Способ диагностики скрытого эндометрита у свиноматок Российский патент 2017 года по МПК G01N33/48 C12Q1/48 

Изобретение относится к области ветеринарной медицины, в частности к методам диагностики скрыто протекающих воспалительных процессов в репродуктивных органах свиноматок путем определения биохимических показателей маточно-цервикальной слизи.

Одной из проблем в воспроизводстве свиней в свиноводческих предприятиях промышленного типа являются болезни органов размножения, к числу которых относятся воспалительные процессы в половых органах. Скрытый эндометрит относится к хроническому эндометриту и протекает у животных без выраженных клинических признаков и выявляется, как правило, при наступлении стадии возбуждения полового цикла во время проявления феномена «течка». Если у коров скрытый эндометрит возможно диагностировать во время «течки» по наличию обильных слизистых выделений с примесью (прожилки или хлопья) гноя, то у свиноматок цервикально-влагалищная слизь выделяется без примесей и в незначительном количестве, что не представляет возможным проведение визуальной диагностики на данную патологию. Поэтому диагностика скрытого эндометрита у свиноматок возможна путем проведения лабораторных бактериологических и биохимических исследований.

Анализ патентной и научной литературы позволил выявить ряд способов диагностики скрытого эндометрита у коров на основе лабораторных исследований цервикально-маточной слизи, полученной у животных во время течки. Так, методика постановки диагноза на скрытый эндометрит по И.И. Нагорнову основана на определении плотности образования осадка муцина при помещении в пробирку равного количества цервикальной слизи и 1%-ного раствора уксусной кислоты или 0,1%-ного раствора этакридина лактата и подогреве в водяной бане до температуры, близкой к кипячению [Хронический скрытый эндометрит (Endometritis latens chronica) [Электронный ресурс] / Болезни животных / Акушерство и гинекология /Московский Ветеринарный WEB-Центр Copyright© 2009. - Режим доступа: http://webmvc.com/bolezn/livestock/tocology/endom3.php.]. Если в пробирке образуется сгусток муцина, не разбивающийся при встряхивании, и осаждающаяся жидкость остается прозрачной, реакция считается отрицательной. В случае помутнения жидкости при легком встряхивании реакция считается положительной.

По методике Попова Ю.Н предусмотрено выявление в цервикальной слизи лейкоцитов по изменению цвета жидкости при добавлении к ней такого же количества 4% раствора едкого натра и доведении до кипячения с последующим охлаждением. Если жидкость остается бесцветной или приобретает соломенно-желтый цвет, реакция считается отрицательной. При приобретении жидкостью лимонно-желтого, серого или черного оттенка реакция считается положительной [Попов Ю.Н. Диагностика скрытого эндометрита у коров [Текст] / Ю.Н. Попов //Ветеринария. - 1969. - №4. - С. 85-87].

Диагностика скрытого эндометрита у коров по методике Г.Г. Козлова основана на обнаружении в слизи лейкоцитов сгустка при смешивании ее с равным или меньшим количеством 5% раствором димастина [Козлов Г.Г. Сравнительная оценка методов диагностики скрытого эндометрита [Текст] /Г.Г. Козлов // Актуальные вопросы акушерско-гинекологической и хирургической патологии с.-х. животных. - М., 1982. - С. 43-44].

Методика диагностики скрытого эндометрита у коров по Г.М. Калиновскому основана на выявлении в слизи серосодержащих аминокислот, появляющихся в ней при воспалении. Для этого в пробирку вносят 4 мл 0,5%-ного раствора свинца уксуснокислого, к которому по каплям добавляют 20%-ный раствор едкого натрия до образования осадка (гидрата окиси свинца). Через 15-20 сек снова добавляют раствор едкого натрия до исчезновения осадка. Затем в пробирку вносят 1,5-2,0 мл течковой слизи, легко встряхивают и нагревают, не доводя до кипения. При наличии скрытого эндометрита смесь приобретает цвет крепко заваренного чая [Калиновский Г.Н. Экспресс-метод диагностики скрытого эндометрита у коров [Текст] / Г.Г. Калиновский, Г.И. Подопригора // Информационное письмо. - Киев, 1987. - 1 с.].

