенсивным поглощением в ближней ИК-области спектра. Свет с длиной волны в области 660 нм проникает в ткани на глубину до 10-15 мм, что существенно расширяет возможности используемых в настоящее время методов лечения крупных и глубокозалегающих опухолей. В основе большинства современных фотосенсибилизаторов лежит структура хлорина е₆, получаемого из природного сырья.

Среди полимеров, разрешенных для медицинского использования, важное место занимают полоксамеры - блок-сополимеры полиоксиэтилена и полиоксипропилена (US 3740421). Различное сродство к воде полиоксипропиленовой (гидрофобной) и полиоксиэтиленовых (более гидрофильных) частей молекул полоксамеров придает им в водном растворе свойства поверхностно-активных веществ. Одним из таких полимеров является Плюроник 123 (Pluronic 123), который состоит из двух блоков по 20 мономерных звеньев окиси этилена, разделенных блоком из 70 звеньев окиси пропилена. Его строение выражается формулой НО(CH₂CH₂O)₂₀(СН₂СН(СН₃)O)₇₀(CH₂CH₂O)₂₀Н.

Ближайшим аналогом заявляемого изобретения является препарат для фотодинамической терапии, выполненный в форме наноструктурированной водной дисперсии, включающий фотосенсибилизатор - производное бактериопурпуринимида, причем производное бактериопурпуринимида представляет собой метиловый эфир О-пропилоксим-N-пропоксибактериопурпуринимида с интенсивной полосой поглощения в области 800 нм (RU 2521327).

К недостаткам указанного препарата следует отнести низкую растворимость субстанции метилового эфира О-пропилоксим-N-пропоксибактериопурпуринимида в воде, что приводит к снижению его биодоступности, а, следовательно, и эффективности терапии с использованием данного соединения. Водорастворимая форма указанного соединения, полученная с использованием Кремофора (Kolliphor ELP), также обладает рядом недостатков, включая низкий уровень селективности и накопления в опухолевых тканях, высокую степень трудоемкости процесса приготовления, низкий уровень стабильности, что приводит к необходимости хранения указанной формы для введения в замороженном виде.

Другим недостатком данного препарата является ограниченный интервал времени между его введением и достижением максимума накопления в опухолевых тканях. Данная особенность серьезно усложняет процедуру фотодинамической терапии, так как препарат необходимо вводить пациенту непосредственно перед облучением в темном помещении.

Техническим результатом заявленного изобретения является расширение арсенала данного класса ФС за счет создания препарата с высоким уровнем фотоиндуцированной противоопухолевой активности, проявляющего низкий уровень токсичности, удобного для приготовления потребительской формы, хранения и проведения сеанса фотодинамической терапии.

Технический результат обеспечивает фотосенсибилизатор для фотодинамической терапии с формулой (1):

, где количество звеньев (а) лежит в диапазоне от 2 до 130, количество звеньев (b) лежит в диапазоне от 15 до 67, в качестве R₁ может выступать соединение общей формулы C_xH_2x+1, где х=1÷5.

Эффективность и безопасность заявленного фотосенсибилизатора обеспечивается за счет синергетического эффекта, обусловленного высокой растворимостью в воде, амфифильностью и высоким уровнем фотоиндуцированной противоопухолевой активности. В рамках исследований препарата авторами было обнаружено, что заявленный фотосенсибилизатор обладает высоким уровнем биодоступности и селективности в отношении опухолевых тканей. Предположительно, данный эффект достигается за счет того, что в водной среде молекулы заявленного фотосенсибилизатора образуют коллоидные структуры, обеспечивающие доставку и накопление препарата в органах и тканях - мишенях. Одновременно с этим, время между введением и достижением максимума накопления препарата в опухолевых тканях пациента позволяет осуществить введение препарата за 2 часа до проведения сеанса фотодинамической терапии в темном помещении.

