Способ выявления у пациента аллергии на пыльцу берёзы Российский патент 2024 года по МПК G01N33/49 G01N27/447 G01N1/30 G01N1/38 

Изобретение относится к медицине, в частности к терапии, аллергологии и иммунологии, и может быть использовано в качестве метода лабораторного обследования пациентов с гиперчувствительностью к пыльце березы.

На данный момент именно аллергия является одной из самых распространенных болезней на Земле. Еще в конце XX века ВОЗ делала прогнозы, что аллергия станет самой большой проблемой мирового здравоохранения. Это предположение подтверждается. По статистике, уже сегодня аллергией страдает, как минимум, каждый пятый житель нашей планеты (от 20-40% населения): каждый шестой американец, каждый четвертый немец, более 30% россиян, 17% москвичей. Международная статистика говорит о том, что за последние два десятилетия заболеваемость аллергией возросла в 3-4 раза, причем заболевание часто протекает в тяжелой, необычной форме. Ухудшающаяся экологическая ситуация, нерациональное питание, излишняя лекарственная терапия, бесконтрольное использование антибиотиков и биологических активных добавок (БАДы), стрессовые нагрузки, малоподвижный образ жизни, изменения в климате - все это повышает подверженность организма человека воздействию аллергенов.

Аллергию можно рассматривать как патологическую реакцию гиперчувствительности организма на воздействие агрессивной окружающей среды, в основе которой лежат иммунологические процессы и механизмы. На сегодняшний день для борьбы с симптомами аллергии и облегчения жизни пациентов широко используются препараты, способные влиять на высвобождение из клеток различных медиаторов воспаления. Наиболее изученными и популярными являются антигистаминные препараты, которые впервые были синтезированы в 1936 году. Гистамин – один из основных медиаторов аллергического воспаления. Высвобождение гистамина лежит в основе развития таких симптомов аллергии, как зуд, слезотечение, заложенность носа, высыпания по типу крапивницы (так называемые уртикарии), отеки кожи. Все антигистаминные препараты можно разделить на две группы: непрямого и прямого действия. Первые тормозят высвобождение медиаторов воспаления из тучных клеток, а вторые блокируют гистаминовые рецепторы, не позволяя им связываться с гистамином, тем самым препятствуя запуску каскада воспалительных реакции. Важно отметить, что антигистаминные препараты нацелены лишь на снятие симптомов аллергии и никак не могут «вылечить» от нее, убрать причину, вызывающую такую реакцию. Этого можно добиться либо полностью исключив контакт с аллергеном, либо с помощью аллерген-специфической иммунотерапии (АСИТ). Проведение аллергенспецифической иммунотерапии (АСИТ) приводит к изменению иммунного ответа Т-лимфоцитов с последующим увеличением уровня специфических антител (IgG4 и/или IgG1 и, в некоторых случаях, IgA) и снижением уровня специфических IgE. Вторичным и, возможно, более поздним иммунным ответом является иммунная девиация (отклонение от нормы) с изменением иммунного ответа специфических Т-клеток.

Согласно статистическим данным на территории Удмуртской Республики за последнее время одним из наиболее распространенных аллергенов является пыльца растений, а именно пыльца березы. Эффективным лечением аллергии является применение лекарственного препарата «Сталораль», который выпускается в форме подъязычных капель и используется в АСИТ при лечении аллергии на березу. В 10 мл этого лекарственного препарата содержится: экстракт аллергена из пыльцы березы 10 ИР/мл*, 300 ИР/мл. Вспомогательные вещества: натрия хлорид 590 мг, глицерол 5800 мг, маннитол 200 мг, вода очищенная до 10 мл (ИР/мл - Индекс Реактивности - биологическая единица стандартизации). АСИТ является болезнь-модифицирующим лечением с высоким уровнем научно-доказательной базы.

Известен способ выявления аллергии с помощью кожного тестирования. Кожные пробы – информативный метод аллергологического обследования, с помощью которого выявляют сенсибилизацию к различным аллергенам, стандартизированным и разрешенным к применению в лечебно-диагностических целях (пыльцевые, пищевые, бытовые, эпидермальные, инсектные, грибковые аллергены). Кожные тесты имеют более выраженную чувствительность в отличие от других способов определения специфических IgE. Они позволяют немедленно получить результат. На один тест затрачивается меньше реагентов и времени, чем при определении специфических IgE in vitro. Постановку кожных тестов следует проводить в специализированных аллергологических кабинетах, оборудованных в соответствии с нормативными требованиями (приказ Минздравсоцразвития России от 01.12.2005 №753). Кабинет должен быть оснащен средствами по оказанию экстренной помощи при развитии анафилактической реакции.