Исследованиями полученной у свиноматок во время «течки» цервикально-влагалищной слизи на скрытый эндометрит по тестам И.С.Нагорного, Ю.А. Попова, Г.Г. Козлова, Г.М. Калиновского получен значительный разброс по показателям положительной, сомнительной и отрицательной реакций [Бригадиров Ю.Н. Диагностика скрытого эндометрита у свиноматок [Текст], Ю.Н. Бригадиров, В.Н. Коцарев, Ю.Н. Масьянов и др. // Ветеринарный врач. - 2015, - №2. - С. 43-46].

При использовании теста Г.М. Калиновского в сравнении с другими методами получено наименьшее количество сомнительных реакций, а величины положительных и сомнительных реакций имеют промежуточные значения, что позволяет его считать наиболее приемлемым для диагностики скрытого эндометрита у свиноматок. Однако данный тест диагностики скрытого эндометрита имеет недостатки. Он относительно трудоемок в выполнении, основан на постановке качественной реакции, требующей визуальной оценки по ходу ее выполнения, что накладывает субъективный оттенок на полученные результаты.

Известно техническое решение, взятое за прототип, предусматривающее проведение диагностики скрытого эндометрита у свиноматок путем определения показателя активности фермента гамма-глутамилтрансферазы (ГГТ) в цервикально-маточной слизи, полученной во время проявления феномена «течка» при наступлении стадии возбуждения полового цикла. Скрытый эндометрит у свиноматок диагностируется при показателе активности ГГТ равном 900 Е/л и более. [Бригадиров Ю.Н. Диагностика скрытого эндометрита у свиноматок [Текст] Ю.Н. Бригадиров, В.Н. Коцарев, Ю.Н. Масьянов и др. // Ветеринарный врач. - 2015, №2. - С. 43-46].

Фермент ГГТ представляет собой белок, состоящий из одной полипептидной цепи с молекулярной массой 90 кД. Он содержит гидрофильный и гидрофобный ферменты. Активный центр расположен на гидрофильном участке полипептидной цепи. Гидрофобная область является частью этой цепи, которой фермент прикреплен к мембране.

Фермент ГГТ участвует в обмене аминокислот, катализирует перенос гаммаглутамилового остатка с гаммаглутамилового пептида на аминокислоту или другой пептид, или на иную субстантную молекулу, либо реакцию гидролиза гаммаглутамилового пептида с образованием свободной гаммаглутамиловой кислоты. При участии ГГТ происходит транспорт аминокислот через клеточную мембрану. Фермент ГГТ содержится в основном в мембране клеток, обладающих высокой секреторной способностью, к которым относятся железистые клетки эпителия, выстилающего шейку матки. Он также содержится в лизосомах и микросомах клетки.

Биологическая роль ГГТ связана с регуляцией уровня глутатиона в тканях (Анализ крови). Регулируя уровень глутатиона, ГГТ влияет на синтез белка, чем объясняется его повышенная активность в тканях с высоким уровнем метаболизма. Его активность значительно возрастает при окислительном стрессе, гепатопатиях, эндогенном токсикозе, интоксикация алкоголем, наркотиками, лекарственной интоксикации.

Системный эндогенный токсикоз является универсальным фактором, вызывающим воспалительный процесс.

В период интоксикации ГГТ включается в формирование окислительного стресса посредством участия в распаде глютатиона и активизации свободнорадикального окисления. В результате действия токсических агентов идет «расхолаживание» системы ГГТ и связанной с ней функционально-глютатионовым и оксипролиновым циклами системы транспорта и обмена белков, аминокислот, обмена биогенных аминов и других компонентов. Исходя из этого, по уровню активности ГГТ можно предположить о проявлении воспалительного процесса.

Недостатком прототипа является то, что цервикально-влагалищную слизь для проведения диагностических исследований на скрытый эндометрит у свиноматок получают во время «течки», что исключает возможность проведения лечебных мероприятий до осеменения.

Технический результат изобретения - проведение диагностики скрытого эндометрита у свиноматок на раннем этапе (через две недели после опороса), что позволяет своевременно провести комплекс лечебно-профилактических мероприятий по устранению патологического процесса в репродуктивных органах.