В немалой степени достижение технического результата обеспечивает способ получения заявленного фотосенсибилизатора, включающий в себя:

- реакцию активации карбоксильной группы соединения со структурной формулой (2):

, где в качестве R₁ может выступать соединение общей формулы C_xH_2x+1, где х=1÷5, а в качестве R₂ может выступать соединение общей формулы C_yH_2y+1, где у=1÷5, в органическом растворителе с использованием активатора с получением промежуточного соединения со структурной формулой (3):

, где в качестве R₁ может выступать соединение общей формулы C_xH_2x+1, где х=1÷5;

- реакцию образования активированного комплекса из вещества со структурной формулой (3) в присутствии катализатора с получением активированного комплекса со структурной формулой (4):

, где в качестве R₁ может выступать соединение общей формулы C_xH_2x+1, где х=1÷5, а в качестве R₂ может выступать соединение общей формулы С_уН_2у+1, где у=1÷5;

- реакцию присоединения блок-сополимера полиоксиэтилена и полиоксипропилена к активированному комплексу со структурной формулой (4) с получением фотосенсибилизатора по п. 1.

В качестве активатора может быть использован 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид, 1,3-дициклогексилкарбодиимид или N-этоксикарбонил-2-этокси-1,2-дигидрохинолин.

В качестве катализатора может быть использован диметиламинопиридин.

В качестве блок-сополимера полиоксиэтилена и полиоксипропилена могут быть использованы любые блок-сополимеры полиоксиэтилена и полиоксипропилена с общей формулой (5).

, где количество звеньев а лежит в диапазоне от 2 до 130, а количество звеньев b лежит в диапазоне от 15 до 67.

Например, для этих целей могут быть использованы Плюроники (Pluronic) L61, L121, F127, F68, F87, P105, P123. Также для этих целей могут быть использованы различные полоксамеры: полоксамер 124, полоксамер 188, полоксамер 237, полоксамер 338, полоксамер 407 и другие.

Как вариант, указанный способ может включать дополнительную стадию очистки полученного фотосенсибилизатора, например, методом диализа.

Как вариант, указанный способ может включать дополнительную стадию лиофильного высушивания полученного фотосенсибилизатора с получением его кристаллической формы.

Основная сложность получения конъюгатов молекул фотосенсибилизаторов с другими веществами состоит в сохранении фотоиндуцированной противоопухолевой активности полученного продукта. Стратегия синтеза заявленного фотосенсибилизатора состоит в проведении реакции активации дипропоксибактериопурпуринимида с последующим присоединением полоксамера. Разработанный подход позволяет получить монозамещенный продукт присоединения с высоким выходом. Для активации дипропоксибактериопурпуринимида был использован реагент EDC (1-Этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид). Данный агент был выбран ввиду того, что другие активирующие агенты, такие, как EEDQ и DCC, образуют побочные продукты, слабо растворимые в воде и приводящие к потере эффективности при диализе. Однако, использование указанных выше агентов также возможно. Для создания активированного комплекса в качестве катализатора был использован диметиламинопиридин. Реакции активации и присоединения проводились в хлористом метилене.

Выбор природного пигмента для создания заявленного фотосенсибилизатора обусловлен рядом факторов, в том числе их распространенностью в природе, интенсивностью поглощения в длинноволновой области спектра, структурной близостью к эндогенным порфиринам. Наличие указанных свойств позволяет предположить относительно низкий уровень токсичности подобных соединений и их быстрое выведение из организма.

Также заявленное изобретение обеспечивает лекарственное средство для лечения онкологических заболеваний, включающее в себя заявленный фотосенсибилизатор и фармацевтически приемлемые добавки. Например, указанное лекарственное средство может быть использовано для лечения онкологических заболеваний предстательной железы.

Как вариант, в качестве фармацевтически приемлемой добавки заявленное лекарственное средство может включать изотонический раствор.

Предлагаемое изобретение иллюстрируется нижеследующими примерами. Пример 1. Получение заявленного фотосенсибилизатора.

К раствору О-пропилоксим-N-пропоксибактериопурпуринимида (32 мг; 0,047 ммоль) в 4,5 мл хлороформа поочередно добавляли 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид (7,5 мг, 0,017 ммоль) и диметиламинопиридин (0,6 мг, 002 ммоль). Полученную смесь оставляли при перемешивании на 20 минут. Затем добавляли полоксамер 407 (793 мг, 0,063 ммоль). В результате было получено 753 мг конъюгата О-пропилоксим-N-пропоксибактериопурпуринимида с полоксамером 407.

ЭСП, λ_max, нм (относительные интенсивности): 363, 415, 553 и 800 (1: 0,76: 0,28:0,86).

