Автоматизированный отбор нуклеиновых кислот по размеру Российский патент 2017 года по МПК C12Q1/68 G01N27/447 C12M1/42 C12M1/34 C12N15/10 

[0001] Эта заявка претендует на приоритет согласно парижской конвенции заявки на патент США №61/497586, поданной 16 июня 2011 г. и носящей название “Способ и устройство для автоматизированного отбора нуклеиновых кислот по размеру”, которая включается в данный документ посредством ссылки во всех контекстах. В контексте США эта заявка претендует на приоритет согласно раздела 35 Кодекса законов США, §119 патента США №61/497586, поданной 16 июня 2011 г. и носящей название “Способ и устройство для автоматизированного отбора нуклеиновых кислот по размеру”, которая включается в данный документ посредством ссылки во всех контекстах.

Область изобретения

[0002] Это изобретение относится к автоматизированному отбору нуклеиновых кислот по размеру. Аспекты изобретения представляют способы и устройство, применяемые для отбора нуклеиновых кислот в соответствии с размером.

Предпосылки изобретения

[0003] Имеется широкий спектр приложений, в которых желательно отбирать нуклеиновые кислоты, такие как ДНК или РНК, по размеру. Например, отбор по размеру применяется при изготовлении библиотек ДНК для применения в секвенировании и других приложениях.

[0004] Существуют различные способы для отбора ДНК по размеру. Некоторые из этих способов являются неприемлемо трудоемкими. Один способ для отбора ДНК по размеру состоит в применении электрофореза к образцу, содержащему ДНК, в геле. Поскольку ДНК различных размеров обладают различной подвижностью в геле, электрофорез разделяет ДНК по размеру на различные полосы. Полоса, содержащая ДНК в необходимом размерном диапазоне, может быть идентифицирована, а затем вручную вырезана из геля. Затем необходимая ДНК может быть извлечена из геля.

[0005] Некоторые электрофоретические системы содержат лунки, образованные в геле. ДНК можно заводить в лунки электрофорезом. Е-гели производства Invitrogen и Flash Gel™ производства Lonza обеспечивают такие лунки.

[0006] Y-канальные машины для отбора по размеру являются другой технологией отбора ДНК по размеру. Примерами являются машины Sage Pippin Prep™ и Caliper XT™. Эти машины могут извлекать ДНК необходимого размерного диапазона из образца путем отведения ДНК необходимого размерного диапазона в боковой канал и сбора отведенных ДНК на молекулярно-весовом отсекающем фильтре.

[0007] Твердофазные обратимые обездвиживающие слои (Solid Phase Reversible Immobilization Beads, SPRI), поставляемые на рынок компанией Beckman Coulter и другими, могут применяться, чтобы захватывать ДНК определенного размера, а затем освобождать ДНК после промывки и изменения рН.

[0008] Сохраняется потребность в технологии для отбора ДНК по размеру, которая может обеспечить высокую производительность. Сохраняется потребность в технологии для отбора ДНК по размеру, которая может обеспечить точный отбор ДНК по размеру с уменьшением трудоемкости.

Суть изобретения

[0009] Это изобретение имеет несколько аспектов, которые могут применяться вместе. Некоторые из этих аспектов имеют независимое применение. Один аспект представляет устройство для автоматизированного отбора нуклеиновых кислот по размеру. Другой аспект представляет компьютерную систему для устройства управления для автоматизированного отбора нуклеиновых кислот по размеру. Другой аспект представляет способы для автоматизированного отбора нуклеиновых кислот по размеру. Нуклеиновые кислоты могут содержать ДНК и/или РНК. Другой аспект представляет картриджи, применяемые inter alia для автоматизированного отбора нуклеиновых кислот по размеру.

[0010] В одном показательном варианте осуществления отбор нуклеиновых кислот по размеру производится путем загрузки образцов ДНК по отдельности в агарозные каналы, каждый из которых содержит загрузочную лунку на одном конце канала и лунку для извлечения ниже по ходу. Электрофорез выполняется на нуклеиновых кислотах после загрузки, и нуклеиновые кислоты разделяются по размеру по мере перемещения по направлению к лунке для извлечения. Во время этого процесса формируются изображения канала с постоянным интервалом, и программный алгоритм использует изображения, чтобы идентифицировать эталонные отрезки и предсказывать время, в которое фрагменты необходимых нуклеиновых кислот появятся в лунке для извлечения. Ток канала также контролируется отдельно посредством широтно-импульсной модуляции постоянного напряжения, так что, если соседние образцы перемещаются с различными скоростями, время извлечения может изменяться, так что никакие два образца нет необходимости извлекать в одно и то же время.

[0011] Другая особенность изобретения представляет способы для отбора по размеру нуклеиновых кислот, таких как ДНК, РНК и т.п. Такие способы включают перемещение нуклеиновых кислот из образца по каналу электрофорезом; автоматическое отслеживание продвижения эталонной фракции нуклеиновых кислот по каналу; на основе отслеживания, оценку расчетного времени прибытия целевой фракции нуклеиновых кислот в лунку для извлечения в канале; и извлечение текучей среды, содержащей целевую фракцию, из лунки для извлечения в расчетное время прибытия. Эталонная фракция может быть той же, что и целевая фракция, или отличаться от нее. Например, в некоторых вариантах осуществления эталонная фракция может содержать нуклеиновые кислоты, которыми изобилует образец (или изначально присутствуют в образце, или добавлены в образец в качестве маркера размера), и целевая фракция может содержать нуклеиновые кислоты, имеющие размер, отличающийся от размера эталонной фракции. Продвижение целевой фракции по каналу может определяться по продвижению эталонной фракции. Например, может быть известно, что целевая фракция может опережать или запаздывать от эталонной фракции на определенную долю. В некоторых вариантах осуществления целевая фракция нуклеиновых кислот содержит адаптер, присоединенный к молекуле нуклеиновой кислоты, представляющей интерес, а эталонная фракция нуклеиновых кислот содержит адаптер, который не присоединен к молекуле нуклеиновой кислоты, представляющей интерес. В некоторых вариантах осуществления способы могут включать автоматическое отслеживание продвижения нескольких эталонных фракций нуклеиновых кислот по каналу. Несколько эталонных фракций может содержать шкалу ДНК или РНК известных размеров.

[0012] В некоторых вариантах осуществления отслеживание включает, в отдельные моменты времени, получение изображения канала и идентификацию на изображениях областей, соответствующих эталонной фракции. Изображения могут, например, быть получены фотоаппаратом, установленным для наблюдения за каналом. Фотоаппарат может одновременно получать изображения большого числа каналов. Продвижение эталонных фракций (которые не обязательно одинаковы для различных каналов) в нескольких каналах может отслеживаться с помощью одного набора изображений. Расчетное время прибытия целевой фракции может оцениваться в некоторых случаях на основании средней скорости целевой фракции на основе разностей между положениями эталонной фракции на двух или более изображениях. Изображения могут содержать изображения с большим динамическим диапазоном. Например, изображения могут быть получены с помощью датчика с большим динамическим диапазоном или могут собираться из двух или более различных экспозиций. В некоторых вариантах осуществления изображения имеют битовую глубину в 10 или 12 бит, или более. В некоторых вариантах осуществления получение каждого изображения включает использование устройства получения изображения, чтобы получать несколько различных экспозиций канала и сочетание нескольких различных экспозиций, чтобы создавать изображение, причем это изображение обладает большим динамическим диапазоном, чем любая из нескольких различных экспозиций.

[0013] Некоторые варианты осуществления включают задание размера или диапазона размеров целевой фракции. Например, размер или диапазон размеров целевой фракции может задаваться в абсолютном выражении или относительно одной или более эталонных фракций. Например, размер или диапазон размеров целевой фракции может задаваться как опережающий или запаздывающий за эталонной фракцией на определенную долю. Некоторые варианты осуществления включают планирование времени прибытия для целевой фракции в лунку для извлечения; сравнение запланированного времени прибытия с расчетным временем прибытия и настройку одного или более параметров электрофореза сигнала электрофореза на основании любой разницы между запланированным временем прибытия и расчетным временем прибытия. В таких вариантах осуществления можно заставлять целевые фракции в различных каналах прибывать в лунки для извлечения в разное время (облегчая извлечение целевых фракций с помощью единого механизма, такого как робот с пипеткой, обслуживающий каждый канал в запланированное время). Также в таких вариантах осуществления можно заставлять целевые фракции в различных каналах прибывать в лунки для извлечения в одно и то же время (облегчая извлечение целевых фракций с помощью многоканального механизма, такого как робот с многоканальной пипеткой, обслуживающий несколько каналов одновременно в запланированное время).

[0014] Настройка одного или более параметров электрофореза может включать настройку рабочего цикла электрофоретического сигнала, настройку потенциалов электрофоретического сигнала или настройку других параметров, определяющих электрофоретический сигнал.

[0015] В некоторых вариантах осуществления способ определяет положение лунки для извлечения и/или загрузочной лунки в одном или более канатах посредством анализа изображения. Это упрощает системы, в которых лунки для извлечения в различных каналах находятся в различных местах, а также упрощает автоматическую компенсацию отличий в положениях лунок для извлечения и/или загрузочных лунок.