Для этого в способе диагностики скрытого эндометрита у свиноматок путем определения показателя активности фермента гамма-глутамилтрансферазы (ГГТ) в цервикально-маточной слизи согласно изобретению ГГТ определяют через две недели после опороса, до наступления «течки», и диагностируют скрытый эндометрит при ГГТ равном 60 Е/л и более.

Способ осуществляют следующим образом. Полученный у свиноматки образец цервикально-маточной слизи в количестве 1-1,5 мл помещают в центрифужную пробирку и центрифугируют на лабораторно-медицинской центрифуге ОПН-3 при скорости 3000 об/мин в течение 30 минут. Затем цервикально-маточную слизь, отделенную от примесей, разводят бидистиллированной водой в соотношении 1:10, тщательно перемешивают до получения гомогенной массы и выдерживают при комнатной температуре в течение 10-30 минут и фильтруют через фильтровальную бумагу (фильтры обеззоленные (красная лента), ТУ 2642-001-42624157-98). Затем подготовленный материал в количестве 250 мкл помещаю в кювету и размещают на диске для образцов прибора «Hitachi-902». Затем вводят программу для определения показателя активности ГГТ с переходом в основной рабочий режим. Его оптическая плотность определяется при длине волны 405 нм. Полученный на приборе цифровой показатель умножается на цифру 10, что составляет фактическое значение активности ГГТ в цервикально-маточной слизи. Принцип метода исследования на биохимическом анализаторе «Hitachi-902» состоит в том, что L-гамма-глутамил-3-карбокси-4-нитроанилид в присутствии глицилглицина и под воздействием гамма-глутамилтрансферазы пробы преобразуется в 5-амино-2-нитробензоат.

Для определения показателя активности ГГТ в биологической жидкости на биохимическом анализаторе «Hitachi-902» используется специальная программа с наборами реактивов: реактив №1 - буфер глицилглицин 150,0 мМ/л с _РН=7,7; реактив №2 - субстракт L-гамма-глутамил-3-карбокси-4-нитроанилид 6,0 мМ/л.

Реактивы поставляет фирма «Ф. Хоффман-Ля Рош Лтд.» (Германия).

Сущность изобретения поясняется примерами.

Пример 1. В опыт включены 35 свиноматок, от которых через две недели после опороса с помощью «Комплекта для получения цервикально-маточной слизи у свиноматок» (Ветеринария или авторское свидетельство) была взята цервикально-маточная слизь, давшая положительную или отрицательную реакцию при исследовании по тесту Калиновского Г.М. В данных пробах цервикально-маточной слизи определяли активность ГГТ на биохимическом анализаторе «Hitachi-902», принцип метода исследования которого состоит в том, что L-гамма-глутамил-3-карбокси-4-нитроанилид в присутствии глицилглицина и под воздействием гамма-глутамилтрансферазы пробы преобразуется в 5-амино-2-нитробензоат. Его оптическая плотность была определена при длине волны 405 нм.

При сопоставлении результатов постановки теста Г.М. Калиновского со значениями показателя активности ГГТ установлено следующее (таблица 1).

Из 17 проб цервикально-влагалищной слизи свиноматок, показатель активности ГГТ которых составил до 50 Е/л, 16 (94,1%) проб имели отрицательную реакцию и 1(5,9%) проба - положительную реакцию по тесту Г.М. Калиновского. Из 18 проб слизи с показателем активности ГГТ свыше 60 Е/л дали отрицательную реакцию по тесту Г.М. Калиновского в 6 (33,3%) случаях и в 12 (66,7%) случаях отрицательную реакцию. Совпадение показателей слизи по активности ГГТ и тесту Г.М. Калиновского по отрицательным и положительным значениям было в 28 (80%) случаях, что позволяет показатель активности ГГТ цервикально-влагалищной слизи, составляющий 60 Е/л и более, использовать в качестве критерия диагностики скрытого эндометрита у свиноматок через две недели после опороса (до проявления половой цикличности).

Пример 2

Проведено сравнение методов диагностики скрытого эндометрита у свиноматок по предлагаемому способу и метода, взятого за прототип, с тестом по Г.М. Калиновскому (таблица 2).