Спектр ¹Н ЯМР (300 МГц, CDCl₃, δ, м.д.): 8.60 (Н, с, 5-Н), 8.53 (Н, с, 10-Н), 8.36 (Н, с, 20-Н), 5.30 (Н, м, 17-Н), 4.54 (4Н, м, -СН₂-СН₃), 4.13 (Н, м, 7-Н), 3.88 (Н, м, 8-Н), 3.64 (4Н, м, -СН₂-СН₂-Ом), 3,55 (2Н, м, =СН-СН₂-O), 3.40 (Н, м, -СН₂=), 3.27 (3Н, с, 2-СН₃), 2.72 (ЗН, с, 3²-СН₃), 2.02 (2Н, м, 8¹ -СН₂), 1.80 (3Н, д, 7-СН₃), 1.63 (9Н, м, -O-СН₂-СН₂-СН₃), 1.13 (3Н, м, -СН3), 0.00 (с, NH), с 0.26 (с, NH).

Таким образом, был получен заявленный фотосенсибилизатор.

Пример 2. Оценка фотоиндуцированной противоопухолевой активности заявленного фотосенсибилизатора

Для оценки фотоиндуцированной противоопухолевой активности заявленного фотостабилизатора in vitro были использованы культуры клеток саркомы S37 и клеток карциномы толстой кишки Colo26.

Все клеточные культуры получены из ФГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского, института цитологии РАН и American Type Culture Collection (АТСС). Пассирование опухолевых клеток in vitro проводили согласно рекомендациям, указанным в сертификате культуры клеток с использованием соответствующих сред с добавлением 2 мМ-L-глутамина и 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС). Культивирование клеток проводили в стандартных условиях при 37°С во влажной атмосфере с 5% содержанием углекислого газа в CO₂ - инкубаторе. Клетки рассевали в лунки плоскодонного 96-луночного микропланшета (Costar, США) в количестве 10⁴ клеток на лунку. Тестируемые соединения - заявленный фотосенсибилизатор (группа 1) и эмульсия О-пропилоксим-N-пропоксибактериопурпуринимида в Kolliphor ELP (4%) в качестве положительного контроля (группа 2) вносили через 24 часа после посева, варьируя концентрации фотосенсибилизаторов от 0,03 до 28 мкМ. В качестве положительного контроля был выбран О-пропилоксим-N-пропоксибактериопурпуринимид в Kolliphor ELP [патент RU 2521327]. Для оценки эффективности через 0,5, 1, 2, 4 и 6 часов инкубации с фотосенсибилизаторами клетки облучали галогеновой лампой с использованием широкополосного фильтра КС-19 (λ≥720 нм) при плотности мощности - 18,0±1,0 мВт/см², расчетной световой дозе - 10 Дж/см². После облучения клетки инкубировали в стандартных условиях в течение суток.

В качестве исследуемого фотосенсибилизатора использовался конъюгат О-пропилоксим-М-пропоксибактериопурпуринимида с полоксамером 237. Отрицательным контролем послужили клетки, не подвергавшиеся воздействию. Выживаемость клеток оценивали с использованием колориметрического МТТ-теста [Carmichael J., DeGraff W.G., Gazdar A.F., Minna J.D., Mitchell J.B Evaluation of a tetrazolium-based semiautomated colorimetric assay: assessment of chemosensitivity testing. Canser Res. 47: 936-942; 1987], no результатам которого вычисляли величину ИК₅₀ (концентрацию ФС, при которой после воздействия наблюдается 50% гибель клеток). Количественные параметры рассчитывали по результатам трех независимых тестов.

Для статистического анализа полученных результатов использовался критерий Стьюдента.

Результаты.

При изучении эффективности заявленного фотосенсибилизатора в сравнении с эмульсией О-пропилоксим-Ы-пропоксибактериопурпуринимида в Kolliphor ELP (4%) выявлено, что оба ФС проявляют активность в отношении обеих культур опухолевых клеток (таблица 1). При этом, статистически значимых различий значений ИК₅₀ между исследуемыми группами не обнаружено.

Таким образом, исходя из полученных данных можно сделать вывод о высоком уровне фотоиндуцированной противоопухолевой активности заявленного фотосенсибилизатора.

Пример 3. Эффективность заявленного фотосенсибилизатора.