[0016] Другая особенность изобретения представляет устройство для отбора нуклеиновых кислот по размеру. Устройство содержит: канал, имеющий первый и второй концы, и лунку для извлечения в канале; источник питания электрофореза, подключенный для подачи электрофоретического сигнала к каналу, для перемещения нуклеиновых кислот из образца по каналу; устройство формирования изображений, установленное для формирования изображения канала; контроллер, подключенный для получения изображения от устройства формирования изображений, при этом контроллер сконфигурирован для: автоматического отслеживания продвижения эталонной фракции нуклеиновых кислот по каналу путем анализа изображений; на основании отслеживания, оценивания расчетного времени прибытия целевой фракции нуклеиновых кислот в лунку для извлечения в канале; и использования механизма для извлечения текучей среды, содержащей целевую фракцию, из лунки для извлечения в расчетное время прибытия.

[0017] Устройство формирования изображений может содержать электронный фотоаппарат. Фотоаппарат может быть оснащен фильтром, который ослабляет свет из полосы испускания красителя, связанного с нуклеиновой кислотой.

[0018] В некоторых вариантах осуществления механизм содержит роботизированную систему, содержащую пипетку, используемую, чтобы перемещать образец в загрузочную лунку в канале и извлекать текучую среду из лунки для извлечения. В некоторых вариантах осуществления пипетка содержит многоканальную пипетку, способную одновременно вносить несколько образцов в несколько каналов или одновременно извлекать текучие среды из лунок для извлечения в нескольких каналах.

[0019] В некоторых вариантах осуществления канал содержит продолговатый желоб, содержащий противоположные первую и вторую стороны, и электрофоретическую среду в желобе, и первая и вторая стороны содержат подъемы, проходящие в продольном направлении вдоль первой и второй сторон, при этом электрофоретическая среда заполняет желоб до подъемов.

[0020] Электрофоретическая среда может содержать, например, гель, такой как агарозный гель, акриламидный гель, денатурирующий акриламидный гель и т.п.

[0021] В некоторых вариантах осуществления контроллер сконфигурирован для определения положения лунки для извлечения в канале путем анализа изображения одного или более изображений и передвигать наконечник пипетки в определенное положение лунки для извлечения.

[0022] В некоторых вариантах осуществления контроллер приспособлен сравнивать расчетное время прибытия целевой фракции в лунку для извлечения с желаемым временем прибытия целевой фракции в лунку для извлечения, чтобы управлять источником питания электрофореза, чтобы регулировать один или более параметров электрофореза электрофоретического сигнала на основании любой разности между желаемым временем прибытия и расчетным временем прибытия.

[0023] В некоторых вариантах осуществления контроллер сконфигурирован для управления скоростью передвижения нуклеиновых кислот по каналу путем пропорционального регулирования с обратной связью одного или более электрофоретических параметров на основании сигнала ошибки, содержащего разность между расчетным временем прибытия и желаемым временем прибытия целевой фракции в лунку для извлечения.

[0024] В некоторых вариантах осуществления контроллер содержит планировщик, сконфигурированный для расчета желаемого времени прибытия целевой фракции в лунку для извлечения.

[0025] Устройство может содержать контроллер пропорциональной обратной связи, сконфигурированный для управления источником питания электрофореза, чтобы изменять среднюю скорость целевой фракции по каналу в ответ на сигнал ошибки, представляющий разность между расчетным временем прибытия целевой фракции в лунку для извлечения и желаемым временем прибытия целевой фракции в лунку для извлечения. В некоторых вариантах осуществления контроллер сконфигурирован для уменьшения разности между расчетным временем прибытия и желаемым временем прибытия, временно прекращая прикладывать электрофоретический сигнал к каналу.

[0026] Другая особенность изобретения представляет кассету для отбора нуклеиновых кислот по размеру. Кассета содержит пластину, имеющую канал, образованный в пластине, канал содержит продолговатый желоб, содержащий противоположные первую и вторую стороны, и электрофоретическую среду в желобе, первая и вторая стороны содержат подъемы, при этом электрофоретическая среда заполняет желоб до подъемов. Пластина может содержать одно или более отверстий, желобов или других элементов для крепления пластины в известном положении относительно робота. Канал может содержать как загрузочную лунку, так и лунку для извлечения, в находящихся на расстоянии местах вдоль по каналу. Пластина необязательно может быть прозрачной, по меньшей мере, в своей части под каналом.

[0027] Дополнительные особенности изобретения и признаки вариантов осуществления изобретения представляются на сопутствующих графических материалах и/или описываются ниже.

Краткое описание графических материалов

[0028] Сопутствующие графические материалы представляют неограничительные примерные варианты осуществления изобретения.

[0029] Фиг.1 представляет собой блок-схему способа для отбора нуклеиновых кислот по размеру в соответствии с одним примерным вариантом осуществления.

[0030] Фиг.1А представляет собой блок-схему альтернативного примерного способа.

[0031] Фиг.2 представляет собой схематическое изображение одного канала.

[0032] Фиг.2А представляет собой график плотности как функции положения вдоль канала.

[0033] Фиг.3 представляет собой блок-схему способа для идентификации пика, соответствующего ДНК предопределенного размера.

[0034] Фиг.4 представляет собой изображение устройства в соответствии с показательным вариантом осуществления.

[0035] Фиг.5 представляет собой изображение примера робота.

[0036] Фиг.5А представляет собой изображение примера настила.

[0037] Фиг.5В представляет собой изображение примера узла фотоаппарата.

[0038] Фиг.6 представляет собой снимок экрана показательного вывода графической информации.

[0039] Фиг.7 представляет собой изображение сверху показательного настила с каналами.

[0040] Фиг.7А представляет собой изображение отдельного канала в поперечном сечении.

[0041] Фиг.7В представляет собой изображение показательного гребня, используемого для образования лунок для загрузки или извлечения.

[0042] Фиг.7С представляет собой изображение сверху показательного настила с каналами в соответствии с другим вариантом осуществления.

[0043] Фиг.7D представляет собой общий вид настила с каналами с гребнями, прикрепленными для образования лунок для загрузки и извлечения.

Описание изобретения

[0044] На протяжении следующего описания излагаются специфические подробности, чтобы обеспечить более исчерпывающее понимание специалистам в данной области техники. Однако хорошо известные элементы могли быть не показаны или не описаны подробно во избежание неизбежного усложнения описания. Соответственно, описание и графические материалы нужно рассматривать в показательном, а не ограничительном смысле.

[0045] Одна особенность изобретения представляет автоматизированный способ для отбора образцов нескольких нуклеиновых кислот по размеру. Способ использует формирование изображения совместно с предсказательными алгоритмами, чтобы рассчитывать время извлечения и предоставлять отобранные по размеру нуклеиновые кислоты необходимого размерного диапазона. Способ может с выгодой использоваться на практике совместно с автоматизированным устройством, содержащим один или более электрофоретических каналов, фотоаппаратом, который получает изображения одного или более электрофоретических каналов, и роботом, имеющим пипетку для введения образцов в соответствующие каналы и извлечения из каналов отобранных по размеру нуклеиновых кислот. Каналы могут быть заполнены, например, агарозным гелем или акриламидным гелем. Каждый канал может иметь загрузочную лунку в канале и лунку для извлечения, находящуюся на расстоянии от загрузочной лунки, вдоль по каналу.

[0046] В следующем описании объясняется конструкция и работа показательных вариантов осуществления, используемых для отбора ДНК по размеру. Например, ДНК может включать кДНК, полученную от РНК. ДНК, подлежащая отбору по размеру, может иметь размер в диапазоне от 10 со (спаренных оснований) до 10 ксо. Однако изобретение может применяться для отбора по размеру других нуклеиновых кислот, таких как РНК. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновые кислоты содержат сдвинутые ДНК.

[0047] Фиг.1 представляет собой блок-схему способа 10 в соответствии с показательным вариантом осуществления изобретения. В блоке 11 образец, содержащий ДНК, вводится в загрузочную лунку в канале, содержащем среду, через которую ДНК может перемещаться электрофорезом. Образец, содержащий ДНК, также может содержать краситель (например, краситель SYBR Green™ или бромид этидия), который вводится в загрузочную лунку вместе с ДНК. Функцией красителя является облегчение обнаружения или формирования изображения ДНК в среде. В некоторых вариантах осуществления молекулы ДНК в образце могут содержать адаптер, который может применяться для последующих приложений, таких как секвентирование ДНК. Среда может, например, содержать агарозный или акриламидный гель. В блоке 12 начинается электрофорез. Электрофорез может осуществляться приложением разности электрических потенциалов между электродами на противоположных концах канала. Разница потенциалов может содержать, например, электрический потенциал постоянного тока, импульсный электрический потенциал постоянного тока или несбалансированный электрический потенциал переменного тока. Приложенный электрический потенциал заставляет ДНК перемещаться из загрузочной лунки по каналу к лунке для извлечения. ДНК различных размеров обладают различной подвижностью в канале, и поэтому ДНК разделяются по размеру.