У данного метода существуют множественные противопоказания:

• острые инфекционные заболевания; • обострение хронических заболеваний;

• тяжелые формы бронхиальной астмы (ОФВ1 менее 70%); • декомпенсированные заболевания печени, почек, кровеносной системы, болезни крови, эндокринной системы и др.; • туберкулез, сифилис, бруцеллез; • аутоиммунные заболевания в стадии обострения (СКВ, ревматоидный артрит, склеродермия, дерматомиозит и др.);

• первичные (врожденные) иммунодефициты; • анафилактический шок в анамнезе;

• злокачественные новообразования; • психические заболевания;

• беременность и лактация; • СПИД.

Существуют состояния, при которых проведение аллергологических проб противопоказано в связи с высоким риском развития системных реакций:

• обострение аллергического заболевания;

• указания в анамнезе на системные и анафилактические реакции при контакте с определёнными аллергенами (проведение кожных тестов с этими ингредиентами недопустимо). Кроме того, проведение подобных тестов запрещено при:

• инфекционных заболеваниях;

• хронических заболеваниях в стадии декомпенсации;

• туберкулезе любой локализации в период обострения;

• системных заболеваниях соединительной ткани.

Нецелесообразно проведение кожного тестирования и при проведении гормональной терапии, терапии антигистаминными препаратами в связи с высокой вероятностью получения ложноотрицательных результатов. На результатах тестирования также может отразиться применение бронхоспазмолитических средств. В один день можно исследовать 10-15 аллергенов, относящихся к одной группе. Максимально допустимое количество исследуемых аллергенов у взрослых - от 18 до 20. При высокой степени сенсибилизации количество аллергенов следует сократить. Тестирование проводят на коже предплечья, в особых случаях (например, при поражении кожи рук) - на коже спины. На вводимые при кожном тестировании экстракты аллергенов возможно возникновение кожных аллергических реакций 1-го типа (IgE-опосредованные реакции), 3-го типа (артюсоподобные реакции), 4-го типа (реакции замедленного типа). IgE-опосредованные кожные реакции проявляются немедленно (через 15-20 мин. после постановки теста).

Также существуют лабораторные методы (in vitro), которые дополняют клинические и в некоторых случаях могут использоваться на первичном этапе диагностики аллергии. Методы in vitro - скрининговая или объемная оценка эффективности и безопасности фармакологических веществ в модельных системах с использованием реакционных сред, ферментов, клеточных линий. Известен способ диагностики аллергического ринита с помощью измерения уровня эндотоксина в крови у детей in vitro. Способ определения уровня эндотоксина производят следующим образом. Принцип теста заключается в том, что бактериальные эндотоксины плазмы активируют в лизате амебоцитов комплекс ферментов, изменяющий физико-химические свойства смеси. Методика заключается в добавлении к предварительно растворенному реактиву исследуемого образца (например, плазма крови). Далее пробирку помещают на водяную баню и инкубируют 60 мин при 37°С. Плотный гель на дне пробирки, не разрушающийся при ее переворачивании, называют положительной реакцией и означает, что концентрация эндотоксина в пробе больше или равна чувствительности реактива. Отсутствие плотного геля или его разрушение при переворачивании пробирки определяют, как отрицательная реакция и означает, что концентрация эндотоксина в данной пробе слегка или значительно ниже чувствительности реактива.

После выдерживания образцов в течение 1 ч по одной убирают пробирки или ампулы и медленно переворачивают, наблюдая за признаками гелеобразования. Позитивным результатом служит формирование геля, который при переворачивании образца не разрывается. Все прочие результаты - мягкие гели, мутность, увеличение вязкости, прозрачная жидкость - считают как негативный результат.

Преимущества использования тестов in vitro: нет возрастных ограничений, можно применять у пациентов с высокой степенью сенсибилизации (системные аллергические реакции при кожном тестировании), при отрицательном отношении пациента к кожным пробам, несоответствии результатов кожных проб данным анамнеза и клинической картине, непрерывно рецидивирующем течении болезни без периодов ремиссии, невозможности отмены антигистаминных препаратов, в период обострения основного заболевания, при приеме трициклических антидепрессантов, измененной реактивности кожи, декомпенсации сопутствующих хронических заболеваний, отсутствии возможности проведения тестирования in vivo сразу всеми предполагаемыми аллергенами в ограниченные сроки обследования, в период анэргии после острой аллергической реакции. Можно использовать любое число тестируемых аллергенов. Отсутствует непосредственный контакт с аллергеном, нет риска анафилактических реакций, что является безопасным. Использование сыворотки для исследования в любой лаборатории (тесты на расстоянии).