Для оценки фотоиндуцированной противоопухолевой активности заявленного фотостабилизатора in vivo были использованы мыши-гибриды первого поколения F1 (СВА х C57B1/6J), самки (возраст 7-9 недель, вес тела 18-22 г), полученные из питомника лабораторных животных «Андреевка» ФГБУН "НЦБМТ" ФМБА России. Животные содержались в отдельных комнатах, в контролируемых условиях окружающей среды (20-24°С и 30-57% относительная влажность). Животные получали стандартный сертифицированный сбалансированный по питательным веществам апатогенный гранулированный корм «Чара» (ЗАО «Ассортимент АГРО», Россия) и чистую питьевую воду без ограничения.

Для экспериментов мышам прививали опухолевые клетки саркомы мягких тканей мыши линии S37 по 1×10⁶ клеток подкожно в область икроножной мышцы с внешней стороны бедра в объеме 0,08 мл 0,9% раствора NaCl. Исследования проводили на 7 сутки после инокуляции опухоли, когда ее объем достигал 130-160 мм³.

Все манипуляции проводили в соответствии с национальными и международными правилами гуманного обращения с животными.

В качестве тестируемого образца использовался использовался конъюгат О-пропилоксим-N-пропоксибактериопурпуринимида с Плюроником F127 (группа 1) и эмульсия О-пропилоксим-N-пропоксибактериопурпуринимида в Kolliphor ELP (4%) (группа 2, положительный контроль).

Фотодинамическую терапию проводили дистанционно на 7-ой день роста опухоли саркомы S37 у мышей с введенными образцами в дозе 5 мг/кг по активному компоненту. Животным группы отрицательного контроля вводили внутривенно изотонический 0,9% раствор хлорида натрия. В качестве анестезии применяли дроперидол (раствор для инъекций 2,5 мг/мл, ФГУП «Московский эндокринный завод», Россия) в дозе 0.25 мг/мышь внутрибрюшинно. К моменту проведения ФДТ объем опухолей варьировал от 130 до 160 мм³.

Для облучения использовали светодиодный источник с длиной волны 810±21 нм (ФГУП ГНЦ НИОПИК, Россия): плотность мощности 100 мВт/см² и плотность энергии 150 Дж/см². Интервал между введением ФС и облучением составил 2 ч. За животными, у которых не было продолженного роста опухоли, наблюдали 90 сут после лечения. Оценку противоопухолевого эффекта проводили по торможению роста опухоли в исследуемых группах. Объем опухоли рассчитывали по формуле 6.

V=a*b*c [мм³]

, где а - длина, b - ширина и с - высота опухолевого узла.

Статистическую обработку результатов проводили с использованием t-критерия Стьюдента. Для построения графиков и статистической обработки использовали программы OriginPro 8 SRO (OriginLab Corporation, USA), Excel (Microsoft) и Statistica 8 (StatSoft).

Результаты.

При изучении эффективности заявленного фотосенсибилизатора в сравнении с эмульсией О-пропилоксим-N-пропоксибактериопурпуринимида в Kolliphor ELP (4%) выявлено, что оба ФС обладают высоким уровнем фотоиндуцированной противоопухолевой активности в отношении саркомы S37 у мышей (таблица 2). При этом, статистически значимых различий значений торможения роста опухоли (ТРО) между исследуемыми группами не обнаружено.

Таким образом, исходя из полученных данных можно сделать вывод о высоком уровне фотоиндуцированной противоопухолевой активности заявленного фотосенсибилизатора.

Пример 4. Исследование острой токсичности заявленного фотосенсибилизатора.