[0048] Необязательный блок 13 обеспечивает задержку, чтобы позволять ДНК перемещаться достаточно далеко по каналу, так чтобы можно было обнаружить концентрации ДНК различных размеров. Блок 14 включает определение положения вдоль канала целевой ДНК желаемого диапазона размеров. В некоторых вариантах осуществления блок 14 включает получение последовательности изображений канала с помощью фотоаппарата, обнаружение одного или более ориентиров на изображении (изображениях), соответствующих ДНК одного или более известных размеров, и определение положения целевой ДНК на основании положения (положений) ориентира (ориентиров). Выход блока 14 представляет собой последовательность положений целевых ДНК вдоль по каналу.

[0049] Эталоны оценки размера (например, ориентиры) могут задаваться во время или до работы; будь то шкала ДНК или присущий признак, который, как ожидается, должен присутствовать в электроферограмме. Если используемым эталоном оценки размера является шкала ДНК, то шкала ДНК может добавляться к образцу до загрузки образца в загрузочные лунки. В некоторых вариантах осуществления эталон оценки размера изначально присутствует в образце. Например, чтобы выбрать по размеру кДНК образец, полученный от микроРНК, образец может содержать и фрагменты кДНК + адаптер (например, имеющие размер 109 со), и фрагменты адаптер-адаптер (например, имеющие размер 80 со). Фрагменты адаптер-адаптер могут применяться в качестве определяющего размер эталона.

[0050] Диапазон размеров целевой ДНК может быть задан различными способами, например, в абсолютном значении или относительно данного эталона (эталонов), позволяя отсекать фракции с размерами или зависящими, или не зависящими от профиля электроферограммы входного образца. Например, входной образец представляет собой сдвинутую геномную ДНК с ожидаемым центром пика на ~250 со, диапазон подвижности целевой фракции может быть задан относительно центра пика (например, 110%-90% подвижности центра пика), или же цель может быть задана как диапазон абсолютных размеров (например, 150-200 со), независимый от фактической подвижности центра пика.

[0051] Блок 15 определяет среднюю скорость целевой ДНК по каналу. Блок 15, например, может просто делить разность двух положений целевой ДНК на время, прошедшее между получением изображений, из которых были определены положения. Блок 15 может принимать во внимание более двух положений. Например, блок 15 может находить среднее или медиану нескольких скоростей.

[0052] Блок 16 оценивает время прибытия целевой ДНК в лунку для извлечения. Это определение может основываться на известном, предопределенном положении лунки для извлечения. В некоторых вариантах осуществления положение лунки для извлечения определяется в блоке 17 путем нахождения изображения лунки для извлечения на изображениях, полученных в блоке 15 (или других отдельных изображениях, полученных с целью определения положения лунки для извлечения). Распознавание изображения может быть основано на моделях (т.е. заранее известно, как должно выглядеть изображение канала на изображении, где каждый канал, как ожидается, должен находиться на изображении и, как ожидается, будет выглядеть изображение лунки для извлечения на изображении). Определение положения лунки для извлечения может, например, включать нахождение положения на изображении, в котором максимизирована корреляция с модельным изображением лунки для извлечения. В других более простых вариантах осуществления определение положения лунки для извлечения включает определение положения одного или более краев, соответствующих лунке для извлечения на изображении.

[0053] Расчетное время прибытия может быть получено, например, путем добавления расчетного времени перемещения к текущему времени. Расчетное время перемещения может определяться, например, делением расстояния между положением лунки для извлечения и текущим положением целевой ДНК на текущую скорость целевой ДНК, как оценивается в блоке 15.

[0054] Блок 18 извлекает целевую ДНК из лунки для извлечения в расчетное время прибытия. Блок 18 может, например, включать управление роботом, несущим пипетку, чтобы размещать пипетку в лунке для извлечения в расчетное время прибытия или до него и забирать текучую среду из лунки для извлечения в пипетку в расчетное время прибытия. Робот затем может отправлять собранную текучую среду в резервуар, в котором текучая среда может храниться или передаваться на последующую обработку.

[0055] Способ 10 имеет ряд разновидностей. В некоторых вариантах осуществления информация о скорости и/или положении целевой ДНК применяется, чтобы контролировать скорость целевой ДНК. Информация о положении, полученная из производимых во время работы электроферограмм, и информация о времени используются в петле обратной связи, чтобы управлять скоростью электрофореза фракции целевой ДНК, в дополнение к ее времени прибытия в лунке для извлечения.

[0056] Управление с обратной связью может применяться, например, чтобы регулировать расчетное время прибытия целевой ДНК в лунку для извлечения. Расчетное время прибытия может регулироваться, например, путем регулирования рабочего цикла и/или напряжения поля электрофореза, и/или остановки приложения поля электрофореза однократно или многократно. Варианты, которые регулируют скорость целевой ДНК путем регулирования рабочего цикла, могут быть более выгодными, поскольку связь между рабочим циклом и скоростью склоняется к линейной или почти линейной. Это облегчает управление. Скорость электрофореза и планирование извлечения могут контролироваться одновременно для произвольного числа образцов. В одном варианте осуществления планирование извлечения обрабатывает 96 образцов, проходящих параллельно.

[0057] Фиг.1А представляет собой блок-схему альтернативного способа 10А, который подобен способу 10, за исключением того, что он включает блок 19, который планирует запланированное время прибытия для целевой ДНК, и блок 20, который сравнивает расчетное время прибытия из блока 16 с запланированным временем прибытия для целевой ДНК. Блок 21 получает сигнал управления из блока 20 и регулирует параметры электрофореза на основании сигнала управления. Цикл 22 может периодически повторяться со скоростью, достаточной, чтобы управлять продвижением целевой ДНК, так что целевая ДНК прибывает в лунку для извлечения в запланированное время.

[0058] В блоке 21 параметры электрофореза могут регулироваться надлежащим образом, чтобы замедлять продвижение целевой ДНК, ускорять продвижение целевой ДНК или поддерживать текущую скорость продвижения целевой ДНК. В некоторых вариантах осуществления регулирование зависит лишь от знака сигнала управления (т.е. опережает ли расчетное время прибытия запланированное время прибытия, или, наоборот, отстает). В других вариантах осуществления регулирование основывается, по меньшей мере, частично, на величине разности между расчетным временем прибытия и запланированным временем прибытия (или, что одно и то же, на величине разности между расчетной скоростью и скоростью, которая привела бы целевую ДНК в лунку для извлечения в запланированное время).

[0059] В обычных случаях целевая ДНК не имеет конкретного размера, но имеет диапазон размеров. Поэтому целевая ДНК появляется в лунке для извлечения во временном окне, имеющем длину, определенную диапазоном размеров во фракции ДНК, а также параметрами электрофореза. В некоторых вариантах осуществления целевая фракция может задаваться изначально, а также непрерывно регулироваться до извлечения фракции.

[0060] Управление временем, в которое целевая ДНК прибывает в лунку для извлечения, может с пользой применяться в случае, когда одновременно используется несколько электрофоретических каналов. Например, электрофорез ДНК в каждом из нескольких каналов может контролироваться так, чтобы заставлять целевую ДНК в каждом канале прибывать в лунку для извлечения в запланированное время, так что запланированные моменты времени в различных каналах отличаются. Целевая ДНК в разных каналах может быть одной и той же или разной. Это может облегчать использование робота для извлечения ДНК из каждого канала, не требуя, чтобы одна пипетка робота извлекала текучую среду из двух лунок для извлечения одновременно. Запланированные моменты времени могут назначаться так, чтобы гарантировать, что имеется достаточно времени для того, чтобы робот произвел каждое запланированное извлечение.

[0061] Управление скоростью электрофореза может применяться для того, чтобы компенсировать различия между каналами в скорости электрофореза (вызванные, например, неоднородностями в электрофоретической среде или другими различиями в электрофоретической среде, используемой в различных каналах). Это управление также может применяться, чтобы компенсировать различия в расположении лунки для извлечения между каналами. Это управление также может применяться, чтобы компенсировать различия в целевой ДНК для различных каналов.

[0062] Некоторые варианты осуществления используют многоканального робота. Например, такой робот может иметь несколько пипеток, расположенных так, что их наконечники могут одновременно вставляться в несколько лунок для извлечения. Например, робот может иметь 8, 16 или некоторое другое количество пипеток. В некоторых таких вариантах осуществления каналы располагаются бок о бок, и робот может быть сконфигурирован для одновременного введения текучей среды в N смежных загрузочных лунок или одновременного удаления текучей среды из N смежных лунок для извлечения.

[0063] В некоторых вариантах осуществления, использующих многоканального робота, электрофорез в нескольких каналах контролируется так, чтобы заставлять ДНК в нескольких каналах достигать лунок для извлечения в одно и то же запланированное время. Целевая ДНК среди нескольких каналов может различаться. Робот затем может управляться так, чтобы помещать наконечники пипеток в лунки для извлечения нескольких каналов в запланированное время и одновременно извлекать текучую среду из лунок для извлечения. Такие варианты осуществления позволяют назначать группам каналов различное запланированное время прибытия. Электрофорез в отдельных каналах в каждой группе может управляться по отдельности, чтобы заставлять целевую ДНК в каждом канале в группе прибывать в соответствующую лунку для извлечения во время, запланированное для этой группы. Запланированное время для различных групп каналов может разноситься так, чтобы робот имел время произвести запланированные извлечения. Такие варианты осуществления могут обеспечивать высокопроизводительный электрофорез.