Недостатки тестов in vitro: обнаружение специфического IgE к какому-либо аллергену не доказывает, что именно этот аллерген ответственен за клиническую симптоматику; титр IgE не всегда коррелирует с тяжестью симптомов АЗ; отсутствие IgE в сыворотке периферической крови не исключает возможности IgE-зависимого механизма (например, местный синтез IgE при аллергическом рините при отсутствии IgE в кровотоке); при крайне высоких уровнях общего IgE (более 1000 МЕ/мл) за счет образования большого количества перекрестных антител низкой специфичности могут регистрироваться ложно-положительные результаты IgE. Необходимо учитывать метод, которым проводится выявление IgE. Наиболее распространенным методом выявления sIgE к аллергенам является иммуноферментный анализ (ИФА), прогностическая ценность метода зависит от вида аллергена. Так, высокая чувствительность (более 90%) получена для аллергенов трав, деревьев, пылевых клещей и кошек. Для других аллергенов (пыльца сорняков, яд пчел, латекс, лекарства и др.) чувствительность теста несколько ниже. Иммунофлуоресцентный анализ ImmunoCAP в настоящее время отмечен ВОЗ как «золотой стандарт» аллергодиагностики и, согласно независимым исследованиям, является наиболее точным и стабильным. Точность определения уровня антител составляет 0,01 кЕ/л.

Также известен способ определения гиперчувствительности организма к пенициллину (по патенту RU2 023 268, выбран в качестве прототипа), используемый в медицине, аллергологии. Цель изобретения - снижение травматичности способа и его упрощение. Сущность изобретения: определяют процентное содержание эритроцитов с электрофоретической подвижностью, равной 1,0 мкм⋅С^-1⋅B^-1cм и более, в контроле и в присутствии пенициллина. При нарастании содержания эритроцитов с ЭФП, равной 1,0 мкм⋅C^-1⋅B^-1cм и более, в присутствии пенициллина на 10% и более диагностируют гиперчувствительность к пенициллину. Целью изобретения является снижение травматичности и упрощение диагностики гиперчувствительности к пенициллину. В известном способе диагностики гиперчувствительности к пенициллину, включающем исследование свойств эритроцитов крови, согласно изобретению, исследуют свойства эритроцитов периферической крови, при этом регистрируют электрофоретическую подвижность эритроцитов в присутствии и в отсутствии 5 тыс. ЕД/мл пенициллина и рассчитывают процентное содержание эритроцитов с электрофоретической подвижностью 1,0 мкм⋅С^-1⋅B^-1cм и более и при его значении 10% и выше контроля определяют гиперчувствительность. Предлагаемый способ может быть осуществлен следующим образом: по 0,05 мл капиллярной крови помещают в пробирки (N 1 - контрольная, N 2 - с 5 тыс. ЕД пенициллина), содержащие по 1,0 мл забуференного (рН - 7,2) физиологического раствора. Обе пробирки инкубируют в течение 10 мин при комнатной температуре. После инкубации определяют электрофоретическую подвижность (ЭФП) эритроцитов с помощью микроэлектрофореза (автоматический измерительный микроскоп "Пармоквант-2" (ГДР). Измеряют ЭФП по 100 эритроцитов в контроле и в присутствии пенициллина, высчитывают процентное содержание эритроцитов с ЭФП, равной 1,0 мкм⋅С^-1⋅B^-1cм и более. Его недостатком является длительность исследования. Так, полный цикл обследования может составить до 30 минут.

Технической задачей изобретения является создание оперативного способа выявления аллергии in vitro, основанном на изучении электрофоретической подвижности эритроцитов человека. Техническим результатом является сокращение времени, необходимого для реализации способа.

Способ выявления у пациента аллергии на пыльцу берёзы, в котором 100 мкл крови пациента помещают в 2 мл водного раствора NaCl 0,9%, добавляют 0,2 мл красителя метиленового синего, затем в 2 ячейки аппарата для микроэлектрофореза вносят капли полученного раствора в равном количестве, в одну ячейку добавляют аллерген в виде жидкого березового экстракта, ячейки закрывают стеклами для равномерного распределения раствора, производят измерение электрофоретической подвижности эритроцитов переменным электромагнитным полем с частотой 0,3 Гц, определяют аллергию на пыльцу берёзы по уменьшению амплитуды движения эритроцитов менее чем 5 мкм. Электрофоретическая подвижность в переменном электромагнитном поле с частотой 0,3 Гц других форменных элементов крови, таких как лейкоциты и тромбоциты не рассматривается, так как в образцах крови при описанном выше способе окрашивания точная дифференцировка клеток и определение диаметра, необходимого для подсчета амплитуды движения лейкоцитов и тромбоцитов в электрическом поле затруднены.