Примечание: ИП - пробы цервикально-маточной слизи с показателями активности ГГТ через две недели после опороса 60 Е/л и более или во время «течки» 900 Е/л и более и положительной реакцией по тесту Г.М. Калиновского; ИО - пробы цервикально-маточной слизи с показателями активности ГГТ через две недели после опороса менее 50 Е/л или во время «течки» менее 800 Е/л и отрицательной реакцией по тесту Г.М. Калиновского; ЛП - пробы цервикально-маточной слизи с показателями активности ГГТ через две недели после опороса 60 Е/л и более или во время «течки» 900 Е/л и более и отрицательной реакцией по тесту Г.М. Калиновского; ЛО - пробы цервикально-маточной слизи с показателями активности ГГТ через две недели после опороса менее 50 Е/л или во время «течки» менее 800 Е/л и положительной реакцией по тесту Г.М. Калиновского.

Показатели сравнительной эффективности способов диагностики скрытого эндометрита у свиноматок по показателю активности ГГТ представлены в таблице 3.

Показатели чувствительности, специфичности и точности заявляемого способа диагностики скрытого эндометрита у свиноматок по заявляемому способу и прототипу рассчитаны по формулам согласно методике, описанной А.Ю. Васильевым с соавторами в 2008 году [Васильев А.Ю. Анализ данных лучевых методов исследования на основе принципов доказательной медицины [Электронный ресурс] / Васильев А.Ю., Малый А.Ю., Серов Н.С. // 3 учебное пособие. - 2008. - Режим доступа: htth//vmede.org/sait/?id^:=Onkologiya_analiz_vasilev_2008&menu=Onkologiya_analiz_vasilev_2008&page=3.].

Проведение расчета чувствительности заявляемого метода

Ч=ИП:(ИП+ЛО)-100%,

где: Ч - чувствительность;

ИП - количество проб слизи с истинно положительным результатом;

ЛО - количество проб слизи с ложно отрицательным результатом.

Ч=12:(12+1)⋅100=92,3%.

Проведение расчета специфичности заявляемого метода

С=ИО:(ИО+ЛП)-100%,

где: С - специфичность;

ИО - количество проб слизи с истинно отрицательным результатом;

ЛП - количество проб слизи с ложно положительным результатом.

С=16:(16+6)⋅100=72,7%.

Проведение расчета точности заявляемого метода

Т=(ИП+ИО):N⋅100%,

где: Т - точность;

ИП - количество проб слизи с истинно положительным результатом;

ИО - количество проб слизи с истинно отрицательным результатом;

N - число свиноматок в опыте.

Т=(12+16):35⋅100=80,0%.

Итого: Чувствительность заявленного способа - 92,3%

Специфичность заявленного способа - 72,7%

Точность заявленного способа - 80,0%

Проведение расчета чувствительности прототипа:

Ч=11: (11+2)⋅100%=84,6%

Проведение расчета специфичности прототипа:

С=17: (17+5)⋅100%=77,3%

Проведение расчета точности прототипа:

Т=(11+17):35⋅100=80,0%

Заявляемый способ превышает прототип по чувствительности, не имеет существенной разницы по специфичности и одинаков по точности, что, с учетом срока его применения, является основанием его использования для диагностики скрытого эндометрита у свиноматок.

Изобретение относится к области ветеринарии и предназначено для диагностики скрытого эндометрита у свиноматок. В цервикально-маточной слизи свиноматок через две недели после опороса определяют показатель активности фермента гамма-глутамилтрансферазы и при выявлении показателя ее активности, составляющего 60 Е/л и более, диагностируют скрытый эндометрит. Использование заявляемого способа позволяет повысить чувствительность метода диагностики, выявлять на раннем этапе проявления патологического процесса и своевременно проводить лечебно-профилактические мероприятия. 2 табл., 2 пр.

Способ диагностики скрытого эндометрита у свиноматок путем определения показателя активности фермента гамма-глутамилтрансферазы (ГГТ) в цервикально-маточной слизи, отличающийся тем, что ГГТ определяют через две недели после опороса, до наступления «течки», и диагностируют скрытый эндометрит при ГГТ равном 60 Е/л и более.