[0064] Описанные выше принципы также могут применяться в ситуациях, когда желательно извлечь две или более фракций из одного и того же образца. Для таких приложений электрофорез может выполняться, чтобы привести первую целевую фракцию в лунку для извлечения и извлечь первую целевую фракцию. После этого может выполняться дальнейший электрофорез, чтобы привести вторую фракцию в лунку для извлечения. Тогда может быть извлечена вторая фракция. Если необходимо, первая и вторая фракция могут удерживаться изолированными друг от друга. Например, каждая из первой и второй фракций могут перемещаться из лунки для извлечения в отдельную лунку назначения. Также можно перемещать несколько фракций из одного образца в одну лунку назначения, если необходимо.

[0065] В некоторых приложениях из одного и того же образца могут извлекаться три или более фракций. Когда из одного образца необходимо извлечь две или более целевых фракций, то извлечение каждой целевой фракции может планироваться отдельно. После того как первая целевая фракция была извлечена из канала в первое запланированное время, параметры электрофореза для канала могут контролироваться так, чтобы привести вторую целевую фракцию в лунку для извлечения во второе запланированное время.

[0066] В некоторых вариантах осуществления электрофорез контролируется в нескольких каналах, чтобы приводить соответствующие несколько первых целевых фракций в лунки для извлечения в нескольких каналах в первое время. Затем может применяться многоканальная пипетка или многоканальный механизм извлечения, чтобы перемещать первую целевую фракцию в соответствующие лунки назначения. Затем электрофорез в нескольких каналах может контролироваться так, чтобы приводить вторые целевые фракции в лунки для извлечения в каналах в одно и то же время. Нет необходимости, чтобы расстояние между первыми целевыми фракциями и вторыми целевыми фракциями в разных каналах было одинаковым. Электрофорез может контролироваться так, чтобы перемешать вторую целевую фракцию в направлении лунки для извлечения быстрее в одних каналах, чем в других. В некоторых вариантах осуществления электрофорез контролируется так, чтобы приводить вторые целевые фракции в лунки для извлечения в одно и то же время в нескольких каналах, так что вторые целевые фракции можно извлекать одновременно с помощью многоканальной пипетки.

[0067] Фиг.2 представляет собой схематическое изображение одного канала 24. Канал 24 содержит дорожку 25 подходящей электрофоритической среды с буферным резервуаром 25А, 25В на каждом конце. Загрузочная лунка 26А располагается в среде 25 возле буферного резервуара 25А. Лунка для извлечения располагается в среде 25 в месте, которое находится на расстоянии от загрузочной лунки 26А в направлении буферного резервуара 25В.

[0068] Также на фиг.2 представлены различные полосы ДНК, которые были перемещены электрофорезом по среде 25 от загрузочной лунки 26А. Поскольку при электрофорезе ДНК различных размеров перемещаются с различными скоростями, полоски в различных положениях представляют ДНК различных размеров. Различные полоски на изображении могут иметь различную плотность. Все полоски могут представлять ДНК, присутствующие в образце. В некоторых вариантах осуществления ДНК известного размера или набора известных размеров (например, шкала ДНК) могут добавляться в образец с целью обеспечения размерной шкалы, которую можно использовать для определения положения целевой ДНК.

[0069] В некоторых вариантах осуществления эталоны оценки размера, такие как ДНК линейки, проводятся в том же канале 24, что и входные образцы. Это гарантирует точность оценки размера по сравнению с вариантами осуществления, в которых эталоны оценки размера и образцы проводятся в отдельных каналах.

[0070] Фиг.2А представляет собой график плотности как функции положения вдоль канала 24. Пики на кривой 27 соответствуют положениям полосок, представленных на фиг.2. Способы, описанные выше, могут идентифицировать пики на кривой 27, соответствующие целевой ДНК, или делать вывод о текущем положении целевой ДНК на основании положений одного или более других пиков, соответствующих ДНК, имеющей известные отношения размера (размеров) с целевой ДНК.

[0071] Некоторые варианты осуществления предоставляют планировщик. Планировщик, например, может быть реализован программным обеспечением. Планировщик может планировать: перемещение образцов в лунки-источники 26А в каналах 24, начало действия электрофореза в каналах 24 и извлечение целевых фракций из лунок 26В для извлечения. В некоторых вариантах осуществления планировщик работает, пока образцы проводятся по каналам 24, и может перепланировать извлечение целевых фракций в ответ на отслеживание продвижения целевой фракции (или полоски, имеющей известное отношение к целевой фракции). Планировщик может сначала планировать извлечение целевой фракции в промежуток времени, который отделен от времени начала электрофореза в канале на период, который длиннее, чем самый короткий период, за который целевая фракция могла бы потенциально продвинуться от лунки-источника 26А в соответствующую лунку 26В для извлечения. В некоторых вариантах осуществления период времени, используемый для этого начального планирования, может быть определен на основании измеренного расстояния от лунки-источника 26А до лунки 26В для извлечения. Период времени может получаться на основании предполагаемой средней скорости целевой фракции, которая меньше, чем максимальная скорость, достижимая в доступном диапазоне параметров электрофореза. Предполагаемая средняя скорость может быть функцией размера целевой фракции и характеристик среды, в которой выполняется электрофорез.

[0072] В некоторых вариантах осуществления длина периода, запланированного планировщиком для извлечения целевой функции, является переменной и зависит от размеров нуклеиновой кислоты, включенной в целевую фракцию (целевая фракция, которая содержит более крупный диапазон размеров, будет извлекаться дольше, чем целевая фракция, в которой разброс размеров мал). В некоторых вариантах осуществления время начала и конца извлечения целевой фракции регулируются на основании расчетного времени прибытия в лунку для извлечения ведущего и замыкающего краев целевой фракции.

[0073] В некоторых вариантах осуществления планировщик отслеживает противоречия между временем для извлечения целевых фракций из различных каналов 24. В некоторых таких вариантах осуществления, в случае противоречия (т.е. периоды, назначенные для извлечения целевых фракций из различных каналов 24, пересекаются), планировщик может пересмотреть запланированное время для извлечения целевой фракции из одного из каналов 24, чтобы снять противоречие. Изменение запланированного времени извлечения может автоматически приводить к изменению параметров электрофореза в перепланируемом канале 24, так чтобы контролировать продвижение целевой фракции в канале 24, чтобы целевая фракция прибывала в лунку для извлечения в перепланированное время.

[0074] В некоторых вариантах осуществления параметры электрофореза для канала 24 контролируются так, чтобы при прибытии ведущего края целевой фракции в соответствующую лунку 26В для извлечения и начале извлечения скорость электрофореза увеличивалась, тем самым уменьшая время, в течение которого необходимо продолжать извлечение, чтобы извлечь всю целевую фракцию.

[0075] Фиг.3 представляет собой блок-схему способа 30 для идентификации пика, соответствующего ДНК предопределенного размера в канале 24. Блок 32 применяет электрофорез к каналу, используя известные параметры электрофореза, на некоторый период времени. Блок 33 получает изображение канала на конце блока 33. Блок 34 идентифицирует ряд положений вдоль канала на основании известных характеристик для целевой ДНК. Например, может предоставляться предопределенная градуировочная кривая 35, которая соотносит положение вдоль канала с размером ДНК. В некоторых вариантах осуществления предоставляется несколько различных градуировочных кривых 35. Различные градуировочные кривые могут относиться к различным средам, которые могут использоваться в каналах 24.

[0076] Блок 34 оценивает положение или ряд положений, в которых, как ожидается, должна быть обнаружена ДНК. Расчетное положение может быть функцией отрезка времени, в течение которого проводился электрофорез, среды в канале 24, параметров электрофореза и характеристик (особенно размера) целевой ДНК. Размер или диапазон размеров для целевой ДНК может вводить оператор. Блок 34 может использовать надлежащую градуировочную кривую 35, чтобы идентифицировать ожидаемое положение пика на кривой 27, соответствующего целевой ДНК. Блок 36 устанавливает диапазон 37 (см. фиг.2А) и ищет на кривой 27 пик в диапазоне 37. Если пик успешно определен (что определяется, например, результатом ДА от блока 39), то пик идентифицируется как начальное положение целевой ДНК. Когда пик, соответствующий целевой ДНК, был идентифицирован на одном изображении, пик можно отслеживать через последующие изображения, по мере того как он проходит по каналу. Заметные признаки профиля электроферограммы можно идентифицировать во время работы и применять, чтобы помогать поддерживать целостность размера, когда более быстро движущиеся эталоны размера уходят из поля зрения.

[0077] Способ 30 может применяться, чтобы идентифицировать один или более пиков, соответствующих ДНК в ДНК лестнице и/или образце. В некоторых вариантах осуществления один или более пиков, отличающихся от целевой ДНК, идентифицируются и отслеживаются, как описано выше. Текущее положение целевой ДНК может идентифицироваться относительно таких пиков. Например, пользователь может задавать величину, на которую целевая ДНК, как ожидается, должна опережать или отставать от одного или более таких пиков.

[0078] Фиг.4 представляет собой изображение устройства 40 в соответствии с показательным вариантом осуществления. Устройство 40 содержит робота 42, имеющего пипетку 44, которая может располагаться роботом 42 над желаемыми положениями в поле 43. Например, робот 42 может содержать XYZ платформу, которая поддерживает одноканальный насос пипетки, который также поддерживает загрузочную линию буфера и механизм выдвижения наконечника. Пластина-источник 45 содержит несколько лунок-источников 45А. Пластина 46 предназначения содержит несколько лунок предназначения 46А. В поле 43 предоставляется несколько каналов 47.

[0079] Робот 42 имеет контроллер 42А, который может управлять положением пипетки 44. Контроллер 42А может, например, управлять роботом 42, чтобы загружать канал следующим образом:

поднимать наконечник 48 пипетки в положении 48А,

располагать наконечник пипетки над выбранной лункой-источником 45А,

опускать наконечник пипетки в лунку-источник 45А,

и затягивать текучую среду в наконечник пипетки 45А,

поднимать наконечник пипетки и устанавливать его над загрузочной лункой выбранного канала 47,

опускать наконечник пипетки в загрузочную лунку,

выпускать из пипетки текучую среду в лунку-источник,

поднимать наконечник пипетки и перемещать наконечник пипетки в область хранения для использованных наконечников пипеток и отсоединять использованный наконечник пипетки.

[0080] Контроллер 42А может, например, управлять роботом 42, чтобы извлекать целевую ДНК из канала следующим образом:

поднимать наконечник 48 пипетки в положении 48А,

располагать наконечник пипетки над лункой для извлечения в выбранном канале, непосредственно перед расчетным прибытием целевой ДНК,

опускать наконечник пипетки в лунку для извлечения канала,

затягивать текучую среду в наконечник пипетки 45А, в течение времени, соответствующего ожидаемому прибытию целевой ДНК,

поднимать наконечник пипетки и располагать его над лункой назначения 46А,

опускать наконечник пипетки в лунку назначения,

выпускать из пипетки текучую среду в лунку назначения,

поднимать наконечник пипетки перемещать наконечник пипетки в область хранения для использованных наконечников пипеток и отсоединять использованный наконечник пипетки.

[0081] Устройство, как описано здесь, может быть сконфигурировано для обработки любого разумного количества образцов. В некоторых вариантах осуществления устройство, как описываемое здесь, обеспечивает автоматизированный отбор по размеру для 96 образцов одновременно. В других показательных вариантах осуществления устройство обрабатывает одновременно величину, кратную 96 образцам. Другие показательные варианты осуществления приспособлены обрабатывать другие количества образцов.

[0082] Роботы, подходящие для использования в качестве робота 42, доступны на рынке. Роботы, подходящие для использования в качестве робота 42, также могут изготавливаться из доступных на рынке компонентов способами, известными специалистам в данной области техники.

[0083] Устройство 40 содержит устройство 50 формирования изображений, которое может, например, содержать фотоаппарат, приспособленный получать изображения каналов 47. Устройство 50 формирования изображений может содержать устройство формирования изображений с большим динамическим диапазоном. Например, фотоаппарат 50 или контроллер, подключенный получать изображения от фотоаппарата 50, могут быть приспособлены получать и комбинировать изображения, взятые с различным временем экспозиции, чтобы расширять обнаруживаемый динамический диапазон. Это позволяет делать видимыми тусклые полосы без насыщения самых ярких полос.

[0084] Источник 52 света освещает каналы 47, чтобы облегчать получение изображений нуклеиновых кислот, продвигающихся по каналам. Там, где ДНК связана с красителем, источник света может испускать свет, соответствующий полосе поглощения красителя (например, полосе, соответствующей длине волны, которая возбуждает флуорофор красителя). Источник света 52 может содержать фильтр, который блокирует длины волн за пределами этого диапазона. Например, краситель SYBR Green™ поглощает свет на длине волны 488 нм. Источник света может испускать синий свет. Например, источник света может содержать массив синих светодиодов. Альтернативно или дополнительно источник света может излучать ультрафиолетовый свет. Фотоаппарат 50 может содержать фильтр, который предпочтительно отмечает свечение красителя. Например, краситель SYBR Green™ излучает свет на длине волны 520 нм. Фотоаппарат может иметь полосовой или режекторный фильтр, который пропускает свет с длиной волны 520 нм, но ослабляет свет на других длинах волн.

[0085] Например, фотоаппарат может быть закреплен на детали робота 42, так что фотоаппарат находится на фиксированном расстоянии от каналов 47. В варианте осуществления - прототипе фотоаппарат 50 и светодиодный осветитель 52 закреплены на руке робота 42, соответствующей оси Y.

[0086] Многоканальный источник питания электрофореза 54 приспособлен подавать потенциалы электрофореза на каналы 47. Источник питания 54 может содержать один элемент или несколько отдельных элементов. Контроллер 55 подключен принимать изображения от фотоаппарата 50, чтобы контролировать источник питания 54 и координировать действия робота 42. Пользовательский интерфейс 56 позволяет пользователям подавать сигналы управления и информацию, чтобы управлять работой устройства 40.

[0087] При работе показательной системы пластины источника и назначения 45, 46 загружаются вместе с двумя ящиками, содержащими наконечники пипетки. Пластины, содержащие каналы 47, устанавливаются на настиле, и массивы электродов располагаются так, что их электроды находятся в электрическом контакте с каналами 47 на концах канальной пластины. В некоторых вариантах осуществления электроды устанавливаются на конструкцию, которая позволяет вводить их в буферные лунки на каждом конце каждого канала. Например, устройство может содержать шарнирную раму, несущую первый и второй электроды, соответствующие каждому каналу. Первый и второй электроды могут быть установлены на шарнирной раме, и шарнирная рама может перемещаться между первым положением, в котором первый и второй электроды выступают в первый и второй буферный резервуары канала, и вторым положением, в котором первый и второй электроды удаляются из первого и второго буферных резервуаров.

[0088] Управляющее программное обеспечение настраивается на положение образцов (все 96 пластина с лунками, больше или меньше), тип образцов и положения канальной пластины (пластин).

[0089] Когда начинается работа, буферные лунки в канальных пластинах заполняются. Образцы вводятся последовательно (например, роботом в загрузочные лунки в каналах 47), и начинается электрофорез. В одном варианте осуществления встроенный фотоаппарат 50 используется для определения положения лунки для извлечения в каждом канале 47, что избавляет от необходимости задавать положение лунки для извлечения вручную. Это облегчает возможность предоставления лунок для извлечения в различных местах в их каналах 47.

[0090] Некоторые варианты осуществления содержат механизм для измерения и/или установки Y-координаты наконечника пипетки. Знание точного положения наконечника пипетки облегчает точную загрузку и извлечение образцов нуклеиновых кислот в маленьких лунках. Такой механизм полезен, поскольку концы различных наконечников пипеток при установке на робота могут находиться в некоторой мере в различных положениях относительно робота. В показательном варианте осуществления механизм содержит переключатель (который может быть микропереключателем, бесконтактным переключателем или т.п.), который изменяет состояние, когда наконечник пипетки находится в предопределенном положении относительно переключателя. Переключатель может находиться в удобном месте в поле робота.

[0091] В некоторых вариантах осуществления переключатель находится возле источника новых наконечников пипеток, так что Y-координата каждого нового наконечника пипетки может устанавливаться путем перемещения робота, чтобы устанавливать наконечник пипетки напротив переключателя. В таких вариантах осуществления наконечник пипетки может располагаться поблизости от переключателя, а затем перемещаться к переключателю в направлении оси Y, пока переключатель не изменит состояние. Этот механизм может использоваться, чтобы по отдельности измерять положение конца каждого наконечника пипетки после загрузки наконечника. Измеренное положение может использоваться для компенсации небольших смещений в различных наконечниках пипетки. Представленная система 40 содержит переключатель 49, приспособленный переключаться, когда наконечник пипетки прижимается к переключателю в направлении оси Y (направление, параллельное каналам 47).

[0092] Фиг.5 представляет собой изображение примера робота. Фиг.5 представляет изображение нижнего настила, который содержит контроллеры и источники питания, и верхнего настила, который содержит канальные пластины и электроды. Выше них располагается головка пипетки с насосом, буферная система доставки и фотоаппарат и лампы для получения изображений каналов.

[0093] Фиг.5А представляет собой изображение примера настила. На фиг.5А представлены установочные плиты, которые удерживают настил на месте. Все коробки с наконечниками, пластины-источники, пластины назначения и канальные пластины устанавливаются на настиле. По меньшей мере все пластины-источники, пластины назначения и канальные пластины могут сниматься с настила. Пружинные фиксаторы предоставляются, чтобы удерживать пластины напротив установочных фиксаторов, так что лунки-источники, лунки назначения и каналы находятся в известных положениях, когда пластины установлены на настиле.

[0094] Фиг.5В представляет собой изображение примера системы фотокамеры, которая содержит камеру 50 и светодиодные массивы 52. Светодиодные массивы 52 содержат испускающие синий свет источники света, такие как синие светодиоды светодиодов, покрытых синими фильтрами, в некоторых вариантах осуществления.

[0095] В показательном варианте осуществления контроллер 55 содержит процессор, сконфигурированный для выполнения команд, представленных в программном обеспечении. Программное обеспечение создает протокол прохождения (какой образец проходит в каких каналах, в каком порядке, и в каких лунках назначения проводятся соответствующие извлечения) на основании данных, введенных пользователем. Об этом пользователю сообщается с помощью графики.

[0096] Фиг.6 представляет собой снимок экрана показательного вывода графической информации. Фиг.6 представляет графический вывод текущей информации. Образцы были загружены последовательно, начиная слева сверху, и первые две с половиной пластины завершили проход. Остающиеся образцы справа идут, и состояние каждого канала представляется графически на основании самого последнего изображения. График сверху представляет собой электроферограмму для канала, выбранного пользователем, показывая пик 59А размерного эталона и целевую область 59В.

[0097] Другая особенность изобретения, которая может использоваться вместе с роботом, наподобие описанного выше, но также может иметь и другие приложения, представляет канальные пластины для использования при разделении нуклеиновых кислот. В некоторых вариантах осуществления на пластине предоставляется один или более каналов. Например, пластина может размещаться с возможностью снятия в поле робота, наподобие описанного выше. Предоставление среды для разделения ДНК в каналах, в отличие от брусков (например, брусочного геля), имеет преимущество, состоящее в том, что уменьшается вероятность взаимного загрязнения одного образца другим.

[0098] Фиг.7 представляет собой изображение сверху показательной пластины 80 с каналами. Пластина 80 содержит позиционирующие признаки 81, такие как отверстия (см. фиг.7А) или пазы (см. фиг.7С) для принятия установочных штифтов или других крепежных признаков, которые позволяют систематически располагать пластину 80 в поле робота или других устройств. Несколько каналов 24 протягиваются по пластине 80. Каждый канал 24 содержит дорожку 25 подходящей электрофоретической среды. Буферный резервуар 25А, 25В предоставляется на каждом конце дорожки 25. Загрузочная лунка 26А располагается на дорожке 25 возле буферного резервуара 25А. Лунка 26В для извлечения располагается на дорожке 25 в месте, которое находится на расстоянии от загрузочной лунки 26А в направлении буферного резервуара 25В. В некоторых приложениях лунки 26В для извлечения различных каналов совмещаются друг с другом, но это не обязательно. В некоторых приложениях может быть удобно, предоставлять лунки 26В для извлечения, которые находятся в различных каналах 24 в разных положениях вдоль по дорожке 25.

[0099] Фиг.7А представляет собой изображение отдельного канала 24 в поперечном сечении. Канал 24 необязательно имеет небольшой край в виде подъема на каждой стороне дорожки 25. В представленном варианте осуществления показаны подъемы 83. Подъемы 83 предоставляют углы 84. Углы 84 идут по длине вдоль дорожки 25 параллельно друг другу. В представленном варианте осуществления углы 84 параллельны плоским верхней и нижней поверхностям 84А и 84В пластины 80. Среда 86 (например, агарозный гель, акриламидный гель или т.п.) заполняет дорожку 25 до уровня углов 84. Подъемы 83 помогают сделать верхнюю поверхность материала 86 в дорожке 85 плоской по длине дорожки 25. Наличие углов 84, когда материал 86 вводится в дорожку 25, помогает уменьшить склонность поверхностного натяжения материала 86 образовывать мениск на поверхности материала 86. Необязательные признаки, такие как небольшие выступы или ямки 89 (см. Фиг.7С), могут быть образованы в стенках дорожки 25 возле концов дорожки 25, чтобы механически фиксировать материал 86 на месте.

[0100] Размеры канала 24 могут быть различными. В показательном варианте осуществления дорожка 25 имеет глубину в диапазоне около 6-12 мм, предпочтительно 8-10 мм. В показательном варианте осуществления дорожка 25 имеет ширину от 3 до 11 мм, предпочтительно от 4 до 7 мм. Однако принципы, описанные в данном документе, могут применяться и к каналам других размеров.

[0101] Пластина 80 может изготавливаться из подходящей пластмассы или другого не проводящего электричество материала. В некоторых вариантах осуществления пластина 80 изготавливается литьем под давлением, однако пластина 80 также может изготавливаться механической обработкой или любым другим подходящим способом.

[0102] Пластина 80 может быть подготовлена путем временного перекрытия или заполнения буферных резервуаров 25А и 25В и заливкой надлежащего количества затвердевающего материала 86 в дорожки 25. Предпочтительно, пока закладывается материал 86, весь объем каждого буферного резервуара заполнен, так что материал 86 не может течь в буферные резервуары. Например, агарозный гель может наливаться в дорожки 25, пока гель находится в жидкой форме, а затем ему позволяется отвердевать в дорожках 25. Количество материала 86, вводимого в каждую дорожку, может быть как раз достаточным для того, чтобы поверхность материала находилась на уровне углов 84.

[0103] Лунки для загрузки и извлечения могут быть образованы в материале 86, пока материал закладывается в дорожки 25. В других вариантах осуществления лунки для загрузки и/или извлечения могут быть созданы после того, как материал 86 затвердел. В некоторых вариантах осуществления лунки для загрузки и/или извлечения образуются путем размещения гребней для загрузки и/или извлечения в надлежащие места на дорожках 25. Фиг.7В представляет собой изображение примера гребня 87. Каждый гребень 87 имеет ряд зубцов 87А. Гребень 87 может помещаться на пластину 80 поперек дорожек 25, так что зубцы 87А устанавливаются, выступая в дорожки 25 каналов 24, пересеченных гребнем 87.

[0104] Пластина 80 может содержать фиксирующие элементы 88, чтобы размещать гребни 87 в необходимом положении для создания загрузочных лунок и/или лунок для извлечения. Может предоставляться несколько наборов фиксирующих элементов 88, чтобы облегчать создание лунок для извлечения в различных местах вдоль по дорожкам 25. Как указано выше, может быть желательно предоставлять лунки для извлечения в месте, которое приспособлено для разделения, которое нужно произвести. Лучшая длина канала разделения между загрузочной лункой 26А и лункой 26В для извлечения зависит от длины ДНК или другой целевой нуклеиновой кислоты и желаемой степени разделения.

[0105] Гребень 87 для создания лунок для извлечения может иметь зубцы 87А, которые немного шире, чем зубцы 87А, используемые для создания загрузочных лунок. Предоставление загрузочных лунок 26А, которые не протягиваются на всю ширину дорожек 25, помогает избежать потери образца на сторонах загрузочной лунки. Лунки 26В для извлечения могут протягиваться на всю ширину дорожек 25 или почти на всю ширину дорожек 25.

[0106] Ряд вариантов осуществления предоставляют каналы, в которых загрузочные лунки шире, чем лунки для извлечения. В одном конкретном показательном варианте осуществления загрузочная лунка имеет размеры 1,2×3,5×9 мм, а лунка для извлечения имеет размеры 1,2×5,5×9 мм (т.е. на 2 мм шире, чем загрузочная лунка). Загрузочная лунка, имеющая размеры 1,2×3,5×9 мм, позволяет загружать образец объемом до 37,8 мкл. Лунка для извлечения, имеющая размеры 1,2×5,5×9 мм, позволяет изымать объем до 59,4 мкл.

[0107] Гребни 87 могут быть спроектированы так, что зубцы 87А, которые образуют лунки, могут немного «плавать» (например, примерно на 0,25 мм) в своих монтажных рамах. Это облегчает удаление гребней 87 после отверждения материала 86.

[0108] Пластина 80, содержащая один или более каналов 24, может предоставляться в форме предварительно подготовленной кассеты, представленной в стерильной упаковке. Упаковка может, например, содержать стерильное покрытие, которое может сниматься, чтобы открывать каналы 24. В некоторых вариантах осуществления кассета может поставляться с гребнями, вставленными в загрузочные лунки и/или лунки для извлечения. Пользователь может удалять гребни перед использованием.

[0109] Фиг.7С представляет собой изображение сверху показательного настила с каналами в соответствии с другим вариантом осуществления.

[0110] Фиг.7D представляет собой общий вид пластины с каналами, где гребни 87-1 и 87-2 вставлены при подготовке к заливке электрофоретической среды в каналы 24. В некоторых вариантах осуществления гребень 87-1 может иметь более узкие зубцы, чем гребень 87-2.

[0111] Хотя фотоаппарат обеспечивает удобное средство для получения изображений нескольких каналов и одновременно для отслеживания продвижения одной или более эталонных фракций в каждом канале, вместо фотоаппарата могут использоваться другие средства. Например, может быть предоставлен однострочный сканер, чтобы измерять концентрацию нуклеиновой кислоты как функцию положения вдоль канала. Кроме того, необязательно, чтобы фотоаппарат смотрел на каналы сверху. В некоторых вариантах осуществления лотки, несущие каналы, являются прозрачными, по меньшей мере, в своих частях, лежащих под каналами, и фотоаппарат смотрит на каналы через пластины снизу.

Интерпретация терминов

[0112] Если контекст явно не указывает на иное, в ходе описания и пунктов формулы изобретения:

«содержит», «включает» и т.п. следует понимать в инклюзивном смысле, в противоположность эксклюзивному или исчерпывающему смыслу; то есть в смысле «включая, но без ограничения»;

«подключенный», «соединенный» или любой вариант этих терминов означает любое соединение или связь, прямое или косвенное, между двумя или более элементами; соединение или связь между элементами могут быть физическими, логическими или их сочетанием;

«в данном документе», «выше», «ниже» и слова аналогичного смысла, когда используются для описания этого изобретения, следует относить к этому описанию в целом, а не к каким-либо конкретным частям этого описания изобретения;

«или», в отношении списка двух или более элементов, включает все следующие интерпретации слова: любой из элементов в списке, все элементы в списке и любое сочетание элементов в списке.

Формы в единственном числе также включают значение любых подходящих форм в множественном числе.

[0113] Слова, которые указывают направления, такие как «вертикальный», «поперечный», «горизонтальный», «восходящий», «нисходящий», «передовой», «обратный», «внутренний», «внешний», «вертикальный», «поперечный», «левый», «правый», «передний», «задний», «верхний», «нижний», «ниже», «выше», «под» и т.п., используемые в этом описании и любом из сопутствующих пунктов формулы изобретения (где присутствуют), зависят от конкретной описываемой и показываемой ориентации устройства. Объект изобретения, описываемый в данном документе, может предполагать различные альтернативные ориентации. Соответственно, эти термины, указывающие направление, строго не определены, и их не следует понимать в узком смысле.

[0114] Варианты осуществления изобретения могут реализовываться с помощью специально разработанного аппаратного обеспечения, настраиваемого аппаратного обеспечения, программируемых процессоров данных, настроенных предоставлением программного обеспечения (которое может необязательно включать встроенное программное обеспечение), способного выполняться на процессорах данных, компьютеров специального назначения или процессоров данных, которые специально запрограммированы, настроены или созданы для выполнения одного или более шагов в способе, который подробно описан в данном документе, и/или сочетаний двух или более вариантов указанного. Примерами специально разработанного аппаратного обеспечения являются: логические схемы, специализированные интегральные схемы («ASIC»), большие интегральные схемы («LSI»), очень большие интегральные схемы («VLSI») и т.п. Примерами настраиваемого аппаратного обеспечения являются: одно или более программируемых логических устройств, таких как программируемые компоненты матричной логики («PAL»), программируемые логические матрицы («PLA») и программируемые пользователем вентильные матрицы («FPGA»). Примерами программируемых процессоров данных являются: микропроцессоры, процессоры цифровой обработки сигналов «DSP», встроенные процессоры, графические процессоры, математические сопроцессоры, компьютеры общего назначения, серверные компьютеры, облачные компьютеры, мэйнфреймы, рабочие станции и т.п. Например, один или более процессоров данных в схеме управления для устройства могут реализовывать способы, наподобие описанных в данном документе, путем выполнения команд программного обеспечения в программной памяти, доступной процессорам.

[0115] Обработка может быть централизованной или распределенной. Когда обработка является распределенной, информация, в том числе программное обеспечение и/или данные, может храниться централизованно или распределено. Обмен такой информацией может осуществляться между различными функциональными элементами с помощью сети передачи данных, такой как локальная вычислительная сеть (LAN), глобальная сеть (WAN) или Интернет, проводных или беспроводных линий передачи данных, электромагнитных сигналов или другого канала передачи данных.

[0116] Например, хотя процессы или блоки представлены в заданном порядке, альтернативные примеры могут выполнять процедуры, имеющие шаги, или использовать системы, имеющие блоки, в другом порядке, а некоторые процессы или блоки могут быть удалены, перемещены, добавлены, подразделены, объединены и/или изменены, чтобы предоставить альтернативу или субкомбинации. Каждый из этих процессов или блоков может быть реализован множеством различных способов. Также, хотя процессы или блоки иногда показаны как выполняемые по порядку, эти процессы или блоки могут вместо этого выполняться параллельно или могут выполняться в различные моменты времени. Кроме того, хотя элементы иногда показаны как выполняемые последовательно, они вместо этого могут выполняться одновременно или в других последовательностях.

[0117] Программные или другие модули могут находиться на серверах, рабочих станциях, персональных компьютерах, встроенных процессорах, контроллерах технологического процесса, планшетных компьютерах и других устройствах, подходящих для описанных в данном документе целей.

[0118] Изобретение также может предоставляться в форме программного продукта. Программный продукт может содержать любую не меняющуюся со временем среду, которая содержит набор машиночитаемых команд, которые, при выполнении процессором данных, заставляют процессор данных выполнять способ изобретения. Например, машиночитаемые команды могут программировать компьютер управлять роботизированной системой отбора нуклеиновых кислот по размеру, как описано в данном документе, и/или планировать операции в системе отбора нуклеиновых кислот по размеру, как описано в данном документе. Программные продукты в соответствии с изобретением могут иметь любую из широкого ряда форм. Программный продукт может содержать, например, не меняющуюся со временем среду, такую как магнитная среда хранения данных, включая гибкие диски, жесткие диски, оптическая среда хранения данных, включая CD-диски, DVD-диски, электронная среда хранения данных, включая ПЗУ, флеш-память, стираемое программируемое постоянное запоминающее устройство (EPROM), жестко смонтированные или предварительно запрограммированные чипы (например, полупроводниковые чипы электрически стираемого программируемого постоянного запоминающего устройства, EEPROM), нанотехнологическая память или т.п. Машиночитаемые сигналы в программном продукте могут необязательно быть сжаты или зашифрованы.

[0119] В некоторых вариантах осуществления изобретение может быть реализовано в программном обеспечении. Для большей ясности, «программное обеспечение» содержит любые команды, исполняемые в процессоре, и может содержать (но без ограничения) встроенное программное обеспечение, резидентное программное обеспечение, микрокод и т.п. Как аппаратное, так и программное обеспечение для обработки могут быть централизованными или распределенными (или их сочетанием), полностью или частично, как известно специалистам в данной области техники. Например, программное обеспечение и другие модули могут быть доступны через локальную память, через сеть, через браузер или другое приложение в контексте распределенных вычислений, или через другие средства, подходящие для описанных выше целей.

[0120] Выше, там где идет ссылка на компонент (например, программный модуль, процессор, узел, устройство, схему и т.п.), если не указано иное, ссылку на этот компонент (включая ссылку на «средство») следует интерпретировать как включение эквивалентов этого компонента, любого компонента, который выполняет функцию описанного компонента (т.е. является функционально эквивалентным), включая компоненты, которые не являются структурно эквивалентными описанной структуре, которая выполняет функцию в представленных показательных вариантах осуществления изобретения.

[0121] Конкретные примеры систем, способов и устройства были описаны в данном документе с целью иллюстрации. Они являются лишь примерами. Технология, представленная в данном документе, может применяться для систем, отличающихся от примерных систем, описанных выше. При реализации этого изобретения на практике возможны многие изменения, модификации, добавления, упущения и перестановки. Это изобретение включает изменения описанных вариантов осуществления, очевидные для специалиста, включая изменения, полученные: заменой признаков, элементов и/или действий эквивалентными признаками, элементами и/или действиями; смешиванием и согласованием признаков, элементов и/или действий из различных вариантов осуществления; сочетанием признаков, элементов и/или действий из вариантов осуществления, как описанные в данном документе, с признаками, элементами и/или действиями другой технологии; и/или упущением признаков, элементов и/или действий из описанных вариантов осуществления.

[0122] Следовательно, подразумевается, что следующие прилагающиеся пункты формулы изобретения и пункты, вводимые далее, должны пониматься как содержащие все такие модификации, перестановки, добавления, опущения и подсочетания, которые могут быть разумно сделаны. Объем формулы изобретения не следует ограничивать предпочтительными вариантами осуществления, изложенными в примерах, а следует интерпретировать наиболее широко, согласно описанию в целом.

[0123] Хотя выше был обсужден ряд примерных особенностей и вариантов осуществления, специалисты в данной области техники распознают их определенные модификации, перестановки, добавления и подсочетания. Следовательно, подразумевается, что следующие прилагающиеся пункты формулы изобретения и пункты формулы, вводимые далее, необходимо рассматривать как включающие такие модификации, перестановки, добавления и подсочетания.

Изобретение относится к области биохимии. Описано изобретение, включающее способ отбора нуклеиновых кислот по размеру. Способ включает в себя стадии перемещения нуклеиновых кислот из образца по каналу электрофорезом, автоматическое отслеживание продвижения эталонной фракции нуклеиновых кислот по каналу, оценку расчетного времени прибытия целевой фракции нуклеиновых кислот в лунку для извлечения в канале, извлечение текучей среды, содержащей целевую фракцию, из лунки для извлечения в расчетное время прибытия. Изобретение расширяет арсенал средств для отбора нуклеиновых молекул по размеру. 43 з.п. ф-лы, 15 ил.

1. Способ отбора нуклеиновых кислот по размеру, включающий:

перемещение нуклеиновых кислот из образца по каналу электрофорезом; автоматическое отслеживание продвижения эталонной фракции нуклеиновых кислот по каналу;

на основании отслеживания, оценку расчетного времени прибытия целевой фракции нуклеиновых кислот в лунку для извлечения в канале; и

извлечение текучей среды, содержащей целевую фракцию, из лунки для извлечения в расчетное время прибытия.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что эталонная фракция является такой же, что и целевая фракция.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что эталонная фракция отличается от целевой фракции, и оценка расчетного времени прибытия целевой фракции включает оценку разности между расчетным временем прибытия эталонной фракции в лунку для извлечения и расчетным временем прибытия целевой фракции в лунку для извлечения.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что отслеживание включает, в разделенные моменты времени, получение изображения канала и идентификацию на изображениях областей, соответствующих эталонной фракции.

5. Способ по п. 4, отличающийся тем, что оценка расчетного времени прибытия целевой фракции включает определение средней скорости целевой фракции на основании разностей между положениями эталонной фракции на двух или более изображениях.

6. Способ по п. 4 или 5, отличающийся тем, что включает, перед перемещением нуклеиновых кислот по каналу, комбинирование нуклеиновых кислот с красителем.

7. Способ по п. 6, отличающийся тем, что краситель содержит флуорофор или хромофор.

8. Способ по п. 6, отличающийся тем, что получение каждого изображения включает использование устройства получения изображений для получения нескольких различных экспозиций канала и сочетание нескольких различных экспозиций для создания изображения, причем это изображение обладает большим динамическим диапазоном, чем любая из нескольких различных экспозиций.

9. Способ по п. 6, отличающийся тем, что при получении изображений включает освещение канала видимым светом или ультрафиолетовым светом.

10. Способ по п. 9, отличающийся тем, что видимый свет или ультрафиолетовый свет имеет длину волны, которая соответствует полосе поглощения красителя.

11. Способ по п. 1, отличающийся тем, что включает планирование времени прибытия целевой фракции в лунку для извлечения; сравнение запланированного времени прибытия с расчетным временем прибытия и регулирование одного или более параметров электрофореза электрофоретического сигнала на основании любой разности между запланированным временем прибытия и расчетным временем прибытия.

12. Способ по п. 11, отличающийся тем, что регулирование одного или более параметров электрофореза включает регулирование рабочего цикла электрофоретического сигнала.

13. Способ по п. 11 или 12, отличающийся тем, что регулирование одного или более параметров электрофореза включает регулирование потенциала электрофоретического сигнала.

14. Способ по п. 11, отличающийся тем, что содержит управление скоростью передвижения нуклеиновых кислот по каналу путем пропорционального регулирования с обратной связью одного или более параметров электрофореза на основании сигнала ошибки, содержащего разность между запланированным временем прибытия и расчетным временем прибытия.

15. Способ по п. 11, отличающийся тем, что включает уменьшение разности между расчетным временем прибытия и запланированным временем прибытия путем временного прекращения приложения электрофоретического сигнала к каналу.

16. Способ по п. 1, отличающийся тем, что включает определение положения лунки для извлечения в канале путем анализа изображения.

17. Способ по п. 16, отличающийся тем, что оценка расчетного времени прибытия целевой фракции нуклеиновых кислот в лунку для извлечения основывается частично на положении лунки для извлечения, как определяется анализом изображения.

18. Способ по п. 1, отличающийся тем, что извлечение текучей среды, содержащей целевую фракцию, из лунки для извлечения выполняют в течение периода, автоматически определяемого по диапазону размеров нуклеиновой кислоты, содержащейся в целевой фракции.

19. Способ по п. 18, отличающийся тем, что содержит оценку расчетного времени прибытия в лунку для извлечения ведущего и замыкающего краев целевой фракции и регулирование начального и конечного времени для извлечения целевой фракции на основании расчетного времени прибытия в лунку для извлечения ведущего и замыкающего краев целевой фракции.

20. Способ по п. 19, отличающийся тем, что включает автоматическое управление электрофорезом для канала, так что после того, как ведущий край целевой фракции прибывает в лунку для извлечения, скорость электрофореза увеличивается.

21. Способ по п. 1, отличающийся тем, что канал является одним из нескольких каналов, и способ выполняют параллельно, чтобы обрабатывать несколько образцов в нескольких каналах.

22. Способ по п. 21, отличающийся тем, что параметры электрофореза каждого из нескольких каналов контролируют независимо.

23. Способ по п. 21, отличающийся тем, что также включает управление роботизированной системой, содержащей пипетку, чтобы переносить несколько образцов в несколько каналов.

24. Способ по п. 23, отличающийся тем, что извлечение текучей среды, содержащей целевую фракцию, из лунки для извлечения содержит управление роботизированной системой для расположения наконечника пипетки в лунке для извлечения, управление пипеткой для изъятия текучей среды из лунки для извлечения, и управление роботизированной системой для переноса изъятой текучей среды в лунку назначения.

25. Способ по п. 24, отличающийся тем, что включает автоматическое управление перемещением нуклеиновых кислот в первом и втором каналах, так что расчетное время прибытия целевой фракции для первого канала отличается от расчетного времени прибытия целевой фракции для второго канала.

26. Способ по п. 23, отличающийся тем, что пипетка содержит многоканальную пипетку, а извлечение текучей среды, содержащей целевую фракцию, из лунки для извлечения, выполняется одновременно для нескольких каналов путем управления роботизированной системой для расположения наконечника пипетки для каналов многоканальной пипетки в лунках для извлечения соответствующих нескольких каналов, управления пипеткой для изъятия текучей среды из лунки для извлечения и управления роботизированной системой, чтобы переносить изъятую текучую среду в лунку назначения.

27. Способ по п. 26, отличающийся тем, что включает автоматическое управление перемещением нуклеиновых кислот в нескольких каналах, так что расчетное время прибытия целевых фракций для каждого из нескольких каналов является одинаковым.

28. Способ по п. 27, отличающийся тем, что целевые фракции для нескольких каналов содержат несколько различных целевых фракций.

29. Способ по п. 1, отличающийся тем, что целевая фракция нуклеиновых кислот содержит адаптер, присоединенный к молекуле нуклеиновой кислоты, представляющей интерес, а эталонная фракция нуклеиновых кислот содержит адаптер, который не присоединен к молекуле нуклеиновой кислоты, представляющей интерес.

30. Способ по п. 1, отличающийся тем, что отслеживание включает автоматическое отслеживание продвижения нескольких эталонных фракций нуклеиновых кислот по каналу, причем опорная фракция является одной из нескольких опорных фракций нуклеиновых кислот.

31. Способ по п. 30, отличающийся тем, что указанные несколько опорных фракций нуклеиновых кислот содержат ДНК или РНК спираль известных размеров.

32. Способ по п. 1, отличающийся тем, что включает задание размера или диапазона размеров целевой фракции нуклеиновых кислот.

33. Способ по п. 1, отличающийся тем, что нуклеиновые кислоты содержат по меньшей мере первую целевую фракцию и вторую целевую фракцию, а этапы оценки и извлечения включают:

оценку расчетного времени прибытия первой целевой фракции в лунку для извлечения в канале;

извлечение текучей среды, содержащей первую целевую фракцию, из лунки для извлечения в расчетное время прибытия первой целевой фракции;

продолжение электрофореза в канале;

оценку расчетного времени прибытия второй целевой фракции в лунку для извлечения в канале; и

извлечение текучей среды, содержащей вторую целевую фракцию, из лунки для извлечения в расчетное время прибытия второй целевой фракции.

34. Способ по п. 33, отличающийся тем, что включает перемещение текучей среды, содержащей первую целевую фракцию, и текучей среды, содержащей вторую целевую фракцию, в отдельные лунки назначения.

35. Способ по п. 33, отличающийся тем, что включает перемещение текучей среды, содержащей первую целевую фракцию, и текучей среды, содержащей вторую целевую фракцию, в одну и ту же лунку назначения.

36. Способ по любому из пп. 33-35, отличающийся тем, что включает планирование первого запланированного времени для извлечения первой целевой фракции и планирование второго запланированного времени для извлечения второй целевой фракции.

37. Способ по п. 36, отличающийся тем, что включает управление одним или несколькими параметрами электрофореза для канала для приведения первой целевой фракции в лунку для извлечения в первое запланированное время.

38. Способ по п. 36, отличающийся тем, что включает управление одним или более параметрами электрофореза для канала для приведения второй целевой фракции в лунку для извлечения во второе запланированное время после того, как была извлечена первая целевая фракция.

39. Способ по п. 33, отличающийся тем, что нуклеиновые кислоты содержат несколько целевых фракций, и при этом несколько целевых фракций извлекается из лунки для извлечения канала в несколько различных моментов времени.

40. Способ по любому из пп. 21-28, отличающийся тем, что нуклеиновые кислоты в каждом из нескольких каналов содержат несколько целевых фракций, и несколько целевых фракций в каждом из каналов извлекаются из лунки для извлечения в несколько моментов времени.

41. Способ по п. 40, отличающийся тем, что содержит управление одним или более параметрами электрофореза для каналов для приведения первых целевых фракций нескольких целевых фракций нескольких каналов в лунки для извлечения в общее первое запланированное время.

42. Способ по п. 41, отличающийся тем, что включает управление одним или более параметрами электрофореза для каналов для приведения первых целевых фракций нескольких целевых фракций нескольких каналов в лунки для извлечения в различное время.

43. Способ по п. 41 или 42, отличающийся тем, что включает управление одним или несколькими параметрами электрофореза для каналов для приведения вторых целевых фракций нескольких целевых фракций нескольких каналов в лунки для извлечения в общее второе запланированное время.

44. Способ по п. 41 или 42, отличающийся тем, что включает управление одним или несколькими параметрами электрофореза для каналов для приведения вторых целевых фракций нескольких целевых фракций нескольких каналов в лунки для извлечения в различное время.