Способ выявления аллергии основан на изучении электрофоретической подвижности эритроцитов человека в присутствии аллергена пыльцы берёзы и осуществляется следующим образом. Перед проведением исследования необходимо взять капиллярную кровь 1 мл в пробирку. Затем 100 мкл забранной крови помещают в 2 мл физиологического раствора NaCl 0,9% (в каждой ячейке добавляется водный 0,9% раствор NaCl, так как он имеет одинаковое осмотическое давление с плазмой крови и является наиболее доступным). Затем добавляют 0,2 мл красителя метиленового синего и смешивают. Затем в 2 ячейки аппарата для микроэлектрофореза с помощью капилляра вносят капли полученного раствора в равном количестве (по 0,1 мл). Далее ячейки закрываются специальными стеклами для равномерного распределения раствора. Может быть добавлена 3 ячейка, контрольная, с препаратом «Сталораль».

Для измерения электрофоретической подвижности применяется аппарат со знакопеременным напряжением, программируемый по амплитуде и частоте (поля слабой интенсивности - 0,3 Гц). В ячейках с добавленной средой происходит движение частиц, а именно клеток крови, от полюса к полюсу. Маятникообразное движение клеток с амплитудой равной половине диаметра клеток (для эритроцитов - 5 мкм). Хаотичное движение или отсутствие амплитуды движения расценивается как нарушение функции клеток. Для определения электрофоретической подвижности сравнивают три ячейки: 1 - контроль; 2 - аллерген; 3 - лекарство «Сталораль». Нормальный потенциал наблюдается в контрольной и 3-й ячейках, то есть в них амплитуда движения эритроцитов не нарушена и равно половине диаметра клеток (5 мкм). Потенциал клеток во 2 ячейке изменен, наблюдается уменьшение амплитуды движения эритроцитов менее чем 5 мкм под действием переменного электромагнитного поля с частотой 0,3 Гц, т.к. мембрана нарушена под действием аллергена. Наблюдения проводят под визуальным контролем или используют фотосъёмку в первые 5 минут исследования. Полный цикл измерений предложенным способом составляет не более 5-10 минут.

Пример 1

У пациента А. с подозрениями на аллергию на березу была взята, в соответствии с правилами забора, капиллярная кровь. Затем, указанным выше способом, был определен потенциал движения клеток. В ячейке с добавлением аллергена наблюдалось уменьшение амплитуды движения эритроцитов менее чем 5 мкм, тогда как в двух других ячейках он оставался в норме, равный 5 мкм. На основании полученных данных врач-аллерголог сделал вывод о том, что у пациента присутствует аллергия на берёзу. Данный диагноз был подтвержден сдачей крови на наличие наличием в крови специфических антител IgE к аллергокомпоненту Betv1 – белку PR-10, рибонуклеазе, патогенетически связанному с развитием сенсибилизации к пыльце березы протеину.

Пример 2

У пациента Б. с подозрениями на аллергию на березу была взята, в соответствии с правилами забора, капиллярная кровь. Затем, указанным выше способом, был определен потенциал движения клеток. В ячейке с добавлением аллергена потенциал клеток был в соответствии с нормой равен 5 мкм, в двух других ячейках потенциал так же сохранялся в пределах нормы (5 мкм). На основании полученных данных врач-аллерголог сделал вывод о том, что у пациента отсутствует аллергия на березу. Данный диагноз был подтвержден отсутствием в крови специфических IgE к аллергокомпоненту Betv1 - белку PR-10, рибонуклеазе, патогенетически связанному с развитием сенсибилизации к пыльце березы протеину.

Изобретение относится к медицине, а именно к терапии, аллергологии и иммунологии, и может быть использовано для выявления у пациента аллергии на пыльцу берёзы. 100 мкл крови пациента помещают в 2 мл водного раствора NaCl 0,9%, добавляют 0,2 мл красителя метиленового синего. Затем в 2 ячейки аппарата для микроэлектрофореза вносят капли полученного раствора в равном количестве, в одну ячейку добавляют аллерген в виде жидкого березового экстракта, ячейки закрывают стеклами для равномерного распределения раствора. Производят измерение электрофоретической подвижности переменным электромагнитным полем с частотой 0,3 Гц. Определяют аллергию на пыльцу берёзы по уменьшению амплитуды движения эритроцитов менее чем 5 мкм. Способ обеспечивает возможность сокращения времени, необходимого для выявления аллергии in vitro, за счет изучения электрофоретической подвижности эритроцитов человека. 2 пр.

Способ выявления у пациента аллергии на пыльцу берёзы, в котором 100 мкл крови пациента помещают в 2 мл водного раствора NaCl 0,9%, добавляют 0,2 мл красителя метиленового синего, затем в 2 ячейки аппарата для микроэлектрофореза вносят капли полученного раствора в равном количестве, в одну ячейку добавляют аллерген в виде жидкого березового экстракта, ячейки закрывают стеклами для равномерного распределения раствора, производят измерение электрофоретической подвижности переменным электромагнитным полем с частотой 0,3 Гц, определяют аллергию на пыльцу берёзы по уменьшению амплитуды движения эритроцитов менее чем 5 мкм.