Для оценки острой токсичности заявленного фотостабилизатора in vivo были использованы мыши линии F1 (CBAxC57Bl/6j). Животные получены из ФГБУН «Научного центра биомедицинских технологий ФМБА (филиал «Андреевка». При изучении острой токсичности заявленного фотосенсибилизатора (группа 1) использовались следующие дозы: 12,5 мг/кг (2,5 токсических доз (ТД)), 25,0 мг/кг (5 ТД), 37,5 мг/кг (7,5 ТД); 50,0 мг/кг (10 ТД). В качестве препарата сравнения использовалась Эмульсия О-пропилоксим-N-пропоксибактериопурпуринимида в Kolliphor ELP (группа 2), вводимая в аналогичных дозировках. Препараты вводили внутривенно дробно (в течение не более восьми часов). Животные были подразделены на группы по 12 мышей для каждой исследуемой дозы. Контрольным животным вводили изотонический (0,9%) раствор хлористого натрия (отрицательный контроль), используя тот же путь и режим введения, что и животным в опытных группах. В ходе испытаний, регистрировали клинические признаки интоксикации, гибель животных от токсичности, сроки их гибели, изменение массы тела животных. Ежедневно проводили осмотр всех животных в клетках содержания с целью выявления смертности или признаков отклонения в состоянии здоровья. В день введения препарата животные находились под наблюдением в течение 2-х часов после введения препаратов. Далее проверка состояния животных и регистрация их гибели проводилась два раза в день в течение всего периода времени наблюдения за животными.

Для статистического анализа полученных результатов использовался критерий Стьюдента.

Результаты.

Данные, полученные при изучении острой токсичности заявленного фотосенсибилизатора в сравнении с эмульсией О-пропилоксим-N-пропоксибактериопурпуринимида в Kolliphor ELP, представены в таблице 3. Внутривенное введение заявленного фотосенсибилизатора животным в дозе, равной 50,0 мг/кг (соответствует 10 ТД, превышает расчетную ТД для человека в 125 раз), было перенесено животными. Гибель от токсичности в группе заявленного фотосенсибилизатора не зафиксирована. В группе 2 (препарат сравнения) при введении эмульсии О-пропилоксим-N-пропоксибактериопурпуринимида в Kolliphor ELP животным в дозе, равной 37,5 мг/кг, привело к гибели 33% животных. Введение эмульсии О-пропилоксим-N-пропоксибактериопурпуринимида в Kolliphor ELP животным в дозе, равной 50,0 мг/кг, привело к гибели 100% животных.

Таким образом, внутривенное введение заявленного фотосенсибилизатора мышам в дозе, равной 50,0 мг/кг (соответствует 10 ТД, превышает расчетную ЭТД для человека в 125 раз), было перенесено животными. Гибель от токсичности отсутствовала. Из полученных данных можно сделать вывод о том, что заявленный фотосенсибилизатор проявляет более низкий уровень токсичности, по сравнению с эмульсией О-пропилоксим-N-пропоксибактериопурпуринимида в Kolliphor ELP.

Настоящее изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности, а именно к способу получения фотосенсибилизатора структурной формулы 1, где а - 2÷130; b - 15÷67, R₁ - C_xH_2x+1, х=1÷5, R₂ - C_yH_2y+1, y=1÷5, для фотодинамической терапии (ФДТ) рака. Фотосенсибилизатор проявляет более низкий уровень токсичности, по сравнению с эмульсией О-пропилоксим-N-пропоксибактериопурпуринимида в Kolliphor ELP. 2 з.п. ф-лы, 3 табл., 2 пр.

1. Способ получения фотосенсибилизатора со структурной формулой (1)

включающий:

- реакцию активации карбоксильной группы соединения со структурной формулой (2)

где R₁ - соединение общей формулы С_хН_2х+1, где х=1÷5, R₂ - соединение общей формулы C_yH_2y+1, где у=1÷5;

в хлороформе с использованием 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида с получением промежуточного соединения со структурной формулой (3)

где R₁ - соединение общей формулы С_хН_2х+1, где х=1÷5, R₂ - соединение общей формулы С_уН_2у+1, где у=1÷5;

- реакцию образования активированного комплекса из вещества со структурной формулой (3) в присутствии катализатора с получением активированного комплекса со структурной формулой (4)

где R₁ - соединение общей формулы С_хН_2х+1, где х=1÷5, R₂ - соединение общей формулы С_уН_2у+1, где у=1÷5;

- реакцию присоединения соединения со структурной формулой (5)

где а - 2÷130; b - 15÷67;

к активированному комплексу со структурной формулой (4) с получением неочищенного фотосенсибилизатора со структурной формулой (1);

- стадию очистки полученного фотосенсибилизатора по п. 1 методом диализа с получением очищенного фотосенсибилизатора со структурной формулой (1).

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве катализатора используется диметиламинопиридин.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что включает стадию лиофильного высушивания полученного очищенного фотосенсибилизатора по п. 1 с получением его кристаллической